Summary
Parakrin ve juxtacrine hücresel etkileşimlerin tümör ilerleme, bağışıklık yanıtı, anjiogenez ve geliştirme de dahil olmak üzere birçok biyolojik süreçlerinde önemli bir rol oynamaktadır. Burada, proksimal kültür yöntemi parakrin sinyal incelemek için doğrudan hücresel temas engelleyen sırasında salgılanan faktörler yerelleştirilmiş konsantrasyonları nerede saklanır kullanılır.
Abstract
Hücreler arası etkileşimler tümör ilerleme, bağışıklık yanıtı, anjiogenez ve geliştirme de dahil olmak üzere birçok biyolojik süreçlerinde önemli bir rol oynamaktadır. Parakrin veya juxtacrine sinyal bu tür etkileşimler aracılık eder. Bir şartına orta ve coculture çalışmalar etkileşimleri bu iki tür arasında ayırımcılık için en yaygın yöntem vardır. Ancak, yerelleştirilmiş yüksek konsantrasyonda microenvironment salgılanan faktörler parakrin etkileşimleri sırasında etkisini doğru tarafından şartına orta recapitulated değil ve böylece, imprecise sonuçlara yol açabilir. Bu sorunu çözmek için parakrin sinyal çalışmaya proksimal kültür yöntemi tasarladılar. İki hücre tipleri 0.4 µm gözenekli bir 10 µm kalınlığında Polikarbonat membran her iki yüzeyi yetiştirilmektedir. Gözenekleri salgılanan faktörler değişimine izin ver ve aynı zamanda, juxtacrine sinyal inhibe. Hücreleri toplanan ve uç noktada parakrin sinyal etkilerini belirlemek için lysed. Salgılanan faktörlerin yerelleştirilmiş konsantrasyon degradeler için izin vermeye ek olarak, bu yöntem takmaktan kültürünün yanı sıra inhibitörleri kullanımını içeren deneyler için mükellef olur. Biz yumurtalık kanseri hücreleri ve metastaz sitesinde karşılaştıkları mesothelial hücreler arasındaki etkileşimler eğitim için bu yöntemi kullanırken, çeşitli alanlarda sinyal parakrin çalışmaya araştırmacılar için herhangi bir iki yapışık hücre tipleri için adapte edilebilir, tümör microenvironment, immünoloji ve geliştirme de dahil olmak üzere.
Introduction
Kanser hücreleri ve tümör microenvironment tümör ilerleme arasındaki üretken karşılıklı etkileşimler rolü de kurulmuş olup araştırma kanser biyoloji1' deki önemli bir odak noktası haline gelmiştir. Çift yönlü sinyal benzer örnekleri şifa, bağışıklık yanıtı, anjiogenez, kök hücre nişler, yara ve geliştirme2,3,4,5,6 sırasında açısından büyük önem taşıyor , 7 , 8. hücreleri hücre kaderi, doku fizyolojisi ve hastalık ilerleme belirleyen çeşitli şekillerde ekstraselüler ipuçlarını kendi microenvironment gelen tepki bu biyolojik süreçler içinde ortak bir tema olduğunu. Bu nedenle, odak giderek tür hücre-hücre iletişim içinde yer alan mekanizmaları daha iyi bir anlayış geliştirmek doğru döndü. Bu tür etkileşimler çoğunluğu ücretli olabilecek parakrin veya hücreler arasında sinyal juxtacrine. Parakrin sinyal bir yanıtta ise9,10, tetikleme çevresinde, tabloda başka bir hücreyi tarafından karşılık gelen reseptörleri juxtacrine algılanan spesifik sinyal faktörler bir hücre salgılanmasını içerir sinyal iki hücre dahil11,12hücresel bileşenleri arasında doğrudan temas gerektirir.
Böyle sinyal doku homeostazı, hem de tümör microenvironment çok önemli bir bileşenidir. Kanser hücrelerinin parakrin ve juxtacrine faktörleri kanser ilişkili fibroblastlar (restorantlar), bağışıklık hücreleri ve adiposit13,14,15,16gibi tümör stroma hücreden faydalanın. Juxtacrine sinyal bitişik ligandlar ve çentik sinyal veya integrinler ve onların anılan sıraya göre arasındaki etkileşimler reseptörler içerir iken büyüme faktörleri, sitokinler, kemokinler, vb, aracılı sinyal parakrin hücre dışı matriks proteinleri. Yumurtalık kanseri hücreleri ve restorantlar arasındaki karşılıklı etkileşimler tümör ilerleme ve metastaz14önemini göstermiştir. Benzer şekilde, anahtar mikroRNA ve metastatik kolonizasyon17, teşvik kanser hücreleri transkripsiyon faktörleri Onkolojisti yumurtalık kanser hücrelerinin metastaz sitenin kapsayan mesothelial hücreler ile etkileşimleri düzenleyen 18.
Bir şartına orta ikinci hücre tipi ile tedavi etmek için bir hücre türünden toplanan kullanımı dahil parakrin sinyal üzerinde çoğu çalışmaları. Bu yaklaşım yaygın olarak kullanılan iken, alan hücre microenvironment salgılanan faktöründeki yerelleştirilmiş yüksek konsantrasyon düzeyleri etkili çoğaltmaz. Aynı zamanda bir hücre tarafından üretilen salgılanan faktörü, sürekli akış kinetik çoğaltmak başarısız olur ve komşu hücre tarafından alınan. Parakrin salgılanan faktörler sadece kaynak hücre çevresinde gerekli konsantrasyonlarda ve diffüz ve mesafe arttıkça dışarı seyreltik eğilimi gibi kısa mesafelerde etkilidir sinyal. Salgılanan faktör bu yerelleştirilmiş yüksek yoğunlukta bir yanıt reseptör hücre olarak tetiklemek için esastır. Ayrıca, alıcı hücrelerdeki yanıt da yeni salgılanan faktörler ve onların sürekli tükenmesi bozulması, bağlama ve içselleştirilmesi alıcı hücreler ve kaynak hücreye uzak difüzyon yoluyla denge bağlıdır. Klimalı orta yüksek yerelleştirilmiş konsantrasyonları microenvironment içinde mevcut için hesabına konsantre olabilir, ama bu doğru bir şekilde tam konsantrasyonları çoğaltma yapamaz. Ayrıca, üretimin doğal kinetik ve faktör ilgili tükenmesi taklit edemez. Daha doğrusu parakrin sinyal çoğaltmak ve mekanizmaları sinyal juxtacrine ayırmak için her iki yüzeyi geçirgen membran iki hücre tipleri büyüyen içerir bir roman proksimal kültür yöntemi tasarladılar. Gözenekleri juxtacrine etkileşimleri önlemek ve henüz yerelleştirilmiş yüksek konsantrasyonları salgılanan faktörler değişimine izin vermek için küçük. Bu şekilde, bu sistem üretim kinetik ve parakrin faktörler tükenmesi korur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokol kurumsal düzenleme kurulu, Indiana Üniversitesi kuralları izler.
1. hücre hazırlık
-
Yalıtım ve kültür insan birincil mesothelial hücreler
- Ayrı tutma insan birincil mesothelial hücreleri (HPMCs)17,18 daha önce açıklanan ve onları büyümek insan omentumun büyüme orta [Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (% 10 fetal Sığır serum, % 1'i içeren DMEM) tamamlamak penisilin-streptomisin, % 1 esansiyel olmayan amino asitler ve % 1'i vitamin] 37 ° C ve % 5 CO2.
Not: HPMCs genellikle % 100 izdiham (Şekil 1A) yetiştirilmektedir.
- Ayrı tutma insan birincil mesothelial hücreleri (HPMCs)17,18 daha önce açıklanan ve onları büyümek insan omentumun büyüme orta [Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (% 10 fetal Sığır serum, % 1'i içeren DMEM) tamamlamak penisilin-streptomisin, % 1 esansiyel olmayan amino asitler ve % 1'i vitamin] 37 ° C ve % 5 CO2.
-
Yumurtalık kanser hücrelerinin büyüme koşulları
- Tam büyüme orta 37 ° C ve % 5 CO2HeyA8 yumurtalık kanseri hücrelerinde büyür.
Not: Kullanım HeyA8 yetiştirilen yaklaşık % 80'i izdiham (Şekil 1B) hücreleri.
- Tam büyüme orta 37 ° C ve % 5 CO2HeyA8 yumurtalık kanseri hücrelerinde büyür.
2. hücre kültürü
-
Proksimal kültür set-up
- 6-iyi plakaları ile 10 mikron kalınlığında Polikarbonat doku kültürü tedavi membran 0.4 mikron gözenekleri (108 gözenekleri/cm2) ve 4,67 cm2 büyüme alanı için kullanım Transwell ekler. Gerekirse, optimize etmek için farklı Ekle boyutları göre büyüme yüzey alanı seribaşı hücre sayısı ölçekleyerek. Sıcak tam büyüme orta, tripsin ve fosfat tamponlu tuz (PBS) kullanmadan önce 37 ° c.
-
Ekler hazırlanıyor
- HeyA8 hücre membran ucun alt yüzeyinde tohum için INSERT steril forseps kullanarak onun paketinden çıkarın ve bir steril 15 cm kültür tabak içinde ters yerleştirin.
- Derinliği ters Ekle karşılamak ya da herhangi bir uygun Steril konteyner ile vekil için olduğu gibi 15 cm tabak kullanın. Deney bağlı olarak ekler gerekli sayıda 15 cm çanak yerleştirin.
- Buna göre üç denetimi ve üç deneysel koşullar etiket ekler kenarında bir marker ile.
-
Kanser hücrelerinin hazırlanıyor
- 25 cm2 şişeye (~ 2 x 106 hücreler) % 80 izdiham, yetiştirilen HeyA8 hücre trypsinize, 40 – 60 s için 1 mL tripsin (%0.25) ekleyin ve tripsin tam büyüme ortamının 6 mL ile nötralize etmek için.
- 500 x g oda sıcaklığında (RT) 3 dk de hücreleri santrifüj kapasitesi, süpernatant atmak ve hücre Pelet tam büyüme orta 5 mL resuspend. Trypan mavi boya hariç tutma yöntemini kullanarak canlı hücreleri saymak.
-
Kanser hücrelerinin tohumlama
- 100.000 hücre/mL tam büyüme orta canlı HeyA8 hücrelerinin askıya alma. Tam büyüme orta (ters beri bu şimdi, karşı karşıya) Ekle alt 800 μL içinde dikkatle tohum 80.000 HeyA8 hücreleri.
- Böylece hücreleri Ekle (Şekil 1 c) kalır bir kubbe gibi şekli oluşturmak için hücre tohum. Membran Merkezi'nden başlayın ve yavaş yavaş pipetting süre eşmerkezli daireler dışa doğru hareket. 3 mm den fazla herhangi bir orta dökülmesini önlemek için kenarından gidiyor kaçının.
Not: Numaralı seribaşı hücre sayısı hücre büyüme oranı ve deneme süresi bağlıdır. Proksimal bu kültürü için tohumlari HeyA8 hücre sayısı optimize ve hücreleri üçüncü günün sonunda % 80 – 90 birleşmesi olacak.
-
Kanser hücre Eki
- 15 cm çanak kapağı ve dikkatle CO2 kuluçka için ekler içeren yemek taşımak. Orta ve hücreleri üzerine yerleştirin Bu adımda damla bozmaya değil önemlidir. Kanser hücrelerinin Ekle'nin üzerine takmak izin vermek 4 h için 37 ° C'de hücreler bırakın.
-
Mesothelial hücreler hazırlanıyor
- Yaklaşık 4 saat sonra % 100 izdiham tripsin (% 0,25) 1-2 min için 2 mL ile 75 cm2 şişeye (~ 4 x 106 hücreler) içinde yetiştirilen HPMCs trypsinize ve tripsin tam büyüme ortamının 12 mL ile nötralize.
- Hücreleri, 500 x g de RT 3 dk santrifüj kapasitesi, hücre Pelet 10 mL tam büyüme orta resuspend ve trypan mavi boya hariç tutma yöntemini kullanarak canlı hücreleri saymak.
-
Mesothelial hücreler tohumlama
- Canlı HPMCs 300.000 hücre/mL tam büyüme aracı olarak askıya alma. Taze tam büyüme ortamının 2.5 mL 6-şey plaka her şey için ekleyin. Dikkatle Biyogüvenlik hood için dışarı ekler içeren 15 cm çanak getir. Steril forseps kullanarak, INSERT flip ve dik, tam büyüme orta (Şekil 1 c) dalmış alt yüzey bağlı HeyA8 hücreleri ile 6-şey kalıbının kuyuya yerleştirin.
- Tohum 450.000 HPMCs (Şekil 1 c) kuyunun bakan yüzeyi veya ekler olmadan herhangi bir HeyA8 hücreleri HPMC denetimler için bağlı HeyA8 hücreler ekler iç büyüme ortamının 1,5 ml askıya. Hücreleri olmadan büyüme ortamının 1.5 mL HeyA8 denetimleri ekleyin.
-
Proksimal kültür büyüyen
- Proksimal kültür için 72 h 37 ° C ve %5 CO2 CO2 kuluçka büyümeye izin. Gerekirse, orta aşağıdaki gibi doldurulan.
- İç ekleme için 750 µL kaldırın ve taze tam büyüme ortamının 750 µL ekleyin.
- Dış ekleme (6-şey plaka) için 1 mL kaldırın ve 1 mL taze tam büyüme ortamının ekleyin. 1 mL tek adımda orta değiştirme kolaylığı için seçildi. İsterseniz, 1,25 mL kaldırıldı ve yerine.
- Proksimal kültür için 72 h 37 ° C ve %5 CO2 CO2 kuluçka büyümeye izin. Gerekirse, orta aşağıdaki gibi doldurulan.
-
Hücre toplama
- Hücreleri proksimal kültür 72 h sonra toplamak. Hücreleri çapraz bulaşma HeyA8 hücreleri ve HPMCs. Trypsinize önlemek için bu adımı, özel dikkat, onları santrifüj kapasitesi ve çapraz kontaminasyonu önlemek için membran hücrelerdeyse lysing yerine Pelet parçalayıcı.
-
Hücreleri trypsinizing
- Her iki ucun 1 x PBS ile yıkayın.
- Yeni bir de ekler nakletmek ve tripsin eklemek. Tripsin 0.5 mL ucun içeriye doğru ekleyin ve tripsin 2 mL 6-şey kalıbı Ekle alt yüzeyine bağlı kanser hücrelerinin trypsinize ekleyin. 37 ° C'de 2 dk plaka kuluçkaya
-
Tripsin nötralize
- Tam büyüme orta 1 mL tripsin nötralize, yukarı ve aşağı, pipet ve sonra hücreleri almak ve etiketli toplama tüp aktarmak için INSERT içine ekleyin. Tam büyüme ortamı tam bir nötralizasyon için bir ek 2 mL ekleyin. Membran değil delmek hücrelerin bir çapraz kontaminasyonu önlemek için pipetting süre için özen gösterilmelidir.
- Hücreleri ekleme alt toplamak için böylece hücreleri 6-şey kalenin dibine oldu ekledi adım 12,2 alt yüzeyine 2-3 x 2 mL tripsin pipette. Tripsin plaka altındaki büyüme ortamının 6 mL ile etkisiz hale getirmek ve etiketli toplama tüp plaka içeriğini aktarmak.
-
Toplama ve hücre lysing
- 500 x g 3 dk de hücreleri santrifüj kapasitesi ve medya Aspire edin. Resuspend ve fenol ve guanidin thiocyanate-tabanlı lizis reaktif RNA çıkarılması için 0.7 mL ile hücre topakları parçalayıcı. Herhangi bir uygun kiti kullanarak RNA yalıtmak.
3. kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu
Not: Aşağıdaki adımlarda bir nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir gen ifadeleri değişikliklerin sonucu olarak proksimal kültür çalışmaya tepkimesi (qPCR) açıklanmıştır.
- CDNA RNA örneklerinden qPCR için hazır olun. Uygun herhangi bir ters transkriptaz Ters transkripsiyon tüm mRNA emin olmak için karşılık gelen bir tampon ve rasgele astar ile kullanın (bkz. Tablo malzeme).
- Fibronektin (FN1) ve E-cadherin (CDH1) mRNA ifade düzeyde değişiklikleri değerlendirme ve büyüme faktörü beta 1 (TGFβ1) tarafından qPCR gliseraldehit 3-fosfat dehidrogenaz (GAPDH) olarak bir iç kontrol ile dönüşümü. Standart ticari olarak mevcut gen ifade deneyleri ( Tablo malzemelerigörmek) kullanmak veya astar tasarım için mümkündür.
- HeyA8 kontrolleri ile HPMCs ve proksimal kültür HPMC kontrolleri ile yetiştirilen HPMCs ile proksimal kültüründe yetiştirilen HeyA8 hücreleri karşılaştırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Onkolojisti yumurtalık kanser hücrelerinin metastaz periton boşluğuna19içinde yerinde mesothelial hücreler karşılaşma. Mesothelial hücreler yardımıyla uyarlamalı başarılı metastaz17,18,20,21 etkinleştirmek yumurtalık kanser hücrelerinin yanıt-e doğru inducing içinde üretken parakrin ve juxtacrine etkileşimleri . Proksimal kültür yönteminin etkinliğini test etmek için HeyA8 yumurtalık kanseri hücreleri ve HPMCs parakrin Hofstede test ettik. Daha önce bir coculture HeyA8 hücre HPMCs ile fibronektin HPMCs21artan bir ifadesi sonuçlar bildirilmiştir. Bu indüksiyon fibronektin ifade TGFβ artan bir salgı HeyA8 hücreleri21tarafından aracılık ettiği. Bu nedenle, her iki bu hücreler HeyA8 hücreleri ve HPMCs proksimal kültürünü etkisi TGFβ ve fibronektin mRNA seviyesini test. Beklendiği gibi fibronektin ekler üzerinde HeyA8 hücreleri daha düşük yüzey (Şekil 2A) bağlı olmadan seribaşı denetimlerine göre HPMCs içinde artan bir ifade HeyA8 hücreleri ile proksimal kültür sonuçlandı. Benzer şekilde, HPMCs HeyA8 TGFβ artan bir ifade (Şekil 2B) eski hücreler sonuçlandı ile proksimal kültürü. Fibronektin ve TGFβ ifadesi de önemli ölçüde nerede HPMCs (Şekil 2C ve 2D) ekler üst yüzey numaralı seribaşı değil HeyA8 hücreleri üzerine HPMCs ile proksimal kültür denetimleri ile karşılaştırıldığında artmıştır.
Klasik klimalı orta yaklaşımın etkisi karşılaştırmak için bir deney HPMC şartına bir orta HeyA8 hücrelerle tedavi uygulandı. Fibronektin ifade bir düşüş ve TGFβ tedavi ile HPMC şartına orta HeyA8 hücrelerdeki önemli bir değişiklik yapıldı. (Şekil 3A ve 3B). Ayrıca salgılanan TGFβ nötralize antikor proksimal kültür ile engelleme olasılığını test ettik. TGFβ nötralize antikor ile tedavi TGFβ indüksiyon önemli bir azalma HPMCs (Şekil 3 c) ile proksimal kültür HeyA8 hücrelerde sonuçlandı. Ancak, TGFβ nötralize antikor biraz telafi edici yanıt (Şekil 3 c) olarak muhtemelen kontrol HeyA8 hücreleri, TGFβ ifadede arttı.
Buna ek olarak, proksimal kültür etkisi ifade düzeyleri epitel işaretin E-cadherin da test ettik. HeyA8 hücreleri ile proksimal kültür biraz E-cadherin ifade HPMCs (Şekil 2E) artarken, HPMCs yakınlığı ile karşılaştırıldığında denetimleri (Şekil 2F) yetiştirilen HeyA8 hücrelerdeki E-cadherin belirgin bir düşüş gözlenmiştir. Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar yumurtalık kanseri hücreleri ve Gen ifadesinin sırasında her iki hücre türleri etkiler metastaz sitesinde normal hücreler arasındaki sinyal parakrin eğitim proksimal kültür sisteminin etkinliğini göstermek metastatik kolonizasyon sürecinin.
Şekil 1: proksimal kültür sistemi montajı. (A) Bu paneli gösterir insan birincil mesothelial hücreler (HPMCs). (B) Bu panel HeyA8 yumurtalık kanseri hücreleri gösterir. Ölçek çubukları 200 µm (A-B) =. Hücreleri bir transwell alt yüzeyinde seribaşı (C) HeyA8 ile 0.4 µm gözenekleri Ekle. Hücreleri iliştirildikten sonra Insert büyüme orta içeren bir 6-şey kalıbının kuyuya yerleştirildi. Böylece üst yüzeye bağlı ve HeyA8 hücrelerden membran tarafından ayrı kaldık mesothelial hücreler sonra Insert numaralı seribaşı. Membran değişimi izin 0.4 µm gözenekleri faktörler salgılanan ama hücreler arasında doğrudan herhangi bir temas inhibe. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: proksimal kültürünün etkisi mRNA ifade. QPCR(a)fibronektin ve insan birincil mesothelial hücreler (HPMCs) (B) TGFβ1 ifade için proksimale HeyA8 hücreleri, HPMCs denetimine göre kültürlü ilk iki kapı aynası göstermek. Sonraki iki panel show qPCR (C) fibronektin ve (D) TGFβ1 ifade HeyA8 hücrelerdeki için proksimale kültürlü HPMCs için hücreleri kontrol Heya8 karşılaştırıldığında. Son iki panel proksimale HeyA8 hücreleri ve proksimale HPMCs. N kültürlü (F) HeyA8 hücreler kültürlü (E) HPMCs E-cadherin ifade qPCR göstermek = 3, * p < 0,01. Hata çubuklarını temsil eden üç tekrarlar standart sapması. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: insan birincil mesothelial hücre (HPMC) etkisi-orta mRNA ifade HeyA8 hücre tedavisine şartına. En iyi iki panel HeyA8 hücrelerinde(a)fibronektin ve (B) TGFβ1 ifade için qPCR göster. (C) bu son panel HeyA8 TGFβ1 ifadesi ile HPMCs. N proksimal bir kültür üzerine üzerinde salgılanan TGFβ1 nötralize antikor (TGFβ1 Ab) ile inhibe etkisini gösterir = 3, * p < 0,01. p < 0.05. Hata çubuklarını temsil eden üç tekrarlar standart sapması. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Parakrin ve juxtacrine hücreler arasında sinyal mekanizmasının anlama, normal doku homeostazı hastalığı koşullar7,ve8hakkında daha iyi bilgi geliştirmek için önemlidir. Çoğu parakrin toplayarak yürütülen çalışmalar sinyal orta bir hücre tipi ve diğer hücre tipi tedavi etmek için kullanarak şartına. Bu yöntem doğal sadeliği içinde bir avantaja sahiptir. Ancak, bu doğru hücresel microenvironment salgılanan faktörler yerelleştirilmiş konsantrasyonları veya üretim kinetik ve faktörler katılan tükenmesi özetlemek değil. Eski bir ölçüde ele alınabileceği iken, yine de tam olarak, klimalı ortam yoğunlaşarak kinetik yeniden oluşturmak çok zordur. Hücreleri ekleme ve kuyunun büyümeye transwell ekler kullanımı bir dereceye kadar üretim ve tükenmesi kinetik etkileri yeniden ele geçirmek. Ancak, hücreleri ekleme ve kuyunun arasındaki mesafe ayrılır ve böylece, parakrin faktörler yerelleştirilmiş konsantrasyonları yeniden. Biz hangi salgılanan faktörler yerelleştirilmiş yüksek konsantrasyonları, hem de üretim oranı ve faktörler tükenmesi dinamiklerini muhafaza karşılıklı parakrin sinyal, eğitim için bir basit proksimal kültür yöntemi geliştirilmesi bildirdi.
Bir kanıt prensibi çalışmada, yumurtalık kanseri hücreleri ve HPMCs arasındaki etkileşimler bildirilen etkileri üreten içinde proksimal kültür yönteminin etkinliğini göstermiştir. Buna ek olarak, ayrıca E-cadherin HeyA8 hücrelerde ve HPMCs epitel marker ifade üzerinde karşılıklı parakrin etkileşimleri ters etkileri gösterdi. Hücreleri bir 3 gün boyunca kültür deneyimiz söz konusu iken, daha kısa için uyarlanabilir veya hücreleri başlangıç sayısını ayarlayarak uzun zaman puan tohumlari. Bu araştırmacılar kısa süreli hem de uzun vadeli etkileri parakrin sinyal çalışmaya veya zaman ders çalışmaları gerçekleştirmek için sağlar. Bu basit yöntem dahil İmmünoloji, anjiogenez, hücre gelişimi ve iyileşmesi, tümör microenvironment derslerine ek olarak iki yapışık hücre türleri arasında sinyal parakrin üzerinde herhangi bir araştırma için potansiyel olarak uygulanabilir.
Bu yöntemde kritik adımlar hücre zarının alt yüzeyinde tohum ve her iki yüzeyler uç noktada hücrelerden hasat. Bir alt yüzeyinde ilk INSERT saygısız ve orta büyük bir damla hücreleri tohum tohum elde. Alt yüzeyinde daha yapisan hücre okudu iki numaralı seribaşı. Bakım birbaloncuktun engellemeden üzerinden orta önlemek için kuluçka sırasında ekleme rahatsız etmek alınması gerekiyor. Silikon jel busting önlemek için INSERT kenarları ve sıvı balonu dökülmesini için uygulanabilir. Proksimal kültür deney sonunda hücre membran her iki tarafında sırayla yerine doğrudan, lysed onları gözenekler yoluyla lysates, membran riskler çapraz bulaşma üzerinde lysing çünkü trypsinized. Onları kendi bireysel bölümler trypsinizing ve orta ve tripsin sesini asla protokol öngörülen miktarı aşıyor bakımı, herhangi bir çapraz bulaşma önlenmiş olur. Her hücre tipi centrifuged, ayrı bir tüpte toplanır ve hücre Pelet sonra lysed.
Her ne kadar bu teknik açık doğrudan etkileşim kaçınırken parakrin etkileşimlerin etkili çalışma sağlar, etkileşimleri nanotubules (TNTs) tünel üzerinden dışarı kural değil. Bu TNTs bazıları 0.4 µm gözenekler geçmek dar ve membran 10 µm kalınlık span kadar olabilir. Gözenekleri onların huzurunda tarafından confocal mikroskobu doğrulamak için bizim girişimleri (yetersiz veri gösterilmez) iken, elektron mikroskobu potansiyel olarak varlıklarını onaylamak için istihdam olabilir. Aday hücreleri onları oluşturan ve aralarında etkileşim özelliği varsa bu nedenle, bu yöntem sayesinde TNTs potansiyel hücre-hücre iletişim ekarte değil. Benzer şekilde, biz artan otokrin potansiyel gözenekleri hücre membran, her iki tarafında tarafından engellenmesini sonucu olarak sinyal çapraz difüzyon önleme ekarte edemez.
Her iki yüzeyi bir membran 0.4 µm gözenekli hücreler büyüyen ayrıca exosomes potansiyel geçişine izin verir. Exosomes geleneksel olarak hücrelerin çöp torbaları kabul edildi, ancak son araştırma bu veziküller ile onların kargo proteinler, mikroRNA ve hatta mRNA'ların ve DNA parakrin hücresel iletiþim22 önemli arabulucu hizmet belirtti , 23 , 24. bu nedenle, proksimal kültür yöntemi etkin hücresel iletiþim exosomes ile çalışmak için kullanılabilir. Buna ek olarak, bu yöntem salgılanan ligand veya karşılık gelen reseptör karşı sinyal veya nötralize antikorların belirli inhibitörleri ile tedaviye mükellef olur. Özetle, biz doğru bir şekilde hücreleri arasındaki doğrudan etkileşim engelleyen sırasında sinyal parakrin çoğaltabilir bir basit ve çok proksimal kültür Yöntem geliştirilmesi bildirdi. Bu yöntem sadeliği kanser biyoloji, geliştirme ve İmmünoloji gibi çeşitli alanlarda yaygın uygulama sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Biz hastalara bu deneyler dokusu toplamalarında onların katılım için borçlu bulunmaktadır. Bir DoD OCRP yumurtalık kanseri Akademi Ödülü (W81XWH-15-0253) ve Anirban K. Mitra için Colleen'in rüya Vakfı Ödülü pilot bu araştırma desteklenen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 mm Transwell permeable support with 0.4 µm Pore Polycarbonate Membrane Insert | Corning (Costar) | 3412 | • 10 µm thick translucent polycarbonate membrane • Treated for optimal cell attachment • Packaged 6 inserts in a 6 well plate, 4 plates per case • Membrane must be stained for cell visibility • Sterilized by gamma radiation |
| 6 well plate | Corning (Falcon) | 353046 | Flat Bottom, TC-treated, sterile, with Lid |
| 15 cm culture dish | Corning (Falcon) | 353025 | Sterile, TC-treated Cell Culture Dish |
| DMEM | Corning (Cellgro) | 10-013-CV | |
| Penicillin Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| MEM Nonessential amino acids | Corning (Cellgro) | 25-025-CI | |
| MEM Vitamins | Corning (Cellgro) | 25-020-CI | |
| 0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Pipets | Any make is fine | ||
| CO2 Incubator | Any make is fine | ||
| Biosafety level II cabinet | Any make is fine | ||
| FN1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs01549976_m1 | |
| TGFB1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs00998133_m1 | |
| CDH1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs01023895_m1 | |
| GAPDH TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs99999905_m1 | |
| miRNeasy mini RNA isolation Kit | Qiagen | 217004 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher Scientific | 43-688-13 | |
| HeyA8 ovarian cancer cells | Obtained from Ernst Lengyel Lab, University of Chicago | ||
| TGFβ Neutralizing Antibody | R&D Systems | MAB1835-100 |
References
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Cupedo, T., Mebius, R. E. Cellular interactions in lymph node development. The Journal of Immunology. 174 (1), 21-25 (2005).
- Suvas, S. Role of Substance P Neuropeptide in Inflammation, Wound Healing, and Tissue Homeostasis. The Journal of Immunology. 199 (5), 1543-1552 (2017).
- Gnecchi, M., Danieli, P., Malpasso, G., Ciuffreda, M. C. Paracrine Mechanisms of Mesenchymal Stem Cells in Tissue Repair. Methods in Molecular Biology. , 123-146 (2016).
- Lionetti, V., Bianchi, G., Recchia, F. A., Ventura, C. Control of autocrine and paracrine myocardial signals: an emerging therapeutic strategy in heart failure. Heart Failure Reviews. 15 (6), 531-542 (2010).
- Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model. International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).
- Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Tackling the cancer stem cells - what challenges do they pose. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (7), 497-512 (2014).
- Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. The cancer stem cell niche: how essential is the niche in regulating stemness of tumor cells. Cell Stem Cell. 16 (3), 225-238 (2015).
- Elenbaas, B., Weinberg, R. A. Heterotypic signaling between epithelial tumor cells and fibroblasts in carcinoma formation. Experimental Cell Research. 264 (1), 169-184 (2001).
- Wilson, K. J., et al. EGFR ligands exhibit functional differences in models of paracrine and autocrine signaling. Growth Factors. 30 (2), 107-116 (2012).
- Kopan, R. Notch signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (10), (2012).
- Singh, A. B., Sugimoto, K., Harris, R. C. Juxtacrine activation of epidermal growth factor (EGF) receptor by membrane-anchored heparin-binding EGF-like growth factor protects epithelial cells from anoikis while maintaining an epithelial phenotype. Journal of Biological Chemistry. 282 (45), 32890-32901 (2007).
- Swartz, M. A., et al. Tumor microenvironment complexity: emerging roles in cancer therapy. Cancer Research. 72 (10), 2473-2480 (2012).
- Mitra, A. K., et al. MicroRNAs reprogram normal fibroblasts into cancer-associated fibroblasts in ovarian cancer. Cancer Discovery. 2 (12), 1100-1108 (2012).
- Nieman, K. M., et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nature Medicine. 17 (11), 1498-1503 (2011).
- Salimian Rizi, B., et al. Nitric oxide mediates metabolic coupling of omentum-derived adipose stroma to ovarian and endometrial cancer cells. Cancer Research. 75 (2), 456-471 (2015).
- Mitra, A. K., et al. Microenvironment-induced downregulation of miR-193b drives ovarian cancer metastasis. Oncogene. 34 (48), 5923-5932 (2015).
- Tomar, S., et al. ETS1 induction by the microenvironment promotes ovarian cancer metastasis through focal adhesion kinase. Cancer Letters. 414, 190-204 (2018).
- Mitra, A. K. Ovarian Cancer Metastasis: A Unique Mechanism of Dissemination. Tumor Metastasis. Xu, K. , InTechOpen. Available from: https://www.intechopen.com/books/tumor-metastasis/ovarian-cancer-metastasis-a-unique-mechanism-of-dissemination 43-58 (2016).
- Iwanicki, M. P., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discovery. 1 (2), 144-157 (2011).
- Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4614-4628 (2014).
- Boelens, M. C., et al. Exosome transfer from stromal to breast cancer cells regulates therapy resistance pathways. Cell. 159 (3), 499-513 (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of exosomes in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).
- Kohlhapp, F. J., Mitra, A. K., Lengyel, E., Peter, M. E. MicroRNAs as mediators and communicators between cancer cells and the tumor microenvironment. Oncogene. 34 (48), 5857-5868 (2015).
