Summary
הזדקנות תאית היא הגורם העיקרי בפיתוח של הפתווגיות הקשורות לגיל כרונית. זיהוי של הtherapeutics שתאי היעד מציגים הבטחה להרחבת הזדקנות בריאה. כאן, אנו מציגים את הבקשה הרומן על המסך לזיהוי של senotherapeutics מבוסס על מדידה של פעילות ביולוגית β-גלטוסידאז הקשורים בתאים בודדים.
Abstract
הזדקנות התא הוא אחד הסימנים ההיכר של ההזדקנות ידוע להשפיע על תוחלת חיים בריאה. תרופות מסוגל להרוג תאים senescent במיוחד בתרבות התא, כינה senolytics, יכול להפחית את הנטל התא הסנאני בvivo ולהאריך את ברינספנה. מספר מחלקות של senolytics זוהו עד כה כולל HSP90 מעכבי, Bcl-2 מעכבי משפחה, piperlongumine, פפטיד FOXO4 מעכבות ושילוב של Dasatinib/Quercetin. זיהוי של SA-β-Gal ב-pH מוגברת למטה הוא אחד הסמנים המאופיינת הטוב ביותר לזיהוי של תאים הסנאים. מדידות התאים הβ-גלטוסידאז (SA-β-Gal) באמצעות מצע הפלורסנט C12fdg בשילוב עם קביעת מספר התאים הכולל באמצעות הצבע המשולב DNA שפותח את האפשרות ל מסך עבור תרופות senotherapeutic המקטינה את הפעילות הכוללת של SA-β-Gal על-ידי הריגת תאים סנסטיים (senotherapeutic) או על-ידי דיכוי SA-β-Gal ופנוטיפים אחרים של תאים סנסטיים (senomמורקס). שימוש בפלטפורמת הרכישה והניתוח של תמונת פלורסנט באיכות גבוהה מאפשר הקרנת תפוקה מהירה וגבוהה של ספריות תרופות לאפקטים ב-SA-β-Gal, מורפולוגיה של תאים ומספר תאים.
Introduction
הזדקנות תאית תוארה בפעם הראשונה על ידי ליאונרד הייפליק ו פול מורהד, אשר הראה כי תאים נורמליים יש יכולת מוגבלת להתרבות בתרבות1. תאי הסנקו אינם מתרבים למרות הנוכחות של חומרים מזינים, גורמי גדילה וחוסר במגע מעכבות, אבל להישאר metabolically פעיל2. תופעה זו ידועה בתור הזדקנות מחודשת והיא יוחסה בעיקר לקיצור טלומר, לפחות בתאים אנושיים3. מחקרים נוספים הראו כי התאים יכולים גם להיות המושרה לעבור הזדקנות בתגובה גירויים אחרים, כגון הלחץ אונגניים (אוננציה המושרה, או), נזק לדנ א, תרופות ציטוטוקסיים, או הקרנה (הנגרמת באופן מלחיץ, SIS)4 , מיכל 5 , 6. בתגובה לנזק לדנ א, כולל הסחף טלומר, תאים מאוהים, להתחיל צמיחת תאים בלתי מבוקרת, או לעבור אפופטוזיס אם הנזק לא ניתן לתקן. במקרה זה, הזדקנות התא נראה מועיל כפי שהוא פועל בצורה מדכאים הגידול2. לעומת זאת, הזדקנות מוגברת עם ההזדקנות בשל הצטברות של נזק הסלולר כולל נזק לדנ א. מאז התאים הסננסלי יכול להפריש ציטוקינים, מטאלופרוטאינסים וגורמי גדילה, כינה את האג הסודי הקשור הפרשה (sasp), זו עלייה בגיל תלוי בתקופת הזדקנות הסלולר sasp תורמת הומאוסטזיס רקמות ירידה ו לאחר מכן הזדקנות. כמו כן, גידול זה תלוי גיל בנטל הזדקנות ידוע לגרום מחלות מטבולית, רגישות למתח, תסמונות פרוגריה, לקויי ריפוי7,8 והוא, בין השאר, אחראי על רבים הקשורים לגיל מחלות, כגון טרשת עורקים, אוסטיאוארתריטיס, ניוון שרירים, היווצרות כיב, ומחלת אלצהיימר9,10,11,12,13. ביטול תאים senescent יכול לעזור למנוע או לעכב את תפקוד הרקמה ולהאריך את בריבן14. זה הוצג במודלים העכבר הטרנסגניים14,15,16 , כמו גם באמצעות תרופות ושילובי סמים שנתגלו באמצעות מאמצי סינון סמים וניתוח ביולוגי של מסלולים המושרה במיוחד בתאי הס,17,18,19,20,21,22. זיהוי התרופות הטיפוליות האופטימליות יותר, היכולת לצמצם ביעילות רבה יותר את הנטל החיצוני של התא, הוא השלב הבא חשוב בפיתוח גישות טיפוליות להזדקנות בריאה.
התאים הסנאריים מציגים תכונות פנוטיטיות ומולקולריות אופייניות, הן בתרבות והן בvivo. אלה סמנים הזדקנות יכול להיות הגורם או תוצאה של אינדוקציה הזדקנות או תוצר לוואי של שינויים מולקולריים בתאים אלה. עם זאת, אף סמן יחיד לא נמצא באופן ספציפי בתאי הסנקו. כיום, זיהוי הβ-גלטוסידאז (SA-β-Gal) הוא אחד השיטות המבוססות על תאים בודדים ומבוססות-תא יחיד למדידת הזדקנות בתוך מבחנה ובvivo. SA-β-גל הוא הידרוקלז ליסוזומל עם פעילות אנזימטית אופטימלית ב-pH 4. מדידת פעילותה ב-pH 6 אפשרי מכיוון שתאי הסנסזים מראים פעילות ליזוזומלית מוגברת23,24. עבור תאים חיים, pH מוגברת ליזוזומל מושגת על ידי ליסוזומיום המלחה עם וולאואר H+-atpase מעכבי Bafilomycin A1 או אנדוזומחמצה מעכבי ככלורוקין25,26. 5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-גלפטוטוסייד (C12fdg) משמש מצע בתאי החיים כפי שהוא שומר על מוצר ביקע בתאים בשל 12 הפחמן ליפופילית moiety25. חשוב לעשות זאת, SA-β-Gal הפעילות עצמה אינה מחוברת ישירות עם כל מסלול מזוהה בתאי הסנקו והוא אינו נחוץ כדי לגרום הזדקנות. בעזרת שיטת הפעולה הזאת, ניתן לזהות את תאי הסנסאלים גם באוכלוסיות הטרוגניות וברקמות ההזדקנות, כגון ביופסיות עור מאנשים מבוגרים. זה גם שימש כדי להראות מתאם בין הזדקנות התא ההזדקנות23 כפי שהוא סמן אמין עבור זיהוי תא הסננסאס במספר אורגניזמים ותנאים27,28,29, . בסדר, 30 כאן, התפוקה הגבוהה SA-β-Gal הקרנת מבוסס על מצע פלורסנט C12fdg באמצעות העכבר הראשי מעובריים מתחלקים (mefs) עם לחץ חמצוני הנגרמת על ידי הזדקנות התא מתוארת היתרונות והחסרונות שלה נדונים. למרות שניתן לבצע את התיקון הזה עם סוגים שונים של תאים, השימוש Ercc1-לקוי, DNA תיקון לקוי mefs מאפשר אינדוקציה מהירה יותר של הזדקנות בתנאים של לחץ חמצוני. בעכברים, ביטוי מופחת של תיקון ה-dna endonuclease ERCC1-xpf גורם לקויי dna תיקון, הצטברות מואצת של נזק dna אנדוסוגני, מוגבה ROS, בתפקוד מיטוכונדריאלי, מוגברת נטל תא העין, אובדן תפקוד תא גזע ו הזדקנות מוקדמת, דומה להזדקנות טבעית31,32. באופן דומה, Ercc1-mefs לקוי לעבור הזדקנות במהירות רבה יותר בתרבות17. תכונה חשובה של שיטת ה-MEF של הארגון היא שבכל החדרים יש שילוב של תאים מיוחדים ובלתי-מוגדרים, ומאפשרים הדגמה ברורה של השפעות מיוחדות לתאים. עם זאת, למרות שאנו מאמינים כי השימוש בלחץ חמצוני בתאים הראשוניים כדי לגרום הזדקנות הוא פיזיולוגי יותר, שיטת זה גם ניתן להשתמש עם קווי התא שבו הזדקנות המושרה עם סוכני DNA נזק כמו etפאות או הקרנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
השימוש בבעלי חיים אושר על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים שסקריפס פלורידה והשימוש.
1. הדור של המחלמה עובריים מתחלקים (MEF) – 12-15 ימים
- לבודד את סוג פראי ו Ercc1-/- mefs מתוך עכברים נשים בהריון ביום העובריים 13 (E13) כמתואר בעבר33.
הערה: כל השלבים הבאים מתבצעים במכסה של תרבות הרקמה תחת תנאים אספטי ושימוש בכלים סטריליים. - . לכרות את ראש העובר מעל העיניים
- הסירו את הרקמה האדומה (הלב והכבד) והשתמשו בהן במקרה הצורך.
- להכין 500 mL של התערובת 1:1 של מדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) ו F10 של האם עם 10% סרום העובר העוברי, 1x חומצות אמינו לא הכרחי, פניצילין, ו סטרפטומיצין כמו בינוני גדילה ולחמם אותו עד 37 ° צ' עבור סביב 15 דקות לפני כל שימוש. אחסן בינונית צמיחה ב-4 ° c.
- מודחלת את שאר העובר עם 0.25% טריפסין/EDTA במשך 10 דקות.
- האוהב העובר לתוך חתיכות 1 מ"מ ופיפטה את הרקמה למעלה ולמטה מספר פעמים.
- הוסף 10 מ ל של הצמיחה בינונית ורקמות הצלחת של עובר אחד לכל 10 ס מ בקוטר הלוח התרבות התאים (מעבר 0).
- לטפח תאים ב 37 ° c, 3% O2, 5% CO2.
הערה: רק תאי MEF מתחברים ללוחות של תרבית רקמה שאינם מצופים בתנאים אלה. - שנה את המדיום כל יום במעבר 0 כדי להסיר מקטעי רקמות ושברי תאים שאינם מצורפים.
הערה: בהתאם לגודל העובר ולאיכות הבידוד, התא בדרך כלל מגיע לידי שליטה לאחר 2 עד 3 ימים. - טריסינוניזציה
- הסר בזהירות את בינוני הצמיחה ולשטוף תאים עם 10 מ ל של 1x PBS פעמיים.
- הוסף 2 מ ל של 0.025% טריפסין/EDTA פתרון לתאים בקוטר 10 ס מ לוחות ו-דגירה ב 37 ° צ' עבור 2-3 דקות.
- ודא שהתאים מנותקים מהמשטח על-ידי בדיקת התאים מתחת למיקרוסקופ.
- הפסקת העיכול באמצעות הוספת אותה כמות של מדיום גדילה.
- העבר את התאים לצינור חרוט ולתאי צנטריפוגה ב 200 x g עבור 3 דקות ולמחוק את הסופרנטאנט.
- השהה את התאים מחדש בזהירות במדיום גדילה טרי, ספירת תאים והזרע אותם בלוחות חדשים בצפיפות התא המתוכננת.
- לצורך טיפוח-תרגול של תאים שאינם מניבים, ה1:4 והרחבת למעבר אחר ב-3% O2, 37 ° צ' לתשואות תאים נוספים (מעבר 1).
הערה: בשלב זה ניתן לשמור על התאים בתרבות או לשמור לשימוש מאוחר יותר בחנקן נוזלי, בקריוצלוחיות המכילות כ-1,000,000 תאים לכל אחד. שלב זה מציע גם את האפשרות ליצור אצווה מעורבת של תאים מבעלי חיים שונים כדי להפחית את השונות הבאה מניתוח בעלי חיים יחיד. - כדי לגרום להזדקנות התא, זרעים פיצול תאים confluent ממעבר 1 ביחס של 1:4 ו-דגירה אותם ב 20% O2, 37 ° c, 5% CO2 עבור 3 ימים; תנאי התרבות האלה הם בעלי אטמוספירה מלאת חמצן.
הערה: טיפוח התאים ו blastocysts תחת ריכוזי חמצן הסביבה יכול להעלות סמנים של הסלולר באופן ספציפי כאשר תיקון נזק DNA הוא לקויי34,35,36. - חזור על הליך זה עבור 2 פסקאות נוספות.
- כדי לפקח על הזדקנות תאית, למדוד את העלייה הדרגתית בקוטר התא ובעוצמת התאים במהלך כל הטריסיזציה באמצעות מערכת המונה מתקדם מונה התא.
- הערכת הפחתת ההתפשטות של התאים על-ידי קביעת הכפל האוכלוסיה (PD) באמצעות המשוואה
PDT = (t2-t1)/3.32 x (log n2 – היומן n1)
הערה: זמן הכפלת האוכלוסיה נעשה בשימוש רק עבור תאים לא-מסנטיים. - השתמש במעבר מוקדם סוג פראי או Ercc1-/- mef תאים שנשמרו ב 3% O2, 37 ° c, 5% CO2 כתאי בקרה שאינם מסנתיים.
2. שיטת ההקרנה הβ-גל המשויכת – 2-3 ימים
- הכנת 10 מ"מ פתרונות מלאי ב-DMSO של כל התרופות כדי להיבדק ולאחסן מאגר ali, ב-80 ° c. אין להקפיא ההפשרה פתרונות מניות כמו זה עשוי להקטין את פעילות הסמים.
הערה: כאן, HSP90 מעכב 17DMAG שימש כתרופה בחרדה מסוגל במיוחד להרוג תאים הסנאט17. - ביום הניסוי להפשיר את aliquot, לדלל את הסמים במדיום תרבות טרייה ולהוסיף לתאים המכילים בינוני ממוזג ביחס 1:1 כדי להניב את הריכוז הסופי במדיום צמיחה.
- השתמש ב-96-ובכן לפני דילול לוחות לדילול סדרתי ושילובי תרופות.
הערה: עבור תאים MEF, זה היה באמפירי נקבע כי ריכוזי DMSO לא יעלה על 2% ולשלוט בתאים שטופלו עם ריכוזי DMSO הגבוהה ביותר בשימוש צריך להיכלל בכל לרוץ. - Seed 5 x 103 תאים הסנסי או 3 x 103 תאים שאינם מסנסוניים לכל טוב ב 96 הצלחות היטב לפחות 6 h לפני הטיפול ב 100 μl של גידול בינוני ו דגירה ב 20% O2, 37 ° c, 5% CO2.
הערה: התאים צריכים להיות כ 80% שוטפת לפני הטיפול. - השימוש בקיר שחור/הרקמה התחתונה ברור הרקמות, טיפל 96 לוחות היטב כדי למזער את אות הפלורסנט מוצלב ורקע.
הערה: עם זאת, לוחות ברורים נבדקו גם בהצלחה. - הוסף מדלל סמים לתאי MEF ו-דגירה עבור 24 שעות עד 48 h תחת 20% O2, 37 ° c, 5% שיתוף2 תנאים.
- שמרו על תאים לא-מסנקיים תחת 3% O2, 37 ° c, 5%2 תנאים.
- עבור ליזוזומלית, להכין פתרון 10 מ"מ bafilomycin A1, סדרת מחלקים ו לשמור קפוא ב-20 ° c.
- לניתוח הקרינה הפלואורסצנטית של פעילות SA-β-Gal, להכין 2 מ"מ C12fdg מניות פתרון, חנות ב-20 ° c, ולהגן מפני אור.
- עבור פתרון העבודה, להכין 100 μM C12fdg במדיום צמיחה ביום הניסוי.
הערה: יש לבצע את כל צעדי הדגירה הכרוכים ב-12fdg בחשכה. - הסר את פתרון התרופה ושטוף את התאים 1 פעם עם 100 μL של 1x PBS.
- לגרום ליסוזומלית על ידי טיפול מקדים בתאים עם 90 μL של 100 nM bafilomycin A1 הפתרון הכין בינונית תרבות התא טרי במשך שעה אחת 20% O2, 37 ° c, 5% CO2.
- הוסף 10 μL של 100 μM C12fdg עבודה פתרון למדיום התרבות (ריכוז סופי 10 μm).
- התאים הדגירה עבור 2 h.
- הוסף 2 μL של 100 μg/mL הואכסט 33342 לצבוע (ריכוז סופי 2 μg/mL) לתרבות, הדגירה עבור 20 דקות.
- הסר מדיה והוסף 100 μL של מדיום גידול טרי.
3. ניתוח תמונה פלואורסצנטית כמותי של תכולה גבוהה
- השתמש בפלטפורמת הצילום והניתוח של תמונת פלורסנט בעלת תוכן גבוה כדי לרכוש תמונות פלורסנט של התאים בשני הערוצים המתאימים ללכידת הופסט ו-C12FDG פלואורסצנטית (g., DAPI ו-FITC הגדרות ערוץ הקבועות מראש, בהתאמה).
הערה: פרוטוקולי הרכישה דורשים הגדרה של מספר משתנים הספציפיים לצורך הצורך. המטרה של פרוטוקול הרכישה היא ללכוד מספר הולם של תמונות פלורסנט במיקוד של מספר מספיק של תאים עבור ניתוח כמותי במורד הזרם. - פתח פרוטוקול ניתוח מתאים על-ידי בחירה בכל ערוץ והגדרה, על-ידי התאמת קריטריון סלקטיבי אחד או יותר, מה שנחשב כתכונה של עניין בכל אחד מהערוצים.
- עבור הגרעין, להשתמש כל כך פילוח מראש סטים (למשל, פילוח גרעיני, מקטעי ושלפוחית, פילוח ציטופלסמה) שיאפשרו זיהוי של אורגלים סלולריים על בסיס של קריטריונים מרובים כולל מורפולוגיה, גודל, ואות עוצמה. כוונן קריטריונים אלה כדי לכלול גרעינים תוך הימנעות משברים ופסולת גרעינית שייתכן שיש להם אות, אבל שהם, למשל, גדולים מדי או קטנים מדי כדי להיות גרעינים.
- בדוק את האות בערוץ FITC אשר הוא הקרינה הפלואורסצנטית C12fdg ומייצגת את כמות הפעילות הβ-גלטוסידהקשורים ביותר בתאים.
הערה: בתאי הסננסאוז יש פעילות גבוהה יותר הקשורה לβ-גלטוסידאז מאשר תאים שאינם מסנזים; עם זאת, C12fdg פלואורסצנטית יהיה לא דיסקרטית ורציפה, המחייב הקמת סף בין מה שנחשב C12fdg-חיוביים ו-c12fdg-שלילי תא. - באמצעות תוכנה אנליטית זמינה מסחרית, צור מספר מופעים בהם אזור מוגדר המקיף את הגרעין (תא שוערת) חופף לפחות פעם אחת עם הסף הגבוה ביותר C12fdg.
הערה: התוכנה האנליטית יוצרת באופן אוטומטי ספירה באמצעות קישור ליעד. זוהי ההגדרה המעשית של הבדיקה של תא בינארי, מתאים ל-12fdg-חיוביים.
- לנתח את כל הדגימות בטריליטה עם 3-5 שדות לערכים מסוימים וממוצע והסטיות הסטנדרטיות המחושבות בהתאם.
- חשב את אחוז התאים המסנסתשימוש בנוסחה הבאה:
תאי סנס100
4 (%)
4 (%)4. שיטת אימות פרמטרים
- עבור כל הדגימות של מקדם הווריאציות הפנים והבין-מתוך-שיטת (% קורות חיים) חושבו באמצעות הנוסחה הבאה:
קורות חיים של שיטת הפנים (n = 10 חוזר ונמדד בניסוי אחד) =
x 100 (%)
קורות חיים בין-שיטת (n = 5 ניסויים עצמאיים ) = x 100 (%) - למטרות הקרנה, לקבוע את הערך Z, פרמטר סטטיסטי כדי להעריך את איכות הטיפול, מתאים שטופלו עם 200 ננומטר rapamycin עבור 24 שעות ב 20% O2, 37 ° צ', 5% CO2 (בקרה חיובית עבור תרופות senotherapeutic) ולא מטופל תאי הסנלי (שליטה שלילית).
הערה: ערך ה-Z חושב בהתאם ל-Zhang ואח '.37. ערכי Z בין 0.5 ל-1 מצביעים על כך שניתן להשתמש באפשרות לסינון תרופות.
x 100 (%)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפעילות SA-β-Gal ניתן לזהות בתאים המושרה על ידי דרכים שונות של תשישות replicative ומתח חמצון, כדי אונאוגן ההפעלה23,25,38. במודל הנוכחי באמצעות Ercc1-לקוי העכבר העובריים תאים, normoxic תנאי הצמיחה (20% O2) היו מספיקים כדי לגרום הזדקנות התא לאחר לטפח אותם כמה מעברים. MEFs סוג פראי גם לעבור הזדקנות אבל דורשים מעברים נוספים ב 20% O2. איור 1 מציג את זרימת העבודה של שיטת ההקרנה החל בבידוד של תאים mef העיקרי מעוברי העכבר Ercc1-לקוי, כדי אינדוקציה של הזדקנות התא על ידי לחץ חמצוני, ולבסוף ניתוח של נתונים מיקרוסקופיים מושגת עם מיקרוסקופ פלורסנט של תוכן גבוה. איור 2 מראה תמונות מייצגות של תרבויות mef המכילים (צעיר) תאים (איור 2, שמאל), על 50% התאים הסנתיים במעבר 5 (איור 2, מרכז), ותאי הסנסטופלו עם תרופה סנחרדה ( איור 2, מימין). איור 3A מראה תמונות הנציגה עבור אוטומטי, תוכנה שנוצר ניתוחים כמותיים של תאים הססוף. איור 3B מדגים את חיסול הרקע β-גלטוסידאז על ידי Bafilomycin-A. איור 4 מציג את התוצאות האפשריות של תרבויות תאים הסננסנט שטופלו בסמים כולל הריגת תאים בלתי מטוהרים (senescent) והזדקנות תרופות (מורמורפית) כמתואר בחברת Fuhrmann-strois,et al. . שבע עשרה
איור 1. סקירה סכימטית של שיטת סינון וציר זמן. התאים MEF מבודדים עכברים בהריון ולשים על התרבות תאים מטופלים לוחיות פלסטיק במשך כמה ימים כדי להרחיב. תאי מעבר מוקדם יכולים להיות קפואים בחנקן נוזלי וניתן להשתמש בהם להקרנה בשלב מאוחר יותר. הזדקנות התא נגרמת על ידי לחץ חמצוני על ידי מעבר ב 20% O2 ו תאים חשופים לסמים ברגע שהם הגיעו למצב מדינה חזקה. ניתוח נתונים הכולל את הסכום הכולל והתאים הנותרים מתבצעים. ציר הזמן, בימים, מציין את משך הניסוי האחד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2. הדמויות הייצוגיות של התאים הבלתי-מסנאתי, הסנסאני והסניום שטופלו עם 100 nM של התרופה senescent 17DMAG. פלואורסצנטית כחול מצביע על כתמים DNA עם Hoechst 33324 ואילו זריחה ירוק מציין SA-β-גל מכתים עם C12fdg. כתמים ירוקים בהירים מייצג את התאים החיוביים SA-β-Gal בעוד שעמעום הצבע מייצג את התאים הנמוכים או השליליים של SA-β-Gal. אנא שימו לב כי תאי הסנקו בדרך כלל כוללים גודל תא גדול יותר ומשוטחים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3. תמונות מייצגות של תרבות תא MEF הסנותח עם תוכנה מסחרית. (א) התאים sa-β-גל חיוביים (sa-β-gal+) מתוארים בירוק (חיצים ירוקים), sa-β-gal שלילי (sa-β-gal-) מתוארים באדום (חיצים אדומים). לוחות שמאל וימין להראות גרעיני (Hoechst) ו-C12fdg האות (fitc), בהתאמה. רק אזורים שכתם חיובי עבור הואכסט (מכילים גרעינים) נחשבים כתאים. (ב) השוואה של תאים Bafilomycin-מטופלים ולא מטופלים. פעילות שיורית®-גלטוסידאז הקיימת בכל התאים מופחתת על ידי lysoזומז חמצה אנא לחץ כאן כדי לצפות בגירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4. הערכה של תוצאות אפשריות. לטיפול בסמים תרופות יכולות להיות השפעות שונות על התאים הסניסוניים ושאינם מסנאים, כולל הרוג תאים (senolytics) או לדכא את SA-β-גל senescent מושגים (senomמורקס). יחד שני כיתות אלה מכונים senotherapeutics. הדמות הזאת השתנתה. מפורמן-סטרופ-אל 17. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SA-β-Gal הוא ביואריקר מוגדר היטב עבור הזדקנות הסלולר התגלתה במקור על ידי Dimri et al. (1995) מראה כי שהפיצוצים האנושיים הסחיים יש להגדיל את הפעילות של SA-β-Gal כאשר העלה ב-pH 623 לעומת תאים מתרבים. בינתיים, בתוך מבחנה ובvivo של SA-β-Gal הוקמו עבור סוגי תאים שונים ורקמות25,39,40. השיטה הפלואורסצנטית מבוססת תא יחיד כדי למדוד SA-β-Gal בתאים חיים המתוארים בפרוטוקול זה הוא כלי מצוין ההקרנה הראשית עבור תרופות המשפיעים על הזדקנות התא17. עם זאת, למרות SA-β-Gal נחשב לאחד הסמנים הנוחים ביותר עבור זיהוי התא הסננסאלי, סמנים נוספים עבור הזדקנות הסלולר כמו זיהוי של הרגולטורים מחזור התא p16Ink4A ו p2141, בסנס הקשורים הסוד פנוטיפ (sasp) חלבונים כמו IL-6, tnfα, HMGB1and NF-κB42, dna נזק לתיקון סמנים כמו הקשורים ו טלומר המשויכים DNA נזק וקדי (tafs)43,44, בסנס הטרוכרוטין משויכת וקדי ( Sahf) 45או סמנים בסיסיים מורפולוגיים כמו גודל התא וצפיפות הרשת צריך להיות במקום כמו confirmatory בחני כדי להבטיח את הפוטנציאל התרפויטי של תרופות40. כיוון שהמעבר מתא רגיל לתוך תא מעבר לתאי השדה הוא תהליך איטי, השלב הקריטי בשיטה זו הוא למצוא את הסף המבדיל בין התאים השליליים של C12fdg חיוביים (שליליים) ושלילי (רגיל). הדבר חייב להיקבע בצורה מדעית עבור כל סוג תא ו-C12fdg חיוביים ושליטה שלילית יש לכלול בכל ניסוי.
בנוסף חמצון-הדגיש Ercc1-/- mefs, שיטה זו ניתן לשנות עבור סוגי תאים אחרים חסיד. חמצון-הדגיש Ercc1בתאי גזע mesenchymal (MSCs) ו etפאות מטופלים האדם תאים IMR90 כבר נבדקו בהצלחה בתוך הטיפול ניתן להשתמש כדי המסך עבור תרופות17. עם זאת, פעמים כדי לגרום הזדקנות, כמו גם זמני טיפול בסמים וריכוזים עשוי להשתנות.
המגבלה העיקרית של טכניקה זו היא כי הפעילות SA-β-Gal הראה להגדיל בתנאים עצמאיים מסוימים בלתי תלויים של תא מגע או עיכוב הסלולר הסלולרי46,47. אזורים המכילים "ערימות תא" ותרביות תאים עם מעל תאים confluent יכול בקלות להיקבע ויש לכלול מתוך הניתוחים. בנוסף, הרקע מכתים מליפופושלפוחיות פלורסנט בצבע ירוק באופן אוטומטי גדל בתאי הסננט יכול להתרחש. בתרביות תאים MEF הם זניחים עקב בהירות של C12fdg אבל יש לבדוק עבור כל סוג תא46. הופסט כתמים של דנ א בדרך כלל אינו מוביל לצביעת הרקע. עם זאת, טבעת פנול המכילה תרופות, עשויה להיות פלורסנט באור UV. הגדלת גודל ההדרה של האות הפלואורסצנטית החיובי של UV עד לגודל של גרעין התא בפועל עשוי לסייע למנוע גילוי לא רצוי של תרופות אלה.
התכונה המשמעותית ביותר של התאמתו המתוארת היא העובדה שתאי הסנסכמו גם תאים שאינם מצויים באותה סביבה, ומאפשרים הערכה של תופעות התרופה על תאים שאינם מעוצבים בו. הזיהוי של מספר התאים הכולל על-ידי ספירת גרעיני תאים נותן אינדיקציה ראשונה לגבי הפוטנציאל הקטלני של הסם. ירידה במספרי תאים והזדקנות התא בדרך כלל מרמזים על תרופות בחרדה בעוד מספר תא קבוע עם מספר מופחת של תאים מופחתים בדרך כלל מצביע על תרופות ממורמות. בשל הזמן הדגירה קצר סמים, אפקטים כמו התפשטות סימולטני של תאים שאינם מסנטיים ומוות תאים של תאים הסנטיים המוביל מספר התא קבוע (למשל, אפקט של בחרדה עם התוצאה הסנגורפית) לא ניתן לשלול אך נחשבים מאוד סביר.
היישומים העתידיים של טכניקה זו כוללים את האפשרות לשלב נוסף סמנים תא לחיות (g., ואפופטוזיס סמן כגון שביעי ו 7aad40) או סמנים עבור תאים תאיים שונים כמו המיטו, או ליסוזומים לתוך ה שיטת הרשת. ניטור במקביל של SA-β-גל וסמנים סלולריים אחרים במהלך טיפול בסמים יכול לעזור להבהיר מנגנון הסלולר הבסיסי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי NIH מענקים AG043376 (פרויקט 2 ו-Core A, PDR; פרוייקט 1 ו-Core B, LJN) ו-AG056278 (פרוייקט 3 ו-Core A, PDR; ו-Project 2, LJN) ומענק מקרן גלן (LJN).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | medium |
| Ham's F10 | Gibco | 12390-035 | medium |
| fetal bovine serum | Tissue Culture Biologics | 101 | serum |
| 1x non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | amino-acids |
| bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | lysosomal inhibitor |
| C12FDG | Setareh Biotech | 7188 | b-Gal substrate |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | DNA intercalation agent |
| 17DMAG | Selleck Chemical LLC | 50843 | HSP90 inhibitor |
| InCell6000 Cell Imaging System | GE Healthcare | High Content Imaging System |
References
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Campisi, J., di Fagagna, F. D. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).
- Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature. 345 (6274), 458-460 (1990).
- Zhu, J., Woods, D., McMahon, M., Bishop, J. M. Senescence of human fibroblasts induced by oncogenic Raf. Genes and Development. 12 (19), 2997-3007 (1998).
- Dimri, G. P., Itahana, K., Acosta, M., Campisi, J. Regulation of a senescence checkpoint response by the E2F1 transcription factor and p14(ARF) tumor suppressor. Molecular and Cellular Biology. 20 (1), 273-285 (2000).
- Michaloglou, C., et al. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi. Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).
- Niedernhofer, L. J. Tissue-specific accelerated aging in nucleotide excision repair deficiency. Mechanisms of Ageing and Development. 129 (78), 408-415 (2008).
- Gitenay, D., et al. Glucose metabolism and hexosamine pathway regulate oncogene-induced senescence. Cell Death & Disease. 5, e1089 (2014).
- Erusalimsky, J. D., Kurz, D. J. Cellular senescence in vivo: its relevance in ageing and cardiovascular disease. Experimental Gerontology. 40 (8-9), 634-642 (2005).
- Kassem, M., Marie, P. J. Senescence-associated intrinsic mechanisms of osteoblast dysfunctions. Aging Cell. 10 (2), 191-197 (2011).
- Campisi, J., Andersen, J. K., Kapahi, P., Melov, S. Cellular senescence: A link between cancer and age-related degenerative disease. Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 354-359 (2011).
- Golde, T. E., Miller, V. M. Proteinopathy-induced neuronal senescence: a hypothesis for brain failure in Alzheimer's and other neurodegenerative diseases. Alzheimers Research & Therapy. 1 (2), 5 (2009).
- Telgenhoff, D., Shroot, B. Cellular senescence mechanisms in chronic wound healing. Cell Death & Differentiation. 12 (7), 695-698 (2005).
- Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
- Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. , (2016).
- Childs, B. G., et al. Senescent intimal foam cells are deleterious at all stages of atherosclerosis. Science. 354 (6311), 472-477 (2016).
- Fuhrmann-Stroissnigg, H., et al. Identification of HSP90 inhibitors as a novel class of senolytics. Nature Communications. 8 (1), 422 (2017).
- Zhu, Y., et al. New agents that target senescent cells: the flavone, fisetin, and the BCL-XL inhibitors, A1331852 and A1155463. Aging. 9 (3), Albany NY. 955-963 (2017).
- Zhu, Y., et al. Identification of a Novel Senolytic Agent, Navitoclax, Targeting the Bcl-2 Family of Anti-Apoptotic Factors. Aging Cell. , (2015).
- Zhu, Y., et al. The Achilles' heel of senescent cells: from transcriptome to senolytic drugs. Aging Cell. , (2015).
- Baar, M. P., et al. Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Homeostasis in Response to Chemotoxicity and Aging. Cell. 169 (1), 132-147 (2017).
- Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature. , (2017).
- Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92 (20), 9363-9367 (1995).
- Itahana, K., Campisi, J., Dimri, G. P. Methods to detect biomarkers of cellular senescence: the senescence-associated beta-galactosidase assay. Methods in Molecular Biology. 371, 21-31 (2007).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-[beta]gal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
- Cahu, J., Sola, B. A sensitive method to quantify senescent cancer cells. Journal of Visualized Experiments. 78 (78), (2013).
- Collado, M., et al. Tumour biology: Senescence in premalignant tumours. Nature. 436 (7051), 642 (2005).
- Krishnamurthy, J., et al. Ink4a/Arf expression is a biomarker of aging. The Journal of Clinical Investigation. 114 (9), 1299-1307 (2004).
- Mishima, K., et al. Senescence-associated beta-galactosidase histochemistry for the primate eye. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 40 (7), 1590-1593 (1999).
- Melk, A., et al. Expression of p16INK4a and other cell cycle regulator and senescence associated genes in aging human kidney. Kidney International. 65 (2), 510-520 (2004).
- Niedernhofer, L. J., et al. A new progeroid syndrome reveals that genotoxic stress suppresses the somatotroph axis. Nature. 444 (7122), 1038-1043 (2006).
- Wang, J., Clauson, C. L., Robbins, P. D., Niedernhofer, L. J., Wang, Y. The oxidative DNA lesions 8,5′-cyclopurines accumulate with aging in a tissue-specific manner. Aging Cell. 11 (4), 714-716 (2012).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (64), (2012).
- Jagannathan, L., Cuddapah, S., Costa, M. Oxidative stress under ambient and physiological oxygen tension in tissue culture. Current Pharmacology Reports. 2 (2), 64-72 (2016).
- Meuter, A., et al. Markers of cellular senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro: molecular consequences of culture in atmospheric oxygen. J Assist Reprod Genet. 31 (10), 1259-1267 (2014).
- Robinson, A. R., et al. Spontaneous DNA damage to the nuclear genome promotes senescence, redox imbalance and aging. Redox Biology. 17, 259-273 (2018).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal Of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Zhao, H., Darzynkiewicz, Z. Biomarkers of cell senescence assessed by imaging cytometry. Methods in Molecular Biology. 965, 83-92 (2013).
- Yang, N. -C., Hu, M. -L. A fluorimetric method using fluorescein di-β-d-galactopyranoside for quantifying the senescence-associated β-galactosidase activity in human foreskin fibroblast Hs68 cells. Analytical Biochemistry. 325 (2), 337-343 (2004).
- Zhao, J., et al. Quantitative Analysis of Cellular Senescence in Culture and In Vivo. Current Protocols in Cytometry. 79, (2017).
- Capparelli, C., et al. CDK inhibitors (p16/p19/p21) induce senescence and autophagy in cancer-associated fibroblasts, "fueling" tumor growth via paracrine interactions, without an increase in neo-angiogenesis. Cell Cycle. 11 (19), 3599-3610 (2012).
- Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annual Review of Pathology. 5, 99-118 (2010).
- Mah, L. J., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. GammaH2AX as a molecular marker of aging and disease. Epigenetics. 5 (2), 129-136 (2010).
- Hewitt, G., et al. Telomeres are favoured targets of a persistent DNA damage response in ageing and stress-induced senescence. Nature Communications. 3, 708 (2012).
- Narita, M., et al. Rb-mediated heterochromatin formation and silencing of E2F target genes during cellular senescence. Cell. 113 (6), 703-716 (2003).
- Georgakopoulou, E. A., et al. Specific lipofuscin staining as a novel biomarker to detect replicative and stress-induced senescence. A method applicable in cryo-preserved and archival tissues. Aging-Us. 5 (1), 37-50 (2013).
- Severino, J., Allen, R. G., Balin, S., Balin, A., Cristofalo, V. J. Is β-Galactosidase Staining a Marker of Senescence in Vitro and in Vivo? Experimental Cell Research. 257 (1), 162-171 (2000).
