Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo descreve a técnica de oxigenação de membrana extracorpórea veno-venosa (ECMO) em um não-intubado, espontaneamente respiração mouse. Este modelo murino de ECMO pode ser efetivamente implementado em estudos experimentais de aguda e doenças pulmonares de estágio final.
Abstract
O uso de oxigenação de membrana extracorpórea (ECMO) tem aumentado substancialmente nos últimos anos. ECMO tornou-se uma terapia eficaz e confiável para aguda, bem como doenças de pulmão estágio final. Com o aumento da demanda de clínica e uso prolongado de ECMO, otimização processual e prevenção de danos em vários órgãos são de importância crucial. O objectivo do presente protocolo é apresentar uma técnica detalhada de ECMO veno-venosa em um não-entubada, respirando espontaneamente do mouse. Este protocolo demonstra o desenho técnico do ECMO e etapas cirúrgicas. Este modelo murino de ECMO facilitará o estudo da fisiopatologia relacionada com ECMO (por exemplo, inflamação, eventos tromboembólicos e sangramento). Devido à abundância de ratos geneticamente modificados, os mecanismos moleculares envolvidos nas complicações relacionadas com o ECMO podem também ser dissecados.
Introduction
Oxigenação de membrana extracorpórea (ECMO) é um sistema de suporte de vida temporária que assume as funções dos pulmões e coração para permitir que a perfusão e a troca gasosa adequada. Hill et al1 descreveu o primeiro uso do ECMO em pacientes em 1972; no entanto, só se tornou amplamente utilizada após a sua aplicação bem sucedida durante o H1N1 da gripe pandêmica em 20092. Hoje, o ECMO rotineiramente é usada como um procedimento de salva-vidas em estágio final coração e pulmão doenças3. ECMO veno-venosa é cada vez mais empregado como uma alternativa para a ventilação mecânica invasiva em acordada, não-entubada, respirando espontaneamente a pacientes com insuficiência respiratória refratários4.
Apesar da sua adopção generalizada, diversas complicações têm sido relatadas para o ECMO5,6,7. Complicações que podem ser experienciadas por pacientes em ECMO incluem hemorragia, trombose, sepse, trombocitopenia, disfunções relacionadas ao dispositivo e embolia gasosa. Além disso, uma síndrome de resposta inflamatória sistêmica (SIRS), resultando em danos nos órgãos multi é bem descrita clinicamente e em estudos experimentais8,9. Complicações neurológicas como infarto cerebral são também frequentemente relatadas em pacientes submetidos a terapia a longo prazo do ECMO. Para confundir matérias, muitas vezes é difícil distinguir se as complicações são causadas pelo ECMO em si ou surgem os distúrbios subjacentes que acompanha aguda e doenças da fase final.
Para estudar especificamente os efeitos do ECMO em um organismo saudável, deve ser estabelecido um modelo animal experimental confiável. Há muito poucos relatórios sobre o desempenho do ECMO em pequenos animais e são todos limitados aos ratos. Até à data, nenhum modelo do rato do ECMO tem sido descrito na literatura. Devido à disponibilidade de um grande número de estirpes de rato geneticamente modificado, estabelecimento de um modelo de ECMO mouse permitiria mais investigação dos mecanismos moleculares envolvidos em complicações relacionadas à ECMO10,11.
Com base no nosso modelo murino descrito anteriormente de extracorpórea (CEC)12, nós desenvolvemos um método estável de ECMO veno-venosa em não-entubada, respirando espontaneamente ratos. O circuito ECMO (Figura 1), que contém o efluxo e cânulas de afluência, uma bomba peristáltica, oxigenador e retêm o ar reservatório, é semelhante ao nosso modelo descrito anteriormente de murino CPB12 com exceção de ter uma menor escorva volume (0,5 mL). Este protocolo demonstra as técnicas detalhadas, monitorização fisiológica e gasometria arterial envolvida em um processo bem sucedido de ECMO.
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Protocol
Experimentos foram realizados em camundongos C57BL/6 machos, com idade de 12 semanas. Este estudo foi realizado em conformidade com as diretrizes da lei alemã Animal sob protocolo TSA 16/2250.
1. materiais preparação
Nota: Todas as etapas são executadas em condições limpas, não estéril. Condições estéreis seria necessárias se o animal é para ser sobreviveu no pós-operatório.
- Introduza um tubo de poliuretano 2-Fr usando uma lâmina cirúrgica sob um microscópio com ampliação de 16 X 3 fenestrações.
Nota: Todas as fenestrações devem estar localizadas no terço distal da cânula para garantir a drenagem de sangue ideal. - Prepare a solução de escorva (Tabela de materiais). Incluem 30 UI/mL heparina e 2,5% v/v de uma solução de 8,4% do NaHCO3. Leve à geladeira esta solução a 4 ° C até que esteja pronto para usar. Prime do circuito com 500 uL de solução de escorva.
- Coloque a cânula de saída para a solução de escorva e encher a máquina ECMO por ligar a bomba peristáltica. Continuam a circular a solução de escorva através da máquina para o próximo 30 min a uma taxa de fluxo de 1 mL/min.
- Dê 0,5 L/min de oxigênio a 100% para o oxigenador.
2. anestesia
- Lugar do animal em uma câmara de indução preenchido com uma mistura de oxigênio/isoflurano 2,5% v/v. Fornece 0,5 L/min de oxigênio a 100% para o vaporizador. Antes da cirurgia, verificar que a anestesia completa é alcançada através do teste de pedais reflexos de retirada e dor. Aplica o gel de olho para evitar danos de secagem.
- Use uma almofada de aquecimento para manter a temperatura do corpo em 37 ° C.
- Realizar a anestesia de máscara de inalação usando um vaporizador de isoflurano e injetar carprofeno 5 mg/kg por via subcutânea.
- Regularmente, observar a respiração espontânea e ajustar a concentração de isoflurano, de modo que é entre 1,3 e 2,5%.
3. cirurgia
- Expor a veia jugular esquerda, usando uma incisão de pele lateral de 4 mm, com a ajuda de uma tesoura bem no lado esquerdo do pescoço. Juntamente com a preparação afiada e contundente, usando cotonetes de algodão e microfórceps, use bipolar coagulação dos pequenos vasos.
- Uma vez que a veia jugular esquerda é exposta, ligate a parte distal, usando uma sutura de seda de 8-0, com a ajuda de microfórceps.
- Coloque um nó de deslizamento na extremidade proximal da veia. Incise a parede anterior da veia utilizando microtesoura.
- Para atingir a heparinização plena, injete heparina de 2,5 UI/g em veia jugular através de um braunula de 26 G.
- Levante o lado da cabeça do animal pad 30 ° para evitar a perda excessiva de sangue da veia durante a inserção da cânula.
- Introduza uma cânula de (PU) poliuretano 2-Fr a parte proximal da veia jugular, gire-o levemente enquanto empurra-lo a uma profundidade de 4 cm; Enquanto isso, se alcançará a bifurcação ilíaca da veia cava inferior (VCI).
- Fixe a cânula com nodos seda 8-0, usando um microfórceps.
- Expor a veia jugular direita, usando as etapas descritas em 3.1, 3.2 e 3.3.
- Canule a veia jugular direita com uma cânula de PU 1-Fr e movê-lo suavemente 5 mm na direção do átrio direito.
- Repita a etapa 3.7.
- Cateterismo da artéria femoral esquerda com outra cânula de PU 1-Fr e usá-lo para pressão invasiva, monitorização, bem como a amostra de sangue para gasometria arterial (BGA).
- Inserir agulhas de eletrocardiograma (ECG) conectadas a um dispositivo de aquisição de dados por via subcutânea, em ambas as patas dianteiras e na parede torácica esquerda.
- Inserir um termômetro retal, conectado a um dispositivo de aquisição de dados.
4. oxigenação de membrana extracorpórea Veno-venosa e arterial
Nota: Para um diagrama esquemático do circuito de ECMO completo, veja a Figura 1.
- Inicie o ECMO do animal ao ligar a bomba com uma taxa de fluxo inicial de 0,1 mL/min. Ajuste a taxa de fluxo da bomba dentro o próximo 2 min para 3-5 mL/min.
- No caso de sucção de ar na cânula de saída através de cânulas, reduzir o fluxo e adicionar 0,1 mL de solução de escorva ao circuito através de um reservatório de ar-caça com armadilhas.
- Sob fluxo estável, continue a monitorar o modo em tempo real todos os parâmetros vitais através do dispositivo de aquisição de dados.
- Observar o refluxo da drenagem venosa e constantemente monitorar o nível de sangue no reservatório de ar-caçador.
- Colete sangue vazando de feridas em uma 1 cc seringa com a ponta de um 24 G branula andreturn-para o circuito ECMO através do reservatório de ar retêm.
- Para BGA, use um cartucho de recolha de amostras de sangue para coletar aproximadamente 75 µ l de sangue arterial para os seguintes pontos de tempo e nos seguintes locais:
- 10 min após o início do ECMO, coletar sangue da veia cava inferior através de um tubo extra construído em antes o oxigenador, através do tubo extra semelhante após oxigenador (controle) e diretamente da artéria femoral.
- 30 min após o início do ECMO, coletar sangue da artéria femoral.
- Dar um extra 0,1 mL da solução de escorva para compensar a perda de líquido intravasal cada 45 min através do ar-caçador ou cateter da artéria femoral ou sugando as bolhas de ar através da cânula de drenagem do sangue.
- Para BGA, use um cartucho de recolha de amostras de sangue para coletar aproximadamente 75 µ l de sangue arterial:
- 1 h após o início do ECMO da artéria femoral.
- 2 h após o início do ECMO, coletar sangue da veia cava inferior através de um tubo extra construído em antes o oxigenador, através do tubo extra semelhante após oxigenador (controle) e diretamente da artéria femoral.
- Após 2 h, reduza a taxa de fluxo da bomba gradualmente (ao longo de 5 min), assim parando ECMO.
- Continue a gravar parâmetros vitais por mais 10 minutos.
- Termine o experimento por corrermos o animal e colheita de sangue e órgãos.
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Representative Results
Este protocolo descreve o método de ECMO veno-venosa em um rato. Este modelo é confiável e reprodutível e em relação ao nosso modelo descrito anteriormente de CEC com detenção respiratória e circulatória12,13, é tecnicamente menos exigente estabelecer.
Fluxo ECMO no sistema venoso foi mantido entre 1,5 e 5 mL/min. A pressão arterial média foi mantida entre 70 e 85 mmHg, adicionando solução de escorva extra no circuito de ECMO. Geralmente, a adição de 0,1 mL de solução de escorva para o circuito durante o ECMO permite substituição do volume sanguíneo. Todo volume substituindo ou soluções tampão foram dadas através da artéria femoral ou reservatório de ar-caça com armadilhas.
Parâmetros fisiológicos foram gravados a cada 10 minutos e os dados de um representante do ECMO experimento são apresentados na Figura 2. Dados BGA de uma bem sucedida ECMO são mostrados na tabela 1.
Parâmetros hematológicos mostraram relevante hemodiluição durante o ECMO; no entanto, nenhuma transfusão de sangue foi necessário para compensar a anemia moderada (tabela 1). Parâmetros de oxigenação de BGA demonstraram desempenho adequado do Oxigenador em uma mistura de oxigênio/ar no FiO2 1.0 (tabela 1).
As alterações metabólicas durante o ECMO mostraram alcalose respiratória no início e acidose moderada no final do experimento (tabela 1). Buffer não extra do sangue foi realizada.
Figura 1: layout ECMO em um mouse. Sangue é drenado da veia cava inferior (VCI) através da veia jugular esquerda e o sangue oxigenado é bombeado para a veia cava superior (SVC) através da veia jugular direita. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: medem de parâmetros fisiológicos durante 2 h de ECMO. Uma frequência cardíaca =, B = pressão arterial média (VS = substituição de volume) e C = temperatura retal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| 10 min | 30 min | 1 h | 2 h | |||||
| Parâmetros | Ó | FA | VEIA CAVA INFERIOR | FA | FA | Ó | FA | VEIA CAVA INFERIOR |
| pH | 7,67 | 7.51 | 7.31 da | 7,57 | 7.5 | 7.6 | 7,57 | 7,34 |
| pCO2 (mmHg) | 24.5 | 24 | 52 | 26 | 25 | 22 | 26 | 51,1 |
| pO2 (mmHg) | 707 | 656 | 135 | 643 | 621 | 638 | 573 | 101 |
| HCO3 (mmol/L) | 28,3 | 25,3 | 26 | 24 | 23 | 27 | 23 | 25 |
| sO2 (%) | 100 | 100 | 99 | 100 | 100 | 100 | 100 | 98 |
| HCT (%) | 24 | 23 | 23 | 20 | 18 | 17 | 17 | 16 |
| HB (g/dl) | 8.8 | 8.6 | 8.5 | 8 | 7,8 | 7.6 | 7.2 | 7 |
| ALC (mmol/L) | 1.9 | 1.7 | 1.8 | 2.1 | 2.4 | 3.2 | 3.1 | 3.3 |
Tabela 1: resultados BGA, ao longo do experimento. Ó = oxigenador, FA = artéria femoral e veia cava inferior = veia cava inferior.
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Discussion
Anteriormente, nós descrevemos um modelo bem sucedido de CEC em um rato12,13. Para implementar esse modelo para aguda ou doenças de pulmão estágio final desenvolvemos um circuito ECMO veno-venosa easy-to-use para ratos. Diferente para o modelo do CPB, veno-venosa ECMO não requer procedimentos cirúrgicos complicados como esternotomia e aperto da aorta, reduzindo assim o risco de sangramento de ferimento em um animal totalmente heparinizado. Para evitar a embolização do oxigenador com coágulos de sangue, 2,5 UI de heparina/kg é dada para cada animal. Esta dose foi baseada em medições anteriores do tempo de coagulação ativada (ACT) que mostrou completa anticoagulação do sangue (agir > 800-sec). Devido à ausência de revestimento de heparina no micro-oxigenador, nosso protocolo de anticoagulação manteve-se semelhante ao nosso procedimento de cec.
Em comparação com o circuito de CEC, poderíamos reduzir o total volume de escorva para 0,5 mL, reduzindo o volume do ar-caçador e micro-oxigenador. Além disso, um fluxo mais lento foi necessário para manter a oxigenação adequada do animal. Intravasal perda do volume de sangue resultou em uma queda gradual da pressão arterial média. Adicionar um extra 0,1 mL de volume de escorva para o animal levou a um aumento na pressão de sangue mais de 20 mmHg, mas uma pequena redução linear da pressão arterial durante o próximos 30 min sempre esteve presente. Substituição de volume foi chamada para se ar foi sugado através da cânula de drenagem ou houve uma queda na pressão arterial abaixo de 75 mmHg.
O desafio mais difícil no procedimento cirúrgico para modelo ECMO do rato é a colocação da cânula através da veia jugular esquerda para a veia cava inferior. Para estabelecer este método, foram testados diferentes tipos de cânulas, e realizou-se uma laparotomia em cadáveres de rato para aperfeiçoar o posicionamento da ponta da cânula para a veia cava inferior, pouco antes da bifurcação ilíaca. Às vezes, em animais maiores, colocação da cânula pode levar a luxação da cânula na veia do rim direito. Não obstante, o sangue de todos os segmentos da veia cava inferior pode ser bem drenado devido fenestrações de lado da cânula.
Em ensaios preliminares, realizamos a canulação através da veia femoral. Infelizmente, apenas uma cânula 1-Fr pode ser colocada na veia femoral, que resulta em um fluxo sanguíneo insuficiente (≤ 1 mL/min). 1-Fr cateteres empurraram para a veia cava inferior tudo exibido backflow insuficiente. Para atingir o recuo substancial, as duas veias femorais precisaria ser canulada; Portanto, abandonou este procedimento e alcançado a drenagem adequada através de uma cânula de 2-Fr colocada na veia cava inferior através da veia jugular. Perda de sangue durante a colocação da cânula em veia jugular é muito típica. Portanto, antes da colocação, o fim principal da almofada do animal é gerado 30-40°, então refluxo da veia é significativamente reduzido.
Uma redução gradual na hemoglobina e o hematócrito é explicada pela hemólise e coletas de sangue repetitivas tomadas para demonstrar o desempenho do dispositivo. Para experiências de sobrevivência, para evitar transfusões de sangue, recolha de amostras de sangue deve ser extremamente limitada ou mesmo evitada. Além disso, no final do experimento, o sangue do circuito do ECMO deve ser retornado para o animal. No entanto, a sobrevivência do modelo tem a ser estudado em um projeto separado usando um protocolo menos invasivo.
Fluxo de sangue durante nossas execuções ECMO foi entre 3 e 5 mL/min. débito cardíaco Normal do rato é relatado para ser entre 6 e 9 mL/min; Portanto, em média, fomos capazes de atingir um fluxo ECMO de 54% do débito cardíaco do rato. Geralmente, o ECMO veno-venosa requer menor fluxo de sangue em comparação com o ECMO veno-arterial, como overperfusion do átrio direito pode levar a sobrecarga de ventrículo direito e, consequentemente, insuficiência cardíaca. Clinicamente, para conseguir a oxigenação adequada, um fluxo ECMO veno-venosa de 50-75% do débito cardíaco é suficiente para a oxigenação suficiente em pacientes ventilados ou respirando espontaneamente. Desnecessariamente, aumentar o fluxo ECMO pode provocar mais danos causados pelos senhores e hemólise e recirculação inútil da maior parte do sangue venoso entre a veia cava inferior e SVC. Além disso, observamos que, através do aumento do escoamento em ECMO veno-venosa, pressão negativa excessiva leva a sucção no local da canulação do ar. Nosso animais recebidos 100% de oxigênio sob anestesia de isoflurano e com a ajuda de ECMO veno-venosa, foram hiperoxigenado. Em nosso modelo tentamos reproduzir condições de "acordado ECMO"4 tendo menos danos aos pulmões.
Os mecanismos moleculares envolvidos nas complicações relacionadas com o ECMO podem agora ser investigados devido a infinidade de cepas de rato geneticamente modificados disponíveis. Há também mais de oitenta cepas de ratos com doenças de pulmão que podem simular o ECMO no contexto destas doenças subjacentes. Portanto, acreditamos que nosso modelo de rato ECMO veno-venosa pode ser implementado em vários projetos sinérgicos.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este projecto foi apoiado por concessão de 311 KFC do Deutsche Forschungsgemeinschaft.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterofundin | B.Braun Petzold GmbH | PZN:8609189 | in 1:1 with Tetraspan |
| Tetraspan 6% Solution | B. Braun Melsungen AG | PZN: 05565416 | in 1:1 with Sterofundin |
| Heparin Natrium 25.000 | Ratiopharm GmbH | PZN: 3029843 | 2,5 IU per ml of priming |
| NaHCO3 8,4% Solution | B. Braun Melsungen AG | PZN: 1579775 | 3% in priming solution |
| Carprofen | Zoetis Inc., USA | PZN:00289615 | 5mg/kg/BW |
| 1 Fr PU Catheter | Instechlabs INC., USA | C10PU-MCA1301 | carotide artery |
| 2 Fr PU Catheter | Instechlabs INC., USA | C20PU-MJV1302 | jugular vein |
| 8-0 Silk suture braided | Ashaway Line & Twine Co., USA | 75290 | ligature |
| Isoflurane | Piramal Critical Care GmbH | PZN:9714675 | narcosis |
| Spring Scissors - 6mm Blades | Fine Science Tools GmbH | 15020-15 | instruments |
| Spring Scissors - 2mm Blades | Fine Science Tools GmbH | 15000-03 | instruments |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools GmbH | 13009-12 | instruments |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools GmbH | 11295-51 | instruments |
| Castroviejo Micro Needle Holder - 9cm | Fine Science Tools GmbH | 12060-02 | instruments |
| Micro Serrefines | Fine Science Tools GmbH | 18555-01 | instruments |
| Bulldog Serrefine | Fine Science Tools GmbH | 18050-28 | instruments |
| Isoflurane Vaporizer Drager 19.1 | Drägerwerk AG & Co. KGaA | anesthesia 1,3 -2,5% | |
| Multichannel Data Aquisition Device with ISOHEART Software | Hugo Sachs Elektronik GmbH, Germany | invasive pressure, ECG, t °C | |
| i-STAT portable device | Abbott Laboratories, Lake Bluff, Illinois, USA | blood gas analysis | |
| i-STAT CG4+ and CG8+ cartridges | Abbott Laboratories, Lake Bluff, Illinois, USA | blood gas analysis | |
| C57Bl/6 mice, male, 30 g, 14 weeks old | Charles River Laboratories | housed 1 week before |
References
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