Summary
Aquí presentamos un protocolo que describe la técnica de oxigenación extracorporal veno-venosa de la membrana (ECMO) en una no intubados, espontáneamente respiración de ratón. Este modelo murino de ECMO puede implementarse con eficacia en estudios experimentales de aguda y enfermedades de la pulmón de fase final.
Abstract
El uso de oxigenación por membrana extracorpórea (ECMO) ha aumentado sustancialmente en los últimos años. ECMO se ha convertido en una terapia fiable y eficaz para aguda así como enfermedades de la pulmón de fase final. Con el aumento de demanda clínica y el uso prolongado de ECMO, optimización de procedimientos y la prevención de daños en múltiples órganos son de vital importancia. El objetivo de este protocolo es presentar una detallada técnica de ECMO veno-venoso en un no-intubados, espontáneamente la respiración del ratón. Este protocolo demuestra el diseño técnico de la ECMO y pasos quirúrgicos. Este modelo murino de ECMO facilitará el estudio de la fisiopatología relacionada con ECMO (p. ej., inflamación, eventos hemorrágicos y tromboembólicos). Debido a la abundancia de ratones genéticamente modificados, los mecanismos moleculares implicados en las complicaciones relacionadas con el ECMO pueden también ser disecados.
Introduction
Oxigenación por membrana extracorpórea (OMEC) es un sistema de soporte de vida temporal que asume las funciones de los pulmones y el corazón para permitir la perfusión y el intercambio de gases adecuado. Hill et al1 se describe el primer uso de ECMO en pacientes en 1972; sin embargo, sólo llegó a ser ampliamente utilizado después de su aplicación exitosa durante la pandemia de H1N1 en el 20092. Hoy en día, ECMO habitualmente se utiliza como un procedimiento para salvar vidas en fase final corazón y pulmón enfermedades3. ECMO veno-venoso es cada vez más empleada como alternativa a la ventilación mecánica invasiva en despierto, no intubados, respiración espontánea pacientes con insuficiencia respiratoria refractaria4.
A pesar de su adopción generalizada, se han reportado diversas complicaciones para ECMO5,6,7. Las complicaciones que pueden ser experimentadas por los pacientes en ECMO incluyen sangrado, trombosis, sepsis, trombocitopenia, anomalías relacionadas con el dispositivo y embolia de aire. Por otra parte, un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (señores) dando por resultado daño en múltiples órganos es bien descrito clínico tanto en estudios experimentales8,9. Complicaciones neurológicas tales como el infarto cerebral se divulgan con frecuencia en pacientes sometidos a terapia de oxigenación por membrana extracorpórea a largo plazo. Para confundir materias, a menudo es difícil distinguir si las complicaciones son causadas por ECMO sí mismo o surgen los trastornos subyacentes que acompañan la aguda y enfermedades de la fase final.
Para estudiar específicamente los efectos de ECMO en un organismo sano, se debe establecer un modelo animal experimental fiable. Hay muy pocos informes sobre el rendimiento de ECMO en pequeños animales y estan todas limitadas a las ratas. Hasta la fecha, ningún modelo de ratón de ECMO se ha descrito en la literatura. Debido a la disponibilidad de un gran número de cepas de ratón modificados genéticamente, establecimiento de un modelo de ratón ECMO permitiría mayor investigación de los mecanismos moleculares implicados en las complicaciones relacionadas con la ECMO10,11.
Basado en el modelo murino descrita de puente cardiopulmonar (CPB)12, hemos desarrollado un método estable para ECMO veno-venoso en no intubado, respiración espontánea ratones. El circuito ECMO (figura 1), que contiene la salida y cánulas de entrada, bomba peristáltica, oxigenador y depósito de la interceptación del aire, es similar al anteriormente descrito modelo de murino CPB12 a excepción de un oscurecimiento más pequeño volumen (0.5 mL). Este protocolo muestra las técnicas detalladas, monitoreo fisiológico y gasometría arterial involucrado en un procedimiento acertado de la oxigenación por membrana extracorpórea.
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Protocol
Los experimentos fueron realizados en ratones C57BL/6 machos, de 12 semanas de edad. Este estudio se llevó a cabo en cumplimiento de las pautas de la ley Animal bajo protocolo TSA 16/2250.
1. preparación de materiales
Nota: Todas las medidas se realizan bajo condiciones limpias, no estériles. Condiciones estériles sería necesarias si el animal debe ser sobrevivió después de la operación.
- Introducir 3 huecos en un tubo de poliuretano de 2 Fr usando una cuchilla quirúrgica en un microscopio con aumentos de 16.
Nota: Todos los huecos deben ubicarse en el tercio distal de la cánula para el drenaje de sangre óptima. - Preparar la solución de cebado (Tabla de materiales). Incluyen 30 UI/mL heparina y 2,5% v/v de una solución al 8,4% de NaHCO3. Refrigerar esta solución a 4 ° C hasta que esté listo para usar. Cebar el circuito con 500 uL de solución de cebado.
- Coloque la cánula de salida en la solución de cebado y llenar la máquina ECMO encendiendo la bomba peristáltica. Seguir a circular la solución de cebado por la máquina para los próximo 30 min a un flujo de 1 mL/min.
- Dar 0.5 L/min de oxígeno 100% para el oxigenador.
2. anestesia
- Lugar el animal en una cámara de inducción llena con una mezcla de oxígeno/isoflurano 2.5% v/v. Proporcionar 0.5 L/min de oxígeno 100% para el vaporizador. Antes de la cirugía, revise que esa anestesia completa se consigue probando pedal reflejos de retirada y el dolor. Aplicar el gel del ojo para evitar daños del secado.
- Use una almohadilla de calentamiento para mantener la temperatura corporal a 37 ° C.
- Realizar anestesia de máscara inhalatoria mediante un vaporizador de isoflurano e inyectar en forma subcutánea 5 mg/kg de carprofeno.
- Observar la respiración espontánea y ajustar la concentración de isoflurano ello es entre 1.3 y 2.5% regularmente.
3. cirugía
- Exponer la vena yugular izquierda mediante el uso de una incisión en la piel lateral de 4 mm con la ayuda de tijeras finas en el lado izquierdo del cuello. Junto con sharp y blunt preparación utilizando hisopos micro pinzas y algodón, usar coagulación bipolar de los vasos pequeños.
- Una vez que se expone la vena yugular izquierda, ligar la parte distal usando una sutura de seda 8-0 con la ayuda de micro pinzas.
- Lugar un nudo deslizante en el extremo proximal de la vena. Haga una incisión en la pared anterior de la vena utilizando micro-tijeras.
- Para lograr la heparinización completa, inyectar heparina de 2,5 UI/g en la vena yugular mediante un braunula 26 G.
- Levantar el lado principal de la almohadilla animal 30° para evitar la pérdida de sangre excesiva de la vena durante la inserción de la cánula.
- Inserte una cánula de (PU) poliuretano 2-Fr en la parte proximal de la vena yugular, rotándolo ligeramente mientras que empuja a una profundidad de 4 cm; al hacerlo, se alcanzará la bifurcación iliaca de la vena cava inferior (IVC).
- Fijar la cánula con nudos de seda 8-0 con Micro-pinzas.
- Exponer la vena yugular derecha usando los pasos descritos en 3.1, 3.2 y 3.3.
- Canule la vena yugular derecha con una cánula de PU 1-Fr y moverlo suavemente 5 mm en la dirección de la aurícula derecha.
- Repita el paso 3.7.
- Cateterizar la arteria femoral izquierda con otra cánula de PU 1-Fr y utilizarlo para presión invasiva, monitoreo y muestreo de sangre para gasometría arterial (BGA).
- Insertar agujas de Electrocardiograma (ECG) conectadas a un dispositivo de adquisición de datos por vía subcutánea en ambos miembros anteriores y en la pared torácica izquierda.
- Inserte un termómetro rectal, conectado a un dispositivo de adquisición de datos.
4. oxigenación por membrana extracorpórea Veno-venoso y gasometría arterial
Nota: Para un esquema del circuito ECMO completado, vea la figura 1.
- Iniciar el ECMO en el animal por encender la bomba con un caudal inicial de 0,1 mL/min ajustar el caudal de la bomba dentro de los próximos 2 minutos 3-5 mL/min.
- En caso de aspiración de aire en la cánula de salida a través del sitio de canulación, reducir el flujo y añadir 0,1 mL de solución de cebado del circuito a través de un depósito de la interceptación del aire.
- Bajo flujo estable, continuar monitorear en tiempo real todos los parámetros vitales mediante el dispositivo de adquisición de datos.
- Constantemente observar reflujo desde el drenaje venoso y el nivel de la sangre en el reservorio de aire-trapper.
- Recoger sangre goteando de heridas en una jeringa de 1 cc con la punta de un 24 G branula andreturn al circuito de ECMO mediante el depósito de la interceptación del aire.
- Para BGA, utilice un cartucho de muestra de sangre para recoger aproximadamente 75 μl de la sangre arterial en los siguientes puntos del tiempo y de las siguientes ubicaciones:
- 10 min después de la iniciación de la OMEC, recoger la sangre de la vena cava inferior mediante un tubo extra construido en antes del oxigenador, vía similar tubo extra después del oxigenador (control) y directamente de la arteria femoral.
- 30 min después de la iniciación de la OMEC, recoger la sangre de la arteria femoral.
- Dar un extra 0,1 mL de la solución de cebado para compensar la pérdida de líquido intravasal cada 45 minutos por aire-trapper o catéter en la arteria femoral o aspirando las burbujas de aire a través de la cánula de drenaje de sangre.
- Para BGA, utilice un cartucho de muestra de sangre para recoger aproximadamente 75 μl de sangre arterial:
- 1 h después del inicio de la oxigenación por membrana extracorpórea de la arteria femoral.
- 2 h después de la iniciación de la OMEC, recoger la sangre de la vena cava inferior mediante un tubo extra construido en antes del oxigenador, vía similar tubo extra después del oxigenador (control) y directamente de la arteria femoral.
- Después de 2 h, reducir el caudal de la bomba poco a poco (a lo largo de 5 minutos), tal modo parar ECMO.
- Continúe registrar parámetros vitales para otros 10 minutos.
- Para finalizar el experimento exanguinante el animal y la recolección de la sangre y órganos.
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Representative Results
Este protocolo describe el método de ECMO veno-venoso en un ratón. Este modelo es confiable y reproducible y en comparación con nuestro modelo previamente descrito de CPB con paro respiratorio y circulatorio12,13, es técnicamente menos exigente establecer.
Flujo ECMO en el sistema venoso se mantuvo entre 1.5 y 5 mL/min. Se mantuvo la presión arterial media entre 70 y 85 mmHg mediante la adición de solución de cebado adicional en el circuito ECMO. Por lo general, la adición de 0,1 mL de solución de cebado del circuito durante ECMO permite la substitución del volumen de sangre. Soluciones tampón o sustitución de volumen todos fueron dados a través de la arteria femoral o depósito de la interceptación del aire.
Parámetros fisiológicos se registraron cada 10 minutos y datos de un representante de ECMO experimento se presentan en la figura 2. Datos BGA de un ECMO éxito se muestran en la tabla 1.
Parámetros hematológicos mostraron relevante hemodilución durante ECMO; sin embargo, no transfusión de sangre era necesaria para compensar la anemia moderada (tabla 1). Parámetros de oxigenación de BGA demostraron el correcto funcionamiento del oxigenador en una mezcla de aire y oxígeno en FiO2 1.0 (tabla 1).
Cambios metabólicos durante ECMO demostraron alcalosis respiratoria al inicio y acidosis moderada al final del experimento (cuadro 1). Sin buffer de la sangre fue realizado.
Figura 1: esquema de ECMO en un ratón. Se drena sangre de la vena cava inferior (IVC) a través de la vena yugular izquierda y la sangre oxigenada es bombeada a la vena cava superior (SVC) a través de la vena yugular derecha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: parámetros fisiológicos medición durante 2 h de la OMEC. Un ritmo =, B = presión arterial media (VS = sustitución de volumen) y C = temperatura rectal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| 10 min | 30 min | 1 h | 2 h | |||||
| Parámetros | O | FA | VENA CAVA INFERIOR | FA | FA | O | FA | VENA CAVA INFERIOR |
| pH | 7.67 | 7.51 | 7.31 | 7.57 | 7.5 | 7.6 | 7.57 | 7.34 |
| pCO2 (mmHg) | 24.5 | 24 | 52 | 26 | 25 | 22 | 26 | 51.1 |
| pO2 (mmHg) | 707 | 656 | 135 | 643 | 621 | 638 | 573 | 101 |
| HCO3 (mmol/L) | 28.3 | 25.3 | 26 | 24 | 23 | 27 | 23 | 25 |
| sO2 (%) | 100 | 100 | 99 | 100 | 100 | 100 | 100 | 98 |
| HCT (%) | 24 | 23 | 23 | 20 | 18 | 17 | 17 | 16 |
| HB (g/dl) | 8.8 | 8.6 | 8.5 | 8 | 7.8 | 7.6 | 7.2 | 7 |
| Lac (mmol/L) | 1.9 | 1.7 | 1.8 | 2.1 | 2.4 | 3.2 | 3.1 | 3.3 |
Tabla 1: resultados BGA en el transcurso del experimento. O = oxigenador, FA = arteria femoral y vena cava inferior = vena cava inferior.
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Discussion
Hemos descrito previamente, un exitoso modelo de CPC en un ratón12,13. Para implementar este modelo para aguda o trastornos de pulmón fase final hemos desarrollado un circuito ECMO veno-venoso de fácil de usar para los ratones. Diferentes al modelo del CPB, veno-venosas ECMO no requiere complicados procedimientos quirúrgicos como la esternotomía y pinzamiento de la aorta, reduciendo así el riesgo de sangrado de herida en un animal completamente heparinizado. Para evitar la embolización de oxigenador con coágulos de sangre, 2,5 UI de heparina/kg se le da a cada animal. Esta dosis se basó en mediciones anteriores del tiempo de coagulación activado (ACT) que mostró completa anticoagulación de la sangre (> 800 sec del acto). Debido a la ausencia de la capa de heparina en el micro-oxigenador, nuestro protocolo de anticoagulación se mantuvo similar a nuestro procedimiento CPB.
En comparación con el circuito de CEC, podríamos reducir el total volumen de cebado a 0,5 mL por reducción del volumen del aire-trapper y micro-oxigenador. Por otra parte, un flujo más lento era necesario para mantener la oxigenación adecuada del animal. Intravasal pérdida de volumen de la sangre dio lugar a una disminución gradual de la presión arterial media. Añadiendo un extra 0,1 mL de volumen de cebado para el animal llevó a un aumento en la presión arterial más de 20 mmHg, pero una pequeña reducción lineal en la presión arterial durante los siguiente 30 min estaba siempre presente. Substitución del volumen fue llamada por si el aire es aspirado a través de la cánula de drenaje o hubo una caída en la presión arterial por debajo de 75 mmHg.
El reto más difícil en el procedimiento quirúrgico para el modelo de ratón ECMO es la colocación de la cánula a través de la vena yugular izquierda en la vena cava inferior. Para establecer este método, se probaron diferentes tipos de cánulas y una laparotomía fue realizada en cadáveres de ratón para perfeccionar la posición de la punta de la cánula en la vena cava inferior justo antes de la bifurcación ilíaca. A veces, en animales más grandes, la colocación de la cánula puede conducir a la dislocación de la cánula en la vena del riñón derecho. Sin embargo, la sangre de todos los segmentos de la vena cava inferior pueden ser bien drenada debido a huecos laterales de la cánula.
En ensayos preliminares, se realizó la canalización a través de la vena femoral. Desafortunadamente, sólo una cánula 1-Fr se puede colocar en la vena femoral, que se traduce en flujo de sangre inadecuado (≤ 1 mL/min). 1-Fr catéteres empujan en el IVC todo muestra reflujo insuficiente. Para lograr la expulsión importante, ambas venas femorales tendría que ser canulado; por lo tanto, abandonó este procedimiento y logra un drenaje adecuado mediante una cánula de 2 Fr colocada en la vena cava inferior a través de la vena yugular. La pérdida de sangre durante la colocación de la cánula en la vena yugular es muy típica. Por lo tanto, antes de la colocación, la cabecera de la almohadilla del animal se eleva 30-40°, por lo que el reflujo de la vena se reduce significativamente.
Una reducción gradual en la hemoglobina y hematocrito se explica por la hemólisis y muestreos repetitivos de sangre para demostrar el funcionamiento del dispositivo. Para experimentos de supervivencia, para evitar las transfusiones de sangre, muestras de sangre deben extremadamente limitado o incluso evitado. Por otra parte, al final del experimento, la sangre del circuito de ECMO debe devolverse en el animal. Sin embargo, supervivencia del modelo tiene que ser estudiada en un proyecto independiente que utiliza un protocolo menos invasivo.
Flujo sanguíneo durante la ECMO fue entre 3 y 5 mL/min de gasto cardíaco Normal del ratón se reporta entre 6 y 9 mL/min; por lo tanto, en promedio, hemos sido capaces de lograr un flujo ECMO del 54% del gasto cardíaco del ratón. Generalmente, ECMO veno-venoso requiere menor flujo de sangre en comparación con el ECMO veno-arterial, overperfusion de la aurícula derecha puede conducir a sobrecarga ventricular derecha y por lo tanto, la insuficiencia cardíaca. Clínico, para lograr oxigenación adecuada, un flujo ECMO veno-venoso de 50-75% del gasto cardíaco basta con suficiente oxigenación en pacientes ventilados o respiración espontánea. Aumentar innecesariamente el flujo ECMO puede provocar más daños por señores y hemólisis y recirculación inútil de la mayor parte de la sangre venosa entre el IVC y SVC. Por otra parte, observamos que mediante el aumento del flujo en el ECMO veno-venosa, una presión negativa excesiva conduce a aire de succión en el sitio de canulación. Nuestro animales recibidos oxígeno al 100% bajo anestesia isoflurano y con la ayuda de ECMO veno-venoso, fueron híper oxigenados. En nuestro modelo hemos intentado reproducir las condiciones de "ECMO despierto"4 con menos daño a los pulmones.
Ahora se pueden investigar los mecanismos moleculares implicados en las complicaciones relacionadas con la ECMO debido a la gran cantidad de cepas de ratón genéticamente modificados disponibles. También hay más de 80 cepas de ratones con trastornos pulmonares que pueden simular el ECMO en el contexto de estas enfermedades subyacentes. Por lo tanto, creemos que nuestro modelo de ratón ECMO veno-venoso puede aplicarse en múltiples proyectos sinérgicos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este proyecto fue apoyado por KFO 311 beca del Deutsche Forschungsgemeinschaft.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterofundin | B.Braun Petzold GmbH | PZN:8609189 | in 1:1 with Tetraspan |
| Tetraspan 6% Solution | B. Braun Melsungen AG | PZN: 05565416 | in 1:1 with Sterofundin |
| Heparin Natrium 25.000 | Ratiopharm GmbH | PZN: 3029843 | 2,5 IU per ml of priming |
| NaHCO3 8,4% Solution | B. Braun Melsungen AG | PZN: 1579775 | 3% in priming solution |
| Carprofen | Zoetis Inc., USA | PZN:00289615 | 5mg/kg/BW |
| 1 Fr PU Catheter | Instechlabs INC., USA | C10PU-MCA1301 | carotide artery |
| 2 Fr PU Catheter | Instechlabs INC., USA | C20PU-MJV1302 | jugular vein |
| 8-0 Silk suture braided | Ashaway Line & Twine Co., USA | 75290 | ligature |
| Isoflurane | Piramal Critical Care GmbH | PZN:9714675 | narcosis |
| Spring Scissors - 6mm Blades | Fine Science Tools GmbH | 15020-15 | instruments |
| Spring Scissors - 2mm Blades | Fine Science Tools GmbH | 15000-03 | instruments |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools GmbH | 13009-12 | instruments |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools GmbH | 11295-51 | instruments |
| Castroviejo Micro Needle Holder - 9cm | Fine Science Tools GmbH | 12060-02 | instruments |
| Micro Serrefines | Fine Science Tools GmbH | 18555-01 | instruments |
| Bulldog Serrefine | Fine Science Tools GmbH | 18050-28 | instruments |
| Isoflurane Vaporizer Drager 19.1 | Drägerwerk AG & Co. KGaA | anesthesia 1,3 -2,5% | |
| Multichannel Data Aquisition Device with ISOHEART Software | Hugo Sachs Elektronik GmbH, Germany | invasive pressure, ECG, t °C | |
| i-STAT portable device | Abbott Laboratories, Lake Bluff, Illinois, USA | blood gas analysis | |
| i-STAT CG4+ and CG8+ cartridges | Abbott Laboratories, Lake Bluff, Illinois, USA | blood gas analysis | |
| C57Bl/6 mice, male, 30 g, 14 weeks old | Charles River Laboratories | housed 1 week before |
References
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