Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Efferocytosis tek hücreli floresans mikroskobu tarafından miktar

Published: August 18, 2018 doi: 10.3791/58149
Automatic Translation
1, 1, 2,3, 1
1Department of Microbiology and Immunology and the Center for Human Immunology, University of Western Ontario, 2Institute of Infection and Global Health, University of Liverpool, 3Department of Respiratory Research, Aintree University Hospital NHS Foundation Trust

Summary

Efferocytosis, apoptotik hücreler, fagositik kaldırılması homeostazı korumak için gerekli ve reseptörleri ve tanıma, engulfment ve apoptotik hücreler içselleştirilmesi için izin sinyal yollar tarafından yönetilir. Burada, biz efferocytosis miktar ve efferocytic sinyal yolları etkinlik için bir floresans mikroskobu Protokolü mevcut.

Abstract

Efferocytosis Yönetmeliği okuyan ve doğru bir şekilde apoptotik hücreler alımını ölçmek için efferocytosis kontrol sinyal ve hücresel işlemleri soruşturma için yöntemler gerektirir. Bu miktar böylece doğru bir şekilde apoptotik hedef karşı artık unengulfed cep efferocytosed kısmı arasında betimlemek Yöntemler gerektiren çoğu kez efferocytosed parça parça, apoptotik hücreler gibi yapmak zor olabilir parçaları. Burada özetlenen yaklaşım doğru makrofajlar gibi efferocytes efferocytosis ve efferocytic kapasitesini dinamikleri ölçmek için çift etiketleme yaklaşımlar kullanır. Apoptotik hücre sitozol apoptotik hücre yüzey biotinylation farklılaşma için sağlar internalized ve sigara içselleştirilmiş arasında iken tüm apoptotik hücre kaynaklı malzemeler, izleme özelliğini etkinleştirme bir hücre izleme boya ile etiketlenir apoptotik hücre kesirler. Canlı ya da sabit hücre floresan fotoğraf çekmek ve streptavidin boyama tarafından Ayrıştırılan gibi ilişkili içselleştirilmiş hedefleri karşı miktarı miktarının efferocytes efferocytic kapasitesini belirler. Bu yaklaşım yöntemleri akış sitometresi, yani efferocytosed apoptotik hücre kesirler, efferocytic dynamics tarafından canlı-cep mikroskobu, ölçmek için yetenek karşı efferocytosed doğru tarif gibi birçok avantaj sunar ve hücresel fluorescently etiketli transgenes ifade hücrelerde sinyalizasyon çalışmaları gerçekleştirmek için kapasite. Birlikte, bu protokol için özetlenen yöntemleri doğru efferocytic etkinliğini ölçmek ve hücresel sinyal yolları efferocytosis sırasında etkin sorguya çekmek için kullanılan esnek bir deneysel yaklaşım için temel olarak hizmet vermektedir.

Introduction

Apoptozis veya programlanmış hücre ölümü, en çok hücreli canlılar arasında oluşur ve onların gelişme ve homeostasis1için son derece önemli bir son derece düzenlenir fizyolojik süreçtir. Ek olarak normal hücre ciro ve embriyonik geliştirme dahil olmak, apoptozis dokular enfekte veya hasarlı hücreleri ortadan kaldırılması sağlar ve yanıt enfeksiyon, inflamasyon, kanser ve aynı zamanda tıbbi müdahaleler tarafından tetiklenebilir radyoterapi veya steroid1gibi. Apoptotik hücreleri göstermek "ye-bana" fagositler, profesyonel ve profesyonel olmayan bir dizi reseptörler tarafından tanınan sinyalleri onların hücre yüzeyinde topluca "efferocytes" anılacaktır. Bu reseptörler nişan alımı ve apoptotik hücre bozulması efferocyte efferocytosis2,3bilinen işlem aracılığıyla tarafından neden olmaktadır. Fosfatidilserin en iyisi karakterize yemek-sürüş efferocytosis işaret. Normalde plazma zarı iç broşür böylece açığa Fosfatidilserin hücre yüzey4' te bu membran asimetrisi bozan bir lipid scramblase aktive apoptozis ile sınırlanır. Fosfatidilserin olgun makrofajlar gibi bazı sigara apoptotik hücre hücre dışı yüzeyinde bulunan ve trombosit aktive. Ancak, bu hücreler efferocytosed "beni yeme" gibi sinyallerini CD47, onların hücre yüzey5,6,7varlığı nedeniyle değildir. Maruz Fosfatidilserin efferocytic reseptörleri efferocytes tarafından ifade edilen bir dizi tarafından kabul edilmektedir. Bu reseptörler Fosfatidilserin için bağlama, doğrudan veya opsonins, yardım yoluyla etkinleştirir apoptotik hücre engulfment efferosome8, olarak adlandırdığı bir membran bağlı çarpıtması içine teşvik sinyal yolları 9 , 10 , 11 , 12. efferosome sırayla endosomes ile sigortalar ve Moleküler makineler efferosome acidify ve apoptotik aşağılamak için gerekli teslim organellerin hücre kargo13,14. Bir kez bozulmuş, apoptotik hücre kaynaklı malzemeler için geri dönüşüm endosome ticareti — bir süreç olan bağışıklık yanıtı apoptotik hücre kaynaklı antijenleri için sınırlar ve hangi apoptotik hücre13, besin kurtarma için izin verebilir 15. Engelli izni efferocytosis sonuçlarında apoptotik hücre bir başarısızlık; temizlenmemiş bu hücreler sonunda sekonder nekrozis tabi. Nekrotik hücre pro-inflamatuar sitozolik İçindekiler, patojenler ve autoantigens böylece driving range infektif, enflamatuar ve otoimmün hastalıklar16,17ekstraselüler ortamın yayın. Birlikte, apoptozis ve efferocytosis ölmek üzere olan ve ölü hücreleri kaldırılmasını kolaylaştırmak ve doku homeostazı bakım için izin.

Efferocytosis temel moleküler mekanizmaları araştıran apoptotik hücre Alım açık bir miktar sağlamak üzere yöntemler gerektirir. Bu miktar diğer alımını mekanizmaları endositoz ve fagositoz18,19, efferocytosis gibi sağlam hedef hücre, parçalı Anlamazdın kaynaklanan engulfment neden olabileceğini değil aslında tarafından karmaşıktır apoptotik hücre efferocyte20. Burada açıklanan protokolü sağlar internalized doğru tarif bir vitro efferocytosis tahlil açıklar karşı bireysel apoptotik hücre bölümleri sigara içselleştirilmiş ve sabit-hücre çeşitli ile kombine edilebilir ve Live-cep mikroskobu yaklaşımlar. Geleneksel fagositoz deneyleri eklemek antikorlar Özel Sigara içselleştirilmiş hedefleri, nerede bizim yöntemi olarak etiketlemek için deney sonunda fagositik hedefe farklı kovalent bağlı biotin21 apoptotik hedefle etiketleme , 22. apoptotik hücre belirli antikor-ebilmek var olmak kullanılmış bu tahlil ederken, biotinylation yaklaşım herhangi bir protein taşıyan hedef etiketlenmeye olanak sağlar ve immunostaining gerçekleştirilirse ikincil antikor olan ile olası sorunları önler . Özellikle, bir hücre izleme boya ve biotin ile çift lekeli edilmiştir apoptotik Jurkat hücreleri hazırlanması anahat. Boya izleme hücre efferocytosis sırasında izleniyor, efferocytosed apoptotik hücre sigara içselleştirilmiş bölümlerden ise yüzey biotinylation ayrımcılık için sağlar internalized apoptotik hücre kaynaklı malzeme sağlar. Ayrıca Kültür ve hazırlanması J774.2 ve THP-1 hücre hatları için fare ve insan efferocytes olarak kullanmak, monosit kaynaklı M2 makrofajlar birincil hücre efferocytosis ve Jurkat hücreleri kullanmak için bir örnek olarak efferocytic hedef olarak açıklar. Bu yöntemler diğer hücre hatlara veya primer hücre, hücre ölümü (Örneğin apoptosis, nekroz ve necroptosis) her türlü geçiren hedef hücrelere ve hangi apoptotik hücreler lipid kaplamalar arasında taklit mikron büyüklüğünde taklit eder kolayca uygulanabilir veya kaplama ligandlar belirli bir faiz efferocytic takımı ile.

Bu protokol için özetlenen yöntemi yaygın olarak kullanılan alan23,24akış sitometresi dayalı yöntemler üzerinde birçok avantajı vardır. NET her iki toplam ve sigara içselleştirilmiş apoptotik hücre malzemesi etiketleme ile kombine Fagosit-apoptotik hücre etkileşimi doğrudan görüntüleme tarafından efferocytosis nicel ölçüleri yapılabilir. Ayrıca, pH-duyarlı fluorophores bazı alternatif yöntemler25zihnimi karıştıran lizozomal pH FITC ve GFP floresans bastırılması gibi karıştırıcı faktörlerin kısıtlar. Son olarak, ayrıntılı olarak açıklanmıştır değil iken, bu yöntemler transgenes, fluorescently etiketli ifade efferocytes kullanarak istihdam edilebilir veya sonrası fiksasyon immunostaining molekül etkinlik sinyal ve izlenmesi miktar için izin vermek için ile hücresel süreçler sırasında efferocytosis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Sağlıklı gönüllülerden kan toplanması sağlık Bilim Araştırma Etik Kurulu Batı Ontario Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. İz Tri-Konseyi ilke bildirimi insan araştırma yönergelere uygun olarak gerçekleştirildi.

1. Kültür ve THP-1 monosit hücre kültürünü hazırlanması

  1. Kültür THP-1 monosit olarak 37 ° C + %5 CO2T25 şişeler bir süspansiyon kültürü. Hücreleri Roswell Park Memorial Enstitüsü 1640 (RPMI 1640) + % 10 5 mL Fetal sığır Serum (FBS) Yetişkin olmak.
  2. Her gün askıya alma hücreleri şişeye, hafifçe sallayarak eşit olarak büyüme medya boyunca sonra hemen bir hemasitometre içeren hücreleri saymak. Hücre yoğunluğu 1 x 106 hücre/mL ulaştıktan sonra hücreleri passaged:
    1. Önceden sıcak RPMI 1640 + %10 37 ° C su banyosu içinde FBS.
    2. 2 x 105 hücreleri içine 1.5 mL microcentrifuge tüp ya da 15 mL konik tüp ve Pelet hücreleri 500 x g 5 min için oda sıcaklığında, centrifuging tarafından aktarın.
    3. Hücre Pelet bozmadan süpernatant kaldırmak ve pelet 1 mL (1.5 mL microcentrifuge tüp) veya fosfat tamponlu tuz (PBS) 5 mL (15 mL konik tüp) resuspend.
    4. Santrifüj tüpü vasıl 500 x g oda sıcaklığında 5 dakika süreyle hücre Pelet bozmadan PBS kaldırın.
    5. 1 ml taze RPMI 1640 + % 10 resuspend Pelet FBS.
    6. Bir yeni T25 şişeyi yere 4 mL ılık medya ve bu 1.2.5 resuspended hücreleri ekleyin. 37 ° C + %5 CO2 kuluçka makinesine kadar hücreleri (genellikle 3 gün) passaging gerektiren veya hücreleri bir deney için gerekli olan kültür.
  3. Makrofajlar THP 1 türetilmiş bir deneme için hücreleri gerekli sayıda şişesi ve passaging önce plaka kaldırın:
    1. 18 mm dairesel cam coverslips (#1.5 kalınlık) gerekli sayıda 12-şey plaka kuyu yerleştirin — koşul ve/veya timepoint başına genellikle 1 coverslip. Her içine aliquot 5 x 104 THP-1 monosit iyi. Hücre sayısı için her şey değiştirilebilir, gerekirse eklendi.
    2. Her toplam sesini getirin de 1 kullanarak RPMI + % 10 mL için hücreyi içeren FBS 37 ° C'ye ısındı
    3. THP-1 monosit makrofaj gibi hücrelere farklılaşma ikna etmek 3 gün boyunca kültür ve her şey için 100 nM phorbol 12-myristate 13-asetat (PMA) ekleyin.

2. Kültür ve J774.2 makrofaj hücre kültürünü hazırlanması

  1. Kültür J774.2 T25 şişeler 37 ° C + %5 CO2hücrelerde. Hücreleri 5 mL Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (DMEM) + % 10 yetiştirilen FBS ve kültür % 80-90 confluency ulaştığında pasajlı. Geçiş hücreleri için:
    1. Tüm medya şişesi ve 5 mL PBS de bir kez yükselişiyle kaldırın.
    2. PBS balonun kaldırmak ve taze DMEM + % 10 ile 5 mL yerine FBS.
    3. Bir hücre kazıyıcı kullanarak, medya hücrelerde askıya şişeye alt kazı. Şiddetle hücreleri herhangi bir hücre toplamları kadar kırmak için birkaç kez pipette.
    4. Hücre süspansiyon 4 mL balonun çıkarmadan ve eski yerine koymak o ile 4 mL taze medya hücreleri 1:5 oranında seyreltin. Kalan hücre süspansiyon atılır, yeni bir hücre kültürü bir taze T25 şişeye başlatmak için kullanılan veya bir deney için kullanılan.
  2. J774.2 hücreleri kullanarak bir efferocytosis tahlil için ayarlamak için:
    1. Deneme, başlamadan önce bir gün J774.2 hücre içine 5 mL taze medya, adımları 2.1.1–2.1.3 göre de askıya alma. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ve gerekli birim hücre konsantrasyonu 5 x 104 hücre/mL, hazırlanın.
    2. 18 mm dairesel cam coverslips (#1.5 kalınlık) gerekli sayısı 12-şey plaka kuyu yerleştirin. Her içine aliquot 1 mL 5 x 104 hücre/mL hücre süspansiyon, iyi.
    3. Kültür bir gecede hücrelere coverslip için uygun ve passaging üzerinden kurtarmak izin vermek için.

3. birincil insan M2 makrofajlar kültürünün

  1. 10 mL M2 makrofajlar gerekli her 12-şey tabak heparinized insan kanı toplamak.
  2. 15 mL santrifüj tüpü 5 mL 5 mL önceden ısıtılmış Lympholyte-poli hücre ayrılık orta de üstüne insan kanı de katman. İşleme birden çok tüpler hazırlamanız > 5 mL kan tercihan--dan istimal büyük birim tüpler de.
  3. 300 x g 35 dk., orta hızlanma ve hiçbir sonu kullanarak için de santrifüj kapasitesi.
  4. Bir plastik pipettor ve 50 mL santrifüj tüpü transfer kullanarak üst mononükleer hücre zengin bant dikkatli bir şekilde çıkarın. 3.2. adımda birden çok tüpler hazırlanmıştır, bantları tek 50 mL tüp içine havuza alınmış. Tüp hacmi getirmek PBS ile ilâ 50 mL.
  5. Vasıl 300 x g 8 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın. Bu adımı sırasında autoclaved 18 mm çapında dairesel coverslips (#1.5 kalınlık) 12-şey plaka her kuyunun içine yerleştirin.
  6. Hücre Pelet 300 µL serum-Alerjik RPMI 1640 istenen sayısına göre wells, resuspend; 10 mL kan tam 12 iyi plaka hazırlamak için işlendiyse Örneğin, 3,6 mL medya hücre Pelet askıya.
  7. 12-şey tabak içinde de coverslip-içeren hücre süspansiyon 300 µL ekleyin. 37 ° C + %5 CO21 h için kuluçkaya.
  8. Nazikçe yıkayın coverslip 3 x 1 mL yapışık olmayan hücreler kaldırmak için ısıtılmış PBS ile.
  9. 1 mL RPMI 1640 + 10 ekleyin % FBS + 10 ng/mL rekombinant insan M-CSF + hücre kültür antibiyotik/antimycotic. 37 ° C + %5 CO2 ' de 5 gün kuluçkaya.
  10. Medya ile RPMI 1640 + 10 yerine % FBS + 10 ng/mL rekombinant insan M-CSF + 10 ng/mL rekombinant insan Il-4 + hücre kültür antibiyotik/antimycotic. 37 ° C + %5 CO2 M2 polarizasyon tamamlamak 2 gün kuluçkaya.
  11. Polarize makrofajlar sonraki 3 gün içinde kullanılmalıdır.

4. apoptotik Jurkat hücreleri hazırlanması

  1. 5 mL RPMI 1640 + % 10 Jurkat hücreler kültür FBS 37 ° C + %5 CO2. Jurkats süspansiyon hücre kültürünü vardır ve 1:5 taze, önceden ısıtılmış medya her 3-5 gün passaging tarafından yapılmaktadır.
  2. Apoptotik hücreler hazırlamak için yüksek yoğunluklu (4-5 gün sonra passaging) büyümeye Jurkat kültür izin. Hücreye bir 1.5 mL microcentrifuge tüp ve pelet tarafından Santrifüjü 500 x g 5 min için de aliquot 1,5 mL.
  3. Süpernatant atın ve hücre pelet 1 mL serum-Alerjik RPMI 1640 orta 1 µM staurosporine içeren yeniden askıya alma.
  4. Hücreleri apoptotik işlemek için 37 ° C + %5 CO2 16 h kuluçkaya.
  5. İstenirse, indüksiyon apoptosis Annexin V: ile boyama tarafından onaylamak
    1. Staurosporine tedavi Jurkat hücre kültür 1.5 mL microcentrifuge tüp içine aliquot 100 µL. Hücreleri tarafından Santrifüjü 500 x g 5 min için de cips, süpernatant atmak ve hücre Pelet serum-Alerjik RPMI 1640 orta 100 µL içinde yeniden askıya alma.
    2. Floresein isothiocyanate (FITC) 1 µL eklemek-Annexin V Birleşik ve karanlık oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.
    3. PBS 900 µL ekleyin ve birimin tümü bir 18 mm dairesel cam coverslip (#1.5 kalınlık) içeren bir 12-şey plaka tek bir şey için transfer. Spin aşağı coverslip için bağlı kalmak için 200 x g hücreleri zorlamak 1 dk için de bir tabak adaptörle donatılmış bir santrifüj içinde. Alternatif olarak, hücre odacıklı bir slayt görüntüleme için içine yerleştirilebilir.
    4. Bir floresan mikroskop kullanarak görüntü.

5. sayısal Efferocytic alımı ve bir sabit hücre Efferocytosis tahlil ve Inside-out boyama kullanarak Dynamics

  1. THP-1, J774.2 veya M2 insan makrofajlar bölümleri 1-3' te, sırasıyla açıklandığı şekilde hazırlayın.
  2. Deneme başlangıcı önce akşam apoptotik Bölüm 4' te açıklandığı gibi Jurkat hücreleri hazırlayın.
  3. Deney hemen önce bir hemasitometre kullanarak apoptotik hücreleri saymak. Apoptotik hücre yeterli sayıda 1.5 mL microcentrifuge tüp içine transfer-biz genellikle 10:1 bir hedef: efferocyte oranı sağlayan 5 x 105 hücreleri/iyi, ekleyin.
  4. Jurkat hücreleri tarafından Santrifüjü 500 x g 5 min için de cips ve PBS 500 μL içinde resuspend.
  5. Santrifüjü sırasında DMSO aliquot 10 µL yeni 1.5 mL microcentrifuge tüp içine. DMSO N-hydroxysuccinimidobiotin (NHS-Biotin) en az bir miktarda geçiyoruz. 5-10 kristaller (~0.005 mg) arasında bir değer yeterlidir.
  6. 500 μL apoptotik hücre/PBS süspansiyon DMSO/NHS-tüp içeren biotin için transfer. Sonra boya üreticisinin tavsiye edilen konsantrasyon apoptotik hücre süspansiyon izleme hücre oranında seyreltin. Hayalice (boya izlemeÖrneğin kırmızı ya da far-red hücre) FITC-Streptavidin ile örtüşmediğinden boya izleme bir hücreyi seçmek emin olun.
  7. Süspansiyon içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya. RPMI 1640 + % 10 eşit bir birim eklemek FBS ve unreacted herhangi bir boya gidermek için karanlık oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
  8. Cips hücreleri tarafından Santrifüjü 500 x g 5 min için de, süpernatant atmak ve RPMI 1640 + %10 100 µL lekeli apoptotik hücrelerde yeniden askıya FBS makrofajlar kuyu başına.
  9. 100 µL lekeli apoptotik hücre süspansiyon dropwise makrofajlar her şey için ekleyin. 200 x g için makrofaj ve apoptotik hücreler arasında temas zorlamak için bir plaka adaptörü ile donatılmış bir santrifüj 1 dk santrifüj kapasitesi.
  10. Doku kültürü kuluçka 37 ° C + %5 CO2 istenen süre için plaka kuluçkaya. Makrofajlar için efferocytosed malzeme genellikle ilk 20-30 dakika sonra algılanabilir ve 120-180 dk sonra tamamlanır.
  11. İstediğiniz saatte noktalarının kuluçka makinesi hücre kaldırma. Hücreleri iki kere oda sıcaklığında efferocytosis durdurmak ve sigara efferocytosed apoptotik hücreler kaldırmak için PBS 1 mL ile yıkayın.
  12. Her şey için bir 1:1,000 seyreltme FITC Birleşik streptavidin ekleyin ve karanlıkta 20 dk için kuluçkaya. Bu maruz biotin herhangi bir sigara efferocytosed apoptotik hücre malzemesi olarak etiketlenir.
    Not: arzu edilirse, hücre çekirdeği bu adımı sırasında Höchst 33342 1:20,000 seyreltme eklenmesi tarafından boyanabilen veya 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI).
  13. Hücreleri 3 kez 1 mL hafifçe sallayarak veya örnekleri durulama başına 5 min için sallanan PBS ile yıkayın. Hücreleri % 4 paraformaldehyde (PFA) ile Oda sıcaklığında 20 dk içinde PBS fix. Bir kez PBS aşırı PFA kaldırmak için hücrelerle durulayın.
  14. Coverslips bir slayt görüntüleme ve floresan mikroskop aktarmak için bağlama. Z-yığınlarını hücreler doğru miktar için yeterli sayıda yakalamak — genellikle 10-30 hücreleri koşul başına. Sigara içselleştirilmiş apoptotik hücre malzemesi boya malzeme efferocytosed malzeme ayrı hücre boya puncta herhangi bir streptavidin ücretsiz izleme oluşturur iken FITC streptavidin boyama tarafından zarflı etiketli izleme hücre elde edilen görüntüde belli olacak boyama.
  15. Efferocytosis çeşitli önlemleri yoluyla elde edilen görüntülerde ölçmek:
    1. Efferocytic endeksi ayrık efferosomes (boya+/streptavidin- puncta izleme hücre) ortalama sayısı belirlenerek makrofaj hesaplanır. Sadece bir apoptotik hücre bağlı veya ≥1 görünür efferosomes içeren makrofajlar ölçmek. Kayıt makrofajlar bir apoptotik hücre ama 0 efferocytic indeksine sahip ve kontrollü olarak eksik olan ayrık efferosomes bağlı.
    2. Efferocytic verimliliği ≥1 efferosome içeren makrofajlar kısmını ölçerek hesaplayın.
    3. Bir hesaplayın oranı sabit ve birden çok kez noktalarda lekeli görüntüleme hücreleri tarafından efferocytosis. Tek görüntü makrofajlar apoptotik hücreler için bağlı veya z-yığınlar ile görünür efferosomes içeren her hücreyi ele geçirdi. Yansıma sonra efferocytosis oranını belirlemek:
      1. Bir rehber ve FIJI/ImageJ26 (veya diğer görüntü analiz yazılım paketi), serbest çizgi veya çokgen seçim aracını tüm boya+/streptavidin- (içselleştirilmişÖrneğin ) izleme hücre daire streptavidin boyama kullanarak malzeme tek uçağa z yığınının içinde. Bu bölge boya izleme hücre entegre yoğunluğunu ölçmek. Her efferosome (Örneğin çapı, hücre kenarlığı veya çekirdek, vbgöreli konumlandırma)15,27 için tek tek önlemler kolayca aynı anda bu ölçümler ile büyük ölçüde elde edilebilir verileri artan çözümleme sırasında toplanan.
      2. Aynı z Bölüm üzerinde tüm boya+/streptavidin+ (sigara içselleştirilmişÖrneğin ) izleme hücre daire bir rehber ve serbest çizgi veya çokgen seçim aracı olarak boyama streptavidin kullanarak tek uçağa z yığının içinde malzeme . Yalnızca Fagosit temas apoptotik hücrelerden boyama dahil. Bu bölge entegre yoğunluğunu ölçmek.
      3. 4.2.3.1 4.2.3.2 geri kalan z-bölümleri için görüntünün yineleyin. Efferocytosed (Σeff) ve non-efferocytosed (ΣKB) malzemeler entegre yoğunluğunu toplamı. Kesir efferocytosed olmuştur apoptotik hücre için hücre hesaplanabilir:
        Equation
      4. Kesir efferocytosed tüm zaman noktalarda tüm hücreler için ölçmek. Not apoptotik hücreler/efferosomes floresan yoğunluğu Görüntü alımı farklılığı boyalar bireysel apoptotik hücreler tarafından izleme hücre nedeniyle ve çekim hızı gibi görüntü edinme Parametrelerindeki değişiklikler nedeniyle arasında değişebilir. Bu nedenle, sadece karşılaştırın kesir Efferocytosed gibi değerleri normalleştirilmiş veya yoğunluk bağımsız tekrarlama efferocytic dizin ve efferocytic verimlilik, görüntüler arasında deneysel koşullar arasında ve arasında gibi deneyler.
    4. Elde edilen veri kümesi efferocytosis hücreler arasında varyasyon iyi yansıtacak emin olmak için hücre her deneyde olası en fazla sayısı bu analizlere kuralları.
      Not: Efferocytic verimlilik ve efferocytic endeks hızla (birkaç saniye /) hesaplanabilir ve biz genellikle deneme, başına en az 100 hücre analiz her deney en az 3 kez yinelenen hedefliyoruz. Efferocytosed kısmını hesaplama malzeme ve efferosome özel önlemler daha zahmetli, genellikle 2-3 dakika alarak / hücre için deneyimli bir analist. Bu hesaplamalar için en az bir koşul, deney başına başına 15 hücre ölçmek.
    5. Kayıt efferocytic Dizin, kesir efferocytosed ve bireysel efferosome veri hücre içi olarak.
      Not: Bu tek hücreli yaklaşımları, böylece arası hücre varyasyonları sayısal izin kullanarak veri analizi için sağlar. Nüfus düzeyinde analizler hala bu veri kümeleri üzerinde bireysel deneylerde elde tek hücre veri sayı ortalaması alınarak yapılabilir. Efferosome özel ölçüler nüfus düzeyinde, tek hücre düzeyi ve topluluklar (Örneğin nüfus efferosomes bunları içeren hücrelerin bağımsız olarak) olarak analiz15.

6. canlı hücre Efferocytosis tahlil apoptotik hücreler kullanma

  1. THP-1, J774.2 veya M2 makrofajlar adımlar 1-3, sırasıyla açıklandığı şekilde hazırlayın. Gerekirse, hücreleri ile transgenes transfected ya da herhangi bir deney gerçekleştirmeden önce en az 18 h diğer genetik yapıları.
  2. Deneme, başlamadan önce akşam apoptotik Bölüm 4 ve 5 aşağıdaki değişiklikler ile açıklandığı gibi Jurkat hücreleri hazırlayın:
    1. Hücreleri sulandırmak ve apoptosis göre 4.1-4.3, teşvik ve apoptotik hücreler 5.3-5,4 göre gerekli sayıda toplamak.
    2. Boya üreticisinin tavsiye edilen konsantrasyon, apoptotik hücre süspansiyon için izleme hücre ekleme. Süspansiyon içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya. RPMI 1640 + % 10 eşit bir birim eklemek FBS ve unreacted herhangi bir boya gidermek için karanlık oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya. NHS-biotin bu deneyler için eklemeyin.
    3. Cips hücreleri tarafından Santrifüjü 500 x g 5 min için de, süpernatant atmak ve RPMI 1640 + %10 100 µL lekeli apoptotik hücreler yeniden askıya FBS makrofajlar kuyu başına.
  3. Gerekirse, seyreltme hayalice boya izleme hücre ile örtüşmediğinden boya izleme hücre kültür medya her kuyudan çıkarıp üreticileri içeren PBS 500 µL ekleme makrofajlar önerilen etiket apoptotik hücreler veya herhangi bir eklenen Floresan transgenes makrofajlar tarafından dile getirdi. Karanlık oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya, o zaman DMEM + % 10 eşit bir birim eklemek FBS ve unreacted herhangi bir boya gidermek için karanlık oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
  4. Makrofaj içeren coverslip Leiden odasına aktar. 400 eklemek DMEM + % 10 µL FBS, etiketli apoptotik hücre süspansiyon 100 µL tarafından takip. 2-3 kez hafifçe medya pipetting tarafından karıştırın.
  5. Leiden odası transfer için bir ısıtmalı ve CO2-derin deniz ticaret odası canlı hücre floresan mikroskop.
    Not: CO2 perfüzyon yetenekleri eksikliği, doku kullanmak mikroskop kurulumları için kültür orta ile 1 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic asit (HEPES) karbonat ise fizyolojik pH korumak için yerine arabelleğe alınmış Kültür havaya maruz.
  6. Bir beyaz ışık (faz kontrast veya DIC) görüntü ve tüm floresan etiketleri görüntülerini içeren bir hızlandırılmış seri yakalama:
    1. 100 X objektif lens kullanmak ince detaylar çözme nerede deneyler (Örneğin hücre-apoptotik hücre etkileşimlerin membran dynamics) gerekli. Bu arada, daha genel önlemler (oranı apoptotik hücre alımı, makrofaj ve apoptotik hücreler arasındaki etkileşim süre vb) en iyi bir 60 X veya 63 X amacı istimal görüntüsü.
    2. Varsa, tek bir satın alma, böylece tek bir deneyde yakalanan efferocytic olayların sayısını artırma sırasında birden çok alan Manzaralı Görüntü noktası-misafir kullanır
    3. Efferocytes sık sık küçük parçaları sağlam hücreler yerine apoptotik hücreler yutmak için z-yığınlar yakalamak en iyisidir. Z-sizin mikroskoplar objektif odak derinliği tarafından ayrılmış bölüm yakalama fototoksisite en aza indirmek için (genellikle 0.5-1.0 µm), hücre (genellikle makrofajlar, Örneğin 8 – 20 dilim/hücre için 8-10 µm) kalınlığı ile. Bu tüm engulfment ve kaçakçılık olayları en az bir z-düzlemde görünür olmasını sağlar. Alternatif olarak, büyük kullanın (1 – 5 µm çapı) apoptotik hücre taklit eder veya en az düzeyde parçalanma sırasında efferocytosis tabi apoptotik hücreler (Örneğin Isı şok nötrofil) bunun yerine olmadan z istifleme. Taklit eder ve apoptotik nötrofil hazırlanması tarif var daha önce28.
    4. Photobleaching en aza indirmek, parlak fluorophores ve yakalama kullanın resimlerini photobleaching en aza indirmek satın alma ayarlarını kullanarak — Örneğin yüksek fotoğraf makinesi kazanç ve kısa maruz kalma ile birlikte düşük yoğunluktaki uyarma kez29. Bir yüksek-duyarlı elektromanyetik şarj kuplajlı cihaz (EM-CCD) kamera veya iplik-disk confocal ve yüksek hızlı piezoelektrik mekanik için bir sahne, bu formu görüntüleme ile donatılmış bir mikroskop kullanarak önerilir.
  7. Bu hızlandırılmış videoları için uygulanabilir olası analiz yöntemleri, geniş ve burada gözden geçirmek için yeteneğimizi sayısıdır. Füzyon, bölünme ve efferosomes hücreleri15içinde hareketi izlemek, colocalization analizde ifade makrofajlar tarafından efferosome füzyon dynamics endolysosomes ile ölçmek için kullanın bazı örnekler el ile veya otomatik izleme yazılımı yuvası özel floresan transgenes13, izleme alım işlemleri gibi sondalama ve Kupası oluşumu30, sinyal ve proteinler efferosome13, kaçakçılığı işe alım dynamics belirlemek ve/veya pH-duyarlı, oksidan duyarlı veya proteaz-harekete geçirmek fluorophores31ile etiketli apoptotik hücreler kullanarak efferosomes degradative etkinliğini ölçmek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Gecede 1 µM staurosporine sonuçlarında apoptozis ile Jurkat hücre kültür > Annexin (Şekil 1) boyama V ile teyit edilmesi hücrelerin % 95'i. Staurosporine konsantrasyonu ve staurosporine tedavi süresi her hücre satırı için optimize edilmiş olması gerekir, ancak diğer hücre tipleri bu deneyler için kullanılabilir. Güvenilir algılama ve efferocytosis, miktar için > hücrelerin % 80'i-meli var olmak efferocytes için eklemeden önce apoptotik. Apoptozis (Örneğin Isı şok, etoposide ve UV ışığı) diğer indükleyicileri de kullanılabilir, ancak deneyim, bunlar daha heterojen bir indüksiyon apoptozis ve apoptotik, ikincil nekrotik içeren karma hücre popülasyonlarının sonucu üretmek ve apoptotik olmayan hedef hücreleri.

Sabit-hücre görüntüleme Inside-out boyama ile yakından apposed efferocyte-apoptotik hücre etkileşimleri açıkça belirlendi sigara-efferocytosed (boya+izleme streptavidin+/cell) ile tüm zaman noktalarda dikkat edilmelidir ve efferocytosed (streptavidin-/cell+izleme) malzemeler görülebilir (Şekil 2). Formları efferocyte ve apoptotik hücre arasında sinaps genellikle streptavidin dışlamak için sıkı olduğunu ve böylece onun çevresi üzerinde herhangi bir noktada streptavidin taşıyan nesne lekeli boya izleme herhangi bir hücreyi düşünülmelidir unutmamak gerekir bir hücre ve bir efferosome bağlı. Çoğu deneylerde efferocytosed apoptotik hücreler kısmını bir saat-bağımlı moda, hiç sigara içselleştirilmiş apoptotik hücre malzemeleri kalıncaya kadar veya en fazla efferocytic kapasitesini (Şekil Fagosit ulaşıncaya kadar artacak 3). Analizi genellikle gerçekleştirilen ve tek tek hücreler için (Şekil 3A) kaydedildi, ancak, veri içinde bireysel deneyleri ve birden çok deneysel tekrarlar ile geleneksel analiz ortalama değerleri hücreler boyunca ortalama istatistiksel yaklaşımlar (Şekil 3B). Birincil hücre tipleri, alternatif efferocytic hedefleri, kullanımı ve dahil edilecek ek boyama için izin vermek için bu standart protokol değişiklik yapılabilir. Örneğin, Şekil 4 oluşan efferocytosed apoptotik hücre taklit eder 3 µm çapı silis boncuk Fosfatidilserin bir karışımı olarak kaplı ve phosphatidylcholine28ardından, olan bir birincil M2 polarize insan makrofaj gösterir sonraki fiksasyon, permeabilization ve immunostaining geri dönüşüm endosome işaretçisi Rab17 için.

Sırasında canlı hücre efferocytic profesyonel fagositler Imaging genişletmek ve küçük bir işlem süreçlerinde geri çekmek için30 "algılama" olarak adlandırdığı gözlenir (5 rakam, t = 0); Bu işlemler bir hedef karşılaştığınızda sıkıca hedefe uygun ve hücre için çizmek. Bu yoklama etkinliği ile profesyonel olmayan fagositler epitel hücreleri gibi gözlenen değil. Efferocyte sonra sıkı bir oluşturacak "efferocytic sinaps"32 kendisi ile sık sık Zarflama apoptotik hücre büyük bir bölümünü bu synapse apoptotik hücre arasındaki (5 rakam, t = 10). Efferocyte sonra onun sitozol (Şekil 5, 10-30 dk) bu synapse apoptotik hücre parçalarını çizecektir. Yakında düzenlerini sonra yeni doğmakta olan bu efferosomes sinaps uzak ve peri-nükleer alan, aracılı Rab7/RILP/dinein-dynactin taşıma33sonucu doğru insan ticareti. Zaman içinde efferosomes küçülür ve büyük olasılıkla neredeler hücre yeniden dağıtılabilir elde edilen bozulmuş malzeme absorbe veya13,15geri dönüştürülmüş. Bu işlemler algılama yeteneğini edinme kare hızı ve deneme süresi son derece bağlıdır. Sondalama gibi hızlı işlemler değil gözlenen düşük kare-hızlarında, yavaş Olaylar (efferosome kaçakçılığı ve emme) daha uzun görüntüleme süre gerektiren süre — her iki durumda da, bu büyük görüntü alımları genellikle daha düşük yoğunluktaki görüntüleri yakalama gerektirir photobleaching ve fototoksisite (Şekil 5) sınırlamak için. Sabit-hücre tahlil ile bu tahlil canlı hücre sürümü araştırmacı gereksinimlerine uyacak şekilde değiştirilebilir. Şekil 6 hangi fluorescently plazma zarı (am-GFP) demark ve hangi seçmeli olarak sinyal lipid PI (3) P (FYVE-RFP) bağlar transgenes ifade J774.2 makrofajlar canlı hücre edinimi tek bir kare gösterir. PI (3) P nesil efferosome membran üzerinde FYVE-RFP Co yerelleştirme PM-GFP+ efferosome membran ile olarak tespit edilebilir. Efferosome FYVE-RFP yoğunluğuna miktarının tarafından PI (3) P efferosome üzerinde sinyal dynamics sayılabilir (Şekil 6).

Figure 1
Şekil 1: apoptotik Jurkat hücreleri ve apoptotik V boyama Annexin. V annexin Fosfatidilserin etiketleri "ye-bana" apoptotik hücreler tarafından maruz sinyal. (Üst) Tedavi edilmemiş (UT) Jurkat hücreleri bir sağlıklı (düz ve yuvarlak) morfoloji (DIC) görüntülemek ve (alt) Annexin V. Jurkat gecede 1 µM staurosporine (STS) ile kültürlü hücreleri bir apoptotik morfoloji (düzensiz ve blebbed) almak ve ile leke ile leke değil Annexin f. ölçek çubuğu 10 µm, = görüntü yoğunluğu renk eşleme olarak görüntülenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: apoptotik Jurkat erken ve geç Engulfment J774.2 makrofajlar tarafından hücreleri. Bir erken (60 dk) ve efferocytosis geç (120 dk) aşaması, makrofajlar, görüntülerdir. Beyaz ışık (DIC) görüntü makrofaj (mφ) ve apoptotik hücre (AC) arasında sıkı arabirim gösterilmektedir. Boya (CTD, kırmızı) izleme hücre tüm apoptotik hücre kaynaklı malzemeler konumunu ortaya koymaktadır. FITC Streptavidin (Str, yeşil) boyama henüz makrofaj tarafından yuttu değil apoptotik hücre olan kısmını tanımlar. Makrofaj hücre çekirdeği DAPI (mavi) ile önceden lekeli. Efferosomes (kırmızı) karşı apoptotik hücre (yeşil/sarı) Sigara içselleştirilmiş bölümünü kolayca Streptavidin ve boya görüntüleri izleme hücre bir bindirme tanımlanır. Streptavidin streptavidin dışlama sıkıca kurulan efferocytic sinaps (*) üzerinden yarattığı erken timepoint makrofaj-apoptotik hücre arayüzü, boyama, olmadığına dikkat edin. Makrofaj çekirdeği (mavi) boyama Höchst tarafından tanımlanır. Ölçek çubuğu 10 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: zaman-apoptotik hücre Efferocytosed J774.2 makrofajlar tarafından kısmını tabii. Efferocytosis deneyleri gerçekleştirilen için belirtilen süreleri ve boya/Streptavadin boyama izleme hücre kullanarak her zaman noktada belirlenen yutulmak apoptotik hücre malzemesi kısmını. (A)kesir efferocytosed malzeme bireysel makrofajlar içinde veri sunulan tek tek hücreler, ortalama gösteren yatay bir çubuk görünür. koşul, 1-5 bağımsız deneyler veri başına 12 – 17 hücreleri. (B) kesir efferocytosed malzemelerin ortalama 5 bağımsız deneyler arasında en az 10 hücreler/durum/tekrarlama. p < 0,05 30 dk, Kruskal-Wallis testi Dunn düzeltme ile karşılaştırıldığında. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: Rab17 işe alım için Efferosomes birincil insan makrofajlar içinde analizini. M2 polarize makrofaj apoptotik hücre taklit eder (oklar) sardı ve 60 dk engulfment takip immunostained Rab17 (yeşil) için yapıldı. Ölçek çubuğu = 5 µm. hücre çekirdeği Hoeschst ile lekeli, DIC görüntü hücre morfolojisi gösterir ve apoptotik hücre taklit eder tanımlamak için kullanılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: canlı hücre efferocytosis tahlil. Boya (AC, kırmızı) izleme farklı renk hücresiyle etiketli bir apoptotik Jurkat hücre yuttu gibi boya labeledJ774.2 makrofaj (mφ, yeşil) izleme hücre kaydedildi. Apoptotik hücre birden çok parçaya parçalı alımı ve birden çok efferosomes (oklar) oluşumu ile sonuçlanan içselleştirilmesi işlemi sırasında ayrılır. Ölçek çubuğu 10 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: floresan Transgenes Efferocytic sinyal araştırmak için kullanarak. J774.2 makrofaj GFP öğesini plazma zarı marker (PM, yeşil) ile transfected ve sinyal lipid bağlar FYVE-RFP yapı PI (3) P (kırmızı). Efferocytosis FYVE-RFP işe alım (ok) tarafından tespit gibi PI (3) P, içeren yeni doğmakta olan bir plazma zarı kaynaklı efferosome oluşturur. PI (3) P sinyal dynamics yoğunluk FYVE-RFP sinyal efferosome kapatma noktasında mevcut göreli kat olarak sayılabilir (t = 0, grafik). Bu deneme bir apoptotik hücre taklit eden boncuk (ok, DIC) apoptotik hücreler yerine kullanılan. Ölçek çubuğu 5 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokol için özetlenen yöntemleri görüntüleme ve miktar sabit-hücre ve canlı hücre yaklaşımları kullanarak dinamik efferocytic işleminin etkinleştirin. Bu yaklaşımlar yaygın istihdam akış sitometresi tabanlı yöntemleri23,24çeşitli avantajlar sunuyor. Inside-out ile sabit örnekleri boyama kullanım oranı daha sağlam ve doğru miktar ve efferocytosis kapsamı sağlar — gerçekten de, birçok akış sitometresi tabanlı yöntem sadece apoptotik hücreler ve makrofajlar ile farklı fluorophores, etiket ve Skor efferocytosis böylece birbirinden ayırmak için kapasite yoksun apoptotik hücre marker ile birlikte boyama makrofajlar kesir olarak içselleştirilmiş apoptotik hücre malzemesi karşı bağlı. Alternatif akış sitometresi yaklaşım bu apoptotik hücreler24etiketli pHrodo kullanarak içerir. pHrodo asidik ph parlaklığı artar pH duyarlı fluorophore var. Bu fluorophore arasında daha iyi çözünürlük sigara içselleştirilmiş-içselleştirilmiş malzemeleri karşı özellikle aşağıdaki apoptotik hücre içselleştirilmesi ve efferosome asitleştirme floresans arttıkça sunarken sonuçları olabilir Hangi efferosome asitleştirme34,35zarar hastalık işlemler tarafından şaşırmış ve bu yöntem-ecek vuramamak efferosomes efferocytosis36asitleştirme-yoksul bölgelerinde yer alan, erken (öncesi asitleştirme) evresinde hücre27, veya zayıf onların organellerin37acidify hücreleri. Bu protokol için açıklanan yöntemin ikinci bir avantajı canlı hücre efferocytosis, dinamiği, yoklama efferocytic sinaps oluşumu gibi işlemler olarak ölçmek için Imaging kullanılır ve hücre içi efferosomes kaçakçılığı olamaz Akış Sitometresi tabanlı yaklaşımlar kullanarak algıladı.

Bu yöntem birçok avantajları sunarken, hücreleri yüzlerce miktar gerektiren deneyler — Örneğin nadir olayları algılama veya son derece değişken işlemleri miktarının deneyler — bu büyük veri analizi ile zor olabilir gereğinden fazla zaman alıyor. Her ne kadar bizim deneyim geçerli otomatik görüntü analiz programları her zaman doğru bir şekilde segmentlere ayırma yeteneği olmayan yüksek-den geçerek akış görüntüleme gibi yaklaşımlar Imaging sitometresi38 geleneksel mikroskobu, daha yüksek üretilen iş için izin verebilir Sigara-içselleştirilmiş karşı içselleştirilmiş malzemeler. Özellikle, hangi formları apoptotik hücre ve efferocyte arasında sıkı efferocytic sinaps streptavidin boyama dışlayabilirsiniz ve bu nedenle ilişkili apoptotik hücre kez tarafından kısmen saran bir solid kitle boya kanal, izleme hücre olarak görünür streptavidin boyama (Şekil 2). Efferosomes kolayca algoritmalarla belirlenir iken, böylece, apoptotik hücre bağımlı bölümünü kez kısmi streptavidin boyama için muhasebe zorluk nedeniyle bir efferosome olarak tanımlanmış. Biz doğru tanımlamak ve ölçmek apoptotik hücreler insan yardımı olmadan parçalı alımını bir programı bulmak için henüz, biz bu öğretilebilir yarı otomatik sistemler39 analizi, büyük ölçüde hızlandırabilir kesir azaltarak bulduk efferocytosed ölçümler için 2-3 dk dan < 60 s hücre başına. Alternatif olarak, sindirilebilir apoptotik hücre taklit eder veya en az parçası apoptosis, hücre tipleri yerine kullanılabilir. Bu algılama otomatik yaklaşımlar daha müsait olabilir ve z-istifleme gereksinimini ortadan kaldırabilir tek ve büyük yapılar için kolaylaştırır. Hatta bu gelişmeler ile bu yöntem toplama ve Analizi hız sınırlayıcı kalır ve analizleri büyük hücreli sayı gerekli23gibi akış sitometresi en uygun yöntem kalır.

Her ne kadar hücre satır ve birincil insan makrofajlar hedefi olarak efferocytes ve apoptotik Jurkat hücreler (T hücre satırı) olarak kullanma bu yöntem tarif var, bu yöntem herhangi bir efferocytic hücre türü veya apoptotik hücre hedef için uygulanabilir. Gerçekten de, benzer yaklaşımlar tetkikine ve epitel hücreleri9,40,41efferocytosis ve tümör hücreleri42gibi klinik hedeflerinden efferocytosis araştırmak için kullanılmaktadır. Non-immün efferocytes kullanırken veya belirli efferocytic olaylar modelleme bu iletişim kuralını değiştirmek gerekli olabilir. Örneğin, Jurkat hücreleri yapışık olmayan ve bu nedenle tamamen mekanik Kuvvetleri özetlemek ve kayma sınırlamaları efferocytes yapisan apoptotik hücreler veya sağlam dokularda apoptotik hücreler ile iletişim halinde olduğu zaman karşılaşmak olası için değildir. Birçok hücre tipleri yapışma apoptosis sırasında korur ve bu nedenle yapisan hedef olarak kullanılabilir; bir örnek olarak, HeLa hücreleri tekrarlanarak staurosporine kaynaklı apoptosis, Fosfatidilserin çabalıyorlar ve blebbing yapışma hücre vücut43korurken 4-6 h süre geçmesi. Biz bu yaklaşımlar kullanan herhangi bir çalışmaları farkında olmasına rağmen hücreleri kollajen matris veya kök hücre kaynaklı organoids44 askıya efferocytosis sağlam dokularda çalışmak için potansiyel modelleri olabilir. Bazı modeller gibi Jurkat hücreleri bağışıklık hücreleri ve nötrofil değil kullanılmalıdır apoptotik hedef olarak bu hücreler sitokin tabanlı serbest olabilir gibi "bulmak-beni" sinyalleri modelleri karıştırıcı bir faktör enflamatuar veya göçmen nerede olabilir CX3CL1 gibi incelenen45işlemlerdir. Bu tahlil çok yönlülük için o efferocytosis hücre tipleri ve model sistemleri aralığında keşfetmek için kullanılmak üzere izin verirken, böylece, uygun efferocytes, hedef hücreleri ve kültür koşulları için en iyi modeli fizyolojik seçmeye özen göstermelidir soruşturma altında işlem.

Bu protokol için açıklanan analiz yöntemleri yalnızca bu deneyler analizleri geniş bir etkinleştirme görüntüleme tabanlı doğası ile bir başlangıç noktası olarak tasarlanmıştır. Örneğin, efferosome konumlandırma ve çapı ölçümleri kesir efferocytosed ölçümleri yapılırken toplanan veya canlı hücre içinde ölçülen, hücre içi kaçakçılığı gibi işlemler araştırmak için zaman-kursları, hücre yıkımı13,15efferosomes ve apoptotik oranı. Immunostaining (Şekil 4) morfolojik analizleri ile birlikte yaşamak-hücre görüntüleme süreçleri ölçmek için kullanılan iken böyle bağlama etkinliği ve oranları engulfment30 efferosomes, protein alımı araştırmak için kullanılabilir , 46. sık sık bu deneyleri molekül etkinleştirme veya etkinliğini hücresel olaylar efferocytosis (Şekil 6) sırasında sinyal rapor floresan transgenes ifade makrofajlar içinde gerçekleştiriyoruz. Bu gazetecilere efferocytosis sırasında süreçleri sinyal izlemeyi etkinleştir; Örneğin, efferosome işleme ve sonraki apoptotik hücre kaynaklı antijenleri13,15kaçakçılığı arabuluculuk rolü Rab5, Rab7 ve Rab17 keşfetmek için Rab GTPases fluorescently öğesini kullanmış. Benzer şekilde, gazetecilere hücre ölümü, efferosome pH, reaktif oksijen türleri üretim ve diğer hücresel süreçler canlı hücre deneyleri içine birleşme efferosomes31 bozulması arabuluculuk işlemlerini araştırmak için kullanılabilir ,47. Bu deneyler ortak mücadelesine transgenes veya gazetecilere ile uyumlu fluorophores tanımlıyor; çoğu zaman, boya ve/veya ücretsiz kanalları için diğer fluorophores düşsel streptavidin izleme hücre ortadan kaldırır. Bazı deneyler için apoptotik hücre sigara parçalanan taklit ile değiştirmek faydalıdır. Bu dinamikleri ve birden çok efferosomes bir tek apoptotik hücre elde izleme karmaşıklığı olmadan hücresel süreçler sinyal miktar sağlar. Evans ve ark. bkz: apoptotik hazırlama yönergeleri için28hücre taklit eder.

Bu deneyler tasarlarken en yaygın zorluk, photobleaching ve fototoksisite29en aza indirerek yansıması istenen işlemler için izin fluorophores bir arada bulgudur. Fluorophore seçimi büyük ölçüde lazerler/uyarma filtreleri, dichroics/küpler tarafından dikte edilir ve mikroskop emisyon filtreler ve bu nedenle fluorophores seçim için bireysel mikroskoplar belirli kez. Genel olarak, daha uzun dalga boyu fluorophores (far-red, Örneğin emisyon maxima turuncu > 580 nm) photobleaching için daha az eğilimli vardır ve bu dalga boylarında hücrelere daha az yıkıcı. Yeşil fluorophores (emisyon maxima ~ 525 nm) kullanılabilir, ancak bakım fototoksisite hücrelere sınırlamak için alınması gerekir. Dalgaboyu daha az 480 heyecanlandırmak Fluorophores nm (mor ve mavi) yüksek fototoksisite ve diğer fluorophores29çamaşır suyu bu uyarma boyları için eğilimi nedeniyle kaçınılmalıdır. Mümkün olan yerlerde, yüksek-aydınlık ve istikrarlı fluorophores seçilmesi gerekir. Benzer şekilde, görüntü edinme parametreleri photobleaching ve fototoksisite en aza indirmek için ayarlanması gereken — Örneğin uzun pozlama düşük uyarma yoğunluğu, daha yüksek uyarma yoğunluklarda48tercih edilir. Rutin gibi antioksidanların eklendiğini ve kaldırıldığını bazı medya bileşenlerinin her iki photostability geliştirir ve fototoksisite49azaltır. Hatta dikkatli seçimi ile fluorophores ve görüntüleme koşulları photobleaching kez sınırlamak gerek düşük sinyal-gürültü oranı (bkz Şekil 5 örnek için) ile görüntüleri yakalama gerektirir. Floresan yoğunluğu miktarının, büyük bir özenle görüntü işleme eserler sınırlamak için alınması gerekir; ideal olarak, pişmemiş imge işleme olmadan herhangi bir analiz edilmelidir. Miktar önce görüntüleri deconvolving, floresan yoğunluklarda korur bir deconvolution algoritması kullanılan50,51olması gerekir.

Canlı hücre satın almalar özellikle, başarılı deneyler uyarma yoğunluğu, çekim hızı, kare hızı ve deneme süresi arasında dikkatli bir denge gerektiren zorlu bir iş olabilir. Uyarma yoğunluğu ve pozlama zaman fototoksisite uzun pozlama süreleri hareket eserler hücre hareketi nedeniyle neden veya satın kare hızı sınırı ihtar ile yukarıda açıklandığı gibi en aza indirmek için ayarlanmalıdır. Kare hızı deneysel gereksinimlerine bağlı olarak değişebilir. Daha düşük kare hızları (5-30 dk çerçeveler arasında) uzun süreler (12 saat veya daha fazla) üzerinde görüntüleme için izin ancak zar dinamiği ve post-efferocytosis efferosomes kaçakçılığı gibi olayları en düşük düzeyde veri sağlamak. Yüksek kare hızları (hızlı saniyede 1 kare olarak) efferocytic olaylar ve efferosome kaçakçılığı mükemmel zamansal çözünürlük sağlar — ama bile fluorophores, uyarma yoğunluğu ve pozlama süreleri dikkatli seçimi ile — photobleaching veya fototoksisite genellikle bu deneyler için bir saatten az süre sınırı olacaktır. Deneyim, her 1-2 dk görüntüleri elde üzerinde deneysel süreleri 2-6 h efferocytic olaylar, yeterli sayıda ölçülebilir görüntüleri ile makul zamansal çözünürlük sağlar kabul edilebilir bir uzlaşma vardır.

Değişmiş ve başarısız olan efferocytosis kanser, ateroskleroz ve birden çok otoimmün hastalıklar patoloji dahil olmak için bilinen, efferocytosis hedefleme terapileri ile gösteren büyük klinik7,52, söz 53,54,55. Bu alanlarda daha da geliştirilmesi kimlik ve hücresel süreçler, reseptörleri ve efferocytosis düzenleyen sinyal yollar karakterizasyonu gerektirir. Bu protokol için sunulan tahlil bu çalışmalar için güçlü bir araç temsil eder ve birçok efferocytosis düzenleyen hücresel ve sinyal gönderme işlemleri ölçmek için değiştirilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan ederim.

Acknowledgments

Bu çalışmada sağlık araştırma (CIHR) işletim Grant paspas-123419, Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi, Kanada keşif Grant 418194 ve bir Ontario Bakanlığı araştırma ve yenilik erken Araştırma Ödülü BH için Kanada Enstitüleri tarafından finanse edildi. DGW bazı resimler, iletişim kuralları'nın bir optimizasyon ve el yazması yazma sunulan katkıda bulunmuştur; Liverpool Üniversitesi bir pompa astar hibe tarafından finanse edildi. CY Vanier Yüksek Lisans Burs ve CIHR MD/doktora öğrencilik tarafından finanse edilmektedir. Finansmanı kuruluşları çalışma tasarım, veri toplama ve analizi, yayımlamaya karar veya el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Media Wisent 3500-000-EL
DMEM Media Wisent 319-005-CL
Fetal Bovine Serum (FBS) Wisent 080-150
PBS Wisent 311-010-CL
18 mm circular glass coverslips #1.5 thickness Electron Microscopy Sciences 72290-08 Size and shape of coverslip is not critical, but 18 mm fit into the wells of a standard 12-well plate which simplifies cell culture
Staurosporine Cayman Chemical 81590 Dissolve in DMSO at 1 mM (1,000x stock solution)
Annexin V-Alexa 488 ThermoFisher R37174
EZ-Link NHS-Biotin ThermoFisher 20217 Store in a dessicator. Do not prepare a stock solution.
DMSO Sigma-Aldrich D2650
CellTrace FarRed ThermoFisher C34572
CellTrace Orange ThermoFisher C34851
Hoescht 33342 ThermoFisher 62249
FITC-Streptavadin ThermoFisher SA1001
Lympholyte-poly cell sepration medium Cedarlane Labs CL5071
Recombinant Human M-CSF Peprotech 200-04
Recombinant Human IL-4 Peprotech 300-25
J774.2 Macrophage Cell Line Sigma-Aldrich 85011428-1VL
THP-1 Human Monocyte Cell Line ATCC TIB-202
Jurkat T Cell Line ATCC TIB-152

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elmore, S. Apoptosis: A review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
  2. Toda, S., Hanayama, R., Nagata, S. Two-step engulfment of apoptotic cells. Molecular and Cellular Biology. 32 (1), 118-125 (2012).
  3. Ravichandran, K. S. Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: Progress and conundrums. The Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).
  4. Fadok, V. A., Voelker, D. R., Campbell, P. A., Cohen, J. J., Bratton, D. L., Henson, P. M. Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages. Journal of Immunology. 148 (7), 2207-2216 (1992).
  5. Bevers, E. M., Comfurius, P., van Rijn, J. L., Hemker, H. C., Zwaal, R. F. Generation of prothrombin-converting activity and the exposure of phosphatidylserine at the outer surface of platelets. European Journal of Biochemistry. 122 (2), 429-436 (1982).
  6. Callahan, M. K., Williamson, P., Schlegel, R. A. Surface expression of phosphatidylserine on macrophages is required for phagocytosis of apoptotic thymocytes. Cell Death and Differentiation. 7 (7), 645-653 (2000).
  7. Kojima, Y., et al. CD47-blocking antibodies restore phagocytosis and prevent atherosclerosis. Nature. 536, 86-90 (2016).
  8. Seitz, H. M., Camenisch, T. D., Lemke, G., Earp, H. S., Matsushima, G. K. Macrophages and dendritic cells use different Axl/Mertk/Tyro3 receptors in clearance of apoptotic cells. Journal of Immunology. 178, 5635-5642 (2007).
  9. Ichimura, T., Asseldonk, E. J. P. V., Humphreys, B. D., Gunaratnam, L., Duffield, J. S., Bonventre, J. V. Kidney injury molecule-1 is a phosphatidylserine receptor that confers a phagocytic phenotype on epithelial cells. The Journal of Clinical Investigation. 118 (5), 1657-1668 (2008).
  10. Flannagan, R. S., Canton, J., Furuya, W., Glogauer, M., Grinstein, S. The phosphatidylserine receptor TIM4 utilizes integrins as coreceptors to effect phagocytosis. Molecular Biology of the Cell. 25 (9), 1511-1522 (2014).
  11. Park, D., et al. BAI1 is an engulfment receptor for apoptotic cells upstream of the ELMO/Dock180/Rac module. Nature. 450 (7168), 430-434 (2007).
  12. Elliott, M. R., Koster, K. M., Murphy, P. S. Efferocytosis Signaling in the Regulation of Macrophage Inflammatory Responses. Journal of Immunology. 198 (4), 1387-1394 (2017).
  13. Yin, C., Kim, Y., Argintaru, D., Heit, B. Rab17 mediates differential antigen sorting following efferocytosis and phagocytosis. Cell Death & Disease. 7 (12), e2529 (2016).
  14. Kinchen, J. M., et al. A pathway for phagosome maturation during engulfment of apoptotic cells. Nature Cell Biology. 10 (5), 556-566 (2008).
  15. Yin, C., Argintaru, D., Heit, B. Rab17 mediates intermixing of phagocytosed apoptotic cells with recycling endosomes. Small GTPases. 0 (0), 1-9 (2017).
  16. Silva, M. T. Secondary necrosis: The natural outcome of the complete apoptotic program. FEBS letters. 584 (22), 4491-4499 (2010).
  17. Thorp, E. B. Mechanisms of failed apoptotic cell clearance by phagocyte subsets in cardiovascular disease. Apoptosis. 15 (9), 1124-1136 (2010).
  18. Sarantis, H., Grinstein, S. Monitoring phospholipid dynamics during phagocytosis: application of genetically-encoded fluorescent probes. Methods in Cell Biology. 108, 429-444 (2012).
  19. Steinberg, B. E., Grinstein, S. Analysis of macrophage phagocytosis: Quantitative assays of phagosome formation and maturation using high-throughput fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 531, 45-56 (2009).
  20. Wang, J., Hossain, M., Thanabalasuriar, A., Gunzer, M., Meininger, C., Kubes, P. Visualizing the function and fate of neutrophils in sterile injury and repair. Science. 358 (6359), 111-116 (2017).
  21. Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. The Journal of Cell Biology. 169 (1), 139-149 (2005).
  22. Greenlee-Wacker, M. C., Rigby, K. M., Kobayashi, S. D., Porter, A. R., DeLeo, F. R., Nauseef, W. M. Phagocytosis of Staphylococcus aureus by human neutrophils prevents macrophage efferocytosis and induces programmed necrosis. Journal of Immunology. 192 (10), 4709-4717 (2014).
  23. Wootton, D. G., et al. Recovery from pneumonia requires efferocytosis which is impaired in smokers and those with low body mass index and enhanced by statins. Thorax. 71 (11), 1052-1054 (2016).
  24. Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
  25. Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator. Biophysical Journal. 74 (3), 1591-1599 (1998).
  26. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  27. Johnson, D. E., Ostrowski, P., Jaumouillé, V., Grinstein, S. The position of lysosomes within the cell determines their luminal pH. The Journal of Cell Biology. 212 (6), 677-692 (2016).
  28. Evans, A. L., Blackburn, J. W. D., Yin, C., Heit, B. Quantitative efferocytosis assays. Methods in Molecular Biology. 1519, 25-41 (2017).
  29. Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), (2017).
  30. Flannagan, R. S., Harrison, R. E., Yip, C. M., Jaqaman, K., Grinstein, S. Dynamic macrophage "probing" is required for the efficient capture of phagocytic targets. The Journal of Cell Biology. 191 (6), 1205-1218 (2010).
  31. Joshi, G. N., Gilberti, R. M., Knecht, D. A. Single cell analysis of phagocytosis, phagosome maturation, phagolysosomal leakage, and cell death following exposure of macrophages to silica particles. Methods in Molecular Biology. 1519, 55-77 (2017).
  32. Karaji, N., Sattentau, Q. J. Efferocytosis of Pathogen-Infected Cells. Frontiers in Immunology. 8 (DEC), 1863 (1863).
  33. Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. Phagosomes fuse with late endosomes and/or lysosomes by extension of membrane protrusions along microtubules: role of Rab7 and RILP. Molecular and Cellular Biology. 23 (18), 6494-6506 (2003).
  34. Reiners, J. J., Kleinman, M., Kessel, D., Mathieu, P. A., Caruso, J. A. Nonesterified cholesterol content of lysosomes modulates susceptibility to oxidant-induced permeabilization. Free Radical Biology & Medicine. 50 (2), 281-294 (2011).
  35. Boya, P., et al. Lysosomal membrane permeabilization induces cell death in a mitochondrion-dependent fashion. The Journal of Experimental Medicine. 197 (10), 1323-1334 (2003).
  36. Fairn, G. D., Grinstein, S. How nascent phagosomes mature to become phagolysosomes. Trends in Immunology. , 1-9 (2012).
  37. Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages. Molecular Biology of the Cell. 25 (21), 3330-3341 (2014).
  38. Phanse, Y., et al. Analyzing cellular internalization of nanoparticles and bacteria by multi-spectral imaging flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (64), e3884 (2012).
  39. Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 230-233 (2011).
  40. Davies, S. P., Reynolds, G. M., Stamataki, Z. Clearance of apoptotic cells by tissue epithelia: A putative role for hepatocytes in liver efferocytosis. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
  41. Ismail, O. Z., Zhang, X., Bonventre, J. V., Gunaratnam, L. G protein α12(Gα12) is a negative regulator of kidney injury molecule-1-mediated efferocytosis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 310 (7), F607-F620 (2016).
  42. Vaught, D. B., Stanford, J. C., Cook, R. S. Efferocytosis creates a tumor microenvironment supportive of tumor survival and metastasis. Cancer Cell & Microenvironment. 2 (1), (2015).
  43. Heit, B., Yeung, T., Grinstein, S. Changes in mitochondrial surface charge mediate recruitment of signaling molecules during apoptosis. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 300 (1), C33-C41 (2011).
  44. Múnera, J. O., Wells, J. M. Generation of Gastrointestinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1597, 167-177 (2017).
  45. Truman, L. A., et al. CX3CL1/fractalkine is released from apoptotic lymphocytes to stimulate macrophage chemotaxis. Blood. 112 (13), 5026-5036 (2008).
  46. Evans, A. L., et al. Antagonistic Coevolution of MER Tyrosine Kinase Expression and Function. Molecular Biology and Evolution. , (2017).
  47. Flannagan, R. S., Heit, B., Heinrichs, D. E. Intracellular replication of Staphylococcus aureus in mature phagolysosomes in macrophages precedes host cell death, and bacterial escape and dissemination. Cellular Microbiology. , (2015).
  48. Mubaid, F., Brown, C. M. Less is More: Longer Exposure Times with Low Light Intensity is Less Photo-Toxic. Microscopy Today. 25 (06), 26-35 (2017).
  49. Bogdanov, A. M., Kudryavtseva, E. I., Lukyanov, K. A. Anti-fading media for live cell GFP imaging. PloS One. 7 (12), e53004 (2012).
  50. Rossner, M., Yamada, K. M. What's in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166 (1), 11-15 (2004).
  51. Sage, D., et al. DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy. Methods. 115, 28-41 (2017).
  52. Ma, G. Z. M., Stankovich, J., Kilpatrick, T. J., Binder, M. D., Field, J. Polymorphisms in the receptor tyrosine kinase MERTK gene are associated with multiple sclerosis susceptibility. PloS One. 6 (2), e16964 (2011).
  53. Thorp, E., Cui, D., Schrijvers, D. M., Kuriakose, G., Tabas, I. Mertk receptor mutation reduces efferocytosis efficiency and promotes apoptotic cell accumulation and plaque necrosis in atherosclerotic lesions of apoe-/- mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (8), 1421-1428 (2008).
  54. Nguyen, K. -Q. N., et al. Overexpression of MERTK Receptor Tyrosine Kinase in Epithelial Cancer Cells Drives Efferocytosis in a Gain-of-Function Capacity. The Journal of Biological Chemistry. 289 (37), 25737-25749 (2014).
  55. Morimoto, K., et al. Lovastatin enhances clearance of apoptotic cells (efferocytosis) with implications for chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Immunology. 176 (12), 7657-7665 (2006).

Tags

İmmünoloji ve enfeksiyon sayı 138 Efferocytosis fagositoz apoptozis mikroskopi hücre makrofaj
Efferocytosis tek hücreli floresans mikroskobu tarafından miktar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Taruc, K., Yin, C., Wootton, D. G.,… More

Taruc, K., Yin, C., Wootton, D. G., Heit, B. Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (138), e58149, doi:10.3791/58149 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter