Summary
Efferocytosis, phagocytic 제거 apoptotic 세포의 항상성 유지 하는 데 필요한 하 고 수용 체와, engulfment, 인식과 apoptotic 세포의 국제화에 대 한 허용 하는 신호 통로 의해 촉진 된다. 여기, 우리는 efferocytosis의 정량화와 efferocytic 신호 통로의 활동에 대 한 형광 현미경 검사 법 프로토콜을 제시.
Abstract
Efferocytosis의 규칙을 공부 apoptotic 세포의 통풍 관을 정확 하 게 계량 하 고 efferocytosis를 제어 하는 신호 및 세포 프로세스를 조사 하는 방법을 필요 합니다. 이 정량화 수행 apoptotic 세포 들은 efferocytosed 증분, 따라서 수 정확 하 게 윤곽을 그리 다 잔여 unengulfed 휴대 대 apoptotic 대상의 efferocytosed 부분 사이 방법이 필요로 하기 어려울 수 있습니다. 파편. 여기 설명 된 방법은 이중 라벨 접근 efferocytosis와 efferocytic 용량의 efferocytes 대 식 세포 등의 역학을 정확 하 게 계량을 활용 합니다. Apoptotic 세포의 cytosol apoptotic 세포의 표면 biotinylation 내 면 및 비 내 면 간의 차별화에 대 한 허용 하는 동안 모든 apoptotic 세포 유래 물질의 모니터링을 활성화 하는 셀 추적 염료와 함께 표시 됩니다. apoptotic 세포의 분수 Efferocytes의 efferocytic 용량 라이브 또는 고정 셀의 형광 이미지와 streptavidin 얼룩으로 구분으로 대 내 면된 대상, 바운드의 양을 측정 하 여 결정 됩니다. 이 방법은 cytometry, 즉 비-efferocytosed 대 efferocytosed apoptotic 세포 분수, efferocytic 역학 라이브 셀 현미경으로 측정 하는 능력의 정확한 묘사 같은 방법에 비해 몇 가지 장점이 고 용량을 붙일 레이블 transgenes 표현 하는 세포에 세포 신호의 연구를 수행 합니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 방법, efferocytic 활동을 정확 하 게 계량 하 고 efferocytosis 동안 활성 세포 신호 경로 심문 하는 데 사용할 수 있는 유연한 실험적인 접근 방식 기반으로 제공 합니다.
Introduction
Apoptosis, 또는 프로그램 된 세포 죽음 대부분 다세포 유기 체에서 발생 하 고 그들의 발달 및 항상성1에 대 한 중요 한 높은 규제 생리 적 과정 이다. 정상 세포 회전율 및 배아 개발에 참여 하 고, 이외에 apoptosis 조직에서 감염 되거나 손상 된 세포의 제거를 가능 하 게 하 고 또한 감염, 염증, 암, 응답 하 고으로 의료 개입에 의해 트리거할 수 있습니다. 방사선 치료 또는 스테로이드1등. Apoptotic 세포 노출 "먹고-나" 다양 한 직업 및 비 직업적인 식 세포에 수용 체에 의해 인식 되는 그들의 세포 표면에 신호 총칭 하 여 "efferocytes"로. 이 수용 체의 참여 efferocytosis2,3로 알려진 프로세스를 통해 efferocyte에 의해 통풍 관 및 apoptotic 세포의 저하를 유도 합니다. Phosphatidylserine은 최고의 특징이 먹고-저 운전 efferocytosis 신호. 그것은 일반적으로 apoptosis을 따라서4셀 표면 phosphatidylserine 노출이 막 비대칭 방해 지질 scramblase 활성화와 원형질 막의 내부 자료에 국한 된다. Phosphatidylserine은 성숙한 세포 등 일부 비 apoptotic 세포의 세포 외 표면에 있고 혈소판 활성화. 그러나,이 세포는 하지 "" 나를 안 먹는, 같은 신호 CD47, 그들의 세포 표면5,,67의 존재로 인해 efferocytosed. 노출된 phosphatidylserine efferocytes에 의해 표현 하는 efferocytic 수용 체의 배열에 의해 인식 된다. Phosphatidylserine에이 수용 체의 바인딩을 직접 또는 opsonins의 원조를 통해 활성화 되 나 efferosome8, 막 도약 공포에 apoptotic 세포의 engulfment를 홍보 하는 신호 통로 9 , 10 , 11 , 12.는 efferosome endosomes를 순차적으로 퓨즈와 리소좀, 분자 기계는 efferosome를 시 어 지 다 하 고 저하는 apoptotic 필요한 제공 셀 화물13,14. 일단 저하, apoptotic 세포 유래 자료는 재활용 endosome에 인신 매매-apoptotic 세포 유래 항 원에 면역 응답을 제한 하 고는 apoptotic 세포13에서 영양분의 복구에 대 한 수는 프로세스 15. Apoptotic 세포;의 장애인된 허가에 efferocytosis 결과에 실패 이러한 uncleared 세포는 결국 보조 괴 사를 받 다. 회 저 성 세포 프로-염증 성 cytosolic 내용, 병원 균, 그리고 autoantigens 따라서 감염, 염증, 자기 면역 질병16,17의 연습장 extracellular 환경으로 풀어. 함께, apoptosis와 efferocytosis 죽어가는 및 죽은 세포의 제거를 촉진 하 고 조직의 항상성 유지에 대 한 허용.
Efferocytosis 기본 분자 메커니즘을 조사 apoptotic 세포 통풍 관의 명확한 정량화를 제공 하는 메서드가 필요 합니다. 이 정량화는 다른 글귀와 달리 endocytosis 및 먹어서18,19, efferocytosis 메커니즘 발생할 수 있습니다 하지 증분 통풍 관의 결과로 그대로 목표 셀의 engulfment에서 사실에 의해 복잡 하 게 efferocyte20apoptotic 세포. 여기에 설명 된 프로토콜 설명 생체 외에서 efferocytosis 분석 결과 내 면의 정확한 묘사를 제공 하는 개별 apoptotic 세포의 비 내 면 부분 대 고정 셀의 다양 한 결합 될 수 있다 및 라이브 셀 현미경에 접근 한다. 전통적인 먹어서 분석 추가 항 체 비 내 면 목표, 우리의 방법으로 레이블 하기 위해 실험의 끝에 phagocytic 대상에 특정 라벨 covalently 연결 biotin21 apoptotic 대상으로 다릅니다 , 22. apoptotic 세포 특정 항 체는이 분석 결과에 사용할 수 있는, biotinylation 접근 어떤 단백질 베어링 대상 표시를 허용 하 고 immunostaining 수행 하는 경우에 이차 항 체 분으로 잠재적인 문제를 피할 수 . 특히, 우리는 셀 추적 염료와 biotin 듀얼 얼룩이 있다 apoptotic Jurkat 세포의 준비 개요. 염료를 추적 셀 apoptotic 세포 유래 자료 efferocytosis 중 추적, 표면 biotinylation의 차별에 대 한 허용 하는 반면 efferocytosed apoptotic 세포의 비 내 면 부분에서 내 면화를 허용 합니다. 우리는 또한 문화 및 준비 J774.2 및 THP-1 셀 라인의 murine 인간과 efferocytes로 사용, M2 세포 monocyte 파생에 대 한 기본 셀 efferocytosis, 및 사용에 대 한 Jurkat 세포의 예를 들어 efferocytic 대상으로 설명합니다. 이러한 방법은 다른 세포 선 또는 1 차 셀, 대상 셀 (예: apoptosis, 괴 사 및 necroptosis), 세포 죽음의 어떤 형태를 겪고 그리고 지질 코팅을 통해 apoptotic 세포 시뮬레이션 미크론 크기의 모방에 쉽게 적용할 수 또는 특정 관심의 efferocytic 수용 체에 ligands와 코팅.
이 프로토콜에서 설명 하는 방법은 필드23,24에 일반적으로 사용 되는 흐름 cytometry 기반 방법 몇 가지 장점이 있습니다. 직접 식 apoptotic 세포 상호 작용, 모두 총 및 비 내 면 apoptotic 세포 물자의 명확한 라벨와 함께 영상으로 efferocytosis의 정량적 측정을 할 수 있다. 또한, pH을 구분 하지 않는 fluorophores의 사용 등 몇 가지 대체 방법을25confounds lysosomal pH에서 FITC와 GFP 형광 억제 혼동 요인 제한 합니다. 마지막으로, 세부 사항에 설명 되지 않은, 하는 동안 이러한 방법을 채택 될 수 있다 transgenes 붙일 표시를 표현 하는 efferocytes를 사용 하 여 또는 후 고정 immunostaining, 신호 분자 활동 및 모니터링의 정량화를 허용 하는 efferocytosis 중 세포 프로세스입니다.
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Protocol
건강 한 지원자에서 혈액의 컬렉션 건강 과학 연구 윤리 위원회의는 웨스턴 온타리오 대학에 의해 승인 되었다. Venipuncture 인간의 연구에 세 배 회의 정책 성명의 지침에 따라 수행 되었다.
1. 문화 및 THP 1 Monocyte 셀 라인의 준비
- 37 ° C + 5% CO2T25 플라스 크에서 현 탁 액 문화로 문화 THP 1 monocytes. 셀 소 태아 혈 청 (FBS) 로스웰 파크 기념 연구소 1640 (RPMI 1640) + 10%의 5 mL에 성장 한다.
-
부드럽게 흔들어 플라스 크, 성장 매체에 걸쳐 균등 하 게 각 날짜 일시 셀 다음 즉시는 hemocytometer 셀을 계산 합니다. 세포는 세포 밀도 도달 하면 1 x 106 셀/mL passaged 해야 합니다.
- 미리 따뜻하게 RPMI 1640 + 10 %FBS 37 ° C 물 목욕에서.
- 5 분 동안 실 온에서 500 x g에서 centrifuging 여 1.5 mL microcentrifuge 튜브 또는 15 mL 원뿔 튜브, 2 x 105 셀 및 펠 릿 세포를 전송.
- 셀 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한을 제거 하 고 펠 릿 1 mL (1.5 mL microcentrifuge 튜브) 또는 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 5 mL (15 mL 원뿔 튜브) resuspend.
- 5 분에 대 한 원심 분리기 실 온에서 500 x g에서 튜브 셀 펠 렛을 방해 하지 않고 PBS를 제거 합니다.
- 1 mL 신선한 RPMI 1640 + 10%의 펠 릿 resuspend FBS.
- 새로운 장소로 T25 플라스 크 따뜻하게 미디어, 그리고이 4 mL 1.2.5에서 resuspended 셀을 추가 합니다. 셀 (일반적으로 3 일), 뿌리고 필요 때까지 나 세포 실험에 필요한 때까지 37 ° C + 5% CO2 배양 기에서 문화.
-
THP 1 파생 된 세포와 실험에 대 한 플라스 크 및 뿌리고 이전 판에서 셀의 필요한 수를 제거:
- 12-잘 접시의 우물에 18 mm 원형 유리 coverslips (#1.5 두께)의 필요한 수를 배치-조건 또는 timepoint 당 일반적으로 1 coverslip. 각 aliquot 5 x 104 THP 1 monocytes 잘. 셀 수 추가 각 잘 변경 될 수 있습니다, 필요한 경우.
- 각각의 총 볼륨을가지고 37 ° c 예 열 FBS RPMI + 10%를 사용 하 여 1 mL을 잘 셀 포함
- 각 잘 하 100 nM phorbol myristate 12 13-아세테이트 (PMA)을 추가 하 고 대 식 세포와 같은 세포로 THP 1 monocytes의 감 별 법을 유도 하기 위해 3 일에 대 한 문화.
2. 문화 및 J774.2 대 식 세포 세포 라인의 준비
-
37 ° C + 5% CO2T25 플라스 크에 문화 J774.2 셀. 셀 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) + 10%의 5 mL에 성장 한다 FBS 및 문화에 도달 하면 80-90% confluency passaged. 통로 셀:
- PBS의 5 mL로 한 번 상승 하 고 플라스 크에서 모든 미디어를 제거 합니다.
- 플라스 크에서 PBS를 제거 하 고 신선한 DMEM + 10%의 5 mL을 바꿉니다 FBS.
- 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 미디어에 셀 중단 플라스 크 하단 다쳤어요. 적극적으로 플라스틱 셀 여러 번 모든 셀 집계 헤어.
- 세포 현 탁 액 4 mL 플라스 크에서 제거 하 고 신선한 미디어의 4 mL와 함께 그것을 대체 하 여 셀 1: 5을 희석. 나머지 셀 서 스 펜 션은 삭제, 신선한 T25 플라스 크에서 새로운 세포 배양을 시작 하는 데 사용 하거나 실험에 사용 될 수 있습니다.
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J774.2 셀을 사용 하 여 efferocytosis 분석 결과 대 한 설정:
- 실험의 시작에 앞서 1 일 단계 2.1.1–2.1.3에 의하여 신선한 미디어의 5 mL로 J774.2 셀을 일시 중단 합니다. hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 하 고 5 x 104 셀/mL의 농도에서 세포의 필요한 볼륨을 준비.
- 12-잘 접시의 우물에 18 mm 원형 유리 coverslips (#1.5 두께)의 필요한 수를 놓습니다. 각 5 x 104 셀/mL 세포 현 탁 액의 aliquot 1 mL을 잘.
- 문화 하는 coverslip 준수 고 뿌리고 셀 수 있도록 하룻밤.
3입니다. 기본 인간의 M2 대 식 세포의 문화
- M2 세포 필요의 모든 12-잘 접시 heparinized 인간의 혈액 10 mL를 수집 합니다.
- 15ml 원심 관에 미리 데워 진된 Lympholyte-폴 리 셀 분리 매체의 5 mL 위에 인간의 혈액 5 mL을 레이어. 처리 하는 경우 여러 개의 튜브를 준비 > 5 mL의 혈액 보다는 더 큰 볼륨 튜브를 사용 하 여.
- 35 분, 중간 가속 및 휴식을 사용 하 여에 대 한 300 x g에서 원심.
- 조심 스럽게 플라스틱 pipettor 및 전송 50 mL 원심 분리기 튜브를 사용 하 여 상위 단 셀 풍부한 밴드 제거. 여러 개의 튜브를 단계 3.2에서에서 준비 했다, 밴드 단일 50 mL 튜브에 풀링된 수 있습니다. 튜브의 볼륨을가지고 최대 50 mL PBS와 함께.
- 8 분에 대 한 300 x g에서 centrifuge 고는 상쾌한을 제거 합니다. 이 단계 동안 12-잘 접시의 각 음에 압력가 18 m m 직경 원형 coverslips (#1.5 두께)을 놓습니다.
- 혈 청 무료 RPMI 1640 우물;의 원하는 수의 300 µ L에서 셀 펠 릿 resuspend 예를 들어, 혈액 10 mL 전체 12 잘 접시를 준비 하 처리 된 경우 미디어의 3.6 ml에서 셀 펠 릿을 일시 중단 합니다.
- 각 coverslip-12-잘 접시에서 포함 된 세포 현 탁 액의 300 µ L를 추가 합니다. 37 ° C + 5% CO2에서 1 시간에 품 어.
- 부드럽게 씻어 coverslip 3 어떤 비 부착 한 세포를 제거 하려면 따뜻하게 PBS의 1 mL x.
- RPMI 1640 + 10의 1 mL을 추가 %FBS + 10 ng/mL 재조합 인간 M-CSF + 셀 항생제/antimycotic 문화. 5 일 동안 37 ° C + 5% CO2 에서 품 어.
- 대체 미디어 RPMI 1640 + 10 %FBS + 10 ng/mL 재조합 인간 M-CSF + 10 ng/mL 재조합 인간 IL-4 + 셀 항생제/antimycotic 문화. 37 ° C + 5% CO2 m 2 양극 화를 완료 하는 데 2 일 동안에 품 어.
- 편광된 세포는 다음 3 일 안에 사용 되어야 한다.
4입니다. Apoptotic Jurkat 세포의 준비
- RPMI 1640 + 10%의 5 ml에서 Jurkat 세포 문화 FBS 37 ° C + 5% CO2. Jurkats은 현 탁 액 셀 라인 하 고 신선 하 고, 미리 데워 진 미디어에 3-5 일 마다 1: 5을 뿌리고 하 여 유지 될 수 있다.
- Apoptotic 세포를 준비 하려면 높은 밀도 (뿌리고 후 4-5 일) 성장 Jurkat 문화 허용. 5 분 동안 500 x g에서 원심 분리 하 여 한 1.5 mL microcentrifuge 튜브와 펠 릿 셀으로 aliquot 1.5 mL.
- 상쾌한 삭제 하 고 다시 1 µ M staurosporine 포함 된 혈 청 무료 RPMI 1640 매체의 1 mL에 셀 펠 릿을 일시 중단.
- 16 h 37 ° C + 5% CO2 셀 apoptotic 렌더링에 품 어.
-
원하는 경우 Annexin v:와 얼룩에 의해 apoptosis의 유도 확인
- Aliquot 100 µ L 1.5 mL microcentrifuge 관으로 Jurkat 세포 배양 staurosporine 처리의. 5 분 동안 500 x g에서 원심 분리 하 여 세포를 작은, 상쾌한, 삭제 하 고 다시 없는 혈 청 RPMI 1640 매체의 100 µ L에서 셀 펠 릿을 일시 중단.
- 1 µ L fluorescein isothiocyanate (FITC) 추가-Annexin V를 활용 하 고 어둠 속에서 실 온에서 10 분 동안 품 어.
- PBS의 900 µ L을 추가 하 고 전체 볼륨을 포함 하는 18 mm 원형 유리 coverslip (#1.5 두께) 12-잘 접시의 단일 영역 전송. 원심 분리기는 coverslip에 세포를 1 분 동안 200 x g에서 플레이트 어댑터 장착에 아래로 회전 합니다. 또한, 세포 이미징에 대 한 연 발된 슬라이드에 배치할 수 있습니다.
- 형광 현미경을 사용 하 여 이미지입니다.
5. 측정 Efferocytic 통풍 관 및 역학 고정된 셀 Efferocytosis 분석 결과 및 내부 얼룩을 사용 하 여
- 각각 1-3에 설명 된 대로 THP-1, J774.2 또는 M2 인간의 세포를 준비 합니다.
- 실험 시작 전에 저녁 준비 apoptotic Jurkat 세포 섹션 4에서 설명한 대로.
- 실험 직전 apoptotic 세포는 hemocytometer를 사용 하 여 계산 합니다. 1.5 mL microcentrifuge 튜브로 apoptotic 세포의 충분 한 번호를 전송-일반적으로 추가 5 x 105 셀/글쎄, 제공 대상: efferocyte의 비율은 10:1.
- 5 분 동안 500 x g에서 원심 분리에 의해 Jurkat 세포를 작은 고 PBS의 500 μ에 resuspend.
- 동안 원심 분리, 새로운 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 DMSO의 aliquot 10 µ L. 최소한 N-hydroxysuccinimidobiotin (NHS-비오 틴)의 DMSO에 녹. 5-10 결정 (~0.005 mg)은 충분 합니다.
- 500 μ apoptotic 세포/PBS 정지는 DMSO/NHS-비오 틴 튜브 포함 된 전송. 다음 셀 추적 염료 제조 업체의 권장된 농도를 apoptotic 세포 현 탁 액에 희석. FITC Streptavidin (예: 빨강 또는 빨강 셀 염료 추적)와 함께 괴기 하 게 중복 되지 않는 염료 추적 셀을 선택 하는 특정 확인 합니다.
- 어둠 속에서 실 온에서 20 분 정지를 품 어. RPMI 1640 + 10%의 동일 볼륨 추가 FBS 및 어떤 unreacted 염료를 풀기 위해 어둠 속에서 실 온에서 5 분 동안 품 어.
- 5 분 동안 500 x g에서 원심 분리 하 여 세포를 작은, 상쾌한, 삭제 및 다시 중단 RPMI 1640 + 10%의 100 µ L에 얼룩진된 apoptotic 세포 대 식 세포의 당 FBS.
- 대 식 세포의 각 음에 dropwise 스테인드 apoptotic 세포 현 탁 액의 100 µ L를 추가 합니다. 대 식 세포, apoptotic 세포 사이 접촉을 강제로 플레이트 어댑터를 갖춘 원심 분리기에서 1 분 200 x g 원심
- 원하는 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C + 5% CO2 시간 동안 접시를 품 어. 대 식 세포, efferocytosed 물자는 일반적으로 첫 번째 20-30 분 후 감지 120-180 분 후 완료 되 고.
- 원하는 시간에 포인트는 인큐베이터에서 셀을 제거합니다. 실내 온도 efferocytosis를 중지 하 고 비 efferocytosed apoptotic 세포를 제거 하는 PBS의 1 mL로 두 번 셀을 씻어.
- FITC 활용 streptavidin 1:1,000 희석을 각 영역에 추가 하 고 어둠 속에서 20 분 동안 품 어. 이 모든 비 efferocytosed apoptotic 세포 자료에 노출된 biotin을 레이블을 것입니다.
참고: 원하는 경우 셀 핵 얼룩이 질 수 있다이 단계 Hoechst 33342의 1:20,000 희석의 추가 의해 또는 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI). - 셀 3 번 1 mL PBS, 부드럽게 흔들어 또는 린스 당 5 분에 대 한 샘플을 흔들어 씻는 다. 실 온에서 20 분에 대 한 PBS에 4 %paraformaldehyde (PFA)와 셀 수정. 한 번 제거 초과 PFA에 PBS 가진 세포를 씻어.
- 영상 및 형광 현미경에 슬라이드에 coverslips를 탑재 합니다. Z-스택 정확한 정량화에 대 한 셀의 충분 한 수의 캡처-조건 당 일반적으로 10-30 셀. 비 내 면 apoptotic 세포 물자 결과 이미지에서 셀 추적 염료 소재 efferocytosed 소재 추적 염료 puncta 어떤 streptavidin의 무료 개별 셀을 형성 하는 동안 FITC streptavidin 얼룩으로 덮여 표시 될 것입니다. 얼룩.
- 계량 측정의 다양 한 통해 결과 이미지에 efferocytosis:
- 대 식 세포 당 개별 efferosomes (셀 추적 염료+/streptavidin- puncta)의 평균 수를 확인 하 여 efferocytic 인덱스를 계산 합니다. Apoptotic 셀에 바인딩된 또는 ≥1 표시 efferosomes 포함 된 세포만 계량. 기록 대 식 세포는 apoptotic 세포, 하지만 부족 한 개별 efferosomes, efferocytic 인덱스 0 갖고에 바인딩됩니다.
- ≥1 efferosome를 포함 하는 대 식 세포의 분 율을 측정 하 여 efferocytic 효율성을 계산 합니다.
- 고정 및 여러 시간 점에서 스테인드 이미지 셀에 의해 efferocytosis의 속도 계산 합니다. 유일한 이미지 세포, apoptotic 세포에 바인딩된 또는 각 셀의 캡처 표시 efferosomes, z 스택을 포함 합니다. 일단 몇 군데, efferocytosis의 속도 결정:
- 가이드, 그리고 피지/ImageJ26 (또는 다른 이미지 분석 소프트웨어 패키지), freehand 또는 다각형 선택 도구 모두 염료+/streptavidin- (예를 들어 내 면)를 추적 하는 셀의 원형으로 streptavidin 얼룩을 사용 하 여 z-스택의 단일 평면에 소재. 이 지역 염료 추적 셀의 통합된 강도 측정 합니다. 각 efferosome (예: 직경, 셀 테두리 또는 핵, 등상대 위치)15,27 에 대 한 개별 조치 쉽게 취득 될 수 있다 동시에 이러한 측정 크게 증가 하는 데이터를 분석 하는 동안 수집.
- 동일한 z-섹션, 염료+/streptavidin+ (예: 비 내 면)를 추적 하는 셀의 모든 원형 streptavidin 가이드 및 자유형 또는 다각형 선택 도구로 얼룩을 사용 하 여 z 스택의 단일 평면에 소재 . Apoptotic 세포는 식 접촉에서 얼룩만 포함 됩니다. 이 지역의 통합된 강도 측정 합니다.
- 이미지의 나머지 z 섹션 단계 4.2.3.1 4.2.3.2 반복 합니다. 합계는 efferocytosed (Σeff) 및 비-efferocytosed (Σne) 자료의 통합된 강렬. Efferocytosed 되었습니다 apoptotic 세포의 일부분으로 셀에 대 한 산출 될 수 있다:
- 모든 시간 지점에서 모든 셀에 대 한 분수 efferocytosed 계량. Note는 apoptotic 세포/efferosomes의 형광 강도 이미지 노출 시간 등 이미지 수집 매개 변수에서 변경 및 개별 apoptotic 세포에 의해 염료를 추적 셀의 통풍 관에 있는 변이 때문에 사이 다를 수 있습니다. 따라서, 유일한 비교 정규화 된 분수 Efferocytosed, 같은 값 또는 efferocytic 인덱스 등 efferocytic 효율성, 이미지, 실험 조건, 사이 그리고 사이 강도-독립적인 값 반복 실험.
- 결과 데이터 집합은 정확 하 게 셀 사이의 efferocytosis에서 변화 반영 되도록 각 실험에서 가능한 셀의 최대 수에이 분석을 수행 합니다.
참고: Efferocytic 효율성과 efferocytic 색인은 빠르게 (몇 초/셀)로 산출 될 수 있다, 그리고 우리가 일반적으로 목표 분석 실험, 당 적어도 100 셀에 각 실험 3 번 이상 반복. Efferocytosed의 분수 계산 자료, 및 efferosome 관련 조치 더 힘 드는, 일반적으로 2-3 분을 복용/숙련 된 애 널 리스트에 대 한 셀. 이러한 계산에 대 한 우리 당 실험 조건 당 15 셀의 최소 계량. - 기록 efferocytic 인덱스, 분수 efferocytosed와 개별 efferosome 데이터 셀 당 기준입니다.
참고: 단일 셀 방법, 따라서 간 세포 변화를 측정할 수 있도록 하는 데이터 분석에 대 한 수 있습니다. 인구 수준 분석 여전히 개별 실험에서 수집 된 단일 셀 데이터를 평균 하 여이 데이터 집합에서 수행할 수 있습니다. 앙상블 (예: efferosomes 그들을 포함 하는 셀의 독립의 인구로) 그리고 인구 수준, 단일 세포 수준에서 Efferosome 관련 측정 분석 될 수 있다15.
6. 라이브 셀 Efferocytosis 분석 결과 Apoptotic 세포를 사용 하 여
- 각각 1-3 단계에 설명 된 대로 THP-1, J774.2 또는 M2 세포를 준비 합니다. 필요한 경우 셀 transgenes와 페 한다 또는 다른 유전 구성 어떤 실험을 수행 하기 전에 적어도 18 h.
-
실험 시작 전에 저녁 준비 apoptotic Jurkat 세포 섹션 4와 5는 다음과 같은 수정에 설명 된 대로:
- 셀을 희석 하 고 당 4.1-4.3, apoptosis 유도 5.3-5.4 당 apoptotic 세포의 필요한 번호를 수집.
- Apoptotic 세포 현 탁 액을 제조 업체의 권장된 농도에서 염료 추적 셀을 추가 합니다. 어둠 속에서 실 온에서 20 분 정지를 품 어. RPMI 1640 + 10%의 동일 볼륨 추가 FBS 및 어떤 unreacted 염료를 풀기 위해 어둠 속에서 실 온에서 5 분 동안 품 어. 이 실험에 대 한 NHS-비오 틴을 추가 하지 마십시오.
- 5 분 동안 500 x g에서 원심 분리 하 여 세포를 작은, 상쾌한, 삭제 및 다시 중단 RPMI 1640 + 10%의 100 µ L에 얼룩진된 apoptotic 세포 대 식 세포의 당 FBS.
- 필요한 경우 각 우물에서 문화 미디어를 제거 하 고 추가 500 µ L의 PBS 제조 업체를 포함 하 여 세포 권장 희석 spectrally 염료 추적 셀과 중첩 되지 않는 염료 추적 셀의 레이블 또는 apoptotic 세포에 추가 형광 transgenes는 대 식 세포에 의해 표현입니다. 어둠 속에서 실 온에서 20 분 동안 품 어 다음 DMEM + 10%의 동일 볼륨 추가 FBS 및 어떤 unreacted 염료를 풀기 위해 어둠 속에서 실 온에서 5 분 동안 품 어.
- 레이 든 챔버를 포함 하는 대 식 세포 coverslip 전송. 추가 400 µ L DMEM + 10 %FBS, 다음 레이블이 apoptotic 세포 현 탁 액의 100 µ L. 부드럽게 pipetting 미디어 2-3 번에 의해 혼합.
- 가 열과 CO2레이 든 챔버를 전송-살아있는 세포 형광 현미경의 챔버 끼얹는다.
참고: CO2 관류 기능 부족, 조직을 사용 하는 현미경 설정에 대 한 문화 매체 버퍼링 1 m m와 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 산 (HEPES) 동안 생리 적 pH를 유지 하기 위해 중 탄산 나트륨 보다는 문화는 공기에 노출 됩니다. -
하얀 빛 단계 대조 (DIC) 이미지 및 모든 형광 라벨의 이미지를 포함 하는 시간 경과 시리즈를 캡처:
- 100 X 객관적 렌즈를 사용 하 여 실험이 세밀 해결 필요 (예: 식 apoptotic 세포 상호 작용의 막 역학). 한편, 보다 일반적인 조치 (apoptotic 세포 통풍 관, 대 식 세포, apoptotic 세포 사이 상호 작용 시간, 속도 등) 최고의 60 X 또는 63 X 목표를 사용 하 여 몇 군데 있다.
- 가능한 경우, 지점 방문을 사용 하 여 단일 수집, 따라서 하나의 실험에서 efferocytic 이벤트의 수를 증가 하는 동안 여러 분야의 보기의 이미지를
- Efferocytes는 종종 그대로 셀 보다는 apoptotic 세포의 작은 파편을 삼 켜, 때문에 z-스택 잡으려고 최상 이다. Phototoxicity를 최소화 하기 위해 z-섹션 구분 현미경 목표의 초점 깊이 캡처 (일반적으로 0.5-1.0 µ m), 세포 (대 식 세포, 예를 들면 8-20 조각/셀에 대 한 일반적으로 8-10 µ m)의 두께 통해. 이렇게 하면 모든 engulfment 및 밀매 이벤트 하나 이상 z-평면에서 볼 수 있을 것입니다. 또는 큰 사용 하 여 (1-5 µ m 직경) apoptotic 세포 모방 또는 efferocytosis 동안 최소한의 조각화를 받아야 apoptotic 세포 (예: 열 충격된 neutrophils) 대신 없이 z-스태킹. 우리 모두 모방과 apoptotic 호 중구의 준비를 설명 이전28.
- Photobleaching를 최소화, 밝은 fluorophores 캡처를 사용 하 여 photobleaching를 최소화 하는 인수 설정을 사용 하 여 이미지- 예를 들어 낮은 강도 여기 높은 카메라 이득 및 짧은 노출 시간29. 고감도 전자기 전 하 결합 소자 (EM-CCD) 카메라 또는 confocal, 회전 디스크와 이미징의이 형태에 대 한 고속 압 전 기계적 무대, 현미경을 사용 하는 것이 좋습니다.
- 이러한 시간 경과 비디오에 적용할 수 있는 가능한 분석 방법의 수는 광범위 하 고 여기에 검토 하는 우리의 능력을 넘어. 몇 가지 예제를 사용 하 여 수동 또는 자동 추적 소프트웨어 융합, 분열, 세포15내 efferosomes의 움직임을 추적, 표현 하는 세포에 colocalization 분석에 의해 endolysosomes와 efferosome 퓨전 역학을 계량 구획 별 형광 transgenes13, 프로 빙 컵 형성30, 같은 모니터 이해 프로세스 확인 신호 및 efferosome13, 단백질 매매의 모집 역학 및 apoptotic 세포 pH에 민감한, 산화 제에 민감한 또는 효소 활성화 fluorophores31표시를 사용 하 여 efferosomes의 degradative 활동 계량.
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Representative Results
밤새 Jurkat 세포의 apoptosis에 1 µ M staurosporine 결과 문화 > Annexin v (그림 1) 얼룩 확인 될 수 있다 세포의 95%. 비록 staurosporine의 농도 및 staurosporine 치료 기간 각 셀 라인에 대 한 최적화 될 필요가 있을 것 이다 다른 세포 유형,이 실험에 대 한 사용할 수 있습니다. 신뢰할 수 있는 검색 및 efferocytosis의 정량화에 대 한 > 세포의 80%는 efferocytes에 그들을 추가 하기 전에 apoptotic 이어야 한다. Apoptosis (예: 열 충격, etoposide 및 UV 빛)의 다른 inducers를 사용할 수 있습니다, 하지만 우리의 경험, 이러한 생산 apoptosis와 혼합된 셀 인구 apoptotic, 괴 사 성 등을 포함 하는 결과의 더 많은 다른 유형의 유도 및 apoptotic 비 대상 셀입니다.
내부 얼룩과 고정 셀 이미징에 대 한 모든 시간 지점에서 명확 하 게 delineated 비-efferocytosed (+염료를 추적 하는 streptavidin+/cell)와 밀접 하 게 apposed efferocyte-apoptotic 세포 상호 작용을 관찰 하 고 efferocytosed (streptavidin-/cell 추적+) 재료 표시 (그림 2). 형성 하는 efferocyte와 apoptotic 세포 사이 시 냅 스 자주 꽉 충분히 streptavidin, 제외 이며 따라서 개체의 둘레에 언제 든 지 streptavidin 베어링 스테인드 염료 추적 셀 간주 되어야 하는 것이 중요 하다는 바인딩된 셀 및 없습니다 efferosome 있습니다. 대부분 실험에서 efferocytosed는 apoptotic 세포의 일부분에서에서 증가할 것 이다 시간에 따른 패션, 아니 비 내 면 apoptotic 세포 자료가 때까지 또는 있는 식의 최대 efferocytic 용량 (그림에 도달할 때까지 그러나 3). 개별 실험 및 여러 실험 반복 기존의 분석에서 평균 값 셀에 걸쳐 데이터를 평균 수 있습니다, 분석은 일반적으로 수행 하 고 개별 셀 (그림 3A)에 대 한 기록 통계 접근 (그림 3B)입니다. 이 표준화 된 프로토콜의 수정 포함 되도록 추가 얼룩에 대 한 기본 셀 형식, 대체 efferocytic 목표의 사용을 위해 허용 하도록 만들 수 있습니다. 예를 들어 그림 4 는 기본 M2 편광 인간 대 식 세포 efferocytosed apoptotic 세포 모방 구성 3 µ m 직경 실리 카 구슬 phosphatidylserine의 혼합물에 코팅 및 phosphatidylcholine28, 뒤의는 이후 기정, permeabilization 및 재활용 endosome 마커 Rab17 immunostaining.
라이브 셀 동안 efferocytic 직업적인 식 세포 이미징 관찰 될 것 입 확장 하는 과정에서 작은 프로세스 취소 되 나 "검색"30 (그림 5, t = 0); 이 프로세스는 대상 발생 했을 때 그들은 단단히 대상에 고착 하 고는 이것을 그립니다. 이 조사 활동 비 직업적인 식 세포 상피 세포 등을 관찰 하지 않을 수 있습니다. efferocyte을 꽉 형성 다음 그 자체 고 종종 apoptotic 세포의 큰 부분을 포함 하는이 냅 apoptotic 세포 사이 "efferocytic 시 냅 스"32 (그림 5, t = 10). efferocyte의 cytosol (그림 5, 10-30 분)에이 시 냅이 스에서 apoptotic 세포의 조각을 그릴 다음 것입니다. 그들의 대형 후에 빨리 이러한 초기 efferosomes는 시 냅 스 그리고 페리 핵 영역, Rab7/RILP/다-dynactin 중재 전송33의 결과 향해 인신 매매. 시간이 지나면서는 efferosomes 축소 됩니다 그리고 그들은 가능성이 있는 셀에 걸쳐 재분배 결과 저하 물질 흡수 또는13,15재활용. 이러한 프로세스를 검색할 수는 인수 프레임율과 실험의 기간에 매우 의존 합니다. 프로 빙 등 신속한 프로세스 느린 이벤트 (efferosome 매매 및 흡수) 이미징 장기간을 필요로 하는 동안 낮은 프레임 속도에서 관찰 하지 않을 수 있습니다-두 경우 모두,이 큰 이미지 인수 종종 낮은 강도 이미지 캡처 필요 photobleaching 및 phototoxicity (그림 5)를 제한 합니다. 고정 셀 분석 결과와 마찬가지로이 분석 결과의 라이브 셀 버전 탐정의 요구에 맞게 수정할 수 있습니다. 그림 6 라이브 셀 인수 transgenes는 붙일 원형질 막 (오후-GFP) 덴마크의 고는 선택적으로 신호 지질 PI (3) P (FYVE-RFP) 결속을 표현 하는 J774.2 세포의 단일 프레임을 보여 줍니다. Efferosome 막에 파이 (3) P 세대는 오후-GFP+ efferosome 막과 FYVE-RFP의 공동 지역화로 검색할 수 있습니다. efferosome에 FYVE-RFP의 강도 측정 하 여 PI (3) P는 efferosome에 신호 역학 측정할 수 있습니다 (그림 6).
그림 1: Annexin V Apoptotic Apoptotic Jurkat 세포의 얼룩. phosphatidylserine 레이블 annexin V "먹고-나" apoptotic 세포에 의해 노출 되는 신호. (맨 위) 치료 (UT) Jurkat 세포 건강 한 (부드럽고 둥근) 형태 (DIC)을 표시 하 고 Annexin 대 (아래) Jurkat 세포 1 µ M staurosporine (STS)와 하룻밤 배양 apoptotic 형태 (불규칙 및 blebbed)에와 얼룩으로 얼룩이 되지 않습니다. 규모 대 annexin 바 = 10 µ m, 이미지 강도 색 지도 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: J774.2 대 식 세포에 의해 세포가 Apoptotic Jurkat의 초기 및 런타임에 Engulfment. 이미지는 초기 (60 분) 및 efferocytosis의 늦은 (120 분) 무대에서 대 식 세포의. 화이트 라이트 (DIC) 이미지는 대 식 세포 (mφ)과 apoptotic 셀 (AC) 사이 꽉 인터페이스를 보여 줍니다. 염료 (CTD, 빨간색)를 추적 셀 모든 apoptotic 세포 유래 자료의 위치를 보여준다. FITC Streptavidin 얼룩 (Str, 녹색)는 대 식 세포에 의해 잠겼습니다 하지 되었습니다 apoptotic 세포의 부분을 식별 합니다. 대 식 세포 핵 DAPI (파란색)와 미리 스테인드 했다. Apoptotic 세포 (녹색/황색)의 비 내 면 부분 대 (레드) Efferosomes Streptavidin과 염료 이미지를 추적 셀의 오버레이에 쉽게 식별 됩니다. Streptavidin streptavidin 단단히 형성된 efferocytic 시 냅 스 (*)에서 제외 하 여 만든 초기 timepoint에 대 식 세포 apoptotic 세포 인터페이스에서 얼룩의 부재 note 대 식 세포 핵 Hoechst 얼룩 (파란색)으로 식별 됩니다. 눈금 막대 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: J774.2 대 식 세포, Apoptotic 세포 Efferocytosed의 분수의 시간 과정. Efferocytosis 분석 실험 수행 되었다는 표시에 대 한 시간과 몸부림치 apoptotic 세포 소재 셀 염색/Streptavadin 얼룩 추적을 사용 하 여 각 시간 지점에서 결정의 분수. 개별 세포 내에서 efferocytosed 자료의 일부분을 (A), 데이터는 개별 셀에서 표시 되, 수평 막대는 의미를 나타냅니다. 조건, 5 독립 실험 1에서 데이터 당 12-17 셀. Efferocytosed 자료의 (B) 분수 5 독립 실험, 적어도 10 셀/조건/반복에 걸쳐 평균. p < 30 분, Kruskal-월리스 테스트 던 교정에 비해 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 기본 인간의 세포에 Efferosomes Rab17 채용의 분석. M2 편광 macrophage apoptotic 세포 모방 (화살표)를 가득 채우고 그리고 Rab17 (녹색)에 대 한 immunostained engulfment 다음 60 분. 눈금 막대 = 5 µ m. 세포 핵 Hoeschst로 얼룩진, DIC 이미지 셀 형태를 보여줍니다 apoptotic 세포 모방을 식별 하는 데 사용 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 라이브 셀 efferocytosis 분석 결과. 염료 labeledJ774.2 대 식 세포 (mφ, 녹색)를 추적 하는 셀 추적 염료 (AC, 빨간) 다른 색상 셀 표시는 apoptotic Jurkat 세포 가득 채우고로 기록 되었다. Apoptotic 세포 과정에서 국제화, 증분 통풍 관 및 여러 efferosomes (화살표)의 형성의 결과로 여러 조각으로 깨진입니다. 눈금 막대 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 형광 Transgenes 조사 Efferocytic 신호를 사용 하 여. J774.2 대 식 세포는 원형질 막 GFP 태그 표시 (오후, 녹색)와 함께 페 및 신호 지질 바인딩 FYVE RFP 구문 PI (3) P (레드). Efferocytosis는 FYVE-RFP 모집 (화살표)에 의해 감지 PI (3) P를 포함 하는 초기 원형질 막에서 파생 된 efferosome를 형성 한다. PI (3) P 신호의 역학으로 FYVE-RFP 신호 efferosome 폐쇄 시점 현재 상대적인 강도 접어 정량 되었다 (t = 0, 그래프). 이 실험은 apoptotic 세포 보다는 apoptotic 세포를 흉내 낸 구슬 (화살표, DIC)를 사용합니다. 눈금 막대 = 5 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 프로토콜에서 설명 된 방법을 사용 이미징 및 고정 셀 및 라이브 셀 접근을 사용 하 여 동적 efferocytic 프로세스의 정량화. 이러한 방식을 일반적으로 고용된 흐름 cytometry 기반 방법23,24에 여러 가지 이점을 제공합니다. 내부 고정 샘플 얼룩의 사용 속도의 더 강력 하 고 정확한 정량화와 efferocytosis의 범위를 제공 한다-실제로, 많은 교류 cytometry 기반 방법을 간단 하 게 레이블을 apoptotic 세포와 대 식 세포와 다른 fluorophores, 그리고 점수 efferocytosis 공동 apoptotic 세포 마커, 따라서 구별 하는 능력 부족으로 얼룩이 지는 세포의 일부분으로 내 면된 apoptotic 세포 소재 대 구속. 대체 흐름 cytometry 접근 apoptotic 세포24을 표시 하는 pHrodo를 사용 하 여 포함 됩니다. pHrodo 산 성 pH에서 밝기 증가 pH에 민감한 fluorophore입니다. 이 fluorophore 비-내 면 내 면된 소재, 대 형광 증가 특히 다음 apoptotic 세포의 국제화 및 efferosome의 산성화로 사이 더 나은 해상도 제공 않지만 결과 수 있습니다. efferosome 산성화34,35, 손상 질병 과정에 의해 혼동 하 고이 메서드는 efferocytosis36의 산성화 가난한 지역에 있는 초기 (사전 산성화) 단계에서 efferosomes를 놓칠 것 이다 27세포 또는 세포를 약하게 그들의 리소좀37시 어 지 다. 이 프로토콜에서 설명 하는 방법의 두 번째 장점은 라이브 셀 이미징 프로세스 조사, efferocytic 시 냅 스의 형성 등으로 efferocytosis의 역학을 측정 하기 위해 사용 하 고 수 없습니다 efferosomes의 세포내 매매 교류 cytometry 기반 방법을 사용 하 여 감지.
그러나이 방법은 많은 장점을 제공 한다, 셀의 많은 수백의 정량화를 필요로 실험-드문 이벤트를 감지 또는 높은 변수 프로세스 측정 실험 예 -어려울 수 있다, 이러한 큰 데이터 집합의 분석 시간의 과도 한 금액을 복용합니다. 높은 처리량 흐름 이미징 등 접근 이미징 cytometry38 수 기존의 현미경 보다 높은 처리량에 대 한 우리의 경험 현재 자동 이미지 분석 프로그램은 항상 정확 하 게 세분화 할 수 있지만 비-내 면 내 면된 재료 대. 특히, apoptotic 세포와 efferocyte 사이 형성 하는 단단한 efferocytic 냅 streptavidin 얼룩, 제외할 수 나타나고 같은 바운드 apoptotic 세포 수시로 부분적으로 의해 덮여 있다 염료 채널 추적 셀에 단단한 질량으로 streptavidin 얼룩 (그림 2)입니다. 따라서, efferosomes는 쉽게 알고리즘을 확인 하는 동안 apoptotic 세포의 바운드 부분 부분 streptavidin 얼룩에 대 한 회계의 어려움으로 인해 efferosome로 종종 오인은. 그러나 우리는 아직 정확 하 게 식별 하 고 인간의 도움 없이 apoptotic 세포의 증분 글귀를 정할 수 있는 프로그램을 찾아, 우리는 발견 그 trainable 반자동된 시스템39 크게 분석, 가속할 수 있다 분수 감소 2-3 분에서 efferocytosed 측정 < 60 셀 당 s. 또는, 비 소화 apoptotic 세포 모방 또는 최소한 apoptosis, 따라 조각 셀 형식 대신 사용할 수 있습니다. 이 감지 자동된 접근 더 많은 의무가 있을 수 있습니다 하 고 z 스태킹에 대 한 필요성을 제거할 수 있습니다 단일, 더 큰 구조를 단순화 합니다. 이러한 진보와도이 방법의 수집 및 분석 속도 유지 제한, 그리고 같은 cytometry 남아 있다 가장 실행 가능한 방법 큰 셀 숫자의 분석은 필요한23때.
비록 우리가 대상으로 efferocytes과 apoptotic Jurkat 세포 (T 세포 선)로 셀-선 및 기본 인간의 세포를 사용 하 여이 메서드를 설명 했으며,이 방법은 어떤 efferocytic 셀 형식 또는 apoptotic 세포 대상에 적용할 수 있습니다. 실제로, 유사한 접근 hepatocytes에 상피 세포9,,4041, efferocytosis 그리고 종양 세포42같은 임상적으로 관련 목표의 efferocytosis를 조사 하기 위해 사용 되었습니다. 그것은 비 면역 efferocytes를 사용 하는 경우 또는 특정 efferocytic 이벤트를 모델링 하는 경우이 프로토콜을 수정 해야 할 수 있습니다. 예를 들어 Jurkat 세포는 비 점착 되며 따라서 없습니다 가능성이 완전히 기계적인 힘을 정리 하 고 부착 apoptotic 세포 또는 단단한 조직 내의 apoptotic 세포와 상호 작용할 때 발생 하는 공간적 한계 efferocytes. 많은 세포 유형 apoptosis 동안 접착 유지 및 부착 대상;로 사용할 수 있습니다. 한 예로 HeLa 세포 reproducibly 받을 staurosporine 유도 된 apoptosis, phosphatidylserine 출 격, 그리고 blebbing 셀 바디43의 접착을 유지 하면서 4-6 h 동안. 비록 우리는 이러한 방식을 사용한 어떤 연구의 인식 하지 셀 콜라겐 매트릭스 또는 줄기 세포 유래 organoids44 에 단단한 조직, efferocytosis 공부에 대 한 잠재적인 모델을 수 있습니다. 일부 모델 Jurkat 세포 같은 면역 세포와 호 중구 수 사용할 없습니다 apoptotic 대상으로 사이토카인이 세포를 해제할 수 있습니다에 대 한 "찾기-나" 염증 성 또는 철새 모델에서 혼동 요인이 될 수 있는 CX3CL1 등 신호 프로세스 조사45입니다. 따라서,이 분석 결과 다양 한 세포 유형 및 모델 시스템 efferocytosis를 탐구 하는 데 사용 될 수 있습니다, 하는 동안 주의 해야 합니다 적절 한 efferocytes, 대상 셀 및 문화 최고의 모델은 생리 적인 조건 선택 조사를 받고 처리 합니다.
이 프로토콜에서 설명 하는 분석 방법의 광범위 한 분석을 사용 하면 이러한 실험 영상 기반 자연과 출발점 으로만 위한 것입니다. 예를 들어 efferosome 위치 및 직경 측정 분수 efferocytosed 측정을 수행할 때 수집 될 수 있습니다 또는 라이브 셀 내에서 측정 시간-과정의 세포내 매매 등의 프로세스를 조사 하려면 efferosomes 및 apoptotic 세포 저하13,15. Immunostaining (그림 4) 같은 바인딩 효능과 engulfment30 의 형태소 분석 함께 라이브 셀 이미징 프로세스 척도를 사용할 수 있지만 efferosomes, 단백질의 신규 모집을 조사 하는 데 사용할 수 있습니다. , 46. 우리가 자주 세포 신호 분자 활성화 또는 셀룰러 이벤트의 활동 efferocytosis (그림 6) 동안 보고 형광 transgenes 표현에서 이러한 분석을 수행. 이 기자 efferocytosis; 하는 동안 프로세스를 신호 모니터링 활성화 예를 들어 우리는 익숙해 랩 GTPases 붙일 태그 efferosome 처리 및 apoptotic 세포 유래 항13,15의 후속 매매 중재에 Rab5, Rab7 및 Rab17의 역할을 탐구. 마찬가지로, 세포 죽음, efferosome pH, 반응 산소 종 생산 및 라이브 세포 실험으로 다른 세포질 과정의 기자 들의 조사 efferosomes31의 저하를 중재 하는 프로세스를 사용할 수 있습니다. ,47. 이 실험에서 일반적인 문제는 식별 transgenes 또는 기자 호환 fluorophores; 종종, 우리 염료 또는 streptavidin 다른 fluorophores 이미징에 대 한 채널을 추적 하는 셀을 제거 합니다. 몇 가지 실험에 대 한 대체 apoptotic 세포 비 분할 모방에 도움이 됩니다. 이로써 신호 역학 추적 단일 apoptotic 세포에서 파생 된 여러 efferosomes의 복잡성 없이 세포질 과정의 정량화. 에반스 외. 참조 apoptotic 준비에 대 한 지침은 셀28모방.
이러한 실험을 설계할 때 가장 일반적인 어려움 photobleaching 및 phototoxicity29최소화 하면서 이미지를 원하는 프로세스에 대 한 있도록 fluorophores의 조합을 찾는 것입니다. Fluorophore 선택은 크게 레이저/여기 필터 dichroics/조각에 의해 규정 하 고 현미경의 방출 필터 및 따라서 fluorophores의 선택은 종종 개별 현미경. 일반적으로, 더 긴 파장 fluorophores (주황색 빨강, 예를 들면 방출 맥시 마 > 580 nm) photobleaching에는 적은 경향이 고이 파장은 세포를 덜 파괴. 녹색 fluorophores (방출 최대 ~ 525 nm)를 사용할 수 있습니다, 하지만 치료 제한 셀에 phototoxicity로 이동 합니다. 미만 480 파장에 흥분 하는 Fluorophores nm (보라색과 파란색) 그들의 높은 phototoxicity 및 다른 fluorophores29표 백제를이 여기 파장에 대 한 성향 때문에 피해 야 한다. 가능 하면, 높은 밝기와 안정적인 fluorophores 선택 되어야 합니다. 마찬가지로, 이미지 수집 매개 변수는 photobleaching 및 phototoxicity을 최소화 하기 위해 조정 되어야 한다-낮은 자극 강렬에 더 긴 노출 예: 높은 여기 농도48위에 선호 됩니다. 루틴 같은 항 산화 물질의 추가 및 일부 미디어 구성 요소 제거 향상 모두 photostability 하 고 phototoxicity49를 줄일 수 있습니다. 심지어 fluorophores 이미징의 신중한 선택, 종종 photobleaching를 제한 하는 필요의 낮은 신호 대 잡음 비율 (예를 들어 그림 5 참조) 이미지 캡처가 필요 합니다. 형광 강도 측정 하는 경우 신중 해야 제한 이미지 처리 유물; 이상적으로, raw 이미지 처리의 어떤 모양 없이 분석 되어야 합니다. 정량화 하기 전에 이미지를 deconvolving, 형광 강도 유지 하는 deconvolution 알고리즘 사용된50,51이어야 합니다.
라이브 셀 인수 도전적 일 수 있다 특히, 자극 강도, 노출 시간, 프레임 속도, 및 실험 기간 사이 주의 깊은 균형을 요구 하는 성공적인 실험. 자극의 강도와 노출 시간 더 긴 노출 시간 모션 유물 셀 운동 때문에 발생할 수 있습니다 또는 취득의 프레임 속도 제한 경고와 함께, 위에서 설명한 대로 phototoxicity를 최소화 하기 위해 조정 되어야 한다. 프레임 속도 실험 요구 사항에 따라 달라질 수 있습니다. 낮은 프레임 속도 (프레임 사이의 5-30 분) (12 h 이상) 시간의 연장된 기간 동안 영상에 대 한 허용 하지만 막 역학 등 efferosomes의 인신 매매 게시물 efferocytosis 현상에 최소한의 데이터를 제공 합니다. Efferocytic 이벤트와 efferosome 매매의 우수한 시간적 해상도 제공 하는 높은 프레임 속도 (초당 1 프레임으로 빨리)-하지만 심지어 fluorophores, 자극의 강도와 노출 시간의 신중한 선택-photobleaching 또는 phototoxicity 일반적으로 이러한 실험 기간에 한 시간을 제한 합니다. 우리의 경험에서는, 모든 1-2 분 이미지 획득 2-6 h의 실험 기간 동안은 합리적인 시간 해상도 efferocytic 이벤트, 충분 한 수의 정량 이미지를 제공 하는 수락 가능한 타협.
변경 된 및 실패 한 efferocytosis 암, 동맥 경화 증, 여러 자가 면역 질환의 병 리에 관련 된 것으로 알려져 있다, efferocytosis를 대상으로 치료와 임상 보여주는 위대한 약속7,52, 53,,5455. 이 분야에서 더 개발 세포 프로세스, 수용 체 및 efferocytosis 조절 신호 통로 식별 해야 합니다. 이 프로토콜에서 제공 하는 분석 결과 이러한 연구에 대 한 강력한 도구를 나타내고 많은 규제 efferocytosis 세포와 신호 프로세스의 척도를 수정할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 충돌의 관심을 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 건강 연구 (CIHR) 운영 보조금 MOP-123419, 자연 과학 및 엔지니어링 연구 위원회의 캐나다 발견 그랜트 418194, 그리고 온타리오 교육부의 연구 및 BH 혁신 초기 연구 수상의 캐나다 학회에 의해 투자 되었다. DGW는 프로토콜의 최적화 및 원고;의 쓰기에, 제시 하는 이미지의 일부를 기여 그는 리버풀 대학에서에서 펌프 못쓰게 교부 금에 의해 투자 되었다. CY는 Vanier 대학원 장학금 및 CIHR MD/PhD 재학에 의해 자금입니다. 자금 지원 기관 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 Media | Wisent | 3500-000-EL | |
| DMEM Media | Wisent | 319-005-CL | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| PBS | Wisent | 311-010-CL | |
| 18 mm circular glass coverslips #1.5 thickness | Electron Microscopy Sciences | 72290-08 | Size and shape of coverslip is not critical, but 18 mm fit into the wells of a standard 12-well plate which simplifies cell culture |
| Staurosporine | Cayman Chemical | 81590 | Dissolve in DMSO at 1 mM (1,000x stock solution) |
| Annexin V-Alexa 488 | ThermoFisher | R37174 | |
| EZ-Link NHS-Biotin | ThermoFisher | 20217 | Store in a dessicator. Do not prepare a stock solution. |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| CellTrace FarRed | ThermoFisher | C34572 | |
| CellTrace Orange | ThermoFisher | C34851 | |
| Hoescht 33342 | ThermoFisher | 62249 | |
| FITC-Streptavadin | ThermoFisher | SA1001 | |
| Lympholyte-poly cell sepration medium | Cedarlane Labs | CL5071 | |
| Recombinant Human M-CSF | Peprotech | 200-04 | |
| Recombinant Human IL-4 | Peprotech | 300-25 | |
| J774.2 Macrophage Cell Line | Sigma-Aldrich | 85011428-1VL | |
| THP-1 Human Monocyte Cell Line | ATCC | TIB-202 | |
| Jurkat T Cell Line | ATCC | TIB-152 |
References
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