Summary
Cellulära åldras är den viktigaste faktorn i utvecklingen av kroniska åldersrelaterade sjukdomar. Identifiering av Therapeutics som riktar sig till senescent celler visar löfte om att förlänga hälsosamt åldrande. Här presenterar vi en ny analys till Screen för identifiering av senotherapeutics baserat på mätning av åldras associerade β-galaktosidas aktivitet i enskilda celler.
Abstract
Cell åldras är en av kännetecknen för åldrande kända för att negativt påverka en hälsosam livslängd. Droger som kan döda senescent celler specifikt i cellkultur, kallas senolytika, kan minska senescent cell börda in vivo och förlänga healthspan. Flera klasser av senolytika har identifierats hittills inklusive HSP90 hämmare, BCL-2 familj hämmare, piperlongumine, en FOXO4 hämmande peptid och kombinationen av dasatinib/quercetin. Detektion av SA-β-gal vid en ökad lysosomalt pH är en av de bäst karakteriserade markörer för detektion av senescent celler. Levande cell mätningar av senescens-associerad β-galaktosidas (sa-β-gal) aktivitet med det fluorescerande substratet C12FDG i kombination med bestämning av det totala cellnumret med hjälp av en DNA-interkalerande Hoechst Dye öppnar möjligheten att Screen för senoterapeutiska läkemedel som antingen minskar Total SA-β-gal aktivitet genom att döda senoida celler (senolytika) eller genom att undertrycka SA-β-gal och andra fenotyper av senescerande celler (senomorphics). Användning av en hög halt fluorescerande bild förvärv och analysplattform möjliggör snabb, hög genomströmning screening av läkemedelsbibliotek för effekter på SA-β-gal, cellmorfologi och cell nummer.
Introduction
Cellular åldras beskrevs för första gången av Leonard Hayflick och Paul Moorhead, som visade att normala celler hade en begränsad förmåga att förgöra sig i kultur1. Senescent celler misslyckas med att förgöra trots närvaron av näringsämnen, tillväxtfaktorer och brist på kontakthämning, men förblir metaboliskt aktiva2. Detta fenomen kallas replikativ åldras och var främst tillskrivs telomerförkortning, åtminstone i mänskliga celler3. Ytterligare studier har visat att celler också kan induceras att genomgå åldras som svar på andra stimuli, såsom onkogen stress (Onkogene inducerad åldras, OIS), DNA-skador, cytotoxiska läkemedel, eller bestrålning (Stress inducerad åldras, SIS)4 , ,5 , 6. som svar på DNA-skador, inklusive telomererosion, celler antingen senesce, starta okontrollerad celltillväxt, eller genomgå apoptos om skadan inte kan repareras. I detta fall verkar cell åldras vara fördelaktigt eftersom det agerar i en tumör suppressiv sätt2. I motsats, åldras ökas med åldrande på grund av ansamling av cellulära skador inklusive DNA-skador. Eftersom senescent celler kan utsöndra cytokiner, metalloproteinaser och tillväxtfaktorer, kallas åldras-associerade sekretoriska fenotyp (SASP), denna åldersberoende ökning av cellulära åldras och SASP bidrar till minskad vävnad homeostas och därefter åldras. Också, denna åldersberoende ökning av åldras bördan är känd för att inducera metabola sjukdomar, stress känslighet, progeri syndrom, och nedsatt läkning7,8 och är, delvis, ansvarig för de många åldersrelaterade sjukdomar, såsom åderförkalkning, artros, muskulös degeneration, magsår bildning, och Alzheimers sjukdom9,10,11,12,13. Eliminera senescent celler kan bidra till att förebygga eller fördröja vävnad dysfunktion och förlänga healthspan14. Detta har visats i transgena musmodeller14,15,16 samt genom att använda senolytiska läkemedel och kombinationer av läkemedel som upptäcktes genom både läkemedels screening insatser och bioinformatisk analys av vägar inducerade specifikt i senescent celler17,18,19,20,21,22. Identifiera mer optimala senoterapeutiska läkemedel, kunna mer effektivt minska senescent cell börda, är ett viktigt nästa steg i utvecklingen av terapeutiska metoder för hälsosamt åldrande.
Senescent celler uppvisar karakteristiska fenotypiska och molekylära egenskaper, både i kultur och in vivo. Dessa åldras markörer kan vara antingen orsaken eller resultatet av åldras induktion eller en biprodukt av molekylära förändringar i dessa celler. Emellertid, ingen enskild markör finns specifikt i senescent celler. För närvarande, åldras-associerade β-galaktosidas (sa-β-gal) upptäckt är en av de bäst kännetecknas och etablerade encelliga metoder för att mäta åldras in vitro-och in vivo. SA-β-gal är en lysosomala hydrolas med en optimal enzymatisk aktivitet vid pH 4. Att mäta sin aktivitet vid pH 6 är möjligt eftersom senescent celler visar ökad lysosomala aktivitet23,24. För levande celler, ökad lysosomalt pH erhålls genom lysosomala alkalinisering med vakuolär H+-ATPas hämmare bafilomycin a1 eller endosomala försurnings hämmare klorokin25,26. 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside (C12FDG) används som substrat i levande celler eftersom den behåller den kluvna produkten i cellerna på grund av dess 12 kol lipofila delen25. Viktigt, SA-β-gal aktivitet i sig är inte direkt samband med någon väg som identifierats i senescent celler och är inte nödvändigt att inducera senescence. Med denna analys, senescent celler kan identifieras även i de heterogena cellpopulationer och åldrande vävnader, såsom hudbiopsier från äldre individer. Det har också använts för att visa ett samband mellan cell åldras och åldrande23 eftersom det är en pålitlig markör för senescent cell detektering i flera organismer och villkor27,28,29, 30. Här, en hög genomströmning sa-β-gal screeninganalys baserad på fluorescerande substrat C12FDG använder primära mus embryonala fibroblaster (MEFS) med robust oxidativ stress inducerad cell åldras beskrivs och dess fördelar och nackdelar diskuteras. Även om denna analys kan utföras med olika celltyper, användning av Ercc1-brist, DNA Repair nedsatt MEFS möjliggör snabbare induktion av åldras under förhållanden av oxidativ stress. Hos möss, minskat uttryck av DNA reparation Endonuklease ERCC1-XPF orsakar nedsatt DNA-reparation, accelererad ackumulering av endogena DNA-skador, förhöjda ROS, mitokondriell dysfunktion, ökad senescent cell börda, förlust av stamcells funktion och för tidigt åldrande, liknande naturligt åldrande31,32. På liknande sätt genomgår Ercc1-brist MEFS åldras snabbare i kultur17. Ett viktigt inslag i den senescent MEF analysen är att varje brunn har en blandning av senescent och icke-senescent celler, vilket möjliggör en tydlig demonstration av senescent cellspecifika effekter. Men, även om vi tror att användningen av oxidativ stress i primära celler för att inducera åldras är mer fysiologisk, denna analys kan också användas med cellinjer där åldras induceras med DNA-skadliga agenter som etoposid eller bestrålning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djuranvändning godkändes av Scripps Florida institutionella djuromsorg och användning kommittén.
1. generering av senescent murina embryonal fibroblast (MEF) – 12-15 dagar
- Isolera vildtyp och Ercc1-/- MEFS från dräktiga honmöss vid embryonal dag 13 (E13) som beskrivits tidigare33.
Anmärkning: alla följande steg utförs i en vävnad kultur huva under aseptiska förhållanden och med hjälp av sterila instrument. - Resect embryot huvudet ovanför ögonen.
- Ta bort den röda vävnaden (hjärta och lever) och Använd dem för genotypning vid behov.
- Förbered 500 ml av en 1:1 blandning av Dulbecco modifierade Eagle ' s medium (DMEM) och Ham ' s F10 med 10% foster bovint serum, 1x onödiga aminosyror, penicillin, och streptomycin som tillväxt medium och värma upp till 37 ° c för cirka 15 min före varje användning. Lagra tillväxtmedium vid 4 ° c.
- Inkubera resten av embryot med 0,25% trypsin/EDTA i 10 min.
- Finhacka embryot i 1 mm bitar och Pipettera vävnaden upp och ner flera gånger.
- Tillsätt 10 mL tillväxtmedium och plattvävnader av ett embryo per 10 cm cell odlings platta med diametern (passage 0).
- Odla celler vid 37 ° c, 3% O2,5% Co2.
Obs: endast MEF-celler fäster på icke-belagda vävnads odlings plattor under dessa förhållanden. - Byt medium varje dag i passage 0 för att ta bort icke-anslutna vävnads-och cellfragment.
Obs: beroende på storleken på embryot och kvaliteten på isoleringen, cellen brukar nå confluency efter 2 till 3 dagar. - Trypsinization
- Ta försiktigt bort odlingsmediet och tvätta cellerna med 10 mL 1x PBS två gånger.
- Tillsätt 2 mL av en 0,025% trypsin/EDTA-lösning till celler i 10 cm-diameterplattor och inkubera vid 37 ° c i 2-3 min.
- Se till att cellerna lossnar från ytan genom att inspektera cellerna under mikroskopet.
- Avsluta trypsin nedbrytning genom att lägga till samma mängd odlingssubstrat.
- Överför cellerna till ett koniskt rör och centrifugera celler vid 200 x g i 3 min och Kassera supernatanten.
- Omsuspendera celler noggrant i färskt odlingsmedium, räkna celler och frö dem i nya plattor på den projicerade CELLTÄTHETEN.
- För icke-senescent sub odling dela konflytande celler 1:4 och förlänga för en annan passage vid 3% O2, 37 ° c för att ge fler celler (passage 1).
Notera: vid denna punkt kan cellerna antingen underhållas i kultur eller lagras för senare användning i flytande kväve, i kryovials som innehåller cirka 1 000 000 celler vardera. Detta steg ger också möjlighet att generera ett blandat parti av celler från olika djur för att minska variationen som kommer från enstaka djur analys. - För att inducera cellsenescens, utsäde dela konfluenta celler från passage 1 vid ett förhållande av 1:4 och inkubera dem vid 20% O2, 37 ° c, 5% Co2 för 3 dagar; dessa odlingsförhållanden är atmosfäriska för syre.
Anmärkning: odling av celler och blastocyster under omgivande syrekoncentrationer kan höja markörer för cellulära åldras särskilt när DNA-skador reparation är nedsatt34,35,36. - Upprepa proceduren för ytterligare 2 passager.
- För att övervaka cellulära senescence, mäta den gradvisa ökningen av cell diameter och cell volym under varje trypsinization steg med hjälp av en avancerad Coulter cell Counter system.
- Utvärdera minskningen av cellproliferation genom bestämning av populations fördubblingen (PD) med hjälp av ekvationen
PDT = (t2-t1)/3,32 x (log n2 – log n1)
Obs: populationsfördubblingstid användes endast för icke-senescent celler. - Använd tidig passage vildtyp eller Ercc1-/- MEF celler som hölls vid 3% O2, 37 ° c, 5% Co2 som icke-senescent kontrollceller.
2. senescent Associated β-gal screening assay – 2-3 dagar
- Förbered 10 mM lagerlösningar i DMSO av alla läkemedel som ska testas och lagra alikvoter vid-80 ° c. Frys inte-Tina lagerlösningar eftersom detta kan minska aktiviteten av droger.
Anmärkning: här, den HSP90 inhibitor 17DMAG användes som en senolytisk drog kan specifikt döda senescent celler17. - På dagen för försöket Tina den alikvot, späda ut läkemedlen i färskt odlingsmedium och tillsätt till de celler som innehåller konditionerade mediet vid en 1:1 förhållande för att ge den slutliga koncentrationen i odlingssubstrat.
- Använd 96-väl pre-utspädnings plattor för seriella utspädningar och kombinationer av läkemedel.
Anmärkning: för MEF-celler var det empiriskt fastställt att DMSO-koncentrationer inte bör överstiga 2% och kontrollceller som behandlats med högsta DMSO-koncentrationer bör inkluderas i varje körning. - Utsäde 5 x 103 senescent celler eller 3 x 103 icke-senescent celler per brunn i 96 väl plattor minst 6 h före behandling i 100 μl av odlingssubstrat och inkubera vid 20% O2, 37 ° c, 5% Co2.
ANMÄRKNINGAR: cellerna bör vara ca 80% konflytande före behandling. - Använd svart vägg/klar botten vävnad kultur, behandlade 96 väl plattor för att minimera fluorescerande signal överhörning och bakgrund.
Observera: dock har tydliga plåtar också testats framgångsrikt. - Tillsätt läkemedelspädningar till MEF celler och inkubera i 24 h till 48 h under 20% O2, 37 ° c, 5% Co2 villkor.
- Håll icke-senescent celler under 3% O2, 37 ° c, 5% Co2 villkor.
- För lysosomala alkalinisering, Förbered en 10 mM bafilomycin a1 lösning, alikvot och hålla frysta vid-20 ° c.
- För fluorescensanalys av SA-β-gal-aktivitet, Förbered en 2 mM C12FDG-lagerlösning, förvara vid-20 ° c och skydda mot ljus.
- För arbetslösningen, Förbered 100 μM C12FDG i odlingssubstrat på dagen för experimentet.
Anmärkning: alla (inkubering) steg med C12FDG bör utföras i mörker. - Ta bort läkemedelslösningen och tvätta cellerna 1 gång med 100 μL 1x PBS.
- Inducera lysosomala alkalinisering genom att förbehandla celler med 90 μL av en 100 nM bafilomycin a1 lösning beredd i färskt cell odlingssubstrat för 1 timme vid 20% O2, 37 ° c, 5% Co2.
- Tillsätt 10 μL 100 μM C12FDG arbetslösning till odlingsmediet (slutkoncentration 10 μm).
- Inkubera celler för 2 h.
- Tillsätt 2 μL 100 μg/mL Hoechst 33342 färgämne (slutkoncentration 2 μg/mL) till kulturen och inkubera i 20 min.
- Ta bort media och tillsätt 100 μL färskt odlingssubstrat.
3. kvantitativ hög innehåll fluorescerande bildanalys
- Använd en hög innehåll fluorescerande bild förvärv och analysplattform för att förvärva fluorescerande bilder av cellerna i de två kanaler som lämpar sig för avskiljning av Hoechst och C12FDG fluorescens (t. ex., DAPI och FITC kanal för inställningar, respektive).
Obs: anskaffnings protokoll kräver definition av flera variabler som är specifika för analysen. Syftet med ett förvärvs protokoll är att fånga upp ett tillräckligt antal fluorescerande bilder i fokus för tillräckligt många celler för kvantitativ analys i efterföljande led. - Utveckla ett lämpligt analysprotokoll genom att välja varje kanal och definiera, genom att justera ett eller flera selektiva kriterier, vad som kvalificerar som en funktion av intresse för varje kanal.
- För kärnan, använda så segmentering för uppsättningar (t. ex., nukleär segmentering, vesikel segmentering, cytoplasma segmentering) som gör det möjligt att identifiera cellulära organeller på grundval av flera kriterier inklusive morfologi, storlek, och signal Intensitet. Justera dessa kriterier för att inkludera kärnor samtidigt som man utesluter nukleära fragment och skräp som kan ha en signal, men som till exempel är för stora eller för små för att vara kärnor.
- Kontrollera signalen i FITC-kanalen som fluorescens från klyvs C12FDG och representerar mängden senescens-associerad β-galaktosidas aktivitet i cellerna.
Anmärkning: senescent celler har en högre senescens-associerad β-galaktosidas aktivitet än icke-senescent celler; C12FDG fluorescens kommer dock att vara icke-diskret och kontinuerlig, vilket nödvändiggör inrättandet av en tröskel mellan vad som anses vara en c12FDG-positiv och en c12FDG-negativ cell. - Med hjälp av kommersiellt tillgänglig analytisk programvara, generera ett antal instanser där en definierad region som omger kärnan (en presumtiv cell) har överlappat minst en gång med ett ovan tröskelvärde C12FDG.
Anmärkning: analysprogram varan genererar automatiskt ett antal med hjälp av mål länkning. Detta är analysens praktiska definition av en senescent, C12FDG-positiv cell.
- Analysera alla prover i tre exemplar med 3-5 fält per brunn och medelvärden och standardavvikelser beräknas i enlighet med detta.
- Beräkna procentandelen av senescent celler med hjälp av följande formel:
Senescent celler (%) =
x 100
x 1004. valideringsparametrar för analys
- För alla prover beräknades variationskoefficienten för intra-och Inter-assay (% CVs) med följande formel:
Intra-assay CV (n = 10 repetitioner mätt i ett experiment)
= x 100 (%)
Inter-assay CV (n = 5 oberoende experiment) = x 100 (%) - För screening ändamål, fastställa Z ' värde, en statistisk parameter för att utvärdera kvaliteten på en analys, från celler som behandlats med 200 nM rapamycin för 24 h vid 20% O2, 37 ° c, 5% Co2 (en positiv kontroll för senoterapeutiska läkemedel) och obehandlad senescent celler (negativ kontroll).
Anm.: Z-värdet beräknades enligt Zhang et al.37. Z-värden mellan 0,5 och 1 indikerar att ett test kan användas för läkemedels screening.
= x 100 (%)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SA-β-gal aktivitet kan detekteras i celler som induceras till senesce av olika sätt från replikativ utmattning, genotoxisk och oxidativ stress, till Onkogene aktivering23,25,38. I den nuvarande modellen med Ercc1-bristfällig mus embryonala fibroblastceller, behandling tillväxtvillkor (20% O2) var tillräckliga för att inducera cell åldras efter odla dem för några passager. Wild typ MEFS genomgår också åldras men kräver ytterligare passager vid 20% O2. Figur 1 visar arbetsflödet för screening-analysen börjar med isolering av primära MEF celler från Ercc1-bristfällig mus embryon, till induktion av cell åldras av oxidativ stress, och slutligen till analysen av mikroskopiska data erhålls med hög halt fluorescerande Mikroskop. Figur 2 visar representativa bilder av MEF cellkulturer som innehåller icke-senescent (unga) celler (figur 2, vänster), om 50% senescent celler i passage 5 (figur 2, centrum), och senescent celler som behandlats med en senolytisk drog ( Figur 2, höger). Bild 3a visar representativa bilder för automatiska, programvarugenererade kvantitativa analyser av senescent celler. Figur 3b visar eliminering av bakgrunds β-galaktosidas aktivitet genom bafilomycin-A. Figur 4 visar möjliga utfall av senescent cellkulturer behandlas med läkemedel inklusive senescent cell avlivning (senolytisk) och åldras modulerande (senomorphic) läkemedel som beskrivs i Fuhrmann-stroissnigget al. 17.
Figur 1. Schematisk översikt över screeninganalys och tidslinje. MEF celler är isolerade från gravida möss och sätta på cellkulturer behandlade plastplattor för ett par dagar att expandera. Tidiga passage celler kan frysas i flytande kväve och kan användas för screening vid en senare tidpunkt. Cell åldras induceras av oxidativ stress genom passage vid 20% O2 och celler utsätts för droger när de har nått en robust senescent tillstånd. Data analys inklusive mängden totalt och resterande senescent celler utförs. Tidslinjen, i dagar, anger varaktigheten för ett experiment. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Representativa bilder av icke-senescent, senescent och senescent celler behandlade med 100 nM av senolytiska drogen 17DMAG. Blå fluorescens indikerar DNA-färgning med Hoechst 33324 medan grön fluorescens indikerar SA-β-gal-färgning med C12FDG. Ljust grönfärgning representerar SA-β-gal positiva senescent celler medan dim färgning representerar SA-β-gal låg eller negativ, icke-senescent celler. Observera att senescent celler oftast har större Cellstorlek och är tillplattade. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Representativa bilder av en senescent MEF cellkultur analyseras med kommersiell programvara. (A) sa-β-gal positiva celler (sa-β-gal+) celler beskrivs i grönt (gröna pilar), sa-β-gal negativa (sa-β-gal-) beskrivs i rött (röda pilar). Vänster och höger panel visar nukleära (Hoechst) och C12FDG (FITC) signal, respektive. Endast områden som fläcken positivt för Hoechst (innehåller en nuclei) betraktas som celler. (B) en jämförelse av Bafilomycin-a behandlade och obehandlade celler. Kvarvarande®-galaktosidas aktivitet som finns i alla celler reduceras genom lysosomala försurning Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. System för möjliga resultat av läkemedelsbehandling. Droger kan ha olika effekter på senescent och icke-senescent celler inklusive döda senescent celler (senolytika) eller undertrycka SA-β-gal senescent fenotyp (senomorphics). Tillsammans kallas dessa två klasser senotherapeutics. Denna siffra har modifierats från Fuhrmann-Stroissnigget al. 17. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SA-β-gal är en väldefinierad biomarkör för cellulär åldras som ursprungligen upptäcktes av dimri et al. (1995) visar att senescent humana fibroblaster har ökad aktivitet av SA-β-gal när analyseras vid pH 623 jämfört med prolifererande celler. Under tiden, in vitro-och in vivo-analys för sa-β-gal har fastställts för olika celltyper och vävnader25,39,40. Fluorescensbaserade encelliga metoden för att mäta sa-β-gal i levande celler som beskrivs i detta protokoll är ett utmärkt primärt screening verktyg för läkemedel som påverkar cell åldras17. Men även om sa-β-gal anses vara en av de mest bekväma markörer för senescent cell detektering, ytterligare markörer för cellulära åldras som detektion av cell cykel regulatorer P16Ink4A och P2141, åldras associerade sekretoriska fenotyp (SASP) proteiner som Il-6, TNFα, HMGB1and NF-κb42, DNA-skador reparation markörer som υh2ax och telomeren associerad DNA skador Foci (tafs)43,44, åldras associerade heterochromatin Foci ( SAHF) 45eller grundläggande morfologiska markörer som Cellstorlek och granularitet måste vara på plats som bekräftande analyser för att säkerställa den senoterapeutiska potentialen av läkemedel40. Eftersom övergången från en normal cell till en senescent cell är en långsam process, är det kritiska steget i denna metod att hitta tröskeln som skiljer mellan C12FDG positiva (senescent) och negativa (normala) celler. Detta måste bestämmas empiriskt för varje celltyp och C12FDG positiva och negativa kontroller måste ingå i varje experiment.
Förutom oxidativ-stressad Ercc1-/- MEFS, denna metod kan ändras för andra anhängare celltyper. Oxidativ-stressade Ercc1-bristfällig mesenkymala stamceller (MSCS) och etoposide-behandlade mänskliga IMR90 celler redanframgångsrikt testats i analysen och kan användas för att skärmen för läkemedel17. Emellertid, gånger för att inducera åldras samt läkemedelsbehandling gånger och koncentrationer kan variera.
Den största begränsningen av denna teknik är att sa-β-gal aktivitet har visat sig öka under vissa senescent oberoende förhållanden sådan cell kontakt hämning eller hög cellulära sammanflödet46,47. Områden som innehåller "cell högar" och cellkulturer med över konfluenta celler kan lätt bestämmas och bör uteslutas från analyserna. Dessutom, bakgrunds färgning från gröna Auto fluorescerande lipofuscin blåsor ökat i senescent celler kan förekomma. I senescent MEF-cellkulturer är de försumbara på grund av ljusstyrkan hos C12FDG, men bör undersökas för varje celltyp46. Hoechst färgning av DNA vanligtvis inte leder till bakgrunds färgning. Vissa fenolring innehållande läkemedel, dock, kan vara fluorescerande i UV-ljus. Ökning av uteslutnings storleken på den UV-positiva fluorescenssignalen upp till storleken av faktiska cellkärnor kan bidra till att förhindra oönskad detektion av dessa läkemedel.
Den mest betydelsefulla inslag i den beskrivna analysen är det faktum att senescent samt icke-senescent celler finns i samma miljö, vilket möjliggör bedömning av läkemedels effekter på senescent och icke-senescent celler samtidigt. Upptäckten av det totala cellnumret genom att räkna cellkärnor ger en första indikation om cell avlivning potential av ett läkemedel. En nedgång i cell nummer och cell åldras oftast antyder senolytiska läkemedel medan en konstant cell nummer med ett reducerat antal senescent celler indikerar vanligtvis senomorfa läkemedel. På grund av den korta drogen inkubationstiden, effekter som samtidig spridning av icke-senescent celler och celldöd av senescent celler som leder till konstant cell nummer (t. ex., senolytisk effekt med senomorphic resultat) kan inte uteslutas men anses vara mycket Osannolikt.
Framtida tillämpningar av denna teknik inkluderar möjligheten att integrera ytterligare levande cell markörer (t. ex., apoptos markör som AnnexinV och 7AAD40) eller markörer för olika intracellulära fack som mitokona eller lysosomer i analyssystem. Samtidig övervakning av SA-β-gal och andra cellulära markörer under läkemedelsbehandling kan bidra till att belysa underliggande cellulära mekanismen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH Grants AG043376 (projekt 2 och Core A, PDR; Projekt 1 och Core B, LJN) och AG056278 (projekt 3 och Core A, PDR; och projekt 2, LJN) och ett bidrag från Glenn Foundation (LJN).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | medium |
| Ham's F10 | Gibco | 12390-035 | medium |
| fetal bovine serum | Tissue Culture Biologics | 101 | serum |
| 1x non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | amino-acids |
| bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | lysosomal inhibitor |
| C12FDG | Setareh Biotech | 7188 | b-Gal substrate |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | DNA intercalation agent |
| 17DMAG | Selleck Chemical LLC | 50843 | HSP90 inhibitor |
| InCell6000 Cell Imaging System | GE Healthcare | High Content Imaging System |
References
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Campisi, J., di Fagagna, F. D. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).
- Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature. 345 (6274), 458-460 (1990).
- Zhu, J., Woods, D., McMahon, M., Bishop, J. M. Senescence of human fibroblasts induced by oncogenic Raf. Genes and Development. 12 (19), 2997-3007 (1998).
- Dimri, G. P., Itahana, K., Acosta, M., Campisi, J. Regulation of a senescence checkpoint response by the E2F1 transcription factor and p14(ARF) tumor suppressor. Molecular and Cellular Biology. 20 (1), 273-285 (2000).
- Michaloglou, C., et al. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi. Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).
- Niedernhofer, L. J. Tissue-specific accelerated aging in nucleotide excision repair deficiency. Mechanisms of Ageing and Development. 129 (78), 408-415 (2008).
- Gitenay, D., et al. Glucose metabolism and hexosamine pathway regulate oncogene-induced senescence. Cell Death & Disease. 5, e1089 (2014).
- Erusalimsky, J. D., Kurz, D. J. Cellular senescence in vivo: its relevance in ageing and cardiovascular disease. Experimental Gerontology. 40 (8-9), 634-642 (2005).
- Kassem, M., Marie, P. J. Senescence-associated intrinsic mechanisms of osteoblast dysfunctions. Aging Cell. 10 (2), 191-197 (2011).
- Campisi, J., Andersen, J. K., Kapahi, P., Melov, S. Cellular senescence: A link between cancer and age-related degenerative disease. Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 354-359 (2011).
- Golde, T. E., Miller, V. M. Proteinopathy-induced neuronal senescence: a hypothesis for brain failure in Alzheimer's and other neurodegenerative diseases. Alzheimers Research & Therapy. 1 (2), 5 (2009).
- Telgenhoff, D., Shroot, B. Cellular senescence mechanisms in chronic wound healing. Cell Death & Differentiation. 12 (7), 695-698 (2005).
- Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
- Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. , (2016).
- Childs, B. G., et al. Senescent intimal foam cells are deleterious at all stages of atherosclerosis. Science. 354 (6311), 472-477 (2016).
- Fuhrmann-Stroissnigg, H., et al. Identification of HSP90 inhibitors as a novel class of senolytics. Nature Communications. 8 (1), 422 (2017).
- Zhu, Y., et al. New agents that target senescent cells: the flavone, fisetin, and the BCL-XL inhibitors, A1331852 and A1155463. Aging. 9 (3), Albany NY. 955-963 (2017).
- Zhu, Y., et al. Identification of a Novel Senolytic Agent, Navitoclax, Targeting the Bcl-2 Family of Anti-Apoptotic Factors. Aging Cell. , (2015).
- Zhu, Y., et al. The Achilles' heel of senescent cells: from transcriptome to senolytic drugs. Aging Cell. , (2015).
- Baar, M. P., et al. Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Homeostasis in Response to Chemotoxicity and Aging. Cell. 169 (1), 132-147 (2017).
- Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature. , (2017).
- Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92 (20), 9363-9367 (1995).
- Itahana, K., Campisi, J., Dimri, G. P. Methods to detect biomarkers of cellular senescence: the senescence-associated beta-galactosidase assay. Methods in Molecular Biology. 371, 21-31 (2007).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-[beta]gal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
- Cahu, J., Sola, B. A sensitive method to quantify senescent cancer cells. Journal of Visualized Experiments. 78 (78), (2013).
- Collado, M., et al. Tumour biology: Senescence in premalignant tumours. Nature. 436 (7051), 642 (2005).
- Krishnamurthy, J., et al. Ink4a/Arf expression is a biomarker of aging. The Journal of Clinical Investigation. 114 (9), 1299-1307 (2004).
- Mishima, K., et al. Senescence-associated beta-galactosidase histochemistry for the primate eye. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 40 (7), 1590-1593 (1999).
- Melk, A., et al. Expression of p16INK4a and other cell cycle regulator and senescence associated genes in aging human kidney. Kidney International. 65 (2), 510-520 (2004).
- Niedernhofer, L. J., et al. A new progeroid syndrome reveals that genotoxic stress suppresses the somatotroph axis. Nature. 444 (7122), 1038-1043 (2006).
- Wang, J., Clauson, C. L., Robbins, P. D., Niedernhofer, L. J., Wang, Y. The oxidative DNA lesions 8,5′-cyclopurines accumulate with aging in a tissue-specific manner. Aging Cell. 11 (4), 714-716 (2012).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (64), (2012).
- Jagannathan, L., Cuddapah, S., Costa, M. Oxidative stress under ambient and physiological oxygen tension in tissue culture. Current Pharmacology Reports. 2 (2), 64-72 (2016).
- Meuter, A., et al. Markers of cellular senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro: molecular consequences of culture in atmospheric oxygen. J Assist Reprod Genet. 31 (10), 1259-1267 (2014).
- Robinson, A. R., et al. Spontaneous DNA damage to the nuclear genome promotes senescence, redox imbalance and aging. Redox Biology. 17, 259-273 (2018).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal Of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Zhao, H., Darzynkiewicz, Z. Biomarkers of cell senescence assessed by imaging cytometry. Methods in Molecular Biology. 965, 83-92 (2013).
- Yang, N. -C., Hu, M. -L. A fluorimetric method using fluorescein di-β-d-galactopyranoside for quantifying the senescence-associated β-galactosidase activity in human foreskin fibroblast Hs68 cells. Analytical Biochemistry. 325 (2), 337-343 (2004).
- Zhao, J., et al. Quantitative Analysis of Cellular Senescence in Culture and In Vivo. Current Protocols in Cytometry. 79, (2017).
- Capparelli, C., et al. CDK inhibitors (p16/p19/p21) induce senescence and autophagy in cancer-associated fibroblasts, "fueling" tumor growth via paracrine interactions, without an increase in neo-angiogenesis. Cell Cycle. 11 (19), 3599-3610 (2012).
- Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annual Review of Pathology. 5, 99-118 (2010).
- Mah, L. J., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. GammaH2AX as a molecular marker of aging and disease. Epigenetics. 5 (2), 129-136 (2010).
- Hewitt, G., et al. Telomeres are favoured targets of a persistent DNA damage response in ageing and stress-induced senescence. Nature Communications. 3, 708 (2012).
- Narita, M., et al. Rb-mediated heterochromatin formation and silencing of E2F target genes during cellular senescence. Cell. 113 (6), 703-716 (2003).
- Georgakopoulou, E. A., et al. Specific lipofuscin staining as a novel biomarker to detect replicative and stress-induced senescence. A method applicable in cryo-preserved and archival tissues. Aging-Us. 5 (1), 37-50 (2013).
- Severino, J., Allen, R. G., Balin, S., Balin, A., Cristofalo, V. J. Is β-Galactosidase Staining a Marker of Senescence in Vitro and in Vivo? Experimental Cell Research. 257 (1), 162-171 (2000).
