Summary
Her præsenterer vi en protokol, der beskriver teknik af veno-venøse ekstrakorporal membran iltning (ECMO) i en ikke-intuberet, spontant vejrtrækning mus. Denne murine model af ECMO kan gennemføres effektivt i eksperimentelle undersøgelser af akut og slutstadiet lungesygdomme.
Abstract
Brugen af ekstrakorporal membran iltning (ECMO) steget betydeligt i de seneste år. ECMO er blevet en pålidelig og effektiv behandling for akut samt slutstadiet lungesygdomme. Med stigningen i kliniske efterspørgsel og langvarig brug af ECMO er proceduremæssige optimering og forebyggelse af multi organskader af afgørende betydning. Formålet med denne protokol er at fremlægge en detaljeret teknik af veno-venøs ECMO i en ikke-intuberet, spontant vejrtrækning mus. Denne protokol viser den tekniske konstruktion af ECMO og kirurgiske skridt. Denne murine ECMO model vil lette undersøgelsen af Patofysiologi relateret til ECMO (fx, betændelse, blødning og tromboemboliske hændelser). På grund af overfloden af genmodificerede mus, kan de molekylære mekanismer involveret i ECMO-relaterede komplikationer også blive dissekeret.
Introduction
Ekstrakorporal membran iltning (ECMO) er en midlertidig livsunderstøttelsessystem, der tager over funktionerne af lunger og hjerte til at give tilstrækkelig gasudveksling og perfusion. Hill mfl1 beskrives den første brug af ECMO hos patienter i 1972; dog, det kun blev udbredt efter sine vellykket anvendelse under H1N1 influenza pandemi i 20092. I dag, anvendes ECMO rutinemæssigt som en livreddende procedure i slutstadiet hjerte og lunge sygdomme3. Veno-venøs ECMO er stadig ansat som et alternativ til invasiv mekanisk ventilation i vågen, intuberet, spontant vejrtrækning patienter med refraktær respirationssvigt4.
På trods af dens udbredte vedtagelse, er forskellige komplikationer blevet rapporteret til ECMO5,6,7. Komplikationer, der kan opleves af patienter på ECMO omfatter blødning, trombose, sepsis, trombocytopeni, enhedsrelaterede funktionsfejl og luft emboli. Desuden er en systemisk inflammatorisk respons syndrom (SIRS) resulterer i multi organskader velbeskrevne både klinisk og eksperimentelle undersøgelser8,9. Neurologiske komplikationer såsom hjernen infarkt er også ofte rapporteret i patienter i langtidsbehandling ECMO. For at forvirre spørgsmål, er det ofte vanskeligt at skelne om komplikationer er forårsaget af ECMO selv eller skyldes den underliggende sygdomme ledsager akut og slutstadiet sygdomme.
At specifikt undersøge virkningerne af ECMO på en sund organisme, må der fastlægges en pålidelige eksperimentelle dyremodel. Der er meget få rapporter om ECMO ydeevne på små dyr og er alle begrænsede til rotter. Til dato, er ingen musemodel af ECMO blevet beskrevet i litteraturen. På grund af tilgængeligheden af et stort antal af genmodificerede mus stammer, ville etablering af en mus ECMO model tillade yderligere undersøgelse af de molekylære mekanismer involveret i ECMO-relaterede komplikationer10,11.
Baseret på vores tidligere beskrevet murine model af hjertemassage bypass (CPB)12, har vi udviklet en stabil metode til veno-venøs ECMO i ikke-intuberet, spontant vejrtrækning mus. ECMO kredsløb (figur 1), der indeholder udstrømning og indstrømning cannulas, en peristaltisk pumpe, oxygenator og luft-fældefangst reservoir, er magen til vores tidligere beskrevne model af murine CPB12 bortset fra at have en mindre priming volumen (0,5 mL). Denne protokol viser detaljerede teknikker, fysiologiske overvågning og blod gas analyse involveret i en vellykket ECMO procedure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsøgene blev udført på mandlige C57BL/6 mus, alderen 12 uger. Denne undersøgelse blev gennemført i overensstemmelse med retningslinjerne i den tyske Animal lov under protokollen TSA 16/2250.
1. materialer forberedelse
Bemærk: Alle trin er udført under rene, ikke-sterile forhold. Sterile forhold ville være påkrævet, hvis dyret er at overlevet efter operationen.
- Indføre 3 fenestrations ind i en 2-Fr polyurethan rør ved hjælp af en kirurgiske kniv under et mikroskop med 16 X forstørrelse.
Bemærk: Alle fenestrations skal være placeret i den distale tredjedel af kanyle til at sikre optimal blod dræning. - Forberede priming løsning (Materialer tabel). Omfatte 30 IE/mL heparin og 2,5% v/v af en 8,4% NaHCO3. Køleskab denne løsning ved 4 ° C, indtil det er klar til brug. Prime kredsløb med 500 uL af priming løsning.
- Placer udstrømning kanyle i priming løsning og fylde ECMO maskinen ved at skifte på den peristaltiske pumpe. Fortsætte med at cirkulere priming løsning gennem maskinen i de næste 30 min med en væskehastighed på 1 mL/min.
- Give 0,5 L/min. 100% ilt til oxygenator.
2. anæstesi
- Sted dyret i en induktion sal fyldt med en 2,5% v/v isofluran/ilt blanding. Give 0,5 L/min. 100% ilt til vaporizer. Før operationen, tjekke at fuld anæstesi er opnået ved afprøvning pedal tilbagetrækning og smerte reflekser. Anvende eye gel for at undgå tørring skader.
- Brug en opvarmning pad til at opretholde kropstemperaturen ved 37 ° C.
- Udføre indånding maske anæstesi ved hjælp af en isofluran vaporizer og indsprøjtes 5 mg/kg carprofen subkutant.
- Regelmæssigt observere spontan vejrtrækning og justere koncentrationen af isofluran, så det er mellem 1,3% og 2,5%.
3. kirurgi
- Udsætte den venstre halsfedt ved hjælp af en lateral hud indsnit i 4 mm ved hjælp af fine saks i venstre side af halsen. Sammen med skarpe og stumpe forberedelse ved hjælp af mikro-pincet og bomuld svaberprøver, bruge bipolar koagulation af de små fartøjer.
- Når den venstre halsfedt er udsat, ligate den distale del ved hjælp af en 8-0 silke sutur ved hjælp af mikro-pincet.
- Placer en slip knude i den proksimale ende af venen. Incise den forreste væg af venen ved hjælp af mikro-saks.
- For at opnå fuld heparinization, skal du injicere 2,5 I.E. pr. g heparin i halsfedt via en 26 G braunula.
- Hæve den hoved side af den animalsk pad ved 30° til at undgå overdreven blodtab fra venen i løbet indsættelse af kanylen.
- Indsætte en 2-Fr polyurethan (PU) kanyle i den proksimale del af halsfedt, rotere det lidt mens skubbe det til en dybde af 4 cm; mens du gør det, vil den iliaca tvedeling af ringere vena cava (IVC) nås.
- Sikre kanylen med 8-0 silke knuder ved hjælp af microforceps.
- Udsætte den rigtige halsfedt ved hjælp af fremgangsmåden beskrevet i 3.1, 3.2 og 3.3.
- Kanyleres den rigtige halsfedt med en 1-Fr PU kanyle og forsigtigt flytte den 5 mm i retning af højre atrium.
- Gentag trin 3.7.
- Catheterize venstre femoralis arterie med en anden 1-Fr PU kanyle og bruge det til invasiv pres overvågning samt udtagning af blodprøve for blod gas analyse (BGA).
- Indsæt elektrokardiogram (EKG) nåle forbundet med en data erhvervelse enhed subkutant i begge forbens og ind i venstre thorax væggen.
- Indsæt en rektal termometer, forbundet med en data erhvervelse enhed.
4. Veno-venøse ekstrakorporal membran iltning og blod Gas analyse
Bemærk: En skematisk af komplet ECMO kredsløbet, se figur 1.
- Indlede ECMO på dyret ved at dreje på pumpen med en indledende gennemstrømningshastighed på 0,1 mL/min. Juster flowet i pumpen inden for de næste 2 min til 3-5 mL/min.
- I tilfælde af luft suges i udstrømning kanyle via webstedet cannulation, reducere strømmen og tilsættes 0,1 mL priming til kredsløbet via en luft-fældefangst reservoir.
- Under stabile flow, fortsætte med at overvåge i realtid tilstand alle vitale parametre via data erhvervelse enhed.
- Konstant observere tilbageløb fra den venøse afløb og overvågning af blod i luften-pelsjæger reservoir.
- Indsamle enhver blodet siver ud fra sår i en 1 cc sprøjte med spidsen af en 24 G branula andreturn det til ECMO kredsløbet via luft-fældefangst reservoir.
- BGA, bruge en blod prøveudtagning patron til at indsamle ca 75 µL af arterielt blod på følgende tidspunkter og fra følgende placeringer:
- 10 min efter indledningen af ECMO, indsamle blod fra IVC via en ekstra rør bygget før oxygenator via lignende ekstra rør efter oxygenator (kontrol), og direkte fra arteria femoralis.
- 30 min efter indledningen af ECMO, indsamle blod fra arteria femoralis.
- Give en ekstra 0,1 mL af priming løsning at kompensere for intravasal flydende tab hver 45 min via luft-trapper eller femorale arterie kateter eller ved at suge luftbobler gennem blod afdrypning kanyle.
- BGA, bruge en blod prøveudtagning patron til at indsamle ca 75 µL af arterielt blod:
- 1 h efter indledningen af ECMO fra arteria femoralis.
- 2 h efter indledningen af ECMO, indsamle blod fra IVC via en ekstra rør bygget før oxygenator via lignende ekstra rør efter oxygenator (kontrol), og direkte fra arteria femoralis.
- Efter 2 h, reducere strømningshastigheden på pumpen gradvist (i løbet af 5 min), derved opbremsning ECMO.
- Fortsætte med at optage vitale parametre for en anden 10 min.
- Afslutte eksperimentet ved exsanguinating dyret og høst blod og organer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol beskriver metoden for veno-venøs ECMO i en mus. Denne model er pålidelig og reproducerbar, og i forhold til vores tidligere beskrevne model af CPB med respiratoriske og kredsløbssygdomme anholdelse12,13, det mindre teknisk krævende at etablere.
ECMO flow i de venøse system blev opretholdt mellem 1,5 og 5 mL/min. Det middel-arterielt tryk blev holdt mellem 70 og 85 mmHg ved at tilføje ekstra priming løsning til ECMO kredsløb. Normalt, tillader tilføje 0,1 ml af priming løsning til kredsløbet under ECMO substitution af blodvolumen. Alle bind erstatte eller bufferkapacitet løsninger blev givet via femorale arterie eller luft-fældefangst reservoir.
Fysiologiske parametre blev registreret hvert 10 min og data fra en repræsentant ECMO eksperimentere er præsenteret i figur 2. BGA data fra en vellykket ECMO er vist i tabel 1.
Hematological parametre viste relevante blodfortynding under ECMO; men ingen blodtransfusion var nødvendige for at kompensere for moderat anæmi (tabel 1). Iltning parametre fra BGA demonstreret korrekt udførelse af oxygenator på en ilt/luft blanding på FiO2 1,0 (tabel 1).
Metaboliske ændringer under ECMO viste respiratorisk alkalose i starten og moderat acidose i slutningen af forsøget (tabel 1). Ingen ekstra buffering af blodet blev udført.
Figur 1: ECMO layout i en mus. Blod er drænet fra den ringere vena cava (IVC) via den venstre halsfedt og iltet blod pumpes ind i den overlegne vena cava (SVC) via den rigtige halsfedt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: fysiologiske parametre måles under 2 h af ECMO. En = puls, B = middel-arterielt tryk (VS = volumen substitution), og C = rektal temperatur. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| 10 min | 30 min | 1 h | 2 h | |||||
| Parametre | O | FA | IVC | FA | FA | O | FA | IVC |
| pH | 7,67 | 7,51 | 7.31 | 7.57 | 7.5 | 7.6 | 7.57 | 7.34 |
| pCO2 (mmHg) | 24,5 | 24 | 52 | 26 | 25 | 22 | 26 | 51.1 |
| pO2 (mmHg) | 707 | 656 | 135 | 643 | 621 | 638 | 573 | 101 |
| HCO3 (mmol/L) | 28.3 | 25,3 | 26 | 24 | 23 | 27 | 23 | 25 |
| sO2 (%) | 100 | 100 | 99 | 100 | 100 | 100 | 100 | 98 |
| HCT (%) | 24 | 23 | 23 | 20 | 18 | 17 | 17 | 16 |
| HB (g/dl) | 8.8 | 8.6 | 8.5 | 8 | 7.8 | 7.6 | 7.2 | 7 |
| Lac (mmol/L) | 1.9 | 1.7 | 1.8 | 2.1 | 2.4 | 3.2 | 3.1 | 3.3 |
Tabel 1: BGA resultater i løbet af eksperimentet. O = oxygenator, FA = femorale arterie og IVC = ringere vena cava.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskrev tidligere, en vellykket model af CPB i en mus12,13. At gennemføre sådan en model for akut eller slutstadiet lungesygdomme vi udviklet en let-at-bruge veno-venøs ECMO kredsløb for mus. Forskellige CPB model, veno-venøse ECMO kræver ikke kompliceret kirurgiske procedurer såsom sternotomi og Fastspænding af aorta, hvilket reducerer risikoen for sår blødning i en fuldt heparinized dyr. For at undgå embolisering af oxygenator med blodpropper, gives 2,5 IE heparin pr. kg til hvert dyr. Denne dosis var baseret på tidligere målinger af den aktiveret koagulationstid (ACT), der viste fuld antikoagulation af blodet (lov > 800 sek). På grund af manglende heparin belægning i mikro-oxygenator, blev vores antikoagulation protokol holdt lignende til vores CPB procedure.
I forhold til CPB kredsløb, kunne vi reducere samlet priming volumen til 0,5 mL ved at reducere mængden af luft-trapper og mikro-oxygenator. Desuden var en langsommere flow nødvendigt at beholde tilstrækkelig iltning af dyret. Intravasal tab af blodvolumen resulterede i en gradvis nedgang af middel-arterielt tryk. Tilføje en ekstra 0,1 mL af priming volumen til dyret førte til en stigning i blodtrykket over 20 mmHg, men en lille lineær reduktion i arterielt tryk over de næste 30 min var altid til stede. Volumen substitution blev kaldt Hvis luften blev suget gennem dræning kanyle eller var der et fald i blodtrykket under 75 mmHg.
Den sværeste udfordring i den kirurgiske procedure for musen ECMO model er placering af kanylen via den venstre halsfedt i IVC. For at etablere denne metode, forskellige typer af cannulas blev testet, og en laparotomi blev udført i mus kadavere til perfekt placering af kanylen tip til IVC lige før den iliaca bifurkation. Nogle gange, i større dyr, kan placering af kanylen føre til forstyrrelser af kanylen i højre nyre-vene. Ikke desto mindre kunne fuldblod fra alle segmenter af IVC være veldrænet på grund af side fenestrations af kanylen.
I indledende forsøg udført vi cannulation via den femorale vene. Desværre kun en 1-Fr kanyle kan placeres i den femur vene, hvilket resulterer i utilstrækkelig blodgennemstrømning (≤ 1 mL/min). 1-Fr katetre skubbet i IVC alle vist utilstrækkelige tilbagestrømning. For at opnå betydelige tilbagestrømning, skulle både femoralis vener være kanylerede; Derfor, vi opgivet denne procedure og opnået tilstrækkelige dræning via en 2-Fr kanylen placeres i IVC via halsfedt. Blodtab under placering af kanylen i halsfedt er meget typisk. Derfor er hovedet ende af animalske pad før placering rejst 30-40°, så tilbageløb fra venen reduceres betydeligt.
En gradvis reduktion i hæmoglobin og hæmatokrit er forklaret af hæmolyse og gentagne blod prøveudtagninger taget at påvise effektiviteten af enheden. For overlevelse eksperimenter, for at undgå blodtransfusioner, bør udtagning af blodprøve være yderst begrænset eller endda undgås. Desuden, i slutningen af forsøget, blod fra ECMO kredsløb bør returneres til dyret. Overlevelsesevne af modellen har imidlertid undersøges i et separat projekt ved hjælp af en mindre invasiv protokol.
Blodgennemstrømningen under vores ECMO løber var mellem 3 og 5 mL/min. Normal mus minutvolumen er rapporteret til at være mellem 6 og 9 mL/min. Derfor, i gennemsnit, vi har kunnet opnå en ECMO flow af 54% af musens minutvolumen. Veno-venøs ECMO kræver som regel, lavere blodgennemstrømning i forhold til veno-arteriel ECMO, som overperfusion af højre atrium kan føre til højre ventrikel overbelastning og derfor hjertesvigt. Klinisk, for at opnå tilstrækkelig iltning, er en veno-venøs ECMO flow på 50-75% af minutvolumen nok for tilstrækkelig iltning i ventileret eller spontant vejrtrækning patienter. Unødigt øge ECMO flow kan føre til mere skade forårsaget af herrer og hæmolyse og ubrugelig recirkulation af størstedelen af det venøse blod mellem IVC og SVC. Desuden konstaterede vi, at ved at øge flow i den veno-venøs ECMO, overdreven undertryk fører til luft suge i stedet for cannulation. Vores dyr har modtaget 100% ilt under isofluran anæstesi, og med hjælp fra veno-venøs ECMO, var hyper-iltet. I vores model har vi forsøgt at genskabe betingelserne for "vågen ECMO"4 har mindre skader på lungerne.
De molekylære mekanismer involveret i ECMO-relaterede komplikationer kan nu blive undersøgt på grund af overfloden af genmodificerede mus stammer tilgængelige. Der er også mere end firs stammer af mus med lungesygdomme, der kan simulere ECMO i forbindelse med disse underliggende sygdomme. Derfor mener vi, at vores veno-venøs ECMO musen model kan gennemføres i flere synergistiske projekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette projekt blev støttet af KFO 311 tilskud fra Deutsche Forschungsgemeinschaft.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterofundin | B.Braun Petzold GmbH | PZN:8609189 | in 1:1 with Tetraspan |
| Tetraspan 6% Solution | B. Braun Melsungen AG | PZN: 05565416 | in 1:1 with Sterofundin |
| Heparin Natrium 25.000 | Ratiopharm GmbH | PZN: 3029843 | 2,5 IU per ml of priming |
| NaHCO3 8,4% Solution | B. Braun Melsungen AG | PZN: 1579775 | 3% in priming solution |
| Carprofen | Zoetis Inc., USA | PZN:00289615 | 5mg/kg/BW |
| 1 Fr PU Catheter | Instechlabs INC., USA | C10PU-MCA1301 | carotide artery |
| 2 Fr PU Catheter | Instechlabs INC., USA | C20PU-MJV1302 | jugular vein |
| 8-0 Silk suture braided | Ashaway Line & Twine Co., USA | 75290 | ligature |
| Isoflurane | Piramal Critical Care GmbH | PZN:9714675 | narcosis |
| Spring Scissors - 6mm Blades | Fine Science Tools GmbH | 15020-15 | instruments |
| Spring Scissors - 2mm Blades | Fine Science Tools GmbH | 15000-03 | instruments |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools GmbH | 13009-12 | instruments |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools GmbH | 11295-51 | instruments |
| Castroviejo Micro Needle Holder - 9cm | Fine Science Tools GmbH | 12060-02 | instruments |
| Micro Serrefines | Fine Science Tools GmbH | 18555-01 | instruments |
| Bulldog Serrefine | Fine Science Tools GmbH | 18050-28 | instruments |
| Isoflurane Vaporizer Drager 19.1 | Drägerwerk AG & Co. KGaA | anesthesia 1,3 -2,5% | |
| Multichannel Data Aquisition Device with ISOHEART Software | Hugo Sachs Elektronik GmbH, Germany | invasive pressure, ECG, t °C | |
| i-STAT portable device | Abbott Laboratories, Lake Bluff, Illinois, USA | blood gas analysis | |
| i-STAT CG4+ and CG8+ cartridges | Abbott Laboratories, Lake Bluff, Illinois, USA | blood gas analysis | |
| C57Bl/6 mice, male, 30 g, 14 weeks old | Charles River Laboratories | housed 1 week before |
References
- Hill, J. D., et al. Prolonged Extracorporeal Oxygenation for Acute Post-Traumatic Respiratory Failure (Shock-Lung Syndrome). New England Journal of Medicine. 286 (12), 629-634 (1972).
- Noah, M. A., et al. Referral to an Extracorporeal Membrane Oxygenation Center and Mortality Among Patients With Severe 2009 Influenza A(H1N1). Journal of the American Medical Association. 306 (15), 1659 (2011).
- Maslach-Hubbard, A., Bratton, S. L. Extracorporeal membrane oxygenation for pediatric respiratory failure: History, development and current status. World Journal of Critical. Care Medicine. 2 (4), 29-39 (2013).
- Langer, T., et al. "Awake" extracorporeal membrane oxygenation (ECMO): pathophysiology, technical considerations, and clinical pioneering. Critical Care. 20 (1), 150 (2016).
- Esper, S. A. Extracorporeal Membrane Oxygenation. Advances in Anesthesia. 35 (1), 119-143 (2017).
- Millar, J. E., Fanning, J. P., McDonald, C. I., McAuley, D. F., Fraser, J. F. The inflammatory response to extracorporeal membrane oxygenation (ECMO): a review of the pathophysiology. Critical Care. 20 (1), 387 (2016).
- Lubnow, M., et al. Technical complications during veno-venous extracorporeal membrane oxygenation and their relevance predicting a system-exchange--retrospective analysis of 265 cases. Public Library of Science One. 9 (12), e112316 (2014).
- Passmore, M. R., et al. Inflammation and lung injury in an ovine model of extracorporeal membrane oxygenation support. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 311 (6), L1202-L1212 (2016).
- Vaquer, S., de Haro, C., Peruga, P., Oliva, J. C., Artigas, A. Systematic review and meta-analysis of complications and mortality of veno-venous extracorporeal membrane oxygenation for refractory acute respiratory distress syndrome. Annals of Intensive Care. 7 (1), 51 (2017).
- Houser, S. R., et al. Animal Models of Heart Failure A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation Research. 111 (1), 131-150 (2012).
- Russell, J. C., Proctor, S. D. Small animal models of cardiovascular disease: tools for the study of the roles of metabolic syndrome, dyslipidemia, and atherosclerosis. Cardiovascular Pathology. 15 (6), 318-330 (2006).
- Madrahimov, N., et al. Novel mouse model of cardiopulmonary bypass. European Journal of Cardio-thoracic Surgery. 53 (1), 186-193 (2017).
- Madrahimov, N., et al. Cardiopulmonary Bypass in a Mouse Model: A Novel Approach. J. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
