Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Kvantificering af Efferocytosis af encellede Fluorescens mikroskopi

Published: August 18, 2018 doi: 10.3791/58149
Automatic Translation
1, 1, 2,3, 1
1Department of Microbiology and Immunology and the Center for Human Immunology, University of Western Ontario, 2Institute of Infection and Global Health, University of Liverpool, 3Department of Respiratory Research, Aintree University Hospital NHS Foundation Trust

Summary

Efferocytosis, fagocyterende fjernelse af apoptotiske celler, er forpligtet til at opretholde homøostase og lettes ved receptorer og signalering veje, der giver mulighed for anerkendelse, engulfment og internalisering af apoptotiske celler. Heri, præsenterer vi en Fluorescens mikroskopi protokol til kvantificering af efferocytosis og aktivitet af efferocytic signaling veje.

Abstract

At studere regulering af efferocytosis kræver metoder, der kunne nøjagtigt kvantificere optagelsen af apoptotiske celler og sonde til signalering og cellulære processer, der styrer efferocytosis. Denne kvantificering kan være vanskelige at udføre som apoptotiske celler er ofte efferocytosed stykkevis, således nødvendiggør metoder, der kan præcist afgrænse mellem efferocytosed del af et apoptotiske mål versus resterende unengulfed cellular fragmenter. Den metode beskrevet heri udnytter dual-mærkning tilgange for at nøjagtigt kvantificere dynamikken i efferocytosis og efferocytic kapacitet af efferocytes såsom makrofager. Cytosol af cellen apoptotiske er mærket med en celle-tracking farvestof til at aktivere overvågning af alle apoptotiske celle-afledte materialer, mens overflade biotinylation af cellen apoptotiske giver mulighed for differentiering mellem internaliseret og ikke internaliseret apoptotiske celle fraktioner. Efferocytic kapaciteten af efferocytes bestemmes ved at tage fluorescerende billeder af levende eller faste celler og kvantificere mængden af bundne versus internaliseret mål, differentieret ved streptavidin farvning. Denne tilgang giver flere fordele over metoder såsom flowcytometri, nemlig den nøjagtige afgrænsning af efferocytosed versus efferocytosed apoptotiske celle fraktioner, evnen til at måle efferocytic dynamics af live-celle mikroskopi, og den kapacitet til at udføre undersøgelser af cellulær signalering i celler, der udtrykker fluorescently mærket transgener. Kombineret, tjene de metoder, der er skitseret i denne protokol som grundlag for en fleksibel eksperimenterende tilgang, der kan bruges til at nøjagtigt kvantificere efferocytic aktivitet og afhøre cellulær signalering veje aktive under efferocytosis.

Introduction

Apoptose, eller programmeret celledød er en stærkt reguleret fysiologisk proces, der forekommer i de fleste flercellede organismer og er afgørende for deres udvikling og homøostase1. Ud over at være involveret i normal cellefornyelsen og fosterudviklingen, apoptose giver mulighed for fjernelse af inficerede eller beskadiget celler fra væv og kan udløses i reaktion på infektion, inflammation, kræft, og også af lægelige indgreb såsom strålebehandling eller steroider1. Apoptotiske celler udsætte "spise-mig" signaler på deres celleoverfladen, som er anerkendt af receptorer på en vifte af professionelle og ikke-professionelle fagocytter, kollektivt benævnt "efferocytes". Engagement i disse receptorer inducerer optagelse og nedbrydning af cellen apoptotiske af efferocyte gennem en proces kendt som efferocytosis2,3. Fosfatidylserin er bedst karakteriseret spise-mig signal drivende efferocytosis. Det er normalt begrænset til den indre folder af plasma membran, med apoptose aktivering en lipid-scramblase, som forstyrrer denne membran asymmetri, dermed udsætte phosphatidylserin på celle overflade4. Fosfatidylserin er fundet på den ekstracellulære overfladen af nogle ikke-apoptotiske celler, såsom modne makrofager og aktiveret blodplader. Disse celler er imidlertid ikke efferocytosed på grund af tilstedeværelsen af "ikke spise mig" signaler, såsom CD47, på deres celle overfladen5,6,7. Udsatte phosphatidylserin genkendes af en bred vifte af efferocytic receptorer udtrykt ved efferocytes. Binding af disse receptorer til phosphatidylserin, aktiveres enten direkte eller gennem støtte af opsonins, signaling veje, der fremmer engulfment af cellen apoptotiske i en membran-bundet vacuole betegnes efferosome8, 9 , 10 , 11 , 12. efferosome sikringer sekventielt med endosomes og lysosomer, som leverer de molekylære maskineri for at forsure efferosome og forringe apoptotiske celle cargo13,14. Når nedbrudt, apoptotiske celle-afledte materialer der handles til genanvendelse endosome — en proces, der begrænser immunrespons mod apoptotiske celle-afledte antigener, og som kan give mulighed for genvinding af næringsstoffer fra apoptotiske celle13, 15. En fejl i efferocytosis medfører nedsat clearance af apoptotiske celler; disse uncleared celler underkastes i sidste ende sekundær nekrose. Nekrotiske celler frigive pro-inflammatoriske cytosole indholdet, patogener og autoantigens i det ekstracellulære miljø, således køre en række infektiøse, inflammatoriske og autoimmune sygdomme16,17. Sammen, apoptose og efferocytosis lette fjernelsen af døende og døde celler og giver mulighed for vedligeholdelsen af væv homøostase.

Undersøger de underliggende efferocytosis molekylære mekanismer kræver metoder, der giver en klar kvantificering af apoptotiske celle optagelse. Denne kvantificering kompliceres af det faktum, at i modsætning til andre optagelse mekanismer såsom endocytose og fagocytose18,19, efferocytosis ikke kan resultere i engulfment af intakt målcellen, resulterer i den stykkevise optagelse af cellen apoptotiske efferocyte20. Protokollen beskrevet heri beskriver en i vitro efferocytosis analyse der giver præcise afgrænsning af den internaliseret versus ikke-internaliseret dele af individuelle apoptotiske celler og kan være kombineret med en række faste celle og Live-celle mikroskopi metoder. Traditionelle fagocytose assays tilføje antistoffer specifikke for fagocyterende målet i slutningen af forsøget for at mærke ikke internaliseret mål, hvor det som vores metode adskiller sig ved mærkning apoptotiske målet med kovalent knyttet biotin21 , 22. mens apoptotiske celle specifikke antistoffer kan bruges i denne analyse, biotinylation tilgangen giver mulighed for enhver protein-bærende mål skal være mærket og undgår potentielle problemer med sekundær antistof krydsreaktivitet hvis immunfarvning udføres . Specifikt, skitsere vi forberedelse af apoptotiske Jurkat celler, der har været dual-farves med både en celle tracking farvestof og biotin. Cellen tracking farvestof giver mulighed for apoptotiske celle-afledte materialer skal være spores under efferocytosis, paa overfladen biotinylation giver mulighed for forskelsbehandling af internaliseret fra ikke-internaliseret dele af efferocytosed apoptotiske celler. Vi beskriver også kultur og forberedelse af J774.2 og THP-1 cellelinjer til brug som murine og menneskelige efferocytes, monocyt-afledte M2 makrofager som et eksempel på primær celle efferocytosis og Jurkat celler til brug som efferocytic mål. Disse metoder kan let anvendes på andre cellelinjer eller primærelementer, målceller under enhver form for celledød (fx apoptose, nekrose og necroptosis) og micron mellemstore efterligner, som simulere apoptotiske celler gennem lipid belægninger eller belægning med ligander specifikke for en efferocytic receptor af interesse.

Den metode, der er skitseret i denne protokol har flere fordele i forhold til flow flowcytometri baseret metoder almindeligvis anvendes i feltet23,24. Ved direkte imaging phagocyt-apoptotiske celle interaktion, kombineret med tydelig mærkning af både samlede og ikke internaliseret apoptotiske cellestof, kan kvantitative foranstaltninger af efferocytosis gøres. Desuden begrænser brugen af pH-ufølsom fluorophores konfunderende faktorer såsom undertrykkelsen af FITC og normal god landbrugspraksis fluorescens på lysosomale pH, der tilintetgør nogle alternative metoder25. Endelig, mens ikke beskrevet i detaljer, disse metoder kan være ansat ved hjælp af efferocytes at udtrykke fluorescently mærket transgener, eller med efter fiksering immunfarvning, at give mulighed for kvantificering af signalering molekyle aktivitet og overvågning af de cellulære processer under efferocytosis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Samling af blod fra raske frivillige forsøgspersoner blev godkendt af Health Science forskning etik Board af University of Western Ontario. Venepunktur blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne i Tri-Rådets politik redegørelse om menneskelige forskning.

1. kultur og forberedelse af THP-1 monocyt cellelinie

  1. Kultur THP-1 monocytter som en suspension kultur i T25 kolber på 37 ° C + 5% CO2. Celler skal være dyrket i 5 mL af Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) + 10% føtal bovint Serum (FBS).
  2. Hver dag suspendere celler jævnt i hele vækst medier ved forsigtigt at ryste kolben, derefter tælle straks celler med en hemocytometer. Celler skal være passaged, når celle tæthed når 1 x 106 celler/mL:
    1. Pre varm RPMI 1640 + 10% FBS i et 37 ° C vandbad.
    2. Overføre 2 x 105 celler ind i en 1,5 mL microcentrifuge rør eller en 15 mL konisk slange, og pellet celler ved centrifugering ved 500 x g ved stuetemperatur i 5 min.
    3. Fjern supernatanten uden at forstyrre den celle pellet og resuspenderes i 1 mL (1,5 mL microcentrifuge tube) eller 5 mL (15 mL konisk slange) i fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
    4. Centrifuge tube på 500 x g ved stuetemperatur i 5 min. Fjern PBS uden at forstyrre den celle pellet.
    5. Resuspend pellet i 1 mL frisk RPMI 1640 + 10% FBS.
    6. Ind i en ny T25 kolbe sted 4 mL varmede medier, og til dette skal du tilføje de resuspenderede celler fra 1.2.5. Kultur i et 37 ° C + 5% CO2 inkubator indtil cellerne kræver passaging (typisk 3 dage), eller celler er nødvendige for et eksperiment.
  3. For et eksperiment med THP-1-afledt makrofager, skal du fjerne det krævede antal celler fra kolben og plade forud for passaging:
    1. Placere det krævede antal 18 mm cirkulære glas coverslips (#1.5 tykkelse) i wells af en 12-godt plade – typisk 1 coverslip pr. tilstand og/eller tidspunkt. Godt alikvot 5 x 104 THP-1 monocytter i hver. Antallet af celler føjes til hver brønd kan ændres, hvis det kræves.
    2. Opdrage det samlede volumen af hver celle-holdige godt til 1 mL ved hjælp af RPMI + 10% FBS varmet til 37 ° C.
    3. Tilsæt 100 nM phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA) til hver brønd og kultur i 3 dage for at inducere differentiering af THP-1 monocytter makrofag-lignende celler.

2. kultur og forberedelse af J774.2 makrofag cellelinje

  1. Kultur J774.2 celler i T25 kolber på 37 ° C + 5% CO2. Celler skal være dyrket i 5 mL af Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) + 10% FBS og passaged når kulturen når 80-90% confluency. Til passage celler:
    1. Fjern alle medier fra kolben og anledning en gang med 5 mL PBS.
    2. Fjern PBS fra kolben og erstatte med 5 mL frisk DMEM + 10% FBS.
    3. Bruger en celle skraber, skrabe bunden af kolben til at suspendere cellerne i medierne. Energisk afpipetteres cellerne flere gange til at bryde op enhver celle aggregater.
    4. Fortyndes 1:5 og celler ved at fjerne 4 mL af cellesuspension fra kolben og erstatte det med 4 mL frisk medier. De resterende cellesuspension kan kasseres, bruges til at starte en ny cellekultur i en frisk T25 kolbe eller anvendes til et eksperiment.
  2. Sådan konfigureres for en efferocytosis analyse ved hjælp af J774.2 celler:
    1. En dag i begyndelsen af eksperimentet, suspendere J774.2 celler i 5 mL frisk medier, som pr skridt 2.1.1–2.1.3. Tælle celler ved hjælp af en hemocytometer og forberede den nødvendige mængde af celler i en koncentration på 5 x 104 celler/mL.
    2. Placere det nødvendige antal 18 mm cirkulære glas coverslips (#1.5 tykkelse) i wells af en 12-godt plade. Godt alikvot 1 mL af 5 x 104 celler/mL cellesuspension til hver.
    3. Kultur natten for at tillade cellerne til at overholde coverslip og inddrive fra passaging.

3. kultur af primære menneskelige M2 makrofager

  1. Indsamle 10 mL af heparinized humant blod for hver 12-godt plade af M2 makrofager kræves.
  2. I en 15 mL centrifugeglas, layer 5 mL af humant blod på toppen af 5 mL af pre varmede Lympholyte-poly celle adskillelse medium. Forbered flere rør, hvis forarbejdning > 5 mL blod i stedet for at bruge større volumen rør.
  3. Der centrifugeres ved 300 x g i 35 min, ved hjælp af medium acceleration og ingen pause.
  4. Fjern forsigtigt den øverste mononukleære celler rige band ved hjælp af en plastik pipette og overførsel til en 50 mL-centrifugerør. Hvis flere rør blev udarbejdet i trin 3.2, kan bands samles i en enkelt 50 mL tube. Bringe mængden af rør op til 50 mL med PBS.
  5. Der centrifugeres ved 300 x g for 8 min og Fjern supernatanten. Under dette trin skal du placere autoklaveres 18 mm diameter cirkulære coverslips (#1.5 tykkelse) i hver brønd med en 12-godt plade.
  6. Resuspenderes celle i 300 µL serum-fri RPMI 1640 pr. ønskede antal brønde; fx, hvis 10 mL blod blev behandlet for at forberede en fuld 12 godt plade, suspendere celle pellet i 3,6 mL af medier.
  7. Tilføje 300 µL af cellesuspension til hver coverslip-holdige godt i den 12-godt plade. Inkuber i 1 timer ved 37 ° C + 5% CO2.
  8. Forsigtigt vaske coverslip 3 x med 1 mL varmede PBS til at fjerne enhver ikke-tilhænger celler.
  9. Der tilsættes 1 mL RPMI 1640 + 10% FBS + 10 ng/mL rekombinant humant M-CSF + celle kultur antibiotikum/antimykotikum. Der inkuberes ved 37 ° C + 5% CO2 i 5 dage.
  10. Erstatte media med RPMI 1640 + 10% FBS + 10 ng/mL rekombinant humant M-CSF + 10 ng/mL rekombinant humant IL-4 + celle kultur antibiotikum/antimykotikum. Der inkuberes ved 37 ° C + 5% CO2 i 2 dage til at fuldføre M2 polarisering.
  11. Polariseret makrofager bør anvendes inden for de næste 3 dage.

4. forberedelse af apoptotiske Jurkat celler

  1. Kultur Jurkat celler i 5 mL af RPMI 1640 + 10% FBS ved 37 ° C + 5% CO2. Jurkats er en suspension cellelinie og kan vedligeholdes af passaging 1:5 til frisk, pre varmede medier hver 3-5 dage.
  2. For at forberede apoptotiske celler, tillade Jurkat kulturen at vokse til høj densitet (4-5 dage efter passaging). Alikvot 1,5 mL til en 1,5 mL microcentrifuge tube og pellet celler ved centrifugering ved 500 x g i 5 min.
  3. Kassér supernatanten og genopslæmmes celle pellet i 1 mL serum-fri RPMI 1640 medium indeholdende 1 µM staurosporine.
  4. Inkuber 16 timer ved 37 ° C + 5% CO2 til at gengive celler apoptotiske.
  5. Hvis det ønskes, bekræfte induktion af apoptose ved farvning med Annexin V:
    1. Alikvot 100 µL af staurosporine-behandlede Jurkat cellekultur ind i en 1,5 mL microcentrifuge rør. Pellet celler ved centrifugering ved 500 x g i 5 min og kassér supernatanten genopslæmmes celle pellet i 100 µL af serumfrit RPMI 1640 medium.
    2. Tilføj 1 µL af fluorescein isothiocyanat (FITC)-konjugeret Annexin V og inkuberes i 10 min. ved stuetemperatur i mørke.
    3. Tilføje 900 µL af PBS og overføre hele diskenheden til en enkelt brønd af et 12-godt plade der indeholder en 18 mm cirkulære glas coverslip (#1.5 tykkelse). Spin ned i en centrifuge, udstyret med en plade adapter på 200 x g i 1 min. at tvinge celler til at overholde coverslip. Celler kan alternativt placeres i en chambered dias til billedbehandling.
    4. Billedet ved hjælp af et fluorescens mikroskop.

5. kvantificering af Efferocytic udbredelse og Dynamics ved hjælp af en fast celle Efferocytosis Assay og Inside-out farvning

  1. Forberede THP-1, J774.2 eller M2 menneskelige makrofager, som beskrevet i afsnit 1-3, hhv.
  2. Om aftenen før begyndelsen af eksperimentet forberede apoptotiske Jurkat celler som beskrevet i afsnit 4.
  3. Umiddelbart før forsøget, tælle apoptotiske celler ved hjælp af en hemocytometer. Overføre tilstrækkelig antal apoptotiske celler til en 1,5 mL microcentrifuge tube – vi tilføje normalt 5 x 105 celler/brønd, yder mål: efferocyte forholdet 10:1.
  4. Pellet Jurkat celler ved centrifugering ved 500 x g i 5 min og resuspend i 500 μL af PBS.
  5. Under centrifugering, alikvot 10 µL af DMSO ind i en ny 1,5 mL microcentrifuge rør. Opløses i DMSO en minimal mængde af N-hydroxysuccinimidobiotin (NHS-Biotin). 5-10 krystaller (~0.005 mg) er tilstrækkelig.
  6. Overføre 500 μL apoptotiske celle/PBS suspension til DMSO/NHS-biotin indeholder rør. Derefter fortyndes en celle tracking farvestof til den af fabrikanten anbefalede koncentration i apoptotiske cellesuspension. Skabe bestemt at markere en celle, tracking farvestof, der ikke overlapper spektralt med FITC-Streptavidin (f.eks. rød eller far-red celle tracking farvestof).
  7. Inkuber suspension i 20 min. ved stuetemperatur i mørke. Tilføje et lige saa stort volumen af RPMI 1640 + 10% FBS og Inkuber i 5 min. ved stuetemperatur i mørke til at slukke enhver ureageret farvestof.
  8. Pellet celler ved centrifugering ved 500 x g i 5 min, kassere supernatanten og farves apoptotiske cellerne i 100 µL af RPMI 1640 + 10% genopslæmmes FBS pr. brønd af makrofager.
  9. Tilsæt 100 µL af bejdset apoptotiske cellesuspension dråbevis til hver brønd af makrofager. Der centrifugeres 200 x g i 1 min i en centrifuge, udstyret med en plade adapter at tvinge kontakt mellem makrofager og apoptotiske celler.
  10. Inkuber plade i den ønskede periode på 37 ° C + 5% CO2 i en vævskultur inkubator. Til makrofager, efferocytosed materiale er normalt først kan påvises efter 20-30 min, og er afsluttet efter 120-180 min.
  11. På det ønskede tidspunkt fjerner point (s) celler fra rugemaskinen. Vaske cellerne to gange med 1 mL af stuetemperatur PBS til at stoppe efferocytosis og fjerne ikke-efferocytosed apoptotiske celler.
  12. Tilføje FITC-konjugeret streptavidin ved 1:1,000 til hver brønd og Inkuber i 20 min. i mørke. Dette vil mærke den udsatte biotin på ikke-efferocytosed apoptotiske celle materiale.
    Bemærk: Hvis det ønskes, cellekerner kan farves under dette trin ved tilsætning af 1:20,000 fortynding af Hoechst 33342 eller 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, dihydrochlorid (DAPI).
  13. Vaske cellerne 3 gange med 1 mL PBS, forsigtigt ryste eller vuggende prøver for 5 min pr. Skyl. Fix celler med 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS i 20 min. ved stuetemperatur. Skyl celler med PBS til at fjerne overskydende PFA.
  14. Montere coverslips på et dias til billedbehandling og overførsel til et fluorescens mikroskop. Fange z-stakke af et tilstrækkeligt antal celler for nøjagtig kvantificering — typisk 10-30 celler pr. betingelse. Non-internaliseret apoptotiske cellestof vil fremgå i det resulterende billede som celle tracking farvestof mærket materiale omsluttet af FITC-streptavidin farvning, mens efferocytosed materiale danner diskrete celle tracking farvestof puncta fri for enhver streptavidin farvning.
  15. Kvantificere efferocytosis i de fremkomne billeder via en række forskellige foranstaltninger:
    1. Beregne efferocytic index ved at bestemme det gennemsnitlige antal diskrete efferosomes (celle tracking farvestoffet+/streptavidin- puncta) pr. makrofag. Kvantificere kun makrofager bundet til en apoptotiske celle eller indeholdende ≥ 1 synlig efferosomes. Optag makrofager bundet til en apoptotiske celle, men mangler diskrete efferosomes, som har et efferocytic indeks 0.
    2. Beregn efferocytic effektivitet ved at måle brøkdel af makrofager, der indeholder ≥ 1 efferosome.
    3. Beregne antallet af efferocytosis af imaging celler fast og farves på flere tidspunkter. Eneste billede makrofager bundet til apoptotiske celler, eller som indeholder synlige efferosomes, med z-stakke fanget af hver celle. Når afbildet, bestemme hastigheden af efferocytosis:
      1. Ved hjælp af streptavidin farvning som en guide, og freehand eller polygon markeringsværktøjet i FIJI/ImageJ26 (eller andre billede analyse softwarepakke), cirkel alle cellens tracking farvestoffet+/streptavidin- (f.eks. internaliseret) materiale i en enkelt plan af z-stakken. Måle integrerede intensiteten af cellen tracking farvestof denne region. Individuelle foranstaltninger for hver efferosome (f.eks. diameter, positionering i forhold til cellekant eller kerne, osv.)15,27 kan nemt erhverves samtidig med disse målinger, stærkt øge data indsamlet under analysen.
      2. På den samme z-afsnit, ved hjælp af streptavidin farvning som en guide og værktøjet frihånd eller polygon markering cirkel alle cellens tracking farvestoffet+/streptavidin+ (f.eks. ikke-internaliseret) materiale i en enkelt plan af z-stak . Medtag kun farvning fra apoptotiske celler i kontakt med phagocyt. Måle integrerede intensiteten af denne region.
      3. Gentag trin 4.2.3.1 og 4.2.3.2 for de resterende z-dele af billedet. Sum integreret intensiteten af efferocytosed (Σeff) og ikke-efferocytosed (Σne) materialer. Brøkdel af de apoptotiske celle, som har været efferocytosed kan beregnes til cellen som:
        Equation
      4. Kvantificere fraktion efferocytosed for alle celler på alle tidspunkter. Bemærk, at fluorescerende intensiteten af apoptotiske celler/efferosomes kan variere mellem billeder på grund af variationer i optagelsen af celle tracking farvestoffer af individuelle apoptotiske celler, og på grund af ændringer i image erhvervelse parametre såsom eksponeringstid. Kun sammenligne normaliserede værdier som brøk Efferocytosed, eller intensitet-uafhængig værdier som efferocytic indeks og efferocytic effektivitet, mellem billeder, mellem forsøgsbetingelser og mellem gentage eksperimenter.
    4. For at sikre, at det resulterende datasæt præcist afspejler variationen i efferocytosis mellem celler, foretage disse analyser på det maksimale antal celler i hvert forsøg.
      Bemærk: Efferocytic effektivitet og efferocytic indeks hurtigt kan beregnes (et par sekunder/celle), og vi typisk har til formål at analysere mindst 100 celler pr. eksperiment, gentage hvert forsøg mindst 3 gange. Beregning af fraktion af efferocytosed materiale og efferosome-specifikke foranstaltninger er mere besværlige, typisk tager 2-3 min/celle for en erfaren analytiker. For disse beregninger kvantificere vi et minimum af 15 celler pr. betingelse, pr. eksperiment.
    5. Optag efferocytic indeks, brøkdel efferocytosed og enkelte efferosome data på basis af pr. celle.
      Bemærk: Dette giver mulighed for analyse af data ved hjælp af encellede metoder, således at for Inter celle variationer til kvantificeres. Befolkningen niveau analyser kan stadig gennemføres på disse datasæt fra et gennemsnit én celle data erhvervet i enkelte eksperimenter. Efferosome-specifikke mål kan analyseres på befolkningsniveau, encellede niveau, og som ensembler (f.eks. som populationer af efferosomes uafhængig af de celler, der indeholder dem)15.

6. levende celle Efferocytosis analyse ved hjælp af apoptotiske celler

  1. Forberede THP-1, J774.2 eller M2 makrofager, som beskrevet i trin 1-3, hhv. Hvis det er påkrævet, celler skal være transfekteret med transgener eller andre genetiske konstruerer mindst 18 h inden du udfører nogen eksperimenter.
  2. Om aftenen før begyndelsen af eksperimentet, forberede apoptotiske Jurkat celler som beskrevet i afsnit 4 og 5 med følgende ændringer:
    1. Fortyndes celler og inducerer apoptose pr 4.1 – 4.3, og samle det nødvendige antal apoptotiske celler pr. 5.3 – 5.4.
    2. Tilføje en celle tracking farvestof ved den af fabrikanten anbefalede koncentration til apoptotiske cellesuspension. Inkuber suspension i 20 min. ved stuetemperatur i mørke. Tilføje et lige saa stort volumen af RPMI 1640 + 10% FBS og Inkuber i 5 min. ved stuetemperatur i mørke til at slukke enhver ureageret farvestof. Tilføj ikke NHS-biotin for disse eksperimenter.
    3. Pellet celler ved centrifugering ved 500 x g i 5 min og kassér supernatanten genopslæmmes farves apoptotiske celler i 100 µL af RPMI 1640 + 10% FBS pr. brønd af makrofager.
  3. Hvis det er påkrævet, etiket makrofager ved at fjerne medier fra hver brønd og tilføje 500 µL af PBS, som indeholder fabrikanterne anbefalede fortynding af en celle tracking farvestof, der ikke overlapper spektralt med cellen tracking farvestof føjes til apoptotiske celler eller nogen fluorescerende transgener udtrykt af makrofager. Inkuber i 20 min. ved stuetemperatur i mørke, så tilføje et lige saa stort volumen af DMEM + 10% FBS og Inkuber i 5 min. ved stuetemperatur i mørke til at slukke enhver ureageret farvestof.
  4. Overføre den makrofag-holdige coverslip til et Leiden kammer. Tilføj 400 µL af DMEM + 10% FBS, efterfulgt af 100 µL af mærket apoptotiske cellesuspension. Mix af forsigtigt pipettering media 2 – 3 gange.
  5. Overføre Leiden salen til et opvarmet og CO2-perfunderet kammer af en levende celle fluorescerende mikroskop.
    Bemærk: For mikroskopet opsætninger, der mangler CO2 perfusion kapaciteter, bruge væv næringssubstratet bufferet med 1 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syre (HEPES) i stedet for natriumbicarbonat at opretholde fysiologisk pH mens den kultur er udsat for luft.
  6. Fange en time-lapse serie, der indeholder et hvidt lys (fasekontrast eller DIC) billede og billeder af alle fluorescerende etiketter:
    1. Brug et 100 X mål linse for eksperimenter hvor løse fine detaljer er påkrævet (f.eks. membran dynamics phagocyt-apoptotiske celle interaktioner). I mellemtiden, mere generelle foranstaltninger (sats af apoptotiske celle optagelse, interaktion tid mellem makrofager og apoptotiske celler, etc.) er bedst afbildet ved hjælp af en 60 X eller 63 X mål.
    2. Hvis rådighed, brug punkt-besøg til at afbilde flere felter-of-view i løbet af en enkelt erhvervelse, hvilket øger antallet af efferocytic begivenheder fanget i en enkelt eksperiment
    3. Fordi efferocytes opsluge ofte små fragmenter af apoptotiske celler, snarere end intakt celler, er det bedst at fange z-stakke. For at minimere fototoksicitet, fange z-dele adskilt af fokale dybden af din mikroskoper mål (typisk 0,5 – 1,0 µm), gennem tykkelsen af celle (typisk 8-10 µm til makrofager, fx 8-20 skiver/celle). Dette sikrer, at alle engulfment og menneskehandel begivenheder vil være synlig i mindst en z-plan. Alternativt kan du bruge store (1-5 µm diameter) apoptotiske celle efterligner eller apoptotic celler, der underkastes minimal fragmentering under efferocytosis (fx varme chokeret neutrofiler) i stedet uden z-stabling. Vi har beskrevet forberedelse af både efterligner og apoptotiske neutrofiler tidligere28.
    4. At minimere photobleaching, skal du bruge lyse fluorophores og fange billeder ved hjælp af erhvervelse indstillinger, der minimerer photobleaching — fx lav intensitet excitation kombineret med høj kamera gevinst og korte eksponering gange29. Det anbefales kraftigt, ved hjælp af et mikroskop udstyret med en høj følsomhed elektromagnetiske ladning - sammen enhed (EM-CCD) kamera eller spinning-disk Konfokal og en højhastigheds piezoelektriske mekaniske fase, for denne form for billeddannelse.
  7. Antallet af mulige analysemetoder, der kan anvendes på disse time-lapse videoer er omfattende og over vores evne til at gennemgå her. Som eksempler, bruge manuel eller automatiske tracking software til at spore fusion, fission og bevægelse af efferosomes inden for celler15, kvantificere efferosome fusion dynamics med endolysosomes af colocalization analyse i makrofager at udtrykke rum-specifikke fluorescerende transgener13, skærm optagelse processer som sondering og cup dannelse30, bestemme rekruttering dynamikken i signalering og handel med proteiner til efferosome13, og/eller kvantificere degradative aktiviteten af efferosomes ved hjælp af apoptotiske celler mærket med pH-følsom, oxidant-følsomme eller protease-aktiveret fluorophores31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Natten kultur af Jurkat celler med 1 µM staurosporine resultater i apoptose af > 95% af celler, der kan bekræftes med Annexin V farvning (figur 1). Andre celletyper kan anvendes til disse forsøg, selvom koncentrationen af staurosporine og staurosporine behandlingens varighed skal være optimeret til hver cellelinje. For pålidelig påvisning og kvantificering af efferocytosis, > 80% af celler skal være apoptotiske forud for at føje dem til efferocytes. Andre induktorer af apoptose (f.eks. heat-shock, etoposide og UV-lys) kan også bruges, men vores erfaring, disse producerer en mere heterogene induktion af apoptose og resultere i blandet cellepopulationer indeholdende apoptotiske, sekundære nekrotisk og ikke-apoptotiske målceller.

For fast-celle imaging med inside-out farvning, tæt apposed efferocyte-apoptotiske celle interaktioner skal overholdes på alle tidspunkter med klart afgrænsede ikke-efferocytosed (streptavidin+/cell tracking farvestoffet+) og efferocytosed (streptavidin-/cell sporing+) materialer synlige (figur 2). Det er vigtigt at bemærke at synapser, der danner mellem efferocyte og den apoptotiske celle er ofte stram nok til at udelukke streptavidin, og dermed bør enhver celle tracking dye farvet objekt forsynet med streptavidin på ethvert punkt på sin omkreds betragtes som en bundne celle og ikke en efferosome. I de fleste eksperimenter vil brøkdel af apoptotiske celler, der er efferocytosed stige i en tidsafhængig mode, enten indtil ingen ikke-internaliseret apoptotiske celle materialer tilbage, eller indtil phagocyt når sin maksimale efferocytic kapacitet (figur 3). analyse er typisk udføres og registreres for enkelte celler (figur 3A), men data kan være gennemsnit på tværs af celler i enkelte eksperimenter og de gennemsnitlige værdier fra flere eksperimentelle gentager analyseret med konventionelle statistiske metoder (figur 3B). Kan foretages ændringer af denne standardiseret protokol giver mulighed for brug af primære celletyper, alternative efferocytic mål, og for yderligere farvning skal medtages. For eksempel, viser figur 4 en primær M2-polariseret menneskelige makrofag, der har efferocytosed apoptotiske celle efterligner består af 3 µm diameter silica perler belagt med en blanding af phosphatidylserin og phosphatidylcholin28, efterfulgt af efterfølgende fiksering, permeabilization og immunfarvning for genanvendelse endosome markør Rab17.

Under levende celle imaging efferocytic professionelle fagocytter vil blive observeret at udvide og trække små processer i en proces, der kaldes "sondering"30 (figur 5, t = 0); Når disse processer støde et mål de fast overholder målet og trække det til phagocyt. Denne sondering aktivitet kan ikke observeres med ikke-professionelle fagocytter såsom epitelceller. Efferocyte vil derefter udgøre en stram "efferocytic synapse"32 mellem sig selv og den apoptotiske celle, med denne synapse ofte samler en stor del af cellen apoptotiske (figur 5, t = 10). Efferocyte vil derefter trække stykker af cellen apoptotiske fra denne synapse i sin cytosol (figur 5, 10-30 min). Snart efter deres dannelse smugles disse vordende efferosomes fra synapser og mod den peri-nukleare område, et resultat af Rab7/RILP/dynein-dynactin medieret transport33. Over tid vil skrumpe ind til efferosomes og deraf følgende forringede materialer omfordeles hele cellen, hvor de er sandsynligvis absorberes eller genanvendt13,15. Evnen til at opdage disse processer er meget afhængig af erhvervelse billedhastighed og varigheden af forsøget. Hurtige processer såsom sondering kan ikke ses på lavere billedhastigheder, mens langsomme begivenheder (efferosome handel og absorption) kræver billeddannelse længere — i begge tilfælde kræver disse store billede erhvervelser ofte erobringen af lavere intensitet billeder at begrænse photobleaching og fototoksicitet (figur 5). Som med fast-celle analyse, kan live-celle version af denne analyse ændres efter behov af investigator. Figur 6 viser et enkelt billede af en levende celle erhvervelse af J774.2 makrofager at udtrykke transgener som fluorescently Danmark plasmamembran (PM-normal god landbrugspraksis) og som selektivt binder den signaling lipid PI (3) P (FYVE-RFP). Generation af PI (3) P på efferosome membran kan påvises som co lokalisering af FYVE-RFP med PM-NGL+ efferosome membran. Af kvantificere intensiteten af FYVE-RFP på efferosome, der kan kvantificeres dynamikken i PI (3) P signalerer på efferosome (figur 6).

Figure 1
Figur 1: Annexin V farvning af apoptotiske og apoptotiske Jurkat celler. Annexin V etiketter phosphatidylserin "spise-mig" signal udsat af apoptotiske celler. (Top) Ubehandlet (UT) Jurkat celler viser en sund (glat og afrundede) morfologi (DIC) og plette ikke med Annexin V. (nederst) Jurkat celler dyrkes natten med 1 µM staurosporine (STS) tage på en apoptotiske morfologi (uregelmæssig og blebbed) og plette med Annexin V. skalalinjen = 10 µm, billede intensitet vises som et farve kort. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: tidlige og sene Engulfment af apoptotiske Jurkat celler ved J774.2 makrofager. Billeder er af makrofager ved en tidlig (60 min) og slutningen (120 min) fase af efferocytosis. Hvid-lys (DIC) billede illustrerer den stramme grænseflade mellem makrofag (mφ) og apoptotiske celle (AC). Celle tracking farvestof (CTD, rød) afslører placeringen af alle apoptotiske celle-afledte materialer. FITC-Streptavidin farvning (Str, grønne) identificerer del af cellen apoptotiske, der endnu ikke er blevet opslugt af makrofager. Makrofag kerner blev præ farves med DAPI (blå). Efferosomes (rød) versus ikke-internaliseret del af cellen apoptotiske (grøn/gul) er let identificeres i en overlejring af Streptavidin og celle tracking farvestof billeder. Bemærk fraværet af streptavidin farvning på grænsefladen makrofag-apoptotiske celle på det tidlige tidspunkt, lavet af udelukkelsen af streptavidin fra stramt udformet efferocytic synapse (*). Makrofag kernen er identificeret af Hoechst farvning (blå). Skalalinjen = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: tidsforløb af brøkdel af apoptotiske celle Efferocytosed af J774.2 makrofager. Efferocytosis assays blev udført for den angivne tid, og fraktion af opslugte apoptotiske cellestof bestemmes for hvert tidspunkt ved hjælp af celle tracking farvestof/Streptavadin farvning. (A) brøkdel af efferocytosed materialer inden for enkelte makrofager, præsenteres data fra individuelle celler, vandrette linje viser middelværdien. 12 – 17 celler pr. tilstand, data fra 1 af 5 uafhængige forsøg. (B) brøkdel af efferocytosed materialer, i gennemsnit på tværs af 5 selvstændige eksperimenter, mindst 10 celler/tilstand/repeat. p < 0,05 sammenlignet med 30 min, Kruskal-Wallis test med Dunn korrektion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: analyse af Rab17 rekruttering til Efferosomes i primære menneskelige makrofager. En M2-polariseret makrofag opslugte apoptotiske celle efterligner (pile) og var immunostained for Rab17 (grøn) 60 min. efter engulfment. Skalalinjen = 5 µm. cellekernen er plettet med Hoeschst, DIC billede viser cellen morfologi og bruges til at identificere apoptotiske celle efterligner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: levende celle efferocytosis assay. En celle tracking farvestoffet labeledJ774.2 makrofag (mφ, grønne) blev optaget som det opslugte en apoptotiske Jurkat celle mærket med en anden farve celle tracking farvestof (AC, rød). Cellen apoptotiske er opdelt i flere fragmenter undervejs internalisering, resulterer i stykkevis optagelse og dannelse af flere efferosomes (pile). Skalalinjen = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: brug af fluorescerende transgener til at undersøge Efferocytic signalering. En J774.2 makrofag var transfekteret med en normal god landbrugspraksis-tagged plasmamembran markør (PM, grøn) og FYVE-RFP konstruktion, som binder den signaling lipid PI (3) P (rød). Efferocytosis danner en spirende plasma membran-afledte efferosome, der indeholder PI (3) P, som registreres af FYVE-RFP rekruttering (pil). Dynamics af PI (3) P signalering var kvantificeres som fold intensitet i forhold til FYVE-RFP signal til stede på det tidspunkt efferosome lukning (t = 0, graf). Dette eksperiment, ikke apoptotiske celler brugt en apoptotiske celle-efterligning perle (pil, DIC). Skalalinjen = 5 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De metoder, der er skitseret i denne protokol aktiverer imaging og kvantificering af dynamiske efferocytic processen, brug af både fast-celle og live-celle tilgange. Disse tilgange giver flere fordele sammenlignet med almindeligt ansat flow flowcytometri-baserede metoder23,24. Brugen af inside-out farvning med faste prøver giver en mere robust og nøjagtig kvantificering af hastigheden og omfanget af efferocytosis — ja, mange flow flowcytometri-baserede metoder simpelthen mærke apoptotiske celler og makrofager med forskellige fluorophores, og score efferocytosis som brøkdel af makrofager Co farvning med apoptotiske celle markør, således mangler evnen til at skelne mellem bundet versus internaliseret apoptotiske cellestof. Alternative flow flowcytometri tilgange omfatte dem, der bruger pHrodo mærket apoptotiske celler24. pHrodo er en pH-følsomme fluorophore, der øger i lysstyrke på sure pH-værdi. Mens denne fluorophore giver bedre opløsning mellem ikke-internaliseret versus internaliseret materialer, som fluorescens stiger specielt efter internalisering af cellen apoptotiske og forsuring af efferosome, kan resultaterne være forvirret af sygdomsprocesser, hvilket forringer efferosome forsuring34,35, og denne metode vil savne efferosomes i de tidlige (pre forsuring) stadier af efferocytosis36, ligger i forsuring-fattige regioner i celle27, eller i celler, der svagt surt deres lysosomer37. En anden fordel af den i denne protokol beskrevne metode er brugen af live-celle imaging for at måle dynamikken i efferocytosis, som processer såsom sondering, dannelsen af synapser efferocytic og intracellulære handel med efferosomes må ikke være registreret bruger flow flowcytometri-baserede tilgange.

Mens denne metode giver mange fordele, eksperimenter, der kræver kvantificering af mange hundreder af celler — f.eks. eksperimenter afsløre sjældne begivenheder, eller kvantificere meget varierende processer — kan være svært, med analyse af disse store datasæt tager uforholdsmæssig meget tid. Høj overførselshastighed imaging tilgange såsom imaging flow flowcytometri38 kan tillade for højere overførselshastighed end konventionelle mikroskopi, selvom i vores erfaring nuværende automatiske billede analyse programmer ikke er altid i stand til at præcist segmentering ikke internaliseret-versus internaliseret materialer. Specifikt, den stramme efferocytic synapse, som danner mellem den apoptotiske celle- og efferocyte kan udelukke streptavidin farvning, og som sådan en bundet apoptotiske celle optræder ofte som en fast masse i cellen tracking farvestof kanal, der er delvist kappebærende af streptavidin farvning (figur 2). Mens efferosomes er let identificeres algoritmisk, er den bundne del af cellen apoptotiske således ofte fejlagtigt som en efferosome på grund af vanskeligheden ved bogføring af delvis streptavidin farvning. Mens vi har endnu til at finde et program, der kan præcist identificere og kvantificere stykkevis optagelsen af apoptotiske celler uden menneskelig hjælp, har vi fundet at trainable halvautomatiske systemer39 kan høj grad fremskynde analyse, at reducere brøkdel efferocytosed målinger fra 2-3 min. til < 60 s pr. celle. Alternativt, ikke-fordøjelige apoptotiske celle efterligner eller celletyper, som minimalt fragment ved apoptose, kan bruges i stedet. Dette simplificerer påvisning at enkelt, større strukturer, som kan være mere medgørlige til automatiserede metoder og kan eliminere behovet for z-stabling. Selv med disse fremskridt, erhvervelse og analyse hastigheden af denne metode fortsat er begrænsende og som sådan flowcytometri er fortsat den mest levedygtige metode når analyser af store celle numre er krævede23.

Selv om vi har beskrevet denne metode ved hjælp af celle-line og primære menneskelige makrofager som efferocytes og apoptotiske Jurkat celler (en T-cellelinje) som mål, kan denne metode anvendes til enhver efferocytic celle type eller apoptotic celle mål. Faktisk, lignende metoder har været brugt til at undersøge efferocytosis i hepatocytter og epitelceller9,40,41, og efferocytosis af klinisk relevante mål, såsom tumor celler42. Det kan være nødvendigt at ændre denne protokol, når du bruger ikke-immune efferocytes, eller når modellering specifikke efferocytic begivenheder. For eksempel, Jurkat celler er ikke-tilhænger og derfor usandsynligt, at fuldt sammenfatte de mekaniske kræfter og rumlige begrænsninger efferocytes opstå, når interagere med vedhængende apoptotiske celler eller apoptotic celler inden for solid væv. Mange celletyper vil opretholde friktion under apoptose og derfor kan bruges som vedhængende mål; som et eksempel gennemgå HeLa celler reproducerbar staurosporine-induceret apoptose, phosphatidylserin scrambling og blebbing over en periode på 4-6 h samtidig opretholde vedhæftning af cellen kroppen43. Celler suspenderet i en kollagen matrix eller stamcelle-afledt organoids44 kan være potentielle modeller for at studere efferocytosis i solid væv, selv om vi er uvidende om nogen undersøgelser, der har brugt disse metoder. For nogle modeller immunceller som Jurkat celler og neutrofile bør ikke bruges som apoptotiske mål, da disse celler kan frigive cytokin-baserede "find-mig" signaler såsom CX3CL1, som kan være en forstyrrende faktor i modeller, hvor inflammatoriske eller vandrende processer er undersøgte45. Således, mens alsidigheden af dette assay giver mulighed for det skal bruges til at udforske efferocytosis på tværs af en række celletyper og modelsystemer, skal sørges for at vælge passende efferocytes, målceller og dyrkningsbetingelserne til bedste model den fysiologiske behandle under undersøgelsen.

De analysemetoder, der er beskrevet i denne protokol er bestemt kun som udgangspunkt, med imaging-baserede arten af disse eksperimenter, gør det muligt for en lang række analyser. For eksempel, efferosome positionering og diameter målinger kan være indsamlet når du udfører brøkdel efferocytosed målinger eller målt inden for live-celle tid-kurser, for at undersøge processer såsom intracellulære menneskehandel efferosomes og den apoptotiske celle nedbrydningen13,15. Immunfarvning (figur 4) kan bruges til at undersøge ansættelse af proteiner til efferosomes, mens live-celle imaging kombineret med morfologiske analyser kan bruges til at kvantificere processer sådanne bindende virkning og satser engulfment30 , 46. vi ofte udfører disse assays i makrofager at udtrykke fluorescerende transgener, der rapporterer signalering molekyle aktivering eller aktiviteten af cellulære begivenheder under efferocytosis (figur 6). Disse journalister aktiverer overvågning af signalering processer under efferocytosis; for eksempel har vi brugt fluorescently markeret Rab GTPases for at udforske Rab5, Rab7 og Rab17 rolle i mægle efferosome behandling og efterfølgende handel med apoptotiske celle-afledte antigener13,15. På samme måde, inkorporering af journalister celledød, efferosome pH, reaktive ilt arter produktion og andre cellulære processer i live-celle eksperimenter kan bruges til at undersøge de processer mægle nedbrydningen af efferosomes31 ,47. En fælles udfordring i disse eksperimenter er at identificere transgener eller journalister med kompatible fluorophores; ofte, vil vi fjerne cellen tracking farvestof og/eller streptavidin til gratis kanaler for imaging andre fluorophores. For nogle eksperimenter er det gavnligt at erstatte den apoptotiske celle med en ikke-fragmentering efterligner. Dette giver mulighed for kvantificering af signalerer dynamik og cellulære processer uden kompleksiteten af sporing af flere efferosomes stammer fra en én apoptotic celle. Se Evans et al. instruktioner om forberedelse apoptotiske celle efterligner28.

De mest almindelige problemer ved udformningen af disse eksperimenter er at finde en kombination af fluorophores, der giver mulighed for de ønskede processer til afbildning, samtidig minimere photobleaching og fototoksicitet29. Fluorophore udvalg er i høj grad dikteret af lasere/excitation filtre, dichroics/kuber og emission filtre af mikroskop, og derfor valget af fluorophores er ofte specifikke for individuelle mikroskoper. Generelt længere bølgelængde fluorophores (orange til far-red, fx emission maxima > 580 nm) er mindre udsat for photobleaching og disse bølgelængder er mindre forstyrrende ind i celler. Grøn fluorophores (emission maxima ~ 525 nm) kan bruges, men pleje skal tages for at begrænse fototoksicitet til cellerne. Fluorophores, at ophidse bølgelængder mindre end 480 nm (violet og blåt) bør undgås på grund af deres høje fototoksicitet og tilbøjelighed til disse excitation bølgelængder at afblege andre fluorophores29. Hvor det er muligt, bør høj lysstyrke og stabil fluorophores vælges. Tilsvarende billede erhvervelse parametre bør tilpasses for at minimere photobleaching og fototoksicitet — fx længere eksponeringer ved lav excitation intensitet foretrækkes over højere excitation intensiteter48. Tilsætning af antioxidanter såsom rutin og fjernelse af nogle medier komponenter kan forbedre både fotostabilitet og reducere fototoksicitet49. Selv med en omhyggelig udvælgelse af fluorophores og billeddiagnostiske betingelser kræver behovet for at begrænse photobleaching ofte erobringen af billeder med lavt signal-støj-forhold (Se figur 5 for et eksempel). Hvis kvantificere fluorescens intensitet, skal stor omhu tages for at begrænse billedbehandling artefakter; ideelt, rå billeder uden nogen form for behandling bør analyseres. Hvis deconvolving billeder før kvantificeringen, skal en deconvolution algoritme, der bevarer fluorescerende intensiteter brugt50,51.

Live celle opkøb kan være særligt udfordrende, med vellykkede eksperimenter der kræver en omhyggelig balance mellem magnetisering intensitet, eksponeringstid, framerate og eksperimentets varighed. Excitation intensitet og eksponering tid bør tilpasses for at minimere fototoksicitet, som beskrevet ovenfor, med det forbehold, at længere eksponering gange kan resultere i bevægelse artefakter celle færdsel eller begrænse frame rate af erhvervelse. Rammehastigheden kan variere alt efter de eksperimentelle krav. Lavere billedhastigheder (5-30 min. mellem rammer) mulighed for billeddannelse over længere perioder (12 timer eller mere) men giver minimal data om fænomener som membran dynamics og post-efferocytosis handel med efferosomes. Høj frame-hastigheder (så hurtigt som 1 indramme per other) giver fremragende tidsmæssige opløsning af efferocytic hændelser og efferosome handel — men selv med en omhyggelig udvælgelse af fluorophores, excitation intensitet og eksponering gange — photobleaching eller fototoksicitet vil normalt begrænse disse eksperimenter til mindre end en time i varighed. Vores erfaring, erhverve billeder hver 1-2 min, over eksperimentelle perioder på 2-6 h, er et acceptabelt kompromis, der giver målbare billeder af et tilstrækkeligt antal efferocytic begivenheder, med rimelig tidsmæssige opløsning.

Ændret og mislykkede efferocytosis er kendt for at være involveret i patologi af kræft, åreforkalkning og flere autoimmune sygdomme, med efferocytosis-targeting terapier viser store klinisk lover7,52, 53,54,55. Yderligere udvikling på disse områder vil kræve identifikation og karakterisering af de cellulære processer, receptorer og signalering veje, som regulerer efferocytosis. Analysen i denne protokol repræsenterer et stærkt værktøj til disse undersøgelser og kan ændres til at kvantificere mange af de cellulære og signalering processer regulerer efferocytosis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer nogen interessekonflikt.

Acknowledgments

Undersøgelsen blev finansieret af canadiske institutter for sundhed Research (CIHR) opererer Grant MOP-123419, naturvidenskab og Engineering Research Rådet af Canada Discovery Grant 418194, og en Ontario Ministeriet for forskning og Innovation tidlige Research Award til BH. DGW bidrog nogle af billederne præsenteres, at optimering af protokoller og skrivning af håndskriftet; Han blev finansieret af et pump-priming tilskud fra university of Liverpool. CY er finansieret af en Vanier Graduate stipendium og CIHR MD/PhD Studentship. De finansielle organer spillede ingen rolle i undersøgelse design, dataindsamling og analyse, beslutningen om at offentliggøre eller forberedelse af manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Media Wisent 3500-000-EL
DMEM Media Wisent 319-005-CL
Fetal Bovine Serum (FBS) Wisent 080-150
PBS Wisent 311-010-CL
18 mm circular glass coverslips #1.5 thickness Electron Microscopy Sciences 72290-08 Size and shape of coverslip is not critical, but 18 mm fit into the wells of a standard 12-well plate which simplifies cell culture
Staurosporine Cayman Chemical 81590 Dissolve in DMSO at 1 mM (1,000x stock solution)
Annexin V-Alexa 488 ThermoFisher R37174
EZ-Link NHS-Biotin ThermoFisher 20217 Store in a dessicator. Do not prepare a stock solution.
DMSO Sigma-Aldrich D2650
CellTrace FarRed ThermoFisher C34572
CellTrace Orange ThermoFisher C34851
Hoescht 33342 ThermoFisher 62249
FITC-Streptavadin ThermoFisher SA1001
Lympholyte-poly cell sepration medium Cedarlane Labs CL5071
Recombinant Human M-CSF Peprotech 200-04
Recombinant Human IL-4 Peprotech 300-25
J774.2 Macrophage Cell Line Sigma-Aldrich 85011428-1VL
THP-1 Human Monocyte Cell Line ATCC TIB-202
Jurkat T Cell Line ATCC TIB-152

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elmore, S. Apoptosis: A review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
  2. Toda, S., Hanayama, R., Nagata, S. Two-step engulfment of apoptotic cells. Molecular and Cellular Biology. 32 (1), 118-125 (2012).
  3. Ravichandran, K. S. Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: Progress and conundrums. The Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).
  4. Fadok, V. A., Voelker, D. R., Campbell, P. A., Cohen, J. J., Bratton, D. L., Henson, P. M. Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages. Journal of Immunology. 148 (7), 2207-2216 (1992).
  5. Bevers, E. M., Comfurius, P., van Rijn, J. L., Hemker, H. C., Zwaal, R. F. Generation of prothrombin-converting activity and the exposure of phosphatidylserine at the outer surface of platelets. European Journal of Biochemistry. 122 (2), 429-436 (1982).
  6. Callahan, M. K., Williamson, P., Schlegel, R. A. Surface expression of phosphatidylserine on macrophages is required for phagocytosis of apoptotic thymocytes. Cell Death and Differentiation. 7 (7), 645-653 (2000).
  7. Kojima, Y., et al. CD47-blocking antibodies restore phagocytosis and prevent atherosclerosis. Nature. 536, 86-90 (2016).
  8. Seitz, H. M., Camenisch, T. D., Lemke, G., Earp, H. S., Matsushima, G. K. Macrophages and dendritic cells use different Axl/Mertk/Tyro3 receptors in clearance of apoptotic cells. Journal of Immunology. 178, 5635-5642 (2007).
  9. Ichimura, T., Asseldonk, E. J. P. V., Humphreys, B. D., Gunaratnam, L., Duffield, J. S., Bonventre, J. V. Kidney injury molecule-1 is a phosphatidylserine receptor that confers a phagocytic phenotype on epithelial cells. The Journal of Clinical Investigation. 118 (5), 1657-1668 (2008).
  10. Flannagan, R. S., Canton, J., Furuya, W., Glogauer, M., Grinstein, S. The phosphatidylserine receptor TIM4 utilizes integrins as coreceptors to effect phagocytosis. Molecular Biology of the Cell. 25 (9), 1511-1522 (2014).
  11. Park, D., et al. BAI1 is an engulfment receptor for apoptotic cells upstream of the ELMO/Dock180/Rac module. Nature. 450 (7168), 430-434 (2007).
  12. Elliott, M. R., Koster, K. M., Murphy, P. S. Efferocytosis Signaling in the Regulation of Macrophage Inflammatory Responses. Journal of Immunology. 198 (4), 1387-1394 (2017).
  13. Yin, C., Kim, Y., Argintaru, D., Heit, B. Rab17 mediates differential antigen sorting following efferocytosis and phagocytosis. Cell Death & Disease. 7 (12), e2529 (2016).
  14. Kinchen, J. M., et al. A pathway for phagosome maturation during engulfment of apoptotic cells. Nature Cell Biology. 10 (5), 556-566 (2008).
  15. Yin, C., Argintaru, D., Heit, B. Rab17 mediates intermixing of phagocytosed apoptotic cells with recycling endosomes. Small GTPases. 0 (0), 1-9 (2017).
  16. Silva, M. T. Secondary necrosis: The natural outcome of the complete apoptotic program. FEBS letters. 584 (22), 4491-4499 (2010).
  17. Thorp, E. B. Mechanisms of failed apoptotic cell clearance by phagocyte subsets in cardiovascular disease. Apoptosis. 15 (9), 1124-1136 (2010).
  18. Sarantis, H., Grinstein, S. Monitoring phospholipid dynamics during phagocytosis: application of genetically-encoded fluorescent probes. Methods in Cell Biology. 108, 429-444 (2012).
  19. Steinberg, B. E., Grinstein, S. Analysis of macrophage phagocytosis: Quantitative assays of phagosome formation and maturation using high-throughput fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 531, 45-56 (2009).
  20. Wang, J., Hossain, M., Thanabalasuriar, A., Gunzer, M., Meininger, C., Kubes, P. Visualizing the function and fate of neutrophils in sterile injury and repair. Science. 358 (6359), 111-116 (2017).
  21. Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. The Journal of Cell Biology. 169 (1), 139-149 (2005).
  22. Greenlee-Wacker, M. C., Rigby, K. M., Kobayashi, S. D., Porter, A. R., DeLeo, F. R., Nauseef, W. M. Phagocytosis of Staphylococcus aureus by human neutrophils prevents macrophage efferocytosis and induces programmed necrosis. Journal of Immunology. 192 (10), 4709-4717 (2014).
  23. Wootton, D. G., et al. Recovery from pneumonia requires efferocytosis which is impaired in smokers and those with low body mass index and enhanced by statins. Thorax. 71 (11), 1052-1054 (2016).
  24. Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
  25. Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator. Biophysical Journal. 74 (3), 1591-1599 (1998).
  26. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  27. Johnson, D. E., Ostrowski, P., Jaumouillé, V., Grinstein, S. The position of lysosomes within the cell determines their luminal pH. The Journal of Cell Biology. 212 (6), 677-692 (2016).
  28. Evans, A. L., Blackburn, J. W. D., Yin, C., Heit, B. Quantitative efferocytosis assays. Methods in Molecular Biology. 1519, 25-41 (2017).
  29. Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), (2017).
  30. Flannagan, R. S., Harrison, R. E., Yip, C. M., Jaqaman, K., Grinstein, S. Dynamic macrophage "probing" is required for the efficient capture of phagocytic targets. The Journal of Cell Biology. 191 (6), 1205-1218 (2010).
  31. Joshi, G. N., Gilberti, R. M., Knecht, D. A. Single cell analysis of phagocytosis, phagosome maturation, phagolysosomal leakage, and cell death following exposure of macrophages to silica particles. Methods in Molecular Biology. 1519, 55-77 (2017).
  32. Karaji, N., Sattentau, Q. J. Efferocytosis of Pathogen-Infected Cells. Frontiers in Immunology. 8 (DEC), 1863 (1863).
  33. Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. Phagosomes fuse with late endosomes and/or lysosomes by extension of membrane protrusions along microtubules: role of Rab7 and RILP. Molecular and Cellular Biology. 23 (18), 6494-6506 (2003).
  34. Reiners, J. J., Kleinman, M., Kessel, D., Mathieu, P. A., Caruso, J. A. Nonesterified cholesterol content of lysosomes modulates susceptibility to oxidant-induced permeabilization. Free Radical Biology & Medicine. 50 (2), 281-294 (2011).
  35. Boya, P., et al. Lysosomal membrane permeabilization induces cell death in a mitochondrion-dependent fashion. The Journal of Experimental Medicine. 197 (10), 1323-1334 (2003).
  36. Fairn, G. D., Grinstein, S. How nascent phagosomes mature to become phagolysosomes. Trends in Immunology. , 1-9 (2012).
  37. Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages. Molecular Biology of the Cell. 25 (21), 3330-3341 (2014).
  38. Phanse, Y., et al. Analyzing cellular internalization of nanoparticles and bacteria by multi-spectral imaging flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (64), e3884 (2012).
  39. Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 230-233 (2011).
  40. Davies, S. P., Reynolds, G. M., Stamataki, Z. Clearance of apoptotic cells by tissue epithelia: A putative role for hepatocytes in liver efferocytosis. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
  41. Ismail, O. Z., Zhang, X., Bonventre, J. V., Gunaratnam, L. G protein α12(Gα12) is a negative regulator of kidney injury molecule-1-mediated efferocytosis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 310 (7), F607-F620 (2016).
  42. Vaught, D. B., Stanford, J. C., Cook, R. S. Efferocytosis creates a tumor microenvironment supportive of tumor survival and metastasis. Cancer Cell & Microenvironment. 2 (1), (2015).
  43. Heit, B., Yeung, T., Grinstein, S. Changes in mitochondrial surface charge mediate recruitment of signaling molecules during apoptosis. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 300 (1), C33-C41 (2011).
  44. Múnera, J. O., Wells, J. M. Generation of Gastrointestinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1597, 167-177 (2017).
  45. Truman, L. A., et al. CX3CL1/fractalkine is released from apoptotic lymphocytes to stimulate macrophage chemotaxis. Blood. 112 (13), 5026-5036 (2008).
  46. Evans, A. L., et al. Antagonistic Coevolution of MER Tyrosine Kinase Expression and Function. Molecular Biology and Evolution. , (2017).
  47. Flannagan, R. S., Heit, B., Heinrichs, D. E. Intracellular replication of Staphylococcus aureus in mature phagolysosomes in macrophages precedes host cell death, and bacterial escape and dissemination. Cellular Microbiology. , (2015).
  48. Mubaid, F., Brown, C. M. Less is More: Longer Exposure Times with Low Light Intensity is Less Photo-Toxic. Microscopy Today. 25 (06), 26-35 (2017).
  49. Bogdanov, A. M., Kudryavtseva, E. I., Lukyanov, K. A. Anti-fading media for live cell GFP imaging. PloS One. 7 (12), e53004 (2012).
  50. Rossner, M., Yamada, K. M. What's in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166 (1), 11-15 (2004).
  51. Sage, D., et al. DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy. Methods. 115, 28-41 (2017).
  52. Ma, G. Z. M., Stankovich, J., Kilpatrick, T. J., Binder, M. D., Field, J. Polymorphisms in the receptor tyrosine kinase MERTK gene are associated with multiple sclerosis susceptibility. PloS One. 6 (2), e16964 (2011).
  53. Thorp, E., Cui, D., Schrijvers, D. M., Kuriakose, G., Tabas, I. Mertk receptor mutation reduces efferocytosis efficiency and promotes apoptotic cell accumulation and plaque necrosis in atherosclerotic lesions of apoe-/- mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (8), 1421-1428 (2008).
  54. Nguyen, K. -Q. N., et al. Overexpression of MERTK Receptor Tyrosine Kinase in Epithelial Cancer Cells Drives Efferocytosis in a Gain-of-Function Capacity. The Journal of Biological Chemistry. 289 (37), 25737-25749 (2014).
  55. Morimoto, K., et al. Lovastatin enhances clearance of apoptotic cells (efferocytosis) with implications for chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Immunology. 176 (12), 7657-7665 (2006).

Tags

Immunologi og infektion spørgsmålet 138 Efferocytosis fagocytose apoptose mikroskopi phagocyt makrofag
Kvantificering af Efferocytosis af encellede Fluorescens mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Taruc, K., Yin, C., Wootton, D. G.,… More

Taruc, K., Yin, C., Wootton, D. G., Heit, B. Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (138), e58149, doi:10.3791/58149 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter