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Biology

एसए-जेड-गैलैक्टोसिडेस-आधारित स्क्रीनिंग सेनोथैरेपी ड्रग्स की पहचान के लिए परख

Published: June 28, 2019 doi: 10.3791/58133
Automatic Translation
*1, *1,2,3, 1, 1, 1,2,3, 1,2,3
1Department of Molecular Medicine and the Center on Aging, The Scripps Research Institute, 2Department of Biochemistry, Molecular Biology and Biophysics, University of Minnesota, 3Institute on the Biology of Aging and Metabolism, University of Minnesota
* These authors contributed equally

Summary

सेलुलर जीर्णता पुरानी उम्र से संबंधित रोगों के विकास में महत्वपूर्ण कारक है। चिकित्सीय की पहचान है कि लक्षित जीर्ण कोशिकाओं स्वस्थ उम्र बढ़ने का विस्तार करने के लिए वादा दिखाते हैं. यहाँ, हम एक कोशिकाओं में सेनेसी संबद्ध - Galactosidase गतिविधि की माप के आधार पर senothethetics की पहचान के लिए स्क्रीन करने के लिए एक उपन्यास परख प्रस्तुत करते हैं.

Abstract

कोशिका जीर्णता एक स्वस्थ जीवन को नकारात्मक रूप से प्रभावित करने के लिए जाना जाता उम्र बढ़ने की पहचान में से एक है. सेल संस्कृति में विशेष रूप से सेनेसेंट कोशिकाओं को मारने में सक्षम दवाएं, जिसे सेनोलिटिक्स कहा जाता है, विवो में जीर्ण सेल बोझ को कम कर सकती है और स्वास्थ्य विस्तार कर सकती है। Senolytics के कई वर्गों HSP90 inhibitors सहित तारीख करने के लिए पहचान की गई है, Bcl-2 परिवार inhibitors, piperlongumine, एक FOXO4 निरोधात्मक पेप्टाइड और Dasatinib के संयोजन / बढ़ी हुई लाइसोसोमल पीएच पर एसए-जेड-गल का पता लगाना जीर्ण कोशिकाओं का पता लगाने के लिए सबसे अच्छा विशेषता मार्करों में से एक है। एक डीएनए intercalating Hoechst डाई का उपयोग कर कुल सेल संख्या के निर्धारण के साथ संयोजन में फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट सी12FDG का उपयोग कर senescence-associated -galactosidase (एसए-जेड-गल) गतिविधि के लाइव सेल माप एक डीएनए intercalating Hoechst डाई का उपयोग कर की संभावना को खोलता है सेनोथैरेपी दवाओं के लिए स्क्रीन जो या तो सेनेसेंट कोशिकाओं (सेनोलिटिक्स) की हत्या करके या एसए-जेड-गल और अन्य फीनोटाइप्स को दबाकर समग्र एसए-जेड-गल गतिविधि को कम करती है। एक उच्च सामग्री फ्लोरोसेंट छवि अधिग्रहण और विश्लेषण मंच का उपयोग एसए-जेड-गल, सेल आकारिकी और सेल नंबर पर प्रभाव के लिए दवा पुस्तकालयों के तेजी से, उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देता है।

Introduction

सेलुलर जीर्णता Leonard Hayflick और पॉल Moorhead, जो पता चला है कि सामान्य कोशिकाओं को संस्कृति1में proliferate करने के लिए एक सीमित क्षमता थी द्वारा पहली बार के लिए वर्णित किया गया था. पोषक तत्वों, वृद्धि कारकों और संपर्क अवरोध की कमी के बावजूद सेसेंट कोशिकाएंबढ़ने में विफल रहती हैं, लेकिन चयापचयी रूप से सक्रिय रहती हैं। इस घटना प्रतिकृति sensence के रूप में जाना जाता है और मुख्य रूप से telomere छोटा करने के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था, कम से कम मानव कोशिकाओं में3. आगे के अध्ययनों से पता चला है कि कोशिकाओं को भी अन्य उत्तेजनाओं के जवाब में जीर्णता से गुजरना करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है, इस तरह के oncogenic तनाव के रूप में (oncogene प्रेरित जीर्णता, OIS), डीएनए क्षति, साइटोटॉक्सिक दवाओं, या विकिरण (तनाव प्रेरित जीर्णता, एसआईएस)4 , 5 , 6. डीएनए क्षति के जवाब में, टेलोमेयर क्षरण सहित, कोशिकाएं या तो सेनेसिस, अनियंत्रित कोशिका वृद्धि शुरू करें, या यदि क्षति की मरम्मत नहीं की जा सकती तो एपोप्टोसिस से गुजरना। इस मामले में, कोशिका जीर्णता फायदेमंद लगती है क्योंकि यह ट्यूमर दमनकारी तरीके से कार्य करतीहै 2। इसके विपरीत, डीएनए क्षति सहित सेलुलर क्षति के संचय के कारण उम्र बढ़ने के साथ जीर्णता बढ़ जाती है। चूंकि जीर्ण कोशिकाओं साइटोकिन्स, मेटलोप्रोटीनेस और विकास कारकों को स्रावित कर सकती है, जिसे जीर्णता-संबद्ध स्रावी फीनोटाइप (एसएएसपी) कहा जाता है, सेलुलर सेनेसी और एसएएसपी में यह आयु-निर्भर वृद्धि ऊतक होमोस्टेसिस में योगदान देती है और बाद में उम्र बढ़ने. इसके अलावा, जीर्णता बोझ में इस उम्र पर निर्भर वृद्धि चयापचय रोगों, तनाव संवेदनशीलता,progeria सिंड्रोम, और बिगड़ा चिकित्सा 7,8 प्रेरित करने के लिए जाना जाता है और भाग में, कई उम्र से संबंधित के लिए जिम्मेदार है रोग, जैसे एथेरोस्क्लेरोसिस, ऑस्टियोआर्थराइटिस, मांसपेशियों के अध: पतन, अल्सर गठन, और अल्जाइमर रोग9,10,11,12,13. जीर्ण कोशिकाओं को समाप्त करने से ऊतक रोग को रोकने या उसमें विलंब करने में मदद मिल सकती है और स्वास्थ्य विस्तार14. यह ट्रांसजेनिक माउस मॉडल में दिखाया गया है14,15,16 के रूप में अच्छी तरह के रूप में senolytic दवाओं और दवा संयोजन है कि दोनों दवा स्क्रीनिंग प्रयासों और bioinformatic विश्लेषण के माध्यम से की खोज की थी का उपयोग करके विशेष रूप से जीर्ण कोशिकाओं में विशेष रूप से प्रेरित पथ17,18,19,20,21,22. अधिक इष्टतम senothethetic दवाओं की पहचान, और अधिक प्रभावी ढंग से senescent सेल बोझ को कम करने में सक्षम, स्वस्थ उम्र बढ़ने के लिए चिकित्सीय दृष्टिकोण के विकास में एक महत्वपूर्ण अगला कदम है.

सेन्सेन्ट कोशिकाएं संस्कृति और विवो दोनों में विशिष्ट लक्षणीय और आण्विक विशेषताएं दर्शाती हैं। ये जीर्णता मार्कर या तो कारण या जीर्णता प्रेरण या इन कोशिकाओं में आणविक परिवर्तन का प्रतिफल का परिणाम हो सकता है. तथापि, विशेष रूप से जीर्ण कोशिकाओं में कोई एकल मार्कर नहीं पाया जाता है। वर्तमान में, जीर्णता-संबद्ध -galactosidase (एसए-जेड-गल) का पता लगाने के सबसे अच्छा विशेषता और स्थापित एकल सेल आधारित तरीकों में से एक है इन विट्रो में और विवो में जीर्णता को मापने के लिए. एसए-जेड-गल पीएच 4 में एक इष्टतम एंजाइमी गतिविधि के साथ एक लाइसोमल हाइड्रोलेस है। पीएच 6 पर इसकी गतिविधि को मापना संभव है क्योंकि जीर्ण कोशिकाएं लाइसोसोमल गतिविधि23,24में वृद्धि दर्शाती हैं . जीवित कोशिकाओं के लिए, बढ़ी हुई लाइसोसोमल पीएच धानी एच+-ATPase अवरोध करनेवाला Bafilomycin A1 या एंडोसोमल अम्लअवरोधक्लोक्विन25,26के साथ lysomal क्षारीकरण द्वारा प्राप्त की है। 5-Dodecanoylaminofluorescein Di-जेड-डी-गैलैक्टोपाइरानोसाइड (सी12FDG) जीवित कोशिकाओं में सब्सट्रेट के रूप में प्रयोग किया जाता है क्योंकि यह अपने 12 कार्बन lipophilic moiety25के कारण कोशिकाओं में cleaved उत्पाद बरकरार रखता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि एसए-जेड-गल गतिविधि स्वयं जीर्ण कोशिकाओं में पहचाने गए किसी भी मार्ग से सीधे तौर पर जुड़ा हुआ नहीं है और यह जीर्णता को प्रेरित करने के लिए आवश्यक नहीं है। इस परख के साथ, जीर्ण कोशिकाओं विषम कोशिका आबादी और उम्र बढ़ने के ऊतकों में भी पहचाना जा सकता है, ऐसे बड़े व्यक्तियों से त्वचा बायोप्सी के रूप में. इसका उपयोग कोशिका जीर्णता और आयु 23 के बीच सहसंबंध को दिखाने के लिए भी किया गया है क्योंकि यह कई जीवों और स्थितियों में जीर्ण कोशिका का पता लगाने के लिए एक विश्वसनीय मार्करहै 27,28,29, 30| यहाँ, एक उच्च थ्रूपुट एसए-जेड-गल स्क्रीनिंग परख फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट सी12FDG पर आधारित प्राथमिक माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट्स (एमईएफ) का उपयोग कर मजबूत ऑक्सीडेटिव तनाव प्रेरित सेल सेनेसी का वर्णन किया गया है और इसके फायदे और नुकसान चर्चा कर रहे हैं. हालांकि इस परख विभिन्न प्रकार के सेल के साथ किया जा सकता है, Ercc1की कमी का उपयोग, डीएनए की मरम्मत बिगड़ा MEFs ऑक्सीडेटिव तनाव की स्थिति में जीर्णता के और अधिक तेजी से प्रेरण के लिए अनुमति देता है. चूहों में, डीएनए की मरम्मत endonuclease ERCC1-XPF की कम अभिव्यक्ति बिगड़ा डीएनए की मरम्मत का कारण बनता है, अंतर्जात डीएनए क्षति के त्वरित संचय, ऊंचा ROS, mitochondrial रोग, वृद्धि हुई जीर्ण सेल बोझ, स्टेम सेल समारोह की हानि और समय से पहले उम्र बढ़ने , प्राकृतिक उम्र के समान31,32. इसी प्रकार, Ercc1कमी MEFs संस्कृति17में और अधिक तेजी से जीर्णता से गुजरना . जीर्ण एमईएफ परख की एक महत्वपूर्ण विशेषता यह है कि प्रत्येक अच्छी तरह से जीर्ण और गैर संवेदनशील कोशिकाओं का एक मिश्रण है, जीर्ण सेल विशेष प्रभाव का स्पष्ट प्रदर्शन के लिए अनुमति देता है. हालांकि, हालांकि हम मानते हैं कि प्राथमिक कोशिकाओं में ऑक्सीडेटिव तनाव का उपयोग सेनेसेंटेंस प्रेरित करने के लिए अधिक शारीरिक है, इस परख भी सेल लाइनों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है जहां संवेदनशीलता एटोपोसाइड या विकिरण जैसे डीएनए हानिकारक एजेंटों के साथ प्रेरित किया जाता है।

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Protocol

पशु उपयोग Scripps फ्लोरिडा संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था.

1. जीर्ण murine भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट (एमईएफ) की पीढ़ी - 12-15 दिन

  1. जंगली प्रकार और Ercc1अलग -/- भ्रूण दिवस 13 (E13) में गर्भवती मादा चूहों से MEFs के रूप में पहले वर्णित33.
    नोट: सभी निम्नलिखित चरणों aseptic शर्तों के तहत एक ऊतक संस्कृति हुड में किया जाता है और बाँझ उपकरणों का उपयोग कर रहे हैं।
  2. भ्रूण के सिर को आंखों के ऊपर काटें।
  3. लाल ऊतक (दिल और जिगर) निकालें और यदि आवश्यक हो तो जीनोटाइपिंग के लिए उनका उपयोग करें।
  4. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1x गैर जरूरी एमिनो एसिड, पेनिसिलिन, और विकास माध्यम के रूप में streptomycin के साथ है Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) और हैम F10 के एक 1:1 मिश्रण के 500 एमएल तैयार करें, और विकास माध्यम के रूप में streptomycin और यह गर्म करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस प्रत्येक उपयोग से पहले मिनट के लिए. वृद्धि माध्यम को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. 10 मिनट के लिए 0.25% ट्रिप्सिन/EDTA के साथ भ्रूण के बाकी को इनक्यूबेट करें।
  6. भ्रूण को 1 मिमी के टुकड़ों में छोटा कर लें और ऊतक को कई बार ऊपर और नीचे पिपेट करें।
  7. 10 सेमी व्यास कोशिका संस्कृति प्लेट (पास 0) के अनुसार एक भ्रूण के 10 एमएल विकास माध्यम और प्लेट ऊतकों को जोड़ें।
  8. 37 डिग्री सेल्सियस, 3% हे2, 5% सीओ2पर कोशिकाओं की खेती करें।
    नोट: केवल MEF कोशिकाओं इन शर्तों के तहत गैर लेपित ऊतक संस्कृति प्लेटों को देते हैं.
  9. गैर संलग्न ऊतक और सेल टुकड़े को दूर करने के लिए मार्ग 0 में हर दिन मध्यम बदलें।
    नोट: भ्रूण के आकार और अलगाव की गुणवत्ता पर निर्भर करता है, सेल आमतौर पर 2 से 3 दिनों के बाद संगम तक पहुँचने.
  10. ट्रिप्सिनाइजेशन
    1. ध्यान से विकास के माध्यम को हटाने और 1x PBS दो बार के 10 एमएल के साथ कोशिकाओं को धोने.
    2. 10 सेमी व्यास प्लेटों में कोशिकाओं के लिए 0.025% trypsin/EDTA समाधान के 2 एमएल जोड़ें और 2-3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    3. यह सुनिश्चित करें कि सूक्ष्मदर्शी के नीचे कोशिकाओं का निरीक्षण करके कोशिकाओं को सतह से अलग किया जाता है।
    4. विकास माध्यम की एक ही राशि जोड़कर trypsin पाचन समाप्त.
    5. कोशिकाओं को 3 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर शंकु नली और अपकेंद्रित्र कोशिकाओं में स्थानांतरित करें और अधिनांत को त्याग दें।
    6. ताजा विकास माध्यम में ध्यान से कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें, कोशिकाओं की गणना करें और उन्हें अनुमानित सेल घनत्व पर नई प्लेटों में बीज दें।
  11. गैर-सेसेंट उप-कृषि विभाजन के लिए विभाजित कोशिकाओं 1:4 और 3% ओ2, 37 डिग्री सेल्सियस पर एक और मार्ग के लिए विस्तार करने के लिए अधिक कोशिकाओं उपज (पासेज 1).
    नोट: इस बिंदु पर कोशिकाओं या तो संस्कृति में बनाए रखा जा सकता है या बाद में तरल नाइट्रोजन में उपयोग के लिए संग्रहीत, cryovials में लगभग 1 लाख कोशिकाओं प्रत्येक युक्त. यह चरण भी एक पशु विश्लेषण से आ रही परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए विभिन्न जानवरों से कोशिकाओं का एक मिश्रित बैच उत्पन्न करने की संभावना प्रदान करता है.
  12. कोशिका संवेदन को प्रेरित करने के लिए, बीज विभाजन confluent कोशिकाओं मार्ग 1से 1:4 के अनुपात में और उन्हें 20% हे 2, 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर 3 दिनों के लिए इनक्यूबेट; ये संस्कृति की स्थिति ऑक्सीजन के लिए वायुमंडलीय हैं।
    नोट: परिवेशी ऑक्सीजन सांद्रता के तहत कोशिकाओं और ब्लास्टोसिस्टों की खेती विशेष रूपसे सेलुलर जीर्णता के मार्करों को ऊपर उठा सकती है जब डीएनए क्षति की मरम्मत 34 ,35,36खराब हो जाती है .
  13. 2 और मार्गों के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ.
  14. सेलुलर जीर्णता की निगरानी करने के लिए, एक उन्नत Coulter सेल काउंटर प्रणाली का उपयोग कर प्रत्येक trypsinization कदम के दौरान सेल व्यास और सेल की मात्रा में क्रमिक वृद्धि को मापने.
  15. समीकरण का उपयोग कर जनसंख्या दोहरीकरण (पीडी) के निर्धारण से सेल प्रसार में कमी का आकलन
    पीडीटी ] (t2-t1)/3.32 x (लॉग n2 - लॉग n1)
    नोट: जनसंख्या दोहरीकरण समय केवल गैर-सेंसेंट कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया गया था.
  16. जल्दी मार्ग जंगली प्रकार या Ercc1का उपयोग करें-/- एमईएफ कोशिकाओं कि 3% ओ2, 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 गैर-सेसेंट नियंत्रण कोशिकाओं के रूप में रखा गया था।

2. सेन्सेंट संबद्ध जेड-गल स्क्रीनिंग परख - 2-3 दिन

  1. सभी दवाओं के DMSO में 10 एम एम स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए परीक्षण किया जा करने के लिए और -80 डिग्री सेल्सियस पर alicots स्टोर. स्टॉक समाधानको फ्रीज न करें क्योंकि इससे दवाओं की गतिविधि कम हो सकती है।
    नोट: यहाँ, HSP90 अवरोध करनेवाला 17DMAG विशेष रूप से जीर्ण कोशिकाओं17 की हत्या करने में सक्षम एक senolytic दवा के रूप में इस्तेमाल किया गया था.
  2. प्रयोग के दिन एलिकोट को थपथपाएं, नई संस्कृति माध्यम में दवाओं को पतला करें और 1:1 अनुपात में वातानुकूलित माध्यम वाली कोशिकाओं को जोड़ें ताकि विकास माध्यम में अंतिम एकाग्रता प्राप्त हो सके।
  3. सीरियल कमजोर पड़ने और दवा संयोजन के लिए 96-अच्छी तरह से पूर्व-डिल्यूशन प्लेटों का उपयोग करें।
    नोट: MEF कोशिकाओं के लिए, यह अनुभवजन्य निर्धारित किया गया था कि DMSO सांद्रता से अधिक नहीं होना चाहिए 2% और नियंत्रण कोशिकाओं उच्चतम DMSO सांद्रता के साथ इलाज किया प्रत्येक रन में शामिल किया जाना चाहिए.
  4. बीज 5 x 103 सेन्सेंट कोशिकाओं या 3 x 103 गैर-सेसेंट कोशिकाओं 96 अच्छी तरह से प्लेटों में प्रति अच्छी तरह से कम से कम 6 एच वृद्धि माध्यम के 100 $L में उपचार से पहले और 20% हे2पर इनक्यूबेट , 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2.
    नोट: कोशिकाओं के बारे में होना चाहिए 80% उपचार से पहले confluent|
  5. फ्लोरोसेंट संकेत crosstalk और पृष्ठभूमि को कम करने के लिए काले दीवार / स्पष्ट नीचे ऊतक संस्कृति, इलाज 96 अच्छी तरह से प्लेटों का प्रयोग करें।
    नोट: हालांकि, स्पष्ट प्लेटें भी सफलतापूर्वक परीक्षण किया गया है.
  6. एमईएफ कोशिकाओं में दवा कमजोर पड़ने जोड़ें और 20% ओ2के तहत 48 एच के लिए 24 एच के लिए इनक्यूबेट करें, 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 शर्तों।
  7. 3% ओ 2, 37डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 शर्तों के तहत गैर-सेसेंट कोशिकाओं रखें।
  8. लाइसोसोमल क्षारीयीकरण के लिए, एक 10 एमएम बाफिलोमाइसिन ए1 समाधान, एलिकोट तैयार करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए रखें।
  9. SA-जेड-गल गतिविधि के फ्लोरोसेंट विश्लेषण के लिए, 2 एम एम सी12एफडीजी स्टॉक समाधान तैयार करें, -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें, और प्रकाश से बचाएं।
  10. कार्य समाधान के लिए, प्रयोग के दिन विकास माध्यम में 100 डिग्री सेल्सियस सी12एफडीजी तैयार कीजिए।
    नोट: सी12FDG शामिल सभी (इनक्यूबेशन) कदम अंधेरे में किया जाना चाहिए.
  11. दवा समाधान निकालें और कोशिकाओं को धोने 11x पीबीएस के 100 डिग्री सेल्सियस के साथ समय.
  12. एक 100 एन एम bafilomycin A1 समाधान के 90 $L के साथ कोशिकाओं pretreating द्वारा lysomal क्षारीयकरण को प्रेरित 20% ओ2पर 1 घंटे के लिए ताजा सेल संस्कृति माध्यम में तैयार , 37 डिग्री सेल्सियस , 5% सीओ2.
  13. संस्कृति माध्यम (अंतिम सांद्रता 10 डिग्री सेल्सियस) के लिए 100 डिग्री एम सी12एफडीजी कार्य समाधान के 10 डिग्री एल जोड़ें।
  14. 2 ज के लिए इनक्यूबेट कोशिकाओं।
  15. एक 100 डिग्री/एमएल Hoechst 33342 डाई (अंतिम एकाग्रता 2 g/mL) की 2 $L जोड़ें संस्कृति और 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट.
  16. मीडिया निकालें और ताजा विकास माध्यम के 100 $L जोड़ें.

3. मात्रात्मक उच्च सामग्री फ्लोरोसेंट छवि विश्लेषण

  1. Hoechst और C12FDG फ्लोरोसेंट (उदाहरण के लिए, DAPI और FITC चैनल presets, क्रमशः) पर कब्जा करने के लिए उपयुक्त दो चैनलों में कोशिकाओं की फ्लोरोसेंट छवियों को प्राप्त करने के लिए एक उच्च सामग्री फ्लोरोसेंट छवि अधिग्रहण और विश्लेषण मंच का उपयोग करें।
    नोट: प्राप्ति प्रोटोकॉल परख के लिए विशिष्ट हैं जो कई चर की परिभाषा की आवश्यकता होती है। एक अधिग्रहण प्रोटोकॉल का उद्देश्य डाउनस्ट्रीम मात्रात्मक विश्लेषण के लिए कोशिकाओं की पर्याप्त संख्या में इन-फोकस फ्लोरोसेंट छवियों की पर्याप्त संख्या पर कब्जा करना है।
  2. प्रत्येक चैनल का चयन करके और परिभाषित करके एक उपयुक्त विश्लेषण प्रोटोकॉल का विकास, एक या एक से अधिक चयनात्मक मानदंडों का समायोजन करके, क्या प्रत्येक चैनल में ब्याज की एक सुविधा के रूप में उत्तीर्ण.
    1. नाभिक के लिए, तो विभाजन पूर्व सेट (उदाहरण के लिए, परमाणु विभाजन, vesicle विभाजन, कोशिका द्रव्य विभाजन) कि आकृति विज्ञान, आकार, और संकेत सहित कई मानदंडों के आधार पर सेलुलर organelles की पहचान की अनुमति देगा का उपयोग करें तीव्रता. परमाणु टुकड़े और मलबे जो एक संकेत हो सकता है को छोड़कर नाभिक शामिल करने के लिए इन मानदंडों को समायोजित करें, लेकिन जो कर रहे हैं, उदाहरण के लिए, बहुत बड़ा या बहुत छोटा करने के लिए नाभिक.
    2. FITC चैनल में संकेत की जाँच करें जो c12FDG से फ्लोरोसेंट है और कोशिकाओं में जीर्णता-संबद्ध - galactosidase गतिविधि की मात्रा का प्रतिनिधित्व करता है.
      नोट: सेन्ससेंट कोशिकाओं में गैर-सेसेंट कोशिकाओं की तुलना में उच्च जीर्ण-सेंसेंस-संबद्ध -गैलाक्टोसिडेज गतिविधि होती है; तथापि, C12FDG फ्लोरोसेंट गैर-असतत और निरंतर होगा, जो सी12एफडीजी-पॉजिटिव और सी12एफडीजी-नकारात्मक सेल माना जाता है के बीच एक सीमा की स्थापना की आवश्यकता है।
    3. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध विश्लेषणात्मक सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, उन उदाहरणों की गणना जेनरेट करें जिनमें नाभिक (एक अनुमानित सेल) के आस-पास का एक परिभाषित क्षेत्र, उपर्युक्त थ्रेसहोल्ड C12FDG के साथ कम से कम एक बार ओवरलैप हो गया है.
      नोट: विश्लेषणात्मक सॉफ़्टवेयर स्वचालित रूप से लक्ष्य लिंकिंग का उपयोग कर एक गिनती जनरेट करता है। यह एक sencent, सी12FDG सकारात्मक सेल की परख व्यावहारिक परिभाषा है.
  3. प्रति अच्छी तरह से 3-5 क्षेत्रों के साथ triplicate में सभी नमूनों का विश्लेषण करें और मतलब मूल्यों और मानक विचलन तदनुसार गणना की जा रही है।
  4. निम्न सूत्र का उपयोग करके जीर्ण कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना करें:
    सेन्सर सेल (%) ] Equation 1 x 100

4. परख सत्यापन मापदंडों

  1. सभी नमूनों के लिए अंतर- और अंतर-assay भिन्नता के गुणांक (%CVs) निम्न सूत्र का उपयोग कर गणना की गई:
    अंतर-आस्से सीवी (n $ 10 एक Equation 2 प्रयोग में मापा दोहराता है) $ x 100 (%)
    अंतर-आस्से सीवी (n ] Equation 2 5 स्वतंत्र प्रयोग) ] x 100 (%)
  2. स्क्रीनिंग प्रयोजनों के लिए, $' मान निर्धारित, एक सांख्यिकीय पैरामीटर एक परख की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए, 200 nM rapamycin के साथ इलाज कोशिकाओं से 24 एच पर 20% हे2, 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 (सेनोथैरेपी दवाओं के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण) और अनुपचारित जीर्ण कोशिकाओं (ऋणात्मक नियंत्रण).
    नोट: $' मूल्य की गणना झांग एट अल37के अनुसार की गई थी। 0.5 और 1 के बीच 'मूल्यों से संकेत मिलता है कि एक परख दवा स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Representative Results

एसए-जेड-गल गतिविधि का पता उन कोशिकाओं में लगाया जा सकता है जो प्रतिकृति थकावट, जीनोटॉक्सिक और ऑक्सीडेटिव तनाव से लेकर ऑनकोजीन सक्रियण23,25,38से विभिन्न तरीकों से सेसेनेस करने के लिए प्रेरित होती हैं। Ercc1कमी माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं का उपयोग कर वर्तमान मॉडल में, normoxic विकास की स्थिति (20% हे2) उन्हें कुछ मार्ग के लिए खेती के बाद सेल जीर्णता प्रेरित करने के लिए पर्याप्त थे. जंगली प्रकार एमईएफ भी जीर्णता से गुजरना है लेकिन 20% हे2पर अतिरिक्त मार्ग की आवश्यकता है . चित्र ाााला 1 Ercc1- कमी वाले माउस भ्रूणों से प्राथमिक एमईएफ कोशिकाओं के पृथक्काल के साथ शुरू होने वाली स्क्रीनिंग परख के कार्यप्रवाह को दर्शाता है, ऑक्सीडेटिव स्ट्रेबल द्वारा सेल जीर्णता को शामिल करने के लिए, और अंत में सूक्ष्म डेटा के विश्लेषण के लिए एक उच्च सामग्री फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ प्राप्त की. चित्र 2 एमईएफ सेल संस्कृतियों के प्रतिनिधि छवियों को दिखाता है जिसमें गैर-सेसेंट (युवा) कोशिकाएं (चित्र2, बाएं), मार्ग 5 में लगभग 50% सेन्सेंट कोशिकाएं (चित्र 2, केंद्र), और सेनेसेंट कोशिकाओं को एक सेनोलिटिक दवा के साथ इलाज किया जाता है ( चित्र 2, ठीक है). चित्र 3क, स्वत: के लिए प्रतिनिधि छवियों को दर्शाता है, सॉफ्टवेयर से संवेदनशील कोशिकाओं के मात्रात्मक विश्लेषण उत्पन्न. चित्रा 3B bafilomycin-A द्वारा पृष्ठभूमि के उन्मूलन को दर्शाता है - galactosidase गतिविधि. चित्र 4 सेन्ससेंट सेल संस्कृतियों के संभावित परिणामों को दिखाता है, जिनमें सेन्ससेंट सेल हत्या (सेनोलिटिक) और सेनेसेंसेंस मॉडुलन (सेनोमॉर्फिक) दवाएं शामिल हैं, जैसा कि फुहरमन-स्ट्रोइसिगगएट अल में वर्णित है। 17.

Figure 1
चित्र 1. स्क्रीनिंग परख और समय के Schematic सिंहावलोकन. एमईएफ कोशिकाओं गर्भवती चूहों से अलग कर रहे हैं और सेल संस्कृति पर डाल कुछ दिनों के लिए प्लास्टिक प्लेटों का इलाज का विस्तार करने के लिए. प्रारंभिक मार्ग कोशिकाओं तरल नाइट्रोजन में जमे हुए किया जा सकता है और एक बाद में समय बिंदु पर स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. कोशिका जीर्णता 20% O2 पर पारित होने से ऑक्सीडेटिव तनाव द्वारा प्रेरित है और कोशिकाओं को दवाओं के संपर्क में हैं एक बार वे एक मजबूत sencent राज्य तक पहुँच चुके हैं. कुल राशि और शेष sencent कोशिकाओं सहित डेटा विश्लेषण किया जाता है. समयरेखा, दिनों में, एक प्रयोग की अवधि को इंगित करती है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2. गैर-सेसेंट, जीर्ण और जीर्ण कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवियाँ senolytic दवा 17DMAG के 100 एनएम के साथ इलाज किया. ब्लू फ्लोरोसेंट Hoechst 33324 के साथ डीएनए धुंधला इंगित करता है, जबकि हरी फ्लोरोसेंट सी12FDG के साथ एसए-जेड-गल दाग इंगित करता है। उज्ज्वल हरे दाग एसए-जेड-गल सकारात्मक जीर्ण कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि मंद धुंधला एसए-जेड-गल कम या नकारात्मक, गैर-सेसेंट कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया ध्यान दें कि जीर्ण कोशिकाओं आमतौर पर बड़ा सेल आकार है और चपटा कर रहे हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3. एक संवेदनशील MEF सेल संस्कृति के प्रतिनिधि छवियाँ वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण किया. (ए) एसए-जेड-गल धनात्मक कोशिकाओं (एसए-जेड-गल+) कोशिकाओं को हरे (हरे तीर), एसए-जेड-गल नकारात्मक (एसए-जेड-गल-) में रेखांकित किया जाता है। बाएँ और दाएँ पैनल क्रमशः परमाणु (Hoechst) और सी12FDG (FITC) संकेत दिखाते हैं. केवल क्षेत्रों है कि Hoechst के लिए सकारात्मक दाग (एक नाभिक होते हैं) कोशिकाओं के रूप में माना जाता है. (बी) बाफिलोमाइसिन-ए इलाज और अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना। अवशिष्ट ®-galactosidase गतिविधि सभी कोशिकाओं में मौजूद lysosomal अम्लीकरण द्वारा कम है कृपया इस आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4. दवा उपचार के संभावित परिणामों की योजना। दवाओं को मारने सेसेंट कोशिकाओं (senolytics) सहित sencent और गैर संवेदनशील कोशिकाओं पर अलग अलग प्रभाव हो सकता है या एसए-जेड-गल सेनेसेंट phenotype (senmorphics) को दबाने. एक साथ इन दोनों वर्गों को सेनोथैरेपी कहा जाता है। यह आंकड़ा Fuhrmann-Stroissnig एट अल से संशोधित किया गयाहै. 17इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

एसए-जेड-गल मूल रूप से Dimri एट अल द्वारा की खोज की सेलुलर senscence के लिए एक अच्छी तरह से परिभाषित biomarker है. (1995) यह दर्शाता है कि जीर्ण मानव फाइब्रोब्लास्ट्स ने एसए-जेड-गल की गतिविधि में वृद्धि की है जब पीएच 623 पर परख की गई थी, जबकि कोशिकाओं में वृद्धि हुई है। इस बीच, इन विट्रो में और एसए-जेड-गल के लिए विवो परख में विभिन्न सेल प्रकारों और ऊतकों के लिए स्थापित किया गया है25,39,40. इस प्रोटोकॉल में वर्णित लाइव कोशिकाओं में एसए-जेड-गल को मापने के लिए फ्लोरोसेंट आधारित एकल-सेल विधि सेल सेनेसी17को प्रभावित करने वाली दवाओं के लिए एक उत्कृष्ट प्राथमिक स्क्रीनिंग उपकरण है। हालांकि, हालांकि एसए-जेड-गल sencent सेल का पता लगाने के लिए सबसे सुविधाजनक मार्करों में से एक के रूप में माना जाता है, सेल चक्र नियामकों p16Ink4A और p2141का पता लगाने की तरह सेलुलर जीर्णता के लिए अतिरिक्त मार्करों, senscence जुड़े secretory phenotype (SASP) IL-6, TNF], HMGB1and NF-[B42, डीएनए क्षति मरम्मत मार्करों की तरह $H2Ax और telomere जुड़े डीएनए क्षति foci (TAFs)43,44, senscence जुड़े हेटेरोक्रोमेटिन foci ( एसएएचएफ) 45या कोशिका आकार और दानेदारता जैसे बुनियादी रूपात्मक मार्करों को पुष्टित्मक परख के रूप में लागू करने की आवश्यकता है ताकि दवाओं की सेनोथैरेपी क्षमता को सुनिश्चित किया जासके. चूंकि एक sencent सेल में एक सामान्य सेल से संक्रमण एक धीमी प्रक्रिया है, इस विधि में महत्वपूर्ण कदम सीमा है कि सी12FDG सकारात्मक (संवेदनशील) और नकारात्मक (सामान्य) कोशिकाओं के बीच भेद खोजने के लिए है. यह प्रत्येक सेल प्रकार के लिए अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना है और सी12FDG सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण प्रत्येक प्रयोग में शामिल किया जाना है.

ऑक्सीडेटिव-तनावग्रस्त Ercc1के अलावा- /- MEFs, इस विधि अन्य अनुयायी सेल प्रकार के लिए संशोधित किया जा सकता है. ऑक्सीडेटिव-तनावग्रस्त Ercc1-कम मेसेन्काइमल स्टेम सेल (एमएससी) और एटोपोसाइड-उपचारित मानव IMR90 कोशिकाओं का पहले से ही परख में सफलतापूर्वक परीक्षण किया गया था और दवाओं के लिए स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता17. हालांकि, समय के रूप में अच्छी तरह से दवा उपचार बार और सांद्रता के रूप में अच्छी तरह से प्रेरित करने के लिए भिन्न हो सकते हैं.

इस तकनीक की प्रमुख सीमा यह है कि एसए-जेड-गल गतिविधि कुछ संवेदनशील-स्वतंत्र परिस्थितियों में इस तरह के सेल संपर्क अवरोध या उच्च सेलुलर संगम46,47में वृद्धि हुई है। "सेल के ढेर" और अधिक confluent कोशिकाओं के साथ सेल संस्कृतियों युक्त क्षेत्रों को आसानी से निर्धारित किया जा सकता है और विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए. इसके अलावा, हरी ऑटो फ्लोरोसेंट lipofuscsin vesicles से पृष्ठभूमि धुंधला जीर्ण कोशिकाओं में वृद्धि हो सकती है. संवेदनशील एमईएफ कोशिकाओं की संस्कृतियों में सी12एफडीजी की चमक के कारण वे नगण्य होते हैं लेकिन प्रत्येक कोशिका प्रकार46के लिए जांच की जानी चाहिए . डीएनए के Hoechst धुंधला आमतौर पर पृष्ठभूमि धुंधला करने के लिए नेतृत्व नहीं करता है. कुछ फीनोल अंगूठी दवाओं युक्त, तथापि, यूवी प्रकाश में फ्लोरोसेंट हो सकता है. वास्तविक सेल नाभिक के आकार तक यूवी सकारात्मक फ्लोरोसेंट संकेत के बहिष्करण आकार में वृद्धि इन दवाओं के अवांछित पता लगाने को रोकने में मदद कर सकती है।

वर्णित परख की सबसे महत्वपूर्ण विशेषता यह है कि जीर्ण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से गैर-सेसेंट कोशिकाओं को एक ही वातावरण में पाए जाते हैं, एक साथ जीर्ण और गैर संवेदनशील कोशिकाओं पर दवा प्रभाव के आकलन के लिए अनुमति देता है. सेल नाभिकों की गणना करके कुल सेल संख्या का पता लगाने से एक दवा की कोशिका हत्या क्षमता के बारे में पहला संकेत मिलता है। सेल संख्या ओंकार में गिरावट और सेल जीर्णता आमतौर पर सेनोलिटिक दवाओं को संकेत देती है जबकि सेनेसेंट कोशिकाओं की कम संख्या के साथ एक निरंतर कोशिका संख्या आमतौर पर सेनोमॉर्फिक दवाओं को इंगित करती है। कम दवा ऊष्मायन समय के कारण, गैर-सेसेंट कोशिकाओं के एक साथ प्रसार और जीर्ण कोशिकाओं की कोशिका मृत्यु जैसे प्रभाव जो निरंतर सेल संख्या (जैसे, सेनोलिटिक परिणाम के साथ सेनोलिटिक प्रभाव) से इनकार नहीं किया जा सकता है लेकिन अत्यधिक माना जाता है अप्रत्याशित.

इस तकनीक के भविष्य के अनुप्रयोगों अतिरिक्त लाइव सेल मार्करों को एकीकृत करने की संभावना शामिल (जैसे, Apoptosis मार्कर की तरह AnnexinV और 7AAD40) या mitochondria या lysosomes जैसे विभिन्न intracellular डिब्बों के लिए मार्कर में परख प्रणाली. दवा उपचार के दौरान एसए-जेड-गल और अन्य सेलुलर मार्करों की संगत निगरानी अंतर्निहित सेलुलर तंत्र को स्पष्ट करने में मदद कर सकती है।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह काम NIH अनुदान AG043376 (परियोजना 2 और कोर ए, पीडीआर द्वारा समर्थित किया गया था; परियोजना 1 और कोर बी, LJN) और AG056278 (परियोजना 3 और कोर ए, पीडीआर; और परियोजना 2, LJN) और ग्लेन फाउंडेशन (LJN) से एक अनुदान.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM  Corning 10-013-CV medium
Ham's F10 Gibco 12390-035 medium
fetal bovine serum Tissue Culture Biologics 101 serum
1x non-essential amino acids Corning 25-025-Cl amino-acids
bafilomycin A1  Sigma B1793 lysosomal inhibitor
C12FDG Setareh Biotech 7188 b-Gal substrate
Hoechst 33342  Life Technologies H1399 DNA intercalation agent
17DMAG Selleck Chemical LLC 50843 HSP90 inhibitor
InCell6000 Cell Imaging System GE Healthcare High Content Imaging System

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References

  1. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
  2. Campisi, J., di Fagagna, F. D. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).
  3. Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature. 345 (6274), 458-460 (1990).
  4. Zhu, J., Woods, D., McMahon, M., Bishop, J. M. Senescence of human fibroblasts induced by oncogenic Raf. Genes and Development. 12 (19), 2997-3007 (1998).
  5. Dimri, G. P., Itahana, K., Acosta, M., Campisi, J. Regulation of a senescence checkpoint response by the E2F1 transcription factor and p14(ARF) tumor suppressor. Molecular and Cellular Biology. 20 (1), 273-285 (2000).
  6. Michaloglou, C., et al. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi. Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).
  7. Niedernhofer, L. J. Tissue-specific accelerated aging in nucleotide excision repair deficiency. Mechanisms of Ageing and Development. 129 (78), 408-415 (2008).
  8. Gitenay, D., et al. Glucose metabolism and hexosamine pathway regulate oncogene-induced senescence. Cell Death & Disease. 5, e1089 (2014).
  9. Erusalimsky, J. D., Kurz, D. J. Cellular senescence in vivo: its relevance in ageing and cardiovascular disease. Experimental Gerontology. 40 (8-9), 634-642 (2005).
  10. Kassem, M., Marie, P. J. Senescence-associated intrinsic mechanisms of osteoblast dysfunctions. Aging Cell. 10 (2), 191-197 (2011).
  11. Campisi, J., Andersen, J. K., Kapahi, P., Melov, S. Cellular senescence: A link between cancer and age-related degenerative disease. Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 354-359 (2011).
  12. Golde, T. E., Miller, V. M. Proteinopathy-induced neuronal senescence: a hypothesis for brain failure in Alzheimer's and other neurodegenerative diseases. Alzheimers Research & Therapy. 1 (2), 5 (2009).
  13. Telgenhoff, D., Shroot, B. Cellular senescence mechanisms in chronic wound healing. Cell Death & Differentiation. 12 (7), 695-698 (2005).
  14. Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
  15. Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. , (2016).
  16. Childs, B. G., et al. Senescent intimal foam cells are deleterious at all stages of atherosclerosis. Science. 354 (6311), 472-477 (2016).
  17. Fuhrmann-Stroissnigg, H., et al. Identification of HSP90 inhibitors as a novel class of senolytics. Nature Communications. 8 (1), 422 (2017).
  18. Zhu, Y., et al. New agents that target senescent cells: the flavone, fisetin, and the BCL-XL inhibitors, A1331852 and A1155463. Aging. 9 (3), Albany NY. 955-963 (2017).
  19. Zhu, Y., et al. Identification of a Novel Senolytic Agent, Navitoclax, Targeting the Bcl-2 Family of Anti-Apoptotic Factors. Aging Cell. , (2015).
  20. Zhu, Y., et al. The Achilles' heel of senescent cells: from transcriptome to senolytic drugs. Aging Cell. , (2015).
  21. Baar, M. P., et al. Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Homeostasis in Response to Chemotoxicity and Aging. Cell. 169 (1), 132-147 (2017).
  22. Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature. , (2017).
  23. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  24. Itahana, K., Campisi, J., Dimri, G. P. Methods to detect biomarkers of cellular senescence: the senescence-associated beta-galactosidase assay. Methods in Molecular Biology. 371, 21-31 (2007).
  25. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-[beta]gal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
  26. Cahu, J., Sola, B. A sensitive method to quantify senescent cancer cells. Journal of Visualized Experiments. 78 (78), (2013).
  27. Collado, M., et al. Tumour biology: Senescence in premalignant tumours. Nature. 436 (7051), 642 (2005).
  28. Krishnamurthy, J., et al. Ink4a/Arf expression is a biomarker of aging. The Journal of Clinical Investigation. 114 (9), 1299-1307 (2004).
  29. Mishima, K., et al. Senescence-associated beta-galactosidase histochemistry for the primate eye. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 40 (7), 1590-1593 (1999).
  30. Melk, A., et al. Expression of p16INK4a and other cell cycle regulator and senescence associated genes in aging human kidney. Kidney International. 65 (2), 510-520 (2004).
  31. Niedernhofer, L. J., et al. A new progeroid syndrome reveals that genotoxic stress suppresses the somatotroph axis. Nature. 444 (7122), 1038-1043 (2006).
  32. Wang, J., Clauson, C. L., Robbins, P. D., Niedernhofer, L. J., Wang, Y. The oxidative DNA lesions 8,5′-cyclopurines accumulate with aging in a tissue-specific manner. Aging Cell. 11 (4), 714-716 (2012).
  33. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (64), (2012).
  34. Jagannathan, L., Cuddapah, S., Costa, M. Oxidative stress under ambient and physiological oxygen tension in tissue culture. Current Pharmacology Reports. 2 (2), 64-72 (2016).
  35. Meuter, A., et al. Markers of cellular senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro: molecular consequences of culture in atmospheric oxygen. J Assist Reprod Genet. 31 (10), 1259-1267 (2014).
  36. Robinson, A. R., et al. Spontaneous DNA damage to the nuclear genome promotes senescence, redox imbalance and aging. Redox Biology. 17, 259-273 (2018).
  37. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal Of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  38. Zhao, H., Darzynkiewicz, Z. Biomarkers of cell senescence assessed by imaging cytometry. Methods in Molecular Biology. 965, 83-92 (2013).
  39. Yang, N. -C., Hu, M. -L. A fluorimetric method using fluorescein di-β-d-galactopyranoside for quantifying the senescence-associated β-galactosidase activity in human foreskin fibroblast Hs68 cells. Analytical Biochemistry. 325 (2), 337-343 (2004).
  40. Zhao, J., et al. Quantitative Analysis of Cellular Senescence in Culture and In Vivo. Current Protocols in Cytometry. 79, (2017).
  41. Capparelli, C., et al. CDK inhibitors (p16/p19/p21) induce senescence and autophagy in cancer-associated fibroblasts, "fueling" tumor growth via paracrine interactions, without an increase in neo-angiogenesis. Cell Cycle. 11 (19), 3599-3610 (2012).
  42. Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annual Review of Pathology. 5, 99-118 (2010).
  43. Mah, L. J., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. GammaH2AX as a molecular marker of aging and disease. Epigenetics. 5 (2), 129-136 (2010).
  44. Hewitt, G., et al. Telomeres are favoured targets of a persistent DNA damage response in ageing and stress-induced senescence. Nature Communications. 3, 708 (2012).
  45. Narita, M., et al. Rb-mediated heterochromatin formation and silencing of E2F target genes during cellular senescence. Cell. 113 (6), 703-716 (2003).
  46. Georgakopoulou, E. A., et al. Specific lipofuscin staining as a novel biomarker to detect replicative and stress-induced senescence. A method applicable in cryo-preserved and archival tissues. Aging-Us. 5 (1), 37-50 (2013).
  47. Severino, J., Allen, R. G., Balin, S., Balin, A., Cristofalo, V. J. Is β-Galactosidase Staining a Marker of Senescence in Vitro and in Vivo? Experimental Cell Research. 257 (1), 162-171 (2000).

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