Summary
Клеточная чувствительность является ключевым фактором в развитии хронических возрастных патологий. Идентификация терапевтических средств, которые нацелены на старческие клетки, показывает перспективу для расширения здорового старения. Здесь мы представляем новый ассс для проверки для выявления сенотерапии на основе измерения сенесценции, связанной с активностью в одиночных клетках.
Abstract
Чувствительность клеток является одной из отличительных черт старения, как известно, негативно влияет на здоровую продолжительность жизни. Препараты, способные убивать старческие клетки специально в клеточной культуре, называют сенолитикой, могут уменьшить бремя старнейки клеток in vivo и расширить продолжительность жизни. На сегодняшний день выявлено несколько классов сенолитики, включая ингибиторы HSP90, ингибиторы семейства Bcl-2, пиперлонгумин, пептид ингибитор FOXO4 и сочетание дасатиниба/кверцетина. Обнаружение SA--з-Gal при повышенном лисосомальном рН является одним из наиболее характерных маркеров для обнаружения старческих клеток. Измерения живых клеток, связанных с сенесценцией, ассоциированной активностью (SA-q-Gal) с использованием флуоресцентного субстрата C12FDG в сочетании с определением общего числа клеток с помощью ДНК, интеркалирующей краситель Hoechst, открывает возможность экран для сенотерапевтических препаратов, которые либо уменьшают общую активность SA-и-Gal путем уничтожения старческих клеток (сенолитики) или путем подавления SA-и-Gal и других фенотипов старческих клеток (сеноморфики). Использование платформы для приобретения и анализа высокой содержания флуоресцентных изображений позволяет быстро, высокой пропускной проверки библиотек лекарственных средств для воздействия на SA-и-Gal, морфологию клеток и номер клеток.
Introduction
Сотовый сенесценции был описан в первый раз Леонард Хейфлик и Пол Мурхед, который показал, что нормальные клетки имели ограниченную способность размножаться в культуре1. Чувствительные клетки не размножаться, несмотря на наличие питательных веществ, факторы роста и отсутствие ингибирования контакта, но остаются метаболически активными2. Это явление известно как репликативное сенесценции и в основном связано с сокращением теломер, по крайней мере в клетках человека3. Дальнейшие исследования показали, что клетки также могут подвергаться сенесценции в ответ на другие стимулы, такие как онкогенный стресс (онкоген индуцированный сенесценции, ОИС), повреждение ДНК, цитотоксические препараты, или облучение (стресс индуцированного сенесценции, SIS)4 , 5 , 6. В ответ на повреждение ДНК, в том числе эрозии теломер, клетки либо senesce, начать неконтролируемый рост клеток, или пройти апоптоз, если повреждение не может быть восстановлена. В этом случае, ценение клеток, кажется, полезно, как он действует в опухоли подавляет образом2. В отличие от этого, сенесценция увеличивается со старением из-за накопления повреждения клеток, включая повреждение ДНК. Так как старческие клетки могут выделять цитокины, металлопротеины и факторы роста, называемые сенесценции связанных секреторный фенотип (SASP), это возрастно-зависимое увеличение клеточного сенесценции и SASP способствует снижению ткани гомеостаза и впоследствии старения. Кроме того, это возрастно-зависимое увеличение бремени старения, как известно, вызывают метаболические заболевания, чувствительность к стрессу, синдромы прогерии, и нарушение исцеления7,8 и, в частности, отвечает за многочисленные возрастные заболеваний, таких как атеросклероз, остеоартрит, мышечная дегенерация, образование язвы, и болезнь Альцгеймера9,10,11,12,13. Устранение старческих клеток может помочь предотвратить или отсрочить дисфункцию тканей и продлить healthspan14. Это было показано в трансгенных моделях мыши14,15,16, а также с помощью сеноличных препаратов и комбинаций лекарств, которые были обнаружены как с помощью усилий по скринингу наркотиков и биоинформатический анализ пути, индуцированные специально в старческих клетках17,18,19,20,21,22. Выявление более оптимальных сенотерапевтических препаратов, способных более эффективно снизить бремя старческих клеток, является важным следующим шагом в развитии терапевтических подходов к здоровому старению.
Чувствительные клетки имеют характерные фенотипические и молекулярные особенности, как в культуре, так и в vivo. Эти маркеры сенесценции могут быть либо причиной, либо результатом индукции сенесценции, либо побочным продуктом молекулярных изменений в этих клетках. Тем не менее, ни один маркер не найден конкретно в старческих клетках. В настоящее время, сенесценция связанных й-galactosidase (SA-я-Гал) обнаружение является одним из наиболее характерных и установленных одноклеточных методов для измерения сенесценции в пробирке и in vivo. СА-З-Гал – это лизосомальная гидролаза с оптимальной ферментативной активностью при рН 4. Измерение его активности при рН 6 возможно, потому что старческие клетки показывают повышенную лисосомальную активность23,24. Для живых клеток, увеличение лизосомального рН получается путем лизосомальной щелочной с вакуолярной H -ATPase ингибитор Bafilomycin A1 или эндосомальный ингибификатор подкисления хлорохин25,26. 5-Dodecanoylaminofluorescein Ди-з-D-galactopyranoside (C12FDG) используется в качестве субстрата в живых клетках, как он сохраняет расщепляние продукта в клетках из-за его 12 углеродных липофильных moiety25. Важно отметить, что сама деятельность SA-q-Gal не связана напрямую с каким-либо путем, выявленным в старческих клетках, и не является необходимой для того, чтобы вызвать сенесценцию. С помощью этого отзыва, старческие клетки могут быть определены даже в неоднородных популяций клеток и старения тканей, таких как биопсии кожи от пожилых людей. Он также был использован, чтобы показать корреляцию между старением клеток и старения23, как это надежный маркер для обнаружения старческих клеток в нескольких организмах и условиях27,28,29, 30. Здесь описывается скрининговый анализ с высокой пропускной результатом SA-'-Gal, основанный на флуоресцентном субстрате C12FDG с использованием первичных эмбриональных фибробластов мыши (MEFs) с надежно окислительным стрессом, индуцированным клеточным сенесценцией, и описаны его преимущества и недостатки обсуждаются. Хотя этот анализ может быть выполнен с различными типами клеток, использование Ercc1-дефицит,ремонт ДНК нарушения MEFs позволяет более быстроиндукции сенесценции в условиях окислительного стресса. У мышей снижение экспрессии эндонуклеи реаниализа ДНК ERCC1-XPF вызывает нарушение репарации ДНК, ускоренное накопление эндогенных повреждений ДНК, повышенную ROS, митохондриальную дисфункцию, повышенную старческой клеточной нагрузки, потерю функции стволовых клеток и преждевременное старение, аналогично естественному старению31,32. Аналогичным образом, Ercc1-дефицитныеMEFs проходят сенесценцию быстрее в культуре17. Важной особенностью старческого игпромата meF является то, что каждая скважина имеет смесь старческих и нестареческих клеток, что позволяет четко проявлять старческие клеточные эффекты. Однако, хотя мы считаем, что использование окислительного стресса в первичных клетках, чтобы вызвать сенесценцию является более физиологическим, этот анализ также может быть использован с клеточными линиями, где сенесценция индуцируется с ДНК повреждающих агентов, таких как этопозид или облучение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Использование животных было одобрено Комитетом по институциональному уходу и использованию животных ВАЗа, штат Флорида.
1. Поколение стареющее морин эмбрионального фибробласта (MEF) - 12-15 дней
- Изолировать дикий тип и Ercc1-/- MEFs от беременных самок мышей в эмбриональный день 13 (E13), как описано ранее33.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все следующие шаги выполняются в капюшоне культуры тканей в асептических условиях и с использованием стерильных инструментов. - Рассекать голову эмбриона над глазами.
- Удалите красную ткань (сердце и печень) и использовать их для генотипирования, если это необходимо.
- Подготовка 500 мл 1:1 смесь Dulbecco в модифицированных Eagle's Medium (DMEM) и F10 ветчины с 10% плода бычьей сыворотки, 1x несущественные аминокислоты, пенициллин, и стрептомицин в качестве среднего роста и тепло его до 37 градусов по Цельсию в течение 15 минут перед каждым использованием. Храните среднюю среду роста при 4 градусах По Цельсию.
- Инкубировать остальную часть эмбриона с 0,25% трипсин / ЭДТА в течение 10 мин.
- Размять эмбрион на 1 мм и пипетку ткани вверх и вниз несколько раз.
- Добавьте 10 мл роста средних и люплтканей одного эмбриона на 10 см диаметром клеточной плиты (проход 0).
- Культивировать клетки при 37градусах Цельсия, 3% O 2, 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Только клетки MEF прикрепляются к непокрытым пластинам культуры тканей в этих условиях. - Изменение среды каждый день в проходе 0, чтобы удалить неприсоединения ткани и фрагменты клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от размера эмбриона и качества изоляции, клетка обычно достигает стоек через 2 -3 дня. - Трипсинизация
- Тщательно удалите средний рост и мыть клетки с 10 мл 1x PBS два раза.
- Добавьте 2 мл раствора трипсина/ЭДТА в клетки диаметром 10 см и насигите при 37 градусах Цельсия в течение 2-3 мин.
- Убедитесь, что клетки отделяются от поверхности, осматривая клетки под микроскопом.
- Прекратите пищеварение трипсина, добавив такое же количество среды роста.
- Перенесите клетки в коническую трубку и центрифуги на 200 х г в течение 3 мин и отбросить супернатант.
- Тщательно отрежируйте клетки в свежей среде роста, подсчитайте клетки и семя их в новых пластинах при прогнозируемой плотности клеток.
- Для нестареющие субкультионации разделить клолюстрентных клеток 1:4 и продлить на другой проход на 3% O2, 37 градусов по Цельсию, чтобы дать больше клеток (проход 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент клетки могут быть либо сохранены в культуре или хранятся для последующего использования в жидком азоте, в криовиалах, содержащих около 1 миллиона клеток каждая. Этот шаг также предлагает возможность для создания смешанной партии клеток из разных животных, чтобы уменьшить изменчивость, поступающую от одного анализа животных. - Чтобы вызвать сенесценцию клеток, семена расщепляли сопливые клетки изпрохода 1 в соотношении 1:4 и инкубировать их при 20% O 2, 37 кв.с, 5% CO2 в течение 3 дней; эти условия культуры атмосферны для кислорода.
ПРИМЕЧАНИЕ: Культивирование клеток и бластоцисты хитростей в концентрациях окружающего кислорода может поднять маркеры клеточного сенесценции именно тогда, когда ремонт повреждений ДНК нарушается34,35,36. - Повторите эту процедуру еще для 2 проходов.
- Для мониторинга клеточного сенесценции, измерьте постепенное увеличение диаметра клеток и объема клеток во время каждого этапа трипсиизации с помощью передовой системы счетчика клеток Coulter.
- Оцените сокращение пролиферации клеток путем определения удвоения численности населения (PD) с помощью уравнения
PDT (t2-t1)/3.32 x (журнал n2 - журнал n1)
ПРИМЕЧАНИЕ: Время удвоения населения использовалось только для нестареческих клеток. - Используйте ранний проход дикого типа или Ercc1-/- MEF клетки, которые были сохранены на 3% O2, 37 КК, 5% CO2 в качестве не-старческих контрольных клеток.
2. Сенесцентный ассоциированный скрининг-анализ - 2-3 дня
- Подготовьте 10 мМ фондовых растворов в DMSO всех препаратов для тестирования и хранения aliquots при -80 градусах Цельсия. Не замораживайте-оттепельные фондовые растворы, так как это может снизить активность препаратов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь ингибитор HSP90 17DMAG был использован в качестве сенолитической наркотиков, способного специально убивать старческие клетки17. - В день эксперимента оттаивает аликот, разбавляют препараты в свежей культуре и добавляют в клетки, содержащие обусловленную среду в соотношении 1:1, чтобы дать окончательную концентрацию в среде роста.
- Используйте 96-ну хорошо предварительно разбавлять пластины для серийных разбавления и лекарственных комбинаций.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для клеток MEF было эмпирически установлено, что концентрации ДМСО не должны превышать 2%, а контрольные клетки, обработанные с наивысшими используемыми концентрациями ДМСО, должны быть включены в каждый запуск. - Семена 5 х 103 старческих клеток или 3 х 103 не-снесенных клеток на хорошо в 96 хорошо пластин по крайней мере 6 ч до лечения в 100 qL среды роста и инкубировать на 20% O2, 37 C, 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки должны быть около 80% сливочные долечения. - Используйте черную стену / очистить культуру нижней ткани, обработанные 96 хорошо пластин, чтобы свести к минимуму флуоресцентный сигнал перекрестный разговор и фон.
ПРИМЕЧАНИЕ: Однако, четкие пластины также были успешно протестированы. - Добавить разбавления препарата в клетки MEF и инкубировать в течение 24 ч до 48 ч под 20% O2, 37 КС, 5% CO2 условиях.
- Держите нестареяческие клеткипод 3% O 2, 37 КС, 5% CO2 условиях.
- Для лизосомальной алкалиализации приготовьте раствор бафиломицина A1 10 мМ, аликот и держите замороженным при -20 градусов по Цельсию.
- Для флуоресценции анализа активности SA-и-Gal подготовьте 2 мМ С12FDG, храните при -20 градусов по Цельсию и защитите от света.
- Для рабочего решения подготовьте 100 МКм C12FDG в среде роста в день эксперимента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все (инкубационные) шаги с участием C12FDG должны выполняться в темноте. - Удалить раствор препарата и мыть клетки 1 раз с 100 Зл л 1x PBS.
- Индуцировать лизосомальной алкалиизации путем предварительной обработки клеток с 90 зл 100 НМ бафиломицин A1 раствор, подготовленный в свежей среде клеточной культуры в течение 1 часа при 20% O2, 37 КК, 5% CO2.
- Добавьте 10 юл из 100 мкм C12FDG рабочего решения для культуры среды (окончательная концентрация 10 мкм).
- Инкубировать клетки на 2 ч.
- Добавьте в культуру 2 qL из 100 мкг/мл Hoechst 33342 красителя (окончательная концентрация 2 мкг/мл) и инкубировать в течение 20 мин.
- Удалите носители и добавьте 100 л свежей среды роста.
3. Количественный анализ флуоресцентных изображений высокого содержания
- Используйте платформу для приобретения и анализа флуоресцентных изображений с высоким содержанием для получения флуоресцентных изображений для получения флуоресцентных изображений в двух каналах, подходящих для захвата флуоресценции Hoechst и C12FDG (например, пресетов канала DAPI и FITC соответственно).
ПРИМЕЧАНИЕ: Протоколы приобретения требуют определения нескольких переменных, которые являются специфическими для ассеа. Целью протокола приобретения является захват достаточного количества флуоресцентных изображений в фокусе достаточного количества ячеек для количественного анализа ниже по течению. - Разработать соответствующий протокол анализа путем выбора каждого канала и определения, путем корректировки одного или нескольких избирательных критериев, что квалифицируется как интересующая интерес для каждого канала.
- Для ядра используйте так сегментации пред-наборы (например, ядерная сегментация, резконизация везикулы, сегментация цитоплазмы), что позволит идентифицировать клеточные органеллы на основе нескольких критериев, включая морфологию, размер и сигнал Интенсивность. Отрегулируйте эти критерии, чтобы включить ядра, исключив при этом ядерные фрагменты и обломки, которые могут иметь сигнал, но которые, например, слишком велики или слишком малы, чтобы быть ядрами.
- Проверьте сигнал в канале FITC, который является флуоресценцией от расщепляется C12FDG и представляет собой количество сенесценции связанных с й-galactosidase деятельности в клетках.
ПРИМЕЧАНИЕ: Senescent клетки имеют более высокую сенесценцию-связанные й-galactosidasae деятельности, чем не-стареющие клетки; однако флуоресценция C12FDG будет недискретной и непрерывной, что потребует установления порога между тем, что считается C12FDG-положительным и C12FDG-отрицательной ячейкой. - Используя коммерчески доступное аналитическое программное обеспечение, создается подсчет случаев, в которых определенный регион, окружающий ядро (предположительное ячейка), пересекался по крайней мере один раз с вышепороговым C12FDG.
ПРИМЕЧАНИЕ: Аналитическое программное обеспечение автоматически генерирует счет с помощью целевого увязки. Это практическое определение ассеа старческой, C12FDG-позитивной ячейки.
- Проанализируйте все образцы в тройном с 3-5 полями на скважину и средними значениями и стандартными отклонениями, рассчитываемыми соответствующим образом.
- Рассчитайте процент старческих клеток с помощью следующей формулы:
Сенесцентные клетки (%)
4. Параметры проверки
- Для всех выборок внутри- и межасберегающий коэффициент вариаций (%CVs) был рассчитан по следующей формуле:
Внутриазивное резюме (n no 10 повторов, измеренных в одном эксперименте) и
x 100 (%)
Межассадное резюме (n no 5 независимых экспериментов) х 100 (%) - Для целей скрининга, определить значение к, статистический параметр для оценки качества анализ, из клеток, обработанных с 200 нм рапамицин для 24 ч на 20% O2, 37 КС, 5% CO2 (положительный контроль для senotherapeutic препаратов) и необработанных старческие клетки (отрицательный контроль).
ПРИМЕЧАНИЕ: Значение кью было рассчитано в соответствии с Чжан и др.37. Значения от 0,5 до 1 указывают на то, что анализ может быть использован для скрининга на наркотики.
x 100 (%)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Активность SA---Gal может быть обнаружена в клетках, которые индуцируются к сенесу различными способами от репликативного истощения, генотоксического и окислительного стресса до активации онкогена23,25,38. В текущей модели с использованием Ercc1-дефицит мыши эмбриональных фибробластных клеток, нормоксические условия роста (20% O2) были достаточны, чтобы вызвать сенесценции клеток после выращивания их в течение нескольких проходов. Дикий тип MEFs также проходят сенесценции, но требуют дополнительных проходов на 20% O2. На рисунке 1 показан рабочий процесс скринингового анализа, начиная с изоляции первичных клеток MEF от эмбрионов Ercc1-дефицитной мыши, индукции клеточного сенесценции путем окислительного стресса, и, наконец, анализа микроскопических данных полученный с высоким содержанием флуоресцентного микроскопа. На рисунке 2 показаны репрезентативные изображения клеточных культур MEF, содержащих нестареческие (молодые) клетки (рисунок2, слева), около 50% старческих клеток в проходе 5(Рисунок 2, центр) и старческие клетки, обработанные сенолитическим препаратом ( Рисунок 2, справа). На рисунке 3A показаны репрезентативные изображения для автоматического, программного обеспечения, генерируемого количественным анализом старческих клеток. Рисунок 3B демонстрирует устранение фоновой активности в области бафиломицина-А. На рисунке 4 показаны возможные исходы старческих клеточных культур, обработанных наркотиками, включая убийство старческих клеток (сенолитическое) и сенесценцию, модулирующую (сеноморфные) препараты, описанные в Fuhrmann-Stroissnigget al. 17.
Рисунок 1. Схематический обзор скринингового обзора и временной шкалы. Клетки MEF изолированы от беременных мышей и положить на клеточной культуры обработанных пластиковых пластин в течение нескольких дней, чтобы расширить. Ранние проходные клетки могут быть заморожены в жидком азоте и могут быть использованы для скрининга на более поздний момент времени. Чувствительность клетки наведена окислительным усилием проходом на 20% O2 и клетки подвергаются действию к снадобьям как только они достигли робастного senescent состояния. Проводится анализ данных, включающим общее количество и оставшиеся старческие клетки. Временная шкала в несколько дней указывает продолжительность одного эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2. Репрезентативное изображение нестаресцентных, старческих и старческих клеток, обработанных 100 нМ сенолитической препарата 17DMAG. Голубая флуоресценция указывает на окрашивание ДНК с Помощью Hoechst 33324, в то время как зеленая флуоресценция указывает на окрашивание SA-и-Gal с помощью C12FDG. Ярко-зеленое окрашивание представляет SA--'-Gal положительные старческие клетки, в то время как тусклое окрашивание представляет SA-я-Gal низкие или отрицательные, не-старческие клетки. Обратите внимание, что старческие клетки обычно имеют больший размер клеток и сплющиваются. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3. Репрезентативные изображения старейшой культуры клеток MEF, проанализированные с помощью коммерческого программного обеспечения. (A) SA-я-Gal положительные клетки (SA-я-Гал)клетки изложены в зеленом (зеленые стрелки), SA-я-Гал отрицательный (SA-я-Гал- )изложены красным (красные стрелки). Левая и правая панели показывают ядерный (Hoechst) и C12FDG (FITC) сигнал, соответственно. Только области, которые пятно положительные для Hoechst (содержат ядра) считаются клетками. (B) Сравнение Бафиломицин-А обработанных и необработанных клеток. Остаточная ®-галактозидаза активность, присутствуюая во всех клетках уменьшается путем лисосомального подкисления Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Схема возможных результатов медикаментозного лечения. Наркотики могут иметь различное воздействие на старческие и нестареющие клетки, включая убийство старческих клеток (сенолитики) или подавление SA-и-Gal старческого фенотипа (сеноморфики). Вместе эти два класса называются senotherapeutics. Эта цифра была изменена с Фюрманн-Стройснигги др. 17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
СА-З-Гал является четко определенным биомаркером клеточного сенесценции, первоначально обнаруженным Димри и др. (1995), показывающий, что старческие фибробласты человека имеют повышенную активность SA-и-Gal при оценке на рН 623 по сравнению с размножающимися клетками. Между тем, in vitro и in vivo анализ для SA-и-Gal были созданы для различных типов клеток и тканей25,39,40. Флуоресценция на основе одноклеточного метода для измерения SA-я-Gal в живых клетках, описанных в этом протоколе является отличным основным инструментом скрининга для наркотиков, влияющих на сенесценцию клеток17. Однако, хотя SA---Gal считается одним из наиболее удобных маркеров для обнаружения старческих клеток, дополнительные маркеры для клеточного сенесценции, такие как обнаружение регуляторов клеточного цикла p16Ink4A и p2141, связанные с сенесценцией секреторный фенотип (SASP) белки, такие как IL-6, TNF, HMGB1and NF-NoB42, маркеры репарации повреждений ДНК, такие как H2Ax и теломер связанные повреждения ДНК foci (TAFs)43,44, сенеск, связанных с heterochromatin foci ( SAHF) 45или основные морфологические маркеры, такие как размер клеток и детализация должны быть на месте в качестве подтверждающих анализов для обеспечения сейнотерапевтического потенциала препаратов40. Поскольку переход от нормальной клетки к стареющим ячейкам является медленным процессом, критическимшагом в этом методе является поиск порога, который различает положительные (старческие) и отрицательные (нормальные) клетки. Это должно быть определено эмпирически для каждого типа клетки и C12FDG положительные и отрицательные элементы контроля должны быть включены в каждом эксперименте.
В дополнение к окислительно-напряженной Ercc1-/- MEFs, этот метод может быть изменен для других типов клеток адептов. Оксидативно-напряженный Ercc1-дефицит мезенхимальных стволовых клеток (MSCs) и etoposide-обработанных человеческих IMR90 клетки уже успешно протестированы в ассиде и могут быть использованы для проверки на наркотики17. Тем не менее, времена, чтобы вызвать сенесценции, а также время лечения наркотиками и концентрации могут варьироваться.
Основным ограничением этого метода является то, что активность SA-и-Gal показала, что увеличивается при определенных старческих независимых условиях, таких как ингибирование контакта клеток или высокое клеточное слияние46,47. Области, содержащие "клеточные кучи" и клеточные культуры с более смещаемыми клетками, могут быть легко определены и должны быть исключены из анализов. Кроме того, фоновое окрашивание из зеленых автоматических флуоресцентных липофусцирующих пузырьков, увеличенных в старческих клетках, может произойти. В старческих культурах клеток MEF они ничтожны из-за яркости C12FDG, но должны быть рассмотрены для каждой ячейки типа46. Hoechst окрашивание ДНК, как правило, не приводит к фоновой окрашивания. Некоторые фенол кольцо, содержащее наркотики, однако, может быть флуоресцентным в ультрафиолетовом свете. Увеличение размера исключения УФ-положительного сигнала флуоресценции до размера фактических ядер клеток может помочь предотвратить нежелательное обнаружение этих препаратов.
Наиболее важной особенностью описанного прозрения является тот факт, что старческие, а также нестареющие клетки находятся в одной среде, что позволяет оценить воздействие препарата на старческие и нестареющие клетки одновременно. Обнаружение общего числа клеток путем подсчета ядер клеток дает первое представление о потенциале клеточного убийства препарата. Снижение числа клеток и возрастной клетки обычно намекает на сенолитические препараты, в то время как постоянное количество клеток с уменьшенным числом старческих клеток обычно указывает на сеноморфные препараты. Из-за короткого времени инкубации наркотиков, эффекты, как одновременное распространение нестареющих клеток и клеточной смерти старческих клеток, ведущих к постоянному номеру клеток (например, сенолитический эффект с сеноморфным результатом) не может быть исключено, но считаются весьма высоко Вряд ли.
Будущие применения этого метода включают возможность интеграции дополнительных маркеров живых клеток (например, маркер апоптоза, как AnnexinV и 7AAD40) или маркеры для различных внутриклеточных отсеков, таких как митохондрии или лисосомы в система ассс.ru. Сопутствующий мониторинг SA-и-Gal и других клеточных маркеров во время лечения наркотиками может помочь выяснить основной клеточный механизм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIH Grants AG043376 (Проект 2 и Ядро А, ДНР; Проект 1 и Core B, LJN) и AG056278 (Проект 3 и Ядро A, PDR; и Проект 2, LJN) и грант от Фонда Гленна (LJN).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | medium |
| Ham's F10 | Gibco | 12390-035 | medium |
| fetal bovine serum | Tissue Culture Biologics | 101 | serum |
| 1x non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | amino-acids |
| bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | lysosomal inhibitor |
| C12FDG | Setareh Biotech | 7188 | b-Gal substrate |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | DNA intercalation agent |
| 17DMAG | Selleck Chemical LLC | 50843 | HSP90 inhibitor |
| InCell6000 Cell Imaging System | GE Healthcare | High Content Imaging System |
References
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Campisi, J., di Fagagna, F. D. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).
- Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature. 345 (6274), 458-460 (1990).
- Zhu, J., Woods, D., McMahon, M., Bishop, J. M. Senescence of human fibroblasts induced by oncogenic Raf. Genes and Development. 12 (19), 2997-3007 (1998).
- Dimri, G. P., Itahana, K., Acosta, M., Campisi, J. Regulation of a senescence checkpoint response by the E2F1 transcription factor and p14(ARF) tumor suppressor. Molecular and Cellular Biology. 20 (1), 273-285 (2000).
- Michaloglou, C., et al. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi. Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).
- Niedernhofer, L. J. Tissue-specific accelerated aging in nucleotide excision repair deficiency. Mechanisms of Ageing and Development. 129 (78), 408-415 (2008).
- Gitenay, D., et al. Glucose metabolism and hexosamine pathway regulate oncogene-induced senescence. Cell Death & Disease. 5, e1089 (2014).
- Erusalimsky, J. D., Kurz, D. J. Cellular senescence in vivo: its relevance in ageing and cardiovascular disease. Experimental Gerontology. 40 (8-9), 634-642 (2005).
- Kassem, M., Marie, P. J. Senescence-associated intrinsic mechanisms of osteoblast dysfunctions. Aging Cell. 10 (2), 191-197 (2011).
- Campisi, J., Andersen, J. K., Kapahi, P., Melov, S. Cellular senescence: A link between cancer and age-related degenerative disease. Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 354-359 (2011).
- Golde, T. E., Miller, V. M. Proteinopathy-induced neuronal senescence: a hypothesis for brain failure in Alzheimer's and other neurodegenerative diseases. Alzheimers Research & Therapy. 1 (2), 5 (2009).
- Telgenhoff, D., Shroot, B. Cellular senescence mechanisms in chronic wound healing. Cell Death & Differentiation. 12 (7), 695-698 (2005).
- Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
- Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. , (2016).
- Childs, B. G., et al. Senescent intimal foam cells are deleterious at all stages of atherosclerosis. Science. 354 (6311), 472-477 (2016).
- Fuhrmann-Stroissnigg, H., et al. Identification of HSP90 inhibitors as a novel class of senolytics. Nature Communications. 8 (1), 422 (2017).
- Zhu, Y., et al. New agents that target senescent cells: the flavone, fisetin, and the BCL-XL inhibitors, A1331852 and A1155463. Aging. 9 (3), Albany NY. 955-963 (2017).
- Zhu, Y., et al. Identification of a Novel Senolytic Agent, Navitoclax, Targeting the Bcl-2 Family of Anti-Apoptotic Factors. Aging Cell. , (2015).
- Zhu, Y., et al. The Achilles' heel of senescent cells: from transcriptome to senolytic drugs. Aging Cell. , (2015).
- Baar, M. P., et al. Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Homeostasis in Response to Chemotoxicity and Aging. Cell. 169 (1), 132-147 (2017).
- Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature. , (2017).
- Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92 (20), 9363-9367 (1995).
- Itahana, K., Campisi, J., Dimri, G. P. Methods to detect biomarkers of cellular senescence: the senescence-associated beta-galactosidase assay. Methods in Molecular Biology. 371, 21-31 (2007).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-[beta]gal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
- Cahu, J., Sola, B. A sensitive method to quantify senescent cancer cells. Journal of Visualized Experiments. 78 (78), (2013).
- Collado, M., et al. Tumour biology: Senescence in premalignant tumours. Nature. 436 (7051), 642 (2005).
- Krishnamurthy, J., et al. Ink4a/Arf expression is a biomarker of aging. The Journal of Clinical Investigation. 114 (9), 1299-1307 (2004).
- Mishima, K., et al. Senescence-associated beta-galactosidase histochemistry for the primate eye. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 40 (7), 1590-1593 (1999).
- Melk, A., et al. Expression of p16INK4a and other cell cycle regulator and senescence associated genes in aging human kidney. Kidney International. 65 (2), 510-520 (2004).
- Niedernhofer, L. J., et al. A new progeroid syndrome reveals that genotoxic stress suppresses the somatotroph axis. Nature. 444 (7122), 1038-1043 (2006).
- Wang, J., Clauson, C. L., Robbins, P. D., Niedernhofer, L. J., Wang, Y. The oxidative DNA lesions 8,5′-cyclopurines accumulate with aging in a tissue-specific manner. Aging Cell. 11 (4), 714-716 (2012).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (64), (2012).
- Jagannathan, L., Cuddapah, S., Costa, M. Oxidative stress under ambient and physiological oxygen tension in tissue culture. Current Pharmacology Reports. 2 (2), 64-72 (2016).
- Meuter, A., et al. Markers of cellular senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro: molecular consequences of culture in atmospheric oxygen. J Assist Reprod Genet. 31 (10), 1259-1267 (2014).
- Robinson, A. R., et al. Spontaneous DNA damage to the nuclear genome promotes senescence, redox imbalance and aging. Redox Biology. 17, 259-273 (2018).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal Of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Zhao, H., Darzynkiewicz, Z. Biomarkers of cell senescence assessed by imaging cytometry. Methods in Molecular Biology. 965, 83-92 (2013).
- Yang, N. -C., Hu, M. -L. A fluorimetric method using fluorescein di-β-d-galactopyranoside for quantifying the senescence-associated β-galactosidase activity in human foreskin fibroblast Hs68 cells. Analytical Biochemistry. 325 (2), 337-343 (2004).
- Zhao, J., et al. Quantitative Analysis of Cellular Senescence in Culture and In Vivo. Current Protocols in Cytometry. 79, (2017).
- Capparelli, C., et al. CDK inhibitors (p16/p19/p21) induce senescence and autophagy in cancer-associated fibroblasts, "fueling" tumor growth via paracrine interactions, without an increase in neo-angiogenesis. Cell Cycle. 11 (19), 3599-3610 (2012).
- Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annual Review of Pathology. 5, 99-118 (2010).
- Mah, L. J., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. GammaH2AX as a molecular marker of aging and disease. Epigenetics. 5 (2), 129-136 (2010).
- Hewitt, G., et al. Telomeres are favoured targets of a persistent DNA damage response in ageing and stress-induced senescence. Nature Communications. 3, 708 (2012).
- Narita, M., et al. Rb-mediated heterochromatin formation and silencing of E2F target genes during cellular senescence. Cell. 113 (6), 703-716 (2003).
- Georgakopoulou, E. A., et al. Specific lipofuscin staining as a novel biomarker to detect replicative and stress-induced senescence. A method applicable in cryo-preserved and archival tissues. Aging-Us. 5 (1), 37-50 (2013).
- Severino, J., Allen, R. G., Balin, S., Balin, A., Cristofalo, V. J. Is β-Galactosidase Staining a Marker of Senescence in Vitro and in Vivo? Experimental Cell Research. 257 (1), 162-171 (2000).
