Summary
باراكريني وجوكستاكريني من التفاعلات الخلوية دوراً هاما في العديد من العمليات البيولوجية، بما في ذلك تطور الورم والاستجابات المناعية، والأوعية، والتنمية. هنا، يستخدم أسلوب ثقافة الدانية لدراسة الإشارات paracrine حيث يتم الاحتفاظ تركيزات مترجمة من العوامل التي يفرزها مع منع الاتصال الخلوية مباشرة.
Abstract
التفاعلات بين الخلايا دوراً هاما في العديد من العمليات البيولوجية، بما في ذلك تطور الورم والاستجابات المناعية، والأوعية، والتنمية. باراكريني أو إشارات جوكستاكريني يتوسط هذه التفاعلات. استخدام وسيلة مكيفة ودراسات كوكولتوري هي الأساليب الأكثر شيوعاً للتمييز بين هذين النوعين من التفاعلات. ومع ذلك، أثر المترجمة تركيزات عالية من عوامل المكروية يفرزها أثناء التفاعلات paracrine لا موجز لها بدقة بواسطة مكيفة، وبالتالي، قد يؤدي إلى نتائج غير دقيقة. للتغلب على هذه المشكلة، وضعنا أسلوب ثقافة الدانية لدراسة الإشارات باراكريني. وتزرع أنواع الخلايا اثنين على السطح أما لغشاء البولي ميكرومتر سميكة 10 مع 0.4 ميكرومتر المسام. المسام يسمح بتبادل العوامل يفرزها، وتمنع في نفس الوقت، مما يشير إلى جوكستاكريني. ويمكن جمع الخلايا وتفكيك في نقطة النهاية تحديد الآثار المترتبة إشارات paracrine. بالإضافة إلى السماح للتدرجات تركيز مترجمة من العوامل يفرزها، هذا الأسلوب قابلة للتجارب التي تنطوي على فترات طويلة للثقافة، وكذلك استعمال مثبطات. بينما يمكننا استخدام هذا الأسلوب لدراسة التفاعلات بين الخلايا mesothelial التي يواجهونها في موقع خبيث وخلايا سرطان المبيض، يمكن تكييفها لأي خلية ملتصقة نوعين للباحثين لدراسة paracrine الإشارات في مختلف المجالات، بما في ذلك ورم المكروية وعلم المناعة، والتنمية.
Introduction
وقد أنشئ أيضا دور الإنتاجية التفاعلات المتبادلة بين الخلايا السرطانية وورم المكروية في تطور الورم وأصبحت محورا أساسيا للبحث في سرطان علم الأحياء1. حالات مماثلة للإشارات ثنائية الاتجاه حاسمة خلال الجرح تضميد الجراح، والاستجابات المناعية، والأوعية، ومنافذ الخلايا الجذعية، والتنمية2،،من34،،من56 , 7 , 8-هو سمة مشتركة في جميع هذه العمليات البيولوجية أن الخلايا تستجيب بطرق مختلفة إلى خارج الخلية العظة من بهم المكروية التي تحدد مصير الخلايا والأنسجة فسيولوجيا وتطور المرض. ولذلك تحولت التركيز متزايد نحو تطوير فهم أفضل للآليات التي تشارك في هذه الاتصالات خلية خلية. تشمل غالبية هذه التفاعلات باراكريني أو جوكستاكريني الإشارات بين الخلايا. إشارات Paracrine ينطوي على إفراز عوامل إشارات محددة بمقدار خلية واحدة حيث يعتبرها المستقبلات المقابلة في خلية أخرى في المنطقة المجاورة، مما آثار ردا في ذلك10من9،، في حين جوكستاكريني الإشارات يتطلب اتصال مباشر بين المكونات الخلوية من خليتين تشارك11،12.
هذه الإشارات عنصر حاسم في التوازن الأنسجة، وكذلك في ورم المكروية. الخلايا السرطانية الاستفادة من عوامل باراكريني وجوكستاكريني من الخلايا في ستروما الورم، بما في ذلك المرتبط بسرطان الخلايا الليفية (اجواءه) والخلايا المناعية adipocytes13،14،،من1516. باراكريني إشارات يمكن أن توسط عوامل النمو، السيتوكينات، المستقطبات، إلخ، بينما يشير جوكستاكريني ينطوي على يغاندس جنبا إلى جنب والمستقبلات كما هو الحال في الشق الإشارات، أو التفاعلات بين إينتيجرينس ومنها المصفوفة خارج الخلية البروتينات. لقد أظهرنا أهمية التفاعلات المتبادلة بين خلايا سرطان المبيض واجواءه في استئصال ورم خبيث وتطور14. وبالمثل، تنظيم التفاعلات بين خلايا سرطان المبيض metastasizing مع الخلايا mesothelial تغطي موقع خبيث ميكرورناس الرئيسية وعوامل النسخ في الخلايا السرطانية التي تروج للاستعمار المنتشر17، 18.
معظم الدراسات على إشارات paracrine تنطوي على استخدام وسيلة المكيفة التي تم جمعها من نوع خلية واحدة لعلاج نوع الخلية الثانية مع. بينما تم استخدام هذا النهج على نطاق واسع، فإنه لا نسخ فعالية مستويات عالية التركيز المترجمة عامل يفرز في المكروية الخلية المستقبلة. كما فشل استنساخ الحركية التدفق المستمر للعامل الذي يفرز يجري إنتاجها بمقدار خلية واحدة وتتلقاها الخلية المجاورة. باراكريني الإشارات هي فعالة عبر مسافات قصيرة كما العوامل التي يفرزها في التركيزات المطلوبة فقط محيط الخلية المصدر وتميل إلى منتشر وتضعف بزيادة المسافة. هذا التركيز العالي مترجمة يفرز عامل ضروري لتؤدي إلى استجابة في الخلية المستقبلة. وعلاوة على ذلك، أيضا استجابة الخلايا المتلقية تعتمد على التوازن بين العوامل يفرز حديثا وعلى استنزاف مستمر من خلال تدهور، وملزمة، واستيعاب في الخلايا المتلقية ونشرها بعيداً عن الخلية المصدر. يمكن أن تكون وسيطة مكيفة مركزة لحساب أعلى تركيزات المترجمة موجودة في المكروية، ولكن دقة لا يمكن النسخ المتماثل التركيزات الدقيقة. وعلاوة على ذلك، فإنه لا يمكن تقليد الحركية الطبيعية للإنتاج ونضوب عامل بالمشاركة. أكثر دقة تكرار الإشارات باراكريني وفصله من جوكستاكريني مما يشير إلى آليات، وضعنا أسلوب رواية ثقافة الدانية، الذي ينطوي على زراعة أنواع الخلايا اثنين على السطح أما لغشاء يسهل اختراقها. المسام صغيرة بما يكفي لمنع التفاعلات جوكستاكريني ويسمح بتبادل العوامل يفرز بتركيزات عالية مترجمة. وبهذه الطريقة، يحتفظ هذا النظام حركية الإنتاج ونضوب العوامل باراكريني.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية "مجلس جامعة إنديانا التنظيمية المؤسسية".
1-إعداد الخلية
-
العزلة والثقافة البشرية الخلايا mesothelial الأولية
- عزل الابتدائي mesothelial الخلايا البشرية (هبمكس) من الثرب البشري كما وصف سابقا17،18 وتنمو لهم في إكمال المتوسطة النمو [المتوسطة (دميم "تعديل النسر" دولبيكو) التي تحتوي على 10% مصل بقرى الجنين، 1% البنسلين والستربتوميسين والأحماض الأمينية غير الأساسية 1%، والفيتامينات 1%] في شركة 37 درجة مئوية و 5%2.
ملاحظة: تزرع في هبمكس عادة إلى التقاء 100% (الشكل 1A).
- عزل الابتدائي mesothelial الخلايا البشرية (هبمكس) من الثرب البشري كما وصف سابقا17،18 وتنمو لهم في إكمال المتوسطة النمو [المتوسطة (دميم "تعديل النسر" دولبيكو) التي تحتوي على 10% مصل بقرى الجنين، 1% البنسلين والستربتوميسين والأحماض الأمينية غير الأساسية 1%، والفيتامينات 1%] في شركة 37 درجة مئوية و 5%2.
-
ظروف نمو خلايا سرطان المبيض
- تنمو خلايا سرطان المبيض HeyA8 في المتوسطة النمو الكامل في شركة 37 درجة مئوية و 5%2.
ملاحظة: HeyA8 استخدام الخلايا المزروعة إلى حوالي 80% التقاء (الشكل 1B).
- تنمو خلايا سرطان المبيض HeyA8 في المتوسطة النمو الكامل في شركة 37 درجة مئوية و 5%2.
2-خلية ثقافة
-
إنشاء ثقافة الدانية
- إدراج ترانسويل استخدام لوحات 6-جيدا مع غشاء البولي الأنسجة-الثقافة-تعامل ميكرومتر سميكة 10 مع 0.4 ميكرومتر المسام (المسام/سم8 102) ومنطقة نمو2 سم 4.67. إذا لزم الأمر، الأمثل لإدراج مختلفة الأحجام بتحجيم عدد الخلايا المصنفة وفقا لنمو المنطقة السطحية. المتوسطة النمو الكامل الحارة، التربسين، والفوسفات مخزنة المالحة (PBS) إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
-
إعداد تدرج
- أن البذور الخلايا HeyA8 على السطح السفلي للغشاء للإدراج، إزالة الإدراج من التعبئة والتغليف باستخدام ملقط معقم ووضعه على مقلوب في صحن ثقافة عقيمة 15 سم.
- استخدام طبق 15 سم، كما أن لديها عمق استيعاب إدراج مقلوب، أو استبداله بأي حاوية معقمة مناسبة. اعتماداً على التجربة، ضع العدد المطلوب من إدراج في الطبق 15 سم.
- قم بتسمية عناصر التحكم الثلاثة وثلاثة شروط تجريبية تبعاً لذلك مع علامة على الحافة من إدراج.
-
إعداد الخلايا السرطانية
- تريبسينيزي الخلايا HeyA8 نمت في التقاء 80% في 25 سم2 قارورة (~ 2 × 106 خلايا) وإضافة 1 مل التربسين (0.25%) ل s 40-60 وتحييد التربسين مع 6 مل متوسط النمو الكامل.
- الطرد المركزي في الخلايا عند 500 س ز في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 3 دقائق وتجاهل المادة طافية ريسوسبيند بيليه الخلية في 5 مل متوسط النمو الكامل. عد الخلايا الحية باستخدام أسلوب الاستبعاد صبغة زرقاء تريبان.
-
زرع الخلايا السرطانية
- تعليق 100,000 خلايا/مل من الخلايا HeyA8 يعيش في المتوسط كاملة النمو. البذور بعناية 80,000 الخلايا HeyA8 علقت في ميكروليتر 800 من متوسط النمو الكامل في الجزء السفلي من الإدراج (الذي يواجه الآن، نظراً لأنه هو مقلوب).
- البذور في الخلايا لتشكيل شكل قبة تشبه حتى تبقى الخلايا على الإدراج (الشكل 1). البدء من وسط الغشاء والانتقال إلى الخارج في دوائر متحدة المركز أثناء بيبيتينج ببطء. تجنب الذهاب أكثر من 3 مم من الحافة لمنع أي تسرب من المتوسط.
ملاحظة: عدد خلايا المصنف سيتوقف على معدل نمو الخلايا ومدة التجربة. عدد الخلايا HeyA8 المصنفة لهذه الثقافة الدانية هي الأمثل والخلايا سوف تكون روافد 80 – 90% في نهاية اليوم الثالث.
-
سرطان الخلية مرفق
- تغطية الطبق 15 سم وتحريك الطبق الذي يحتوي على إدراج للحاضنة2 CO بعناية. المهم ليس لعرقلة قطره من المتوسطة والخلايا على الإدراج في هذه الخطوة. ترك الخلايا في 37 درجة مئوية ح 4 للسماح للخلايا السرطانية لإرفاقها الإدراج.
-
إعداد الخلايا mesothelial
- بعد حوالي 4 ح، تريبسينيزي هبمكس نمت في التقاء 100% في قارورة2 75 سم (~ 4 × 106 خلايا) مع 2 مل التربسين (0.25%) لمدة 1 – 2 دقيقة وتحييد التربسين مع 12 مل متوسط النمو الكامل.
- الطرد المركزي في الخلايا عند 500 س ز على RT لمدة 3 دقائق، ريسوسبيند بيليه الخلية في 10 مل متوسط النمو الكامل، ومن عد الخلايا الحية باستخدام أسلوب الاستبعاد صبغة زرقاء تريبان.
-
بذر الخلايا mesothelial
- تعليق 300,000 خلايا/مل من هبمكس يعيش في المتوسط كاملة النمو. إضافة 2.5 مل وسائط النمو كاملة جديدة لكل بئر من لوحة 6-جيدا. إحضار الطبق 15 سم يحتوي على إدراج خارجاً لغطاء السلامة الأحيائية بعناية. استخدام الملقط العقيمة، الوجه الإدراج ووضعه في بئر لوحة 6-جيدا حيث أنها تستقيم، مع الخلايا HeyA8 تعلق على السطح السفلي منغمسين في الأجلين المتوسط والنمو الكامل (الشكل 1).
- هبمكس بذور 450,000 علقت في 1.5 مل متوسط النمو في داخل إدراج مع الخلايا HeyA8 تعلق على السطح تواجه أسفل البئر (الشكل 1) أو لإدراج دون أي الخلايا HeyA8 لعناصر التحكم HPMC. إضافة 1.5 مل متوسط النمو دون الخلايا إلى عناصر التحكم HeyA8.
-
تزايد ثقافة الدانية
- واسمحوا ثقافة الدانية تنمو في الحاضنة2 CO في 37 درجة مئوية و 5% CO2 ح 72. إذا لزم الأمر، يمكن تجديدها في المتوسط على النحو التالي.
- للداخل الإدراج، إزالة ميليلتر 750 وإضافة 750 ميليلتر من متوسط النمو كاملة جديدة.
- للخارج الإدراج (لوحة 6-جيدا)، إزالة مل 1 وإضافة 1 مل متوسطة جديدة كاملة النمو. واختير 1 مل لتوفير الراحة لتغيير وسيلة في خطوة واحدة. إذا رغبت في ذلك، يمكن إزالة 1.25 مل واستبدال بدلاً من ذلك.
- واسمحوا ثقافة الدانية تنمو في الحاضنة2 CO في 37 درجة مئوية و 5% CO2 ح 72. إذا لزم الأمر، يمكن تجديدها في المتوسط على النحو التالي.
-
جمع الخلايا
- جمع الخلايا بعد 72 ساعة ثقافة الدانية. عناية خاصة في هذه الخطوة منع التلوث عبر الخلايا HeyA8 وهبمكس-تريبسينيزي الخلايا والطرد المركزي لهم، وبيليه بدلاً من ليسينج الخلايا في الغشاء لمنع تلوث عبر.
-
تريبسينيزينج الخلايا
- شطف كلا الجانبين من الإدراج مع برنامج تلفزيوني 1 x.
- نقل إدراج إلى بئر جديدة وإضافة التربسين. إضافة 0.5 مل التربسين إلى داخل الإدراج وإضافة 2 مل التربسين إلى لوحة 6-جيدا تريبسينيزي الخلايا السرطانية يعلق على السطح السفلي للإدراج. احتضان لوحة ل 2 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
-
تحييد التربسين
- أضف 1 مل متوسط النمو الكامل إلى داخل الإدراج لتحييد التربسين، "الماصة؛" صعودا وهبوطاً، ثم تأخذ الخلايا وتحويلها إلى أنبوب جمع مسمى. إضافة مل 2 إضافية من المتوسطة النمو الكامل لإبطال كامل. وينبغي الحرص لا لاختراق الغشاء أثناء بيبيتينج لمنع تلوث عبر الخلايا.
- جمع الخلايا في الجزء السفلي من الإدراج، "الماصة؛" التربسين 2 مل الذي تمت إضافته في الخطوة 12.2 على السطح السفلي x 2 – 3 حيث أن الخلايا تقع في الجزء السفلي من لوحة 6-جيدا. تحييد التربسين في الجزء السفلي من اللوحة مع 6 مل من النمو المتوسطة ونقل محتويات اللوحة إلى أنبوب جمع مسمى.
-
جمع وليسينج الخلايا
- الطرد المركزي في الخلايا عند 500 س ز لمدة 3 دقائق ونضح وسائط الإعلام. ريسوسبيند والكريات الخلية مع 0.7 مل من تحلل الفينول غوانيدين ثيوسيانات-القائم وكاشف لاستخراج الحمض النووي الريبي. عزل الجيش الملكي النيبالي باستخدام أي أدوات مناسبة.
3-الكمية في الوقت الحقيقي تفاعل البوليميراز المتسلسل
ملاحظة: تصف الخطوات التالية كمية في الوقت الحقيقي البلمرة المتسلسل (qPCR) دراسة التغيرات التعبير الجيني نتيجة ثقافة الدانية.
- إعداد كدنا من عينات الحمض النووي الريبي ل qPCR. استخدم أي المنتسخة العكسية المناسبة مع المخزن مؤقت مقابلة وكبسولة تفجير عشوائي للتأكد من النسخ العكسي لجميع مرناً (انظر الجدول للمواد).
- تقييم التغيرات في مستويات التعبير مرناً فيبرونيكتين (FN1) وهاء-كادهيرين (CDH1) وتحويل عامل النمو بيتا 1 (TGFβ1) من قبكر مع جليسيرالديهيدي 3-الفوسفات نازعة (جابده) كعنصر تحكم داخلي. من الممكن استخدام موحدة فحوصات التعبير الجيني المتاحة تجارياً (انظر الجدول للمواد) أو لتصميم أجهزة الإشعال.
- قارن بين الخلايا HeyA8 نمت في الثقافة الدانية مع هبمكس مع عناصر التحكم HeyA8 وهبمكس نمت في الثقافة الدانية مع عناصر التحكم HPMC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
خلايا سرطان المبيض metastasizing تواجه الخلايا mesothelial في موقع خبيث داخل التجويف الصفاقى19. التفاعلات المنتجة باراكريني وجوكستاكريني بمساعدة الخلايا mesothelial في حفز الاستجابات التكيفية في خلايا سرطان المبيض، التي تمكن من ورم خبيث الناجحة17،،من1820،21 . لاختبار فعالية أسلوب الثقافة الدانية، اختبرنا paracrine التفاعلات بين خلايا سرطان المبيض HeyA8 وهبمكس. وأفيد قبل أن كوكولتوري خلايا HeyA8 مع هبمكس يؤدي إلى زيادة تعبير عن فيبرونيكتين في هبمكس21. هو توسط هذا الاستقراء التعبير فيبرونيكتين زيادة إفراز TGFβ الخلايا HeyA821. ولذلك، نحن اختبار أثر ثقافة الدانية من الخلايا HeyA8 وهبمكس على مستويات مرناً فيبرونيكتين و TGFβ في كل من هذه الخلايا. كما هو متوقع، أدى إلى ثقافة الدانية مع خلايا HeyA8 في تعبير زيادة عن فيبرونيكتين في هبمكس المقارنة مع عناصر التحكم التي كانت تبذر في إدراج دون خلايا HeyA8 تعلق على السطح السفلي (الشكل 2A). وبالمثل، ثقافة الدانية هبمكس مع HeyA8 الخلايا أدى إلى زيادة تعبير عن TGFβ في السابق (الشكل 2). التعبير عن فيبرونيكتين و TGFβ زادت أيضا بدرجة كبيرة في الخلايا HeyA8 على الثقافة الدانية مع هبمكس بالمقارنة مع عناصر التحكم حيث كانت لا تبذر هبمكس في السطح العلوي من إدراج (الشكل 2 و 2D).
لمقارنة تأثير النهج متوسطة مكيفة الكلاسيكية، أجرينا تجربة علاج الخلايا HeyA8 مع وسيط مكيفة HPMC. كان هناك انخفاض في التعبير فيبرونيكتين وتغييرا كبيرا في TGFβ في HeyA8 الخلايا تعامل مع المتوسطة HPMC مكيفة. (الشكل 3 ألف و 3 باء). نحن أيضا اختبار إمكانية عرقلة TGFβ يفرز مع جسم تحييد في ثقافة الدانية. المعاملة مع جسم تحييد TGFβ أسفرت عن انخفاض كبير في استحثاث TGFβ في خلايا HeyA8 في ثقافة الدانية مع هبمكس (الشكل 3). ومع ذلك، جسم تحييد TGFβ زيادة طفيفة التعبير TGFβ في الخلايا التحكم HeyA8، ربما كاستجابة تعويضية (الشكل 3).
وبالإضافة إلى ذلك، نحن أيضا اختبار تأثير الثقافة الدانية على مستويات التعبير علامة طلائي كادهيرين ه. بينما الثقافة الدانية مع الخلايا HeyA8 زيادة طفيفة التعبير ه-كادهيرين في هبمكس (الشكل 2E)، لوحظ انخفاض ملحوظ في ه-كادهيرين في خلايا HeyA8 التي تزرع بقرب هبمكس بالمقارنة مع عناصر التحكم (الشكل 2 واو). أخذت معا، هذه النتائج تدل على فعالية نظام الثقافة الدانية في دراسة paracrine الإشارات بين خلايا سرطان المبيض والخلايا الطبيعية في موقع خبيث تؤثر على التعبير الجيني في كل أنواع الخلايا أثناء عملية الاستعمار المنتشر.
رقم 1: الجمعية العامة للنظام ثقافة الدانية. (أ) هذا الإنسان يظهر الفريق الأساسي الخلايا mesothelial (هبمكس). (ب) هذا الفريق يظهر خلايا سرطان المبيض HeyA8. تغيير حجم أشرطة = 200 ميكرومتر (أ-ب). (ج) HeyA8 كانت تبذر الخلايا على السطح السفلي من ترانسويل إدراج مع 0.4 ميكرومتر المسام. متى كانت موصولة الخلايا، وضعت الإدراج في بئر صفيحة 6-كذلك يتضمن المتوسطة النمو. ثم كان المصنف الخلايا mesothelial في الإدراج حيث أن تعلق على السطح العلوي ومفصولة الغشاء من الخلايا HeyA8. ويفرز عوامل المسام ميكرومتر 0.4 في الغشاء الذي يسمح بالتبادل لكن تحول دون أي اتصال مباشر بين الخلايا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: تأثير الثقافة الدانية على التعبير مرناً. إظهار أول فريقي qPCR فيبرونيكتين (A) والتعبير (ب) TGFβ1 في الخلايا البشرية mesothelial الأولية (هبمكس) مثقف بروكسيمالي للخلايا HeyA8، بالمقارنة مع التحكم هبمكس. المعرض القادم فريقي qPCR فيبرونيكتين (ج) والتعبير TGFβ1 (د) في الخلايا HeyA8 مثقف بروكسيمالي إلى هبمكس، بالمقارنة مع التحكم Heya8 الخلايا. إظهار آخر فريقي qPCR للتعبير ه-كادهيرين في هبمكس (ه) مثقف بروكسيمالي HeyA8 الخلايا والخلايا HeyA8 (و) مثقف بروكسيمالي إلى هبمكس- N = 3، * p < 0.01. أشرطة الخطأ يمثل الانحراف المعياري ليكرر ثلاثة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: تأثير الخلايا البشرية mesothelial الأولية (HPMC)-تكييف العلاج المتوسط على التعبير مرناً للخلايا HeyA8. إظهار رأس فريقي qPCR فيبرونيكتين (A) والتعبير (ب) TGFβ1 في الخلايا HeyA8. (ج) هذا الفريق الأخير يظهر أثر إعاقة TGFβ1 يفرزها مع جسم تحييد (TGFβ1 Ab) على التعبير HeyA8 TGFβ1 على ثقافة الدانية مع هبمكس- N = 3، * p < 0.01. ف < 0.05. أشرطة الخطأ يمثل الانحراف المعياري ليكرر ثلاثة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
فهم إليه باراكريني وجوكستاكريني الإشارات بين الخلايا أمر ضروري لتطوير معرفة أفضل بأنسجة طبيعية التوازن والمرض ظروف7،8. باراكريني معظم الإشارات وتجري دراسات عن طريق جمع مكيفة المتوسطة من نوع خلية واحدة واستخدامه لعلاج نوع الخلية الأخرى. يحتوي هذا الأسلوب ميزة في ما ينطوي عليه من البساطة. ومع ذلك، فإنه لا دقة الخص تركيزات مترجمة من العوامل التي يفرزها في المكروية الخلوية أو حركية الإنتاج ونضوب العوامل التي تنطوي عليها. بينما يمكن تناولها في السابق إلى حد ما، على الرغم من عدم دقة، بالتركيز المتوسط مكيفة، من الصعب جداً إعادة الحركية. استخدام إدراج ترانسويل لنمو الخلايا في الإدراج وفي الجزء السفلي من البئر يمكن، إلى حد ما، استعادة تأثيرات حركية الإنتاج ونضوب. ومع ذلك، الخلايا مفصولة بالمسافة بين الإدراج وأسفل البئر، وهكذا، لا يمكن إعادة إنشاء تركيزات مترجمة من العوامل باراكريني. أبلغنا بتطوير أسلوب الثقافة الدانية بسيطة لدراسة الإشارات paracrine المتبادلة، التي تحتفظ بتركيزات عالية مترجمة من العوامل التي يفرزها، فضلا عن القوى المحركة لمعدل الإنتاج ونضوب العوامل.
في دراسة لإثبات للمبدأ، نحن أثبتت فعالية الأسلوب الثقافة الدانية في استنساخ الآثار المبلغ عنها للتفاعلات بين خلايا سرطان المبيض وهبمكس. وبالإضافة إلى ذلك، نحن كما أظهرت عكس آثار التفاعلات المتبادلة باراكريني على التعبير عن علامة طلائي كادهيرين ه في خلايا HeyA8 وهبمكس. في حين تشارك لدينا تجربة استزراع الخلايا على مدى فترة 3 أيام، فإنه يمكن تكييفها لأقصر أو نقاط زمنية أطول عن طريق ضبط العدد الأولى لخلايا المصنف. هذا يتيح للباحثين دراسة الآثار القصيرة الأجل وكذلك الطويلة الأجل لإشارات paracrine أو القيام بدراسات الوقت بالطبع. يمكن تطبيق هذا الأسلوب بسيط يحتمل أن تكون لأي بحث بشأن paracrine الإشارات بين نوعين ملتصقة الخلية، بما في ذلك علم المناعة، والأوعية، وتطوير الخلية، والتئام الجروح، بالإضافة إلى دراسات عن ورم المكروية.
الخطوات الحاسمة في هذا الأسلوب هي زرع الخلايا على السطح السفلي للغشاء وحصاد الخلايا من كل الأسطح في نقطة النهاية. لقد حققنا البذور على السطح السفلي التقليب أول الإدراج والبذر ثم الخلايا كانخفاض كبير في متوسط. ينبغي أن يكون المصنف الخلية ملتصقة أكثر من اثنين درس على السطح السفلي. العناية بمراعاة عدم الإخلال الإدراج حين تفرخ لتجنب هذه النقطة المتوسطة من عرقلة. يمكن تطبيق هلام السيليكون إلى حواف الإدراج لتجنب خرق وتسرب من الفقاعة السائل. في نهاية التجربة الثقافة الدانية، الخلايا الموجودة على جانبي الغشاء هي التتابع تريبسينيزيد بدلاً من تفكيك مباشرة، نظراً لأن ليسينج لهم على الغشاء مخاطر التلوث عبر من ليساتيس عن طريق المسام. تريبسينيزينج لهم في هذه المقصورات الفردية، والعناية بأن يتجاوز حجم متوسط والتربسين ابدأ المبلغ المنصوص عليه البروتوكول، هو تجنب أي تلوث الصليب. كل نوع من الخلايا التي يتم جمعها في أنبوب منفصل، تثفيل، وثم يتم تفكيك خلية بيليه.
على الرغم من أن هذا الأسلوب يسمح دراسة التفاعلات paracrine فعالة مع تجنب التفاعلات المباشرة العلنية، لا نستبعد التفاعلات من خلال نفق نانوتوبوليس (تنتس). يمكن أن تكون بعض هذه تنتس ضيقة بما يكفي تمر عبر المسام ميكرومتر 0.4 وطويلة بما يكفي تمتد إلى 10 ميكرون سمك الغشاء. بينما كانت محاولاتنا للتحقق من وجودها في المسام عن طريق الفحص المجهري [كنفوكل] غير حاسمة (البيانات لا تظهر)، يمكن استخدام الميكروسكوب الإلكتروني يحتمل أن تكون لتأكيد وجودها. ولذلك، هذا الأسلوب لا يستبعد الاتصالات خلية خلية المحتملة من خلال تنتس إذا كانت الخلايا مرشح قادر على تشكيل لهم والتفاعل من خلال هذه. وبالمثل، لا يمكننا استبعاد المتزايد autocrine مما يشير إلى نتيجة محتملة بحظر المسام من الخلايا على جانبي الغشاء، منع نشر الصليب.
زراعة الخلايا على السطح أما لغشاء مع 0.4 ميكرومتر المسام يسمح أيضا إمكانية تبادل اكسوسوميس. اكسوسوميس كانت تعتبر تقليديا في أكياس القمامة من الخلايا، ولكن البحوث الحديثة قد أشارت إلى أن هذه الحويصلات مع حمولتها من البروتينات والحمض النووي ميكرورناس، ومرناس حتى تكون بمثابة وسطاء هام ل الاتصالات الخلوية paracrine22 , 23 , 24-ولذلك، يمكن استخدام الأسلوب الثقافة الدانية فعالية لدراسة الاتصالات الخلوية من خلال اكسوسوميس. وبالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب قابلة للمعالجة بمثبطات محددة للإشارات أو تحييد الأجسام المضادة ضد يفرز يجند أو مستقبلات المقابلة. وباختصار، أبلغنا بتطوير طريقة بسيطة ومتعددة الاستعمالات الدانية الثقافة، التي يمكن بدقة النسخ المتماثل paracrine مما يشير إلى حين منع التفاعل المباشر بين الخلايا. بساطة هذا الأسلوب يمكن تطبيقه على نطاق واسع في ميادين متنوعة مثل سرطان علم الأحياء والتنمية، وعلم المناعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن مدينون للمرضى للمشاركة في جمع الأنسجة لهذه التجارب. "وزارة الدفاع أوكرب المبيض السرطان جائزة الأوسكار" (W81XWH-15-0253) وجائزة تجريبية من "مؤسسة حلم" كولين في إلى Anirban ك. ميترا يؤيد هذا البحث.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 mm Transwell permeable support with 0.4 µm Pore Polycarbonate Membrane Insert | Corning (Costar) | 3412 | • 10 µm thick translucent polycarbonate membrane • Treated for optimal cell attachment • Packaged 6 inserts in a 6 well plate, 4 plates per case • Membrane must be stained for cell visibility • Sterilized by gamma radiation |
| 6 well plate | Corning (Falcon) | 353046 | Flat Bottom, TC-treated, sterile, with Lid |
| 15 cm culture dish | Corning (Falcon) | 353025 | Sterile, TC-treated Cell Culture Dish |
| DMEM | Corning (Cellgro) | 10-013-CV | |
| Penicillin Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| MEM Nonessential amino acids | Corning (Cellgro) | 25-025-CI | |
| MEM Vitamins | Corning (Cellgro) | 25-020-CI | |
| 0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Pipets | Any make is fine | ||
| CO2 Incubator | Any make is fine | ||
| Biosafety level II cabinet | Any make is fine | ||
| FN1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs01549976_m1 | |
| TGFB1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs00998133_m1 | |
| CDH1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs01023895_m1 | |
| GAPDH TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs99999905_m1 | |
| miRNeasy mini RNA isolation Kit | Qiagen | 217004 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher Scientific | 43-688-13 | |
| HeyA8 ovarian cancer cells | Obtained from Ernst Lengyel Lab, University of Chicago | ||
| TGFβ Neutralizing Antibody | R&D Systems | MAB1835-100 |
References
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Cupedo, T., Mebius, R. E. Cellular interactions in lymph node development. The Journal of Immunology. 174 (1), 21-25 (2005).
- Suvas, S. Role of Substance P Neuropeptide in Inflammation, Wound Healing, and Tissue Homeostasis. The Journal of Immunology. 199 (5), 1543-1552 (2017).
- Gnecchi, M., Danieli, P., Malpasso, G., Ciuffreda, M. C. Paracrine Mechanisms of Mesenchymal Stem Cells in Tissue Repair. Methods in Molecular Biology. , 123-146 (2016).
- Lionetti, V., Bianchi, G., Recchia, F. A., Ventura, C. Control of autocrine and paracrine myocardial signals: an emerging therapeutic strategy in heart failure. Heart Failure Reviews. 15 (6), 531-542 (2010).
- Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model. International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).
- Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Tackling the cancer stem cells - what challenges do they pose. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (7), 497-512 (2014).
- Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. The cancer stem cell niche: how essential is the niche in regulating stemness of tumor cells. Cell Stem Cell. 16 (3), 225-238 (2015).
- Elenbaas, B., Weinberg, R. A. Heterotypic signaling between epithelial tumor cells and fibroblasts in carcinoma formation. Experimental Cell Research. 264 (1), 169-184 (2001).
- Wilson, K. J., et al. EGFR ligands exhibit functional differences in models of paracrine and autocrine signaling. Growth Factors. 30 (2), 107-116 (2012).
- Kopan, R. Notch signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (10), (2012).
- Singh, A. B., Sugimoto, K., Harris, R. C. Juxtacrine activation of epidermal growth factor (EGF) receptor by membrane-anchored heparin-binding EGF-like growth factor protects epithelial cells from anoikis while maintaining an epithelial phenotype. Journal of Biological Chemistry. 282 (45), 32890-32901 (2007).
- Swartz, M. A., et al. Tumor microenvironment complexity: emerging roles in cancer therapy. Cancer Research. 72 (10), 2473-2480 (2012).
- Mitra, A. K., et al. MicroRNAs reprogram normal fibroblasts into cancer-associated fibroblasts in ovarian cancer. Cancer Discovery. 2 (12), 1100-1108 (2012).
- Nieman, K. M., et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nature Medicine. 17 (11), 1498-1503 (2011).
- Salimian Rizi, B., et al. Nitric oxide mediates metabolic coupling of omentum-derived adipose stroma to ovarian and endometrial cancer cells. Cancer Research. 75 (2), 456-471 (2015).
- Mitra, A. K., et al. Microenvironment-induced downregulation of miR-193b drives ovarian cancer metastasis. Oncogene. 34 (48), 5923-5932 (2015).
- Tomar, S., et al. ETS1 induction by the microenvironment promotes ovarian cancer metastasis through focal adhesion kinase. Cancer Letters. 414, 190-204 (2018).
- Mitra, A. K. Ovarian Cancer Metastasis: A Unique Mechanism of Dissemination. Tumor Metastasis. Xu, K. , InTechOpen. Available from: https://www.intechopen.com/books/tumor-metastasis/ovarian-cancer-metastasis-a-unique-mechanism-of-dissemination 43-58 (2016).
- Iwanicki, M. P., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discovery. 1 (2), 144-157 (2011).
- Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4614-4628 (2014).
- Boelens, M. C., et al. Exosome transfer from stromal to breast cancer cells regulates therapy resistance pathways. Cell. 159 (3), 499-513 (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of exosomes in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).
- Kohlhapp, F. J., Mitra, A. K., Lengyel, E., Peter, M. E. MicroRNAs as mediators and communicators between cancer cells and the tumor microenvironment. Oncogene. 34 (48), 5857-5868 (2015).
