Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Kwantificering van Efferocytosis door eencellige fluorescentie microscopie

Published: August 18, 2018 doi: 10.3791/58149
Automatic Translation
1, 1, 2,3, 1
1Department of Microbiology and Immunology and the Center for Human Immunology, University of Western Ontario, 2Institute of Infection and Global Health, University of Liverpool, 3Department of Respiratory Research, Aintree University Hospital NHS Foundation Trust

Summary

Efferocytosis, de fagocytische verwijdering van apoptotic cellen, is nodig om de homeostase te handhaven en wordt vergemakkelijkt door de receptoren en signaalroutes waarmee voor de erkenning, de engulfment, en de internalisering van de apoptotic cellen. Hierin presenteren wij een fluorescentie microscopie protocol voor de kwantificering van efferocytosis en de activiteit van efferocytic signaalroutes.

Abstract

Bestuderen van de regulering van de efferocytosis vereist methoden die kunnen de opname van apoptotic cellen nauwkeurig te kwantificeren en sonde de signalering en cellulaire processen die efferocytosis zijn. Deze kwantificering kunnen moeilijk uit te voeren zoals apoptotic cellen vaak efferocytosed fragmentarisch zijn, aldus dwingt tot methoden die nauwkeurig af te tussen het efferocytosed-gedeelte van een doelwit van de apoptotic versus residuele unengulfed mobiele bakenen kunnen fragmenten. De aanpak hierin maakt gebruik van dual-labeling benaderingen om de dynamiek van efferocytosis en efferocytic capaciteit van efferocytes zoals macrofagen nauwkeurig te kwantificeren. Het cytosol van de apoptotic cel heet met een cel-tracking kleurstof aan controle van alle apoptotic cel-afgeleide materialen, terwijl de oppervlakte biotinylation van de cel van apoptotic zorgt voor differentiatie tussen verinnerlijkte en niet-geïnternaliseerd inschakelen de fracties van de cel van de apoptotic. De capaciteit van de efferocytic van efferocytes wordt bepaald door de fluorescerende opnamen van live of vaste cellen en kwantificeren van het bedrag van de afhankelijke versus verinnerlijkte doelen, zoals onderscheiden door daar kleuring. Deze benadering biedt verschillende voordelen ten opzichte van methoden zoals stroom cytometry, namelijk de nauwkeurige afbakening van niet-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cel breuken, de mogelijkheid voor het meten van efferocytic dynamiek door live-cel microscopie, en de capaciteit voor het uitvoeren van studies van cellulaire signalering in cellen uiten fluorescently-label transgenen. Gecombineerde, dienen de methoden die worden beschreven in dit protocol als basis voor een flexibele experimentele aanpak die kan worden gebruikt om de activiteit van de efferocytic nauwkeurig te kwantificeren en te ondervragen van cellulaire signaalroutes actief tijdens efferocytosis.

Introduction

Apoptosis of geprogrammeerde celdood, is een sterk gereguleerd fysiologische proces dat voorkomt in de meeste meercellige organismen en is van cruciaal belang voor hun ontwikkeling en homeostase1. Naast betrokkenheid bij normale cel omzet en embryonale ontwikkeling, apoptosis kan de verwijdering van geïnfecteerde of beschadigde cellen van weefsels en kan worden geactiveerd in reactie op de infectie, ontsteking, kanker, en ook door medische ingrepen zoals radiotherapie of steroïden1. Apoptotic cellen bloot "eten-me" signalen op hun celoppervlak die worden herkend door receptoren op een scala aan professionele en niet-professionele fagocyten, gezamenlijk aangeduid als "efferocytes". Betrokkenheid van deze receptoren induceert de opname en afbraak van de apoptotic cel door de efferocyte door middel van een proces dat bekend staat als efferocytosis2,3. Fosfatidylserine is het beste gekarakteriseerd eten-me signaal drijvende efferocytosis. Het is normaliter beperkt tot de innerlijke bijsluiter van het plasma-membraan, met een lipide-scramblase die dit membraan asymmetrie verstoort, dus bloot fosfatidylserine op de oppervlakte van cel4activeren apoptosis. Fosfatidylserine is te vinden op het extracellulaire oppervlak van sommige niet-apoptotic cellen, zoals volwassen macrofagen en bloedplaatjes geactiveerd. Deze cellen zijn echter niet efferocytosed als gevolg van de aanwezigheid van "don't eat me" signalen, zoals CD47, op hun cel oppervlakte5,6,7. Blootgestelde fosfatidylserine wordt herkend door een matrix van efferocytic receptoren uitgedrukt door efferocytes. Binden van deze receptoren aan fosfatidylserine, activeert ofwel rechtstreeks ofwel via de hulp van opsonins, signaalroutes ter bevordering van de engulfment van de apoptotic cel in een membraan-gebonden vacuole genoemd de efferosome8, 9 , 10 , 11 , 12. de efferosome zekeringen opeenvolgend met Endosomen en lysosomes, die de moleculaire machines nodig breng het efferosome te leveren te degraderen de apoptotic cellen lading13,14. Zodra gedegradeerd, de apoptotic cel-afgeleide materialen worden verhandeld aan de recycling endosome — een proces die grenzen immuunresponsen aan apoptotic cel-afgeleide antigenen, en die kunnen toestaan voor de terugwinning van voedingsstoffen uit de apoptotic cellen13, 15. Een storing in efferocytosis resulteert in verminderde Goedkeuringvande apoptotic cellen; Deze onontgonnen cellen ondergaan uiteindelijk secundaire necrose. Necrotische cellen introductie pro-inflammatoire cytosolische inhoud, pathogenen en autoantigens in de extracellulaire milieu, dus een drivingrange van besmettelijke, inflammatoire en auto-immune ziekten16,17. Samen, apoptosis en efferocytosis de opheffing vergemakkelijkt van de stervende en dode cellen en zorgen voor het onderhoud van de weefsel homeostase.

Onderzoek naar de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de efferocytosis vereist methoden waarmee een duidelijke kwantificering van apoptotic cellen opname. Deze kwantificering wordt bemoeilijkt door het feit dat in tegenstelling tot andere opname mechanismen zoals endocytose en fagocytose18,19, efferocytosis niet leiden de engulfment van intact doelcel tot kunnen, resulterend in de versnipperde opname van de apoptotic cel door de efferocyte20. Het protocol hierin beschreven beschrijft een in vitro efferocytosis bepaling waarmee nauwkeurige afbakening van de verinnerlijkte versus niet-geïnternaliseerd gedeelten van individuele apoptotic cellen en kan gecombineerd worden met een aantal vaste-cel en Live-cel microscopie benaderingen. Traditionele fagocytose assays toevoegen antilichamen die specifiek zijn voor de fagocytische doelgroep op het einde van het experiment om het label niet-geïnternaliseerd doelen, waar als onze methode verschilt door etikettering van het doel van de apoptotic met biotine covalent alternerende21 , 22. terwijl apoptotic cel specifieke antilichamen kunnen worden gebruikt in deze test, de biotinylation aanpak zorgt voor geen eiwithoudende doelstelling worden gelabeld en vermijdt potentiële problemen met secundair antilichaam Kruisallergie als immunokleuring wordt uitgevoerd . Specifiek, duidelijk naar voren komt de voorbereiding van apoptotic Jurkat cellen, die dual-gekleurd met zowel een cel bijhouden kleurstof en biotine zijn. De cel voor het bijhouden van kleurstof zorgt voor apoptotic cel-afgeleide materialen worden bijgehouden tijdens de efferocytosis, terwijl de oppervlakte biotinylation zorgt voor de discriminatie van geïnternaliseerd van niet-geïnternaliseerd delen van efferocytosed apoptotic cellen. Ook beschrijven we de cultuur en de voorbereiding van J774.2 en THP-1 cellijnen voor gebruik als lymfkliertest en menselijke efferocytes, monocyt-afgeleide M2 macrofagen als een voorbeeld van de primaire cel efferocytosis en Jurkat cellen voor gebruik als efferocytic doelen. Deze methoden kunnen eenvoudig worden toegepast op andere cellijnen of primaire cellen, doelcellen ondergaat elke vorm van celdood (bijvoorbeeld apoptosis, necrose en necroptosis) en micron-sized nabootsers die simuleren van apoptotic cellen via lipide coatings of coating met liganden specifieke aan een receptor efferocytic van belang.

De methode geschetst in dit protocol kent verschillende voordelen ten opzichte van de stroom cytometry gebaseerde methoden gewoonlijk worden gebruikt in het veld23,24. Door direct imaging de fagocytensysteem-apoptotic cel interactie, gecombineerd met duidelijke etikettering van beide totale en niet-geïnternaliseerd apoptotic cel materiaal, kunnen kwantitatieve metingen van efferocytosis worden gemaakt. Bovendien beperkt het gebruik van pH-ongevoelig fluorophores storende factoren zoals de onderdrukking van FITC en GFP fluorescentie bij lysosomale pH dat kunstdiscours sommige alternatieve methoden25. Tot slot, terwijl niet in detail beschreven, deze methoden kunnen worden ingezet met behulp van uiten van fluorescently-label transgenen, efferocytes of met na fixatie immunokleuring, met het oog op kwantificering van de activiteit van de molecule signalering en monitoring van de cellulaire processen tijdens efferocytosis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Collectie van bloed van gezonde vrijwilligers werd goedgekeurd door de Health Science onderzoek Ethics Board van de University of Western Ontario. Venapunctie werd uitgevoerd overeenkomstig de richtsnoeren van de Tri-Raad-beleidsverklaring inzake menselijke onderzoek.

1. cultuur en voorbereiding van de THP-1 monocyt cellijn

  1. Cultuur THP-1 monocyten als een schorsing cultuur in T25 kolven op 37 ° C + 5% CO2. Cellen moeten worden gekweekt in 5 mL Roswell Park Memorial Instituut 1640 (RPMI 1640) + 10% foetale runderserum (FBS).
  2. Elke dag onderbreken cellen gelijkmatig over de media van de groei door zachtjes schudden de kolf dan tellen onmiddellijk cellen met een hemocytometer. Cellen moeten worden gepasseerd zodra celdichtheid 1 x 106 cellen/mL bereikt:
    1. Vooraf warm RPMI 1640 + 10% FBS in een waterbad 37 ° C.
    2. 2 x 105 cellen in een tube van de microcentrifuge 1,5 mL of een conische tube van 15 mL en pellet cellen overbrengen door centrifugatie bij 500 x g bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
    3. Verwijder de bovendrijvende vloeistof zonder verstoring van de cel pellet en resuspendeer de pellet in 1 mL (1,5 mL microcentrifuge buis) of 5 mL (conische tube van 15 mL)-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
    4. Centrifugeer de buis bij 500 x g bij kamertemperatuur gedurende 5 min. verwijderen de PBS zonder verstoring van de cel-pellet.
    5. Resuspendeer pellet in 1 mL verse RPMI 1640 + 10% FBS.
    6. Voeg de geresuspendeerde cellen uit 1.2.5 naar een nieuwe T25 kolf plek 4 mL verwarmde media, en daartoe. Cultuur in een 37 ° C + 5% CO2 incubator totdat de cellen vereisen passaging (meestal 3 dagen) of cellen zijn vereist voor een experiment.
  3. Voor een experiment met THP-1-afgeleide macrofagen, het vereiste aantal cellen uit de kolf en de plaat voorafgaand aan passaging te verwijderen:
    1. Plaats van het vereiste aantal 18 mm ronde glazen coverslips (#1.5 dikte) in de putjes van de plaat van een 12-well — meestal 1 dekglaasje aan per voorwaarde en/of timepoint. Nou in elk aliquot 5 x 104 THP-1 monocyten. Het aantal cellen toegevoegd aan elk putje kan worden gewijzigd, indien nodig.
    2. Opvoeden van het totale volume van elke cel-bevattende goed tot 1 mL met behulp van RPMI + 10% FBS opgewarmd tot 37 ° C.
    3. Voeg 100 nM phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) aan elk putje en cultuur voor 3 dagen voor het opwekken van differentiatie van THP-1 monocyten in macrofaag-achtige cellen.

2. cultuur en voorbereiding van de J774.2 Macrophage cellijn

  1. Cultuur J774.2 cellen in T25 kolven op 37 ° C + 5% CO2. Cellen moeten worden gekweekt in 5 mL Dulbecco van bewerkt Eagle Medium (DMEM) + 10% FBS en zodra de cultuur 80-90% confluentie tot gepasseerd. Passage cellen:
    1. Verwijder alle media van de kolf en de opkomst eenmaal met 5 mL PBS.
    2. PBS uit de kolf Verwijder en vervang door 5 mL van de verse DMEM + 10% FBS.
    3. Met behulp van een cel schraper, schraap de onderkant van de kolf op te schorten de cellen in de media. Krachtig Pipetteer de cellen meerdere malen te breken van elke cel aggregaten.
    4. Verdun cellen 1:5 door verwijderen van 4 mL van de celsuspensie van de kolf en te vervangen met 4 mL verse media. De resterende celsuspensie kan worden genegeerd, gebruikt voor het starten van een nieuwe cultuur van de cel in een verse T25 kolf of gebruikt voor een experiment.
  2. Instellen voor een efferocytosis assay cuvetten van J774.2:
    1. Een dag vóór de aanvang van het experiment, schorten J774.2 cellen in 5 mL verse media, volgens stappen 2.1.1–2.1.3. Met behulp van een hemocytometer cellen tellen en voorbereiding van de noodzakelijke hoeveelheid cellen bij een concentratie van 5 x 104 cellen/mL.
    2. Het benodigde aantal 18 mm ronde glazen coverslips (#1.5 dikte) plaats in de putjes van de plaat van een 12-well. Nou in elk aliquot 1 mL van de 5 x 104 cellen/mL celsuspensie.
    3. Cultuur overnachting zodat de cellen zich houden aan het dekglaasje aan en herstellen van passaging.

3. cultuur van de primaire mens M2 macrofagen

  1. Het verzamelen van 10 mL EDTA bloed voor elke 12-well plaat van M2 macrofagen vereist.
  2. Laag in een centrifugebuis 15 mL, 5 mL bloed op de top van 5 mL voorverwarmde Lympholyte-poly cel scheiding voedingsbodem. Bereiden van meerdere buizen als verwerking > 5 mL bloed in plaats van met behulp van grotere volume buizen.
  3. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 35 minuten, met gemiddelde versnelling en geen pauze.
  4. Verwijder voorzichtig de bovenste mononucleaire cellen rijke band met behulp van een plastic pipet en overdracht aan een tube van 50 mL centrifuge. Als meerdere buizen werden voorbereid in stap 3.2, kunnen de bands worden samengevoegd in een enkele 50 mL-buis. Volume van de buis te brengen tot 50 mL met PBS.
  5. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 8 minuten en verwijder de bovendrijvende substantie. Tijdens deze stap gesteriliseerde met autoclaaf 18 mm diameter circulaire coverslips (#1.5 dikte) in elk putje van de plaat van een 12-well te plaatsen.
  6. Resuspendeer de pellet cel in 300 µL van de serum-vrije RPMI 1640 per gewenste aantal putten; bijvoorbeeld als 10 mL bloed werd verwerkt ter voorbereiding van een volledige 12 goed plaat, schorten cel pellet in 3,6 mL media.
  7. Voeg 300 µL van de celsuspensie naar elke dekglaasje aan-bevattende goed in de 12-well-plaat. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C + 5% CO2.
  8. Voorzichtig wassen dekglaasje aan 3 x met 1 mL verwarmde PBS niet-aanhanger cellen verwijderen.
  9. Voeg vervolgens 1 mL van RPMI 1640 + 10% FBS + 10 ng/mL recombinante menselijke M-CSF + cel cultuur antibioticum/antimycotic. Incubeer bij 37 ° C + 5% CO2 gedurende 5 dagen.
  10. Media vervangen door RPMI 1640 + 10% FBS + 10 ng/mL recombinante menselijke M-CSF + 10 ng/mL recombinante menselijke IL-4 + cel cultuur antibioticum/antimycotic. Incubeer bij 37 ° C + 5% CO2 voor 2 dagen in beslag M2 polarisatie.
  11. Gepolariseerde macrofagen moeten worden gebruikt binnen de komende 3 dagen.

4. bereiding van Jurkat van Apoptotic cellen

  1. Cultuur van de Jurkat cellen in 5 mL RPMI 1640 + 10% FBS bij 37 ° C + 5% CO2. Jurkats zijn een cellijn van schorsing en kan worden gehandhaafd door passaging van 1:5 in verse, voorverwarmde media elke 3-5 dagen.
  2. Ter voorbereiding van apoptotic cellen, kunt u de Jurkat-cultuur te groeien met hoge dichtheid (4 – 5 dagen na de passaging). Aliquot 1,5 mL in een 1,5 mL microcentrifuge buis en pellet cellen door centrifugeren bij 500 x g gedurende 5 min.
  3. Verwijder supernatant en resuspendeer cel pellet in 1 mL serumvrij RPMI 1640 medium dat 1 µM staurosporine.
  4. Incubeer 16 h bij 37 ° C + 5% CO2 te renderen van apoptotic cellen.
  5. Indien gewenst, inductie van apoptosis bevestigen door kleuring met Annexine V:
    1. Aliquot 100 µL Jurkat celkweek staurosporine-behandeld in een tube van 1,5 mL microcentrifuge. Pellet cellen door centrifugeren bij 500 x g gedurende 5 min, verwijder supernatant en resuspendeer de pellet cel in 100 µL van serumvrij RPMI 1640 medium.
    2. Voeg 1 µL van fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-geconjugeerd Annexine V en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
    3. Voeg 900 µL van PBS en overdracht van het gehele volume aan een enkel putje van een 12-well-plaat met een dekglaasje aan van 18 mm, circulaire glas (#1.5 dikte). Spin naar beneden in een centrifuge uitgerust met een adapter plaat bij 200 x g gedurende 1 minuut te dwingen cellen zich te houden aan het dekglaasje aan. U kunt ook kunnen cellen worden geplaatst in een chambered dia voor imaging.
    4. Beeld met behulp van een fluorescentie Microscoop.

5. kwantificeren van de opname van de Efferocytic en dynamiek met behulp van een vaste cel Efferocytosis Assay en binnenstebuiten kleuring

  1. THP-1, J774.2 of M2 menselijke macrofagen bereiden zoals beschreven in de secties 1-3, respectievelijk.
  2. De avond vóór de aanvang van het experiment bereiden apoptotic cellen van de Jurkat zoals beschreven in sectie 4.
  3. Onmiddellijk voorafgaand aan het experiment, apoptotic cellen met behulp van een hemocytometer te tellen. Breng voldoende aantallen apoptotic cellen in een tube van 1,5 mL microcentrifuge – we meestal toevoegen 5 x 10,5 cellen/well, bieden een doel: efferocyte verhouding van 10:1.
  4. Pellet Jurkat cellen door centrifugeren bij 500 x g gedurende 5 min en resuspendeer in 500 μL van PBS.
  5. Tijdens het centrifugeren, aliquoot 10 µL van DMSO in een nieuwe 1,5 mL microcentrifuge buis. Los in de DMSO een minimale hoeveelheid N-hydroxysuccinimidobiotin (NHS-Biotine). 5-10 kristallen (~0.005 mg) is voldoende.
  6. Breng de 500 μL apoptotic cellen/PBS de DMSO/NHS-Biotine met buis. Dan Verdun een cel bijhouden van kleurstof bij de aanbevolen concentratie van de fabrikant in de apoptotic celsuspensie. Zorg ervoor om te selecteren van een cel bijhouden kleurstof die niet overlapt spectraal met FITC-streptavidine (bijvoorbeeld rood of far-red cel bijhouden kleurstof).
  7. Incubeer schorsing gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Voeg een gelijk volume RPMI 1640 + 10% FBS en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in het donker om quench elke spoorverontreiniging kleurstof.
  8. Pellet cellen door centrifugeren bij 500 x g gedurende 5 min, verwijder supernatant en resuspendeer de gebeitst apoptotic cellen in 100 µL RPMI 1640 + 10% FBS per putje van macrofagen.
  9. Voeg 100 µL celsuspensie van gebeitst apoptotic ontkleuring aan elk putje van de macrofagen. Centrifugeer 200 x g gedurende 1 min. in een centrifuge uitgerust met een adapter plaat te dwingen contact tussen macrofagen en apoptotic cellen.
  10. Incubeer plaat voor de gewenste periode op 37 ° C + 5% CO2 in een incubator weefselkweek. Voor macrofagen, efferocytosed materiaal is meestal eerste detecteerbare na 20-30 min, en na 120-180 min is voltooid.
  11. Op het gewenste tijdstip wordt in punt cellen verwijderen uit de incubator. Wassen cellen tweemaal met 1 mL van de kamertemperatuur PBS te stoppen efferocytosis en niet-efferocytosed apoptotic cellen verwijderen.
  12. Voeg FITC-geconjugeerd streptavidine bij een verdunning 1:1,000 aan elk putje en incubeer gedurende 20 min in het donker. Dit zal het label van de blootgestelde Biotine op niet-efferocytosed apoptotic cel materiaal.
    Opmerking: Indien gewenst, celkernen kunnen worden gekleurd tijdens deze stap door toevoeging van 1:20,000 verdunning van Hoechst 33342 of 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI).
  13. Wassen cellen 3 keer met 1 mL PBS, zachtjes schudden of het schommelen van de monsters voor 5 min per spoeling. Fix cellen met 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Spoel de cellen een keer met PBS te verwijderen overtollige PFA.
  14. Mount coverslips op een dia voor beeldbewerking en overdracht aan een fluorescentie Microscoop. Z-stacks van een voldoende aantal cellen voor nauwkeurige kwantificering vangen — meestal 10 – 30 cellen per voorwaarde. Non-geïnternaliseerd apoptotic cel materiaal zal blijken in de resulterende afbeelding als cel kleurstof label materiaal gehuld door FITC-streptavidine kleuring, terwijl efferocytosed materiaal vormt een aparte cel bijhouden kleurstof puncta gratis een streptavidine bijhouden kleuring.
  15. Kwantificeren van efferocytosis in de resulterende afbeeldingen via een verscheidenheid van maatregelen:
    1. Berekening van de efferocytic-index door bepaling van het gemiddelde aantal discrete efferosomes (cel bijhouden kleurstof+/streptavidin- puncta) per macrofaag. Alleen de macrofagen ≥1 zichtbaar efferosomes die geheel of gebonden aan een apoptotic cellen te kwantificeren. Record macrofagen gebonden aan een apoptotic cellen, maar ontbreekt discrete efferosomes, als een efferocytic-index van 0.
    2. Berekenen efferocytic-efficiëntie door het meten van de Fractie van de macrofagen die ≥1 efferosome bevatten.
    3. Bereken het percentage van efferocytosis door imaging cellen vast en gekleurd op meerdere tijdstippen. Enige afbeelding macrofagen verbonden met apoptotic cellen, of van elke cel waarin zichtbaar efferosomes, met z-stacks gevangen. Zodra de image is gemaakt, bepaalt het tarief van efferocytosis:
      1. Met behulp van de kleuring van de daar als een gids, en het gereedschap freehand of veelhoek in FIJI/ImageJ26 (of andere afbeelding analyse softwarepakket), alle van de cel voor het bijhouden van kleurstof+/streptavidin- (bijvoorbeeld geïnternaliseerd) cirkel materiaal in een enkel vliegtuig van de z-stack. Het meten van de geïntegreerde intensiteit van de cel voor het bijhouden van kleurstof deze regio. Individuele maatregelen voor elke efferosome (bijv . diameter, positionering ten opzichte van de rand van een cel of nucleus, etc.)15,27 kunnen gemakkelijk worden verworven gelijktijdig met deze metingen, sterk verhoging van de gegevens verzameld tijdens de analyse.
      2. Op dezelfde z-sectie, alle van de cel kleurstof+/streptavidin+ (bijvoorbeeld niet-geïnternaliseerd) bijhouden met behulp van de streptavidine als een gids en het gereedschap freehand of veelhoek kleuring cirkel materiaal in een enkel vliegtuig van de z-stack . Alleen omvatten kleuring van apoptotic cellen in contact met de fagocytensysteem. Het meten van de geïntegreerde intensiteit van deze regio.
      3. Herhaal stap 4.2.3.1 aan 4.2.3.2 voor de resterende z-delen van de afbeelding. Som van de geïntegreerde intensiteit van de efferocytosed (ΣEVF) en niet-efferocytosed (Σne) materialen. De Fractie van de apoptotic-cel die is geweest efferocytosed kan worden berekend voor de cel als:
        Equation
      4. De Fractie efferocytosed voor alle cellen op alle tijdstippen te kwantificeren. Merk op dat de fluorescerende intensiteit van apoptotic cellen/efferosomes kan variëren tussen beelden als gevolg van de variaties in de opname van cel kleurstoffen tracking door individuele apoptotic cellen, en als gevolg van veranderingen in de afbeelding overname parameters zoals belichtingstijd. Als zodanig enige vergelijk genormaliseerde waarden zoals de Fractie Efferocytosed of intensiteit-onafhankelijke waarden zoals efferocytic index en efficiëntie van de efferocytic, tussen beelden, tussen experimentele omstandigheden, en tussen herhalen experimenten.
    4. Om ervoor te zorgen dat de resulterende dataset komt nauwkeurig overeen met de variatie in efferocytosis tussen cellen, voeren deze analyses op het maximum aantal cellen mogelijk in elk experiment.
      Opmerking: Efferocytic-efficiëntie en de efferocytic-index kan snel worden berekend (een paar seconden/cel), en meestal willen we analyseren van ten minste 100 cellen per experiment, elk experiment ten minste 3 keer herhalen. Berekening van de Fractie van efferocytosed materiaal, en efferosome-specifieke maatregelen zijn meer moeizaam, nemen meestal 2-3 min/cel voor een ervaren analist. Voor deze berekeningen kwantificeren we een minimum van 15 cellen per voorwaarde per experiment.
    5. Record efferocytic index, breuk efferocytosed en individuele efferosome gegevens op basis van de per-cel.
      Opmerking: Dit zorgt voor data-analyse met behulp van eencellige benaderingen, waardoor Inter cel variaties worden gekwantificeerd. Populatieniveau analyses kunnen nog steeds worden uitgevoerd op deze datasets door gemiddeld eencellige gegevens verworven in persoonlijke experimenten. Efferosome-specifieke metingen kunnen worden geanalyseerd op het bevolkingsniveau, eencellige niveau, en als ensembles (bijvoorbeeld als de bevolking van efferosomes onafhankelijk van de cellen met hen)15.

6. levende cel Efferocytosis Assay met behulp van Apoptotic cellen

  1. THP-1, J774.2 of M2 macrofagen bereiden zoals beschreven in stappen 1-3, respectievelijk. Indien nodig, de cellen moeten zijn transfected met transgenen of andere genetische construeert ten minste 18 h voordat u alle experimenten uitvoert.
  2. De avond vóór de aanvang van het experiment, bereiden apoptotic cellen van de Jurkat als beschreven in afdelingen 4 en 5 met de volgende wijzigingen:
    1. Verdun cellen en induceren van apoptose per 4.1-4.3, en verzamelen van het vereiste aantal apoptotic cellen per 5.3-5.4.
    2. Een cel bijhouden kleurstof bij de aanbevolen concentratie van de fabrikant van de celsuspensie apoptotic toevoegen. Incubeer schorsing gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Voeg een gelijk volume RPMI 1640 + 10% FBS en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in het donker om quench elke spoorverontreiniging kleurstof. Voeg geen NHS-Biotine voor deze experimenten.
    3. Pellet cellen door centrifugeren bij 500 x g gedurende 5 min, verwijder supernatant en resuspendeer gebeitst apoptotic cellen in 100 µL RPMI 1640 + 10% FBS per putje van macrofagen.
  3. Indien nodig, label de macrofagen door verwijderen van voedingsbodems van elk putje en het toevoegen van 500 µL van PBS met de fabrikanten Aanbevolen verdunning van een cel bijhouden kleurstof die niet spectraal overlapt met de cel bijhouden kleurstof toegevoegd aan de apoptotic cellen of een fluorescerende transgenen uitgedrukt door de macrofagen. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker, dan Voeg een gelijk volume DMEM + 10% FBS en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in het donker om quench elke spoorverontreiniging kleurstof.
  4. De macrofaag-bevattende dekglaasje aan overbrengen in een kamer Leiden. Voeg 400 µL van DMEM + 10% FBS, gevolgd door 100 µL celsuspensie van de gelabelde apoptotic. Meng door zachtjes pipetteren media 2-3 keer.
  5. De kamer Leiden overbrengen in een verwarmde en CO2-geperfundeerd kamer van een levende cel fluorescente microscoop.
    Opmerking: Voor Microscoop opstellingen die ontbreken van CO2 perfusie mogelijkheden, gebruik weefsel kweekmedium gebufferd met 1 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic zuur (HEPES) in plaats van natriumbicarbonaat om fysiologische pH terwijl de cultuur is blootgesteld aan lucht.
  6. Vastleggen van een time-lapse serie met de afbeelding van een wit licht (fase contrast of DIC) en beelden van alle fluorescerende etiketten:
    1. Gebruik een 100 X-objectief voor experimenten waar oplossen van fijne details is vereist (bijvoorbeeld membraan dynamiek van fagocytensysteem-apoptotic cel interacties). Ondertussen, meer algemene maatregelen (tarief van apoptotic cellen opname, tijd van de interactie tussen de macrofagen en de apoptotic cellen, etc.) zijn beste beeld met behulp van een 60 X of 63 X doelstelling.
    2. Indien beschikbaar, gebruik punt-een bezoek aan het beeld van meerdere velden-of-view tijdens een enkele verwerving, waardoor het aantal efferocytic-gebeurtenissen vastgelegd in een enkele experiment
    3. Omdat efferocytes vaak kleine fragmenten van apoptotic cellen, in plaats van onbeschadigde cellen verzwelgen, is het beter om te vangen z-stacks. Vangen om te minimaliseren fototoxiciteit, z-delen gescheiden door de focal diepte van uw doelstelling microscopen (meestal 0.5 – 1.0 µm), door de dikte van de cel (meestal 8-10 µm voor macrofagen, bijvoorbeeld 8 – 20 segmenten/cel). Dit zorgt ervoor dat alle engulfment en mensenhandel gebeurtenissen zichtbaar zijn in ten minste één z-vlak zullen. Anderzijds gebruiken grote (1-5 µm diameter) apoptotic cel nabootsers of apoptotic cellen die minimale fragmentatie tijdens efferocytosis ondergaan (bijvoorbeeld warmte geschokt neutrofielen) in plaats daarvan zonder z-stapelen. Wij hebben de voorbereiding van zowel de Nabootsers en de apoptotic neutrofielen beschreven eerder28.
    4. Gebruik helder fluorophores en vangen te minimaliseren photobleaching beelden met overname-instellingen die photobleaching minimaliseren — bijvoorbeeld lage-intensiteit excitatie gecombineerd met hoge camera winst en kortstondige blootstelling tijden29. Wij raden met behulp van een microscoop voorzien van een hoog-gevoeligheids elektromagnetische charge - coupled apparaat (EM-CCD) camera of spinnen-schijf confocale en een high-speed piëzo-elektrische mechanische stadium, voor deze vorm van beeldvorming.
  7. Het aantal mogelijke analysemethoden die kunnen worden toegepast op deze time-lapse video's is uitgebreid en buiten ons vermogen om de recensie hier. Als enkele voorbeelden, gebruik handmatige of automatische tracking software te volgen de kernfusie, kernsplijting en verkeer van efferosomes binnen cellen15, kwantificeren efferosome fusion dynamiek met endolysosomes door colocalization analyse in macrofagen uitdrukken compartiment-specifieke fluorescerende transgenen13, monitor opname processen zoals indringende en cup vorming30, bepalen de dynamiek van de werving van signalering en eiwitten voor de efferosome13, mensenhandel en/of de afbraakroutes activiteit van efferosomes met behulp van apoptotic cellen aangeduid met pH-gevoelige, oxidant-gevoelige en protease-geactiveerde fluorophores31te kwantificeren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

'S nachts cultuur van Jurkat cellen met 1 µM staurosporine resultaten in apoptosis van > 95% van de cellen, die kunnen worden bevestigd met Annexine V kleuring (Figuur 1). Andere celtypes kunnen worden gebruikt voor deze experimenten, hoewel de concentratie van staurosporine en de duur van de behandeling van de staurosporine zal moeten worden geoptimaliseerd voor elke regel van de cel. Voor betrouwbare detectie en kwantificering van efferocytosis, > 80% van de cellen moet apoptotic voorafgaand aan deze toe te voegen aan de efferocytes. Andere inductoren van apoptosis (bijvoorbeeld warmte-schok, etoposide en UV-licht) kunnen ook worden gebruikt, maar in onze ervaring, deze produceren een meer heterogene inductie van apoptosis en resultaat in gemengde cel populaties met apoptotic, secundaire necrotische en niet-apoptotic doelcellen.

Voor vaste-cel beeldbewerking met binnenstebuiten kleuring, moeten nauw apposed efferocyte-apoptotic cel interacties worden waargenomen op alle tijdstippen, met duidelijk afgebakende niet-efferocytosed (streptavidine+distributiedatum bijhouden kleurstof+) en efferocytosed (streptavidine-distributiedatum bijhouden+) materialen zichtbaar (Figuur 2). Het is belangrijk op te merken dat de synaps die tussen de efferocyte en de apoptotic cellen vormt is vaak strak genoeg om uit te sluiten daar, en aldus een cel bijhouden kleurstof gekleurd object gezien daar op elk gewenst moment op de omtrek moet worden beschouwd als een afhankelijke cel en niet een efferosome. In de meeste experimenten zal de breuk van apoptotic cellen die efferocytosed zijn toenemen in een tijd-afhankelijke manier, totdat er geen niet-geïnternaliseerd apoptotic cel materialen blijven, of totdat de fagocytensysteem bereikt zijn maximale efferocytic capaciteit (figuur 3). analyse wordt meestal uitgevoerd en opgenomen voor afzonderlijke cellen (figuur 3A), echter de gegevens kan worden gemiddeld over cellen binnen individuele experimenten en de gemiddelde waarden uit meerdere experimentele herhalingen geanalyseerd met conventionele statistische methoden (figuur 3B). Wijzigingen van dit gestandaardiseerde protocol kunnen worden aangebracht dat voor het gebruik van primaire celtypes, alternatieve efferocytic doelstellingen, en voor extra vlekken om te worden opgenomen. Figuur 4 geeft bijvoorbeeld een primaire M2-gepolariseerde menselijke macrofaag met efferocytosed apoptotic cel nabootsers bestond uit 3 µm diameter silica kralen gecoat in een mengsel van fosfatidylserine en dunlaag28, gevolgd door latere fixatie, permeabilization en immunokleuring voor de recycling endosome markering Rab17.

Tijdens de levende cel imaging efferocytic professionele fagocyten zal worden waargenomen uit te breiden en intrekken van kleine processen in een proces genoemd "sonderen"30 (Figuur 5, t = 0); Wanneer deze processen een target tegenkomen ze stevig vasthouden aan het doel en het vestigen van de fagocytensysteem. Deze indringende activiteit kan niet worden waargenomen met niet-professionele fagocyten zoals epitheliale cellen. De efferocyte zal dan een strakke vormen "efferocytic SYNAPS"32 tussen zichzelf en de apoptotic cel, met deze synapse vaak onder omslag steken van een groot deel van de apoptotic cel (Figuur 5, t = 10). De efferocyte zal dan stukken van de apoptotic cel trekken van deze synapsen in haar cytosol (Figuur 5, 10-30 min). Kort na hun vorming, worden deze ontluikende efferosomes uit de buurt van de synaps en peri-nucleair gebied, een resultaat van Rab7/RILP/dynein-dynactin gemedieerde vervoer33verhandeld. Na verloop van tijd de efferosomes zal krimpen en de resulterende aangetaste materialen herverdeeld in de cel, waar ze waarschijnlijk zijn geabsorbeerd of gerecycleerd13,15. De mogelijkheid om op te sporen van deze processen is sterk afhankelijk van de overname-framesnelheid en de duur van het experiment. Snelle processen zoals het sonderen kunnen niet worden waargenomen op lagere framesnelheid, terwijl langzaam gebeurtenissen (efferosome handel en absorptie) imaging langere vereisen — in beide gevallen vereisen deze grote afbeelding overnames vaak de verovering van lage-intensiteit beelden te beperken photobleaching en fototoxiciteit (Figuur 5). Net als bij de vaste-cel assay, kan de live-cel-versie van deze bepaling worden gewijzigd aan de behoeften van de onderzoeker. Figuur 6 toont een enkel frame van een levende cel verwerving van J774.2 macrofagen uiting van transgenen die demark fluorescently het plasma-membraan (PM-GFP) en die bindt selectief de signalering lipide PI (3) P (FYVE-RFP). Generatie van PI (3) P op het efferosome-membraan kan worden gedetecteerd als co lokalisatie van FYVE-RFP met de PM-GFP+ efferosome membraan. Door het kwantificeren van de intensiteit van de FYVE-RFP op de efferosome, de dynamiek van de PI (3) P signalering op het efferosome kunnen worden gekwantificeerd (Figuur 6).

Figure 1
Figuur 1: Annexine V kleuring van Apoptotic en Jurkat voor niet - Apoptotic cellen. Annexine V etiketten de fosfatidylserine "eten-me" signaal blootgesteld door apoptotic cellen. (Boven) Onbehandelde (UT) Jurkat cellen weer een gezonde (vloeiend en afgerond) morfologie (DIC) en doen geen vlekken met Annexine V. (onder) Jurkat cellen gekweekt 's nachts met 1 µM staurosporine (STS) nemen op een apoptotic morfologie (onregelmatig en blebbed) en vlek met Annexin V. schaal bar = 10 µm, intensiteit van de afbeelding wordt weergegeven als een kleurplan. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: vroege en Late Engulfment van Jurkat van Apoptotic cellen door Macrophages J774.2. Beelden zijn van macrofagen op een vroege (60 min) en de late (120 min) stadium van efferocytosis. Wit-licht (DIC) afbeelding illustreert de strakke interface tussen de macrofaag (mφ) en de apoptotic cellen (AC). Cel bijhouden kleurstof (CTD, rode) toont de locatie van alle apoptotic cellen afkomstige materialen. FITC-streptavidine kleuring (Str, groene) geeft het gedeelte van de apoptotic cel die nog niet zijn overspoeld door de macrofaag. Macrophage kernen waren vooraf gekleurd met DAPI (blauw). Efferosomes (rood) ten opzichte van de niet-geïnternaliseerd gedeelte van de apoptotic cel (groen/geel) worden in een overlay van de streptavidine en de cel bijhouden kleurstof beelden gemakkelijk geïdentificeerd. Opmerking het ontbreken van kleuring op de macrofaag-apoptotic cel-interface op de vroege timepoint, gemaakt door de uitsluiting van daar uit de synaps strak gevormde efferocytic (*) daar. De macrofaag kern wordt aangeduid met Hoechst kleuring (blauw). Schaal bar = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: tijd-gangen van de Fractie van Apoptotic cel Efferocytosed door J774.2 macrofagen. Efferocytosis tests werden uitgevoerd voor de aangegeven tijden, en de Fractie van overspoeld apoptotic cel materiaal bepaald op elk punt van de tijd met behulp van cel bijhouden kleurstof/Streptavadin kleuring. (A) breuk van efferocytosed materialen binnen individuele macrofagen, gegevens van afzonderlijke cellen wordt gepresenteerd, horizontale balk geeft aan het gemiddelde. 12 – 17 cellen per voorwaarde, gegevens uit 1 van de 5 onafhankelijke experimenten. (B) breuk van efferocytosed materialen, gemiddeld over 5 onafhankelijke experimenten, ten minste 10 cellen/conditie/herhalen. p < 0.05 in vergelijking met 30 min, Kruskal-Wallis test met Dunn correctie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: analyse van Rab17 werving ter Efferosomes in primaire menselijke macrofagen. Een M2-gepolariseerde macrofaag overspoelde apoptotic cel nabootsers (pijlen) en was immunostained voor Rab17 (groen) 60 min na engulfment. Schaal bar = 5 µm. celkern is gekleurd met Hoeschst, DIC afbeelding toont de morfologie van de cel en wordt gebruikt voor het identificeren van apoptotic cellen nabootsers. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: levende cel efferocytosis assay. Een cel bijhouden kleurstof labeledJ774.2 macrofaag (mφ, groene) werd opgenomen als het overspoelde een apoptotic Jurkat cel aangeduid met een cel van de andere kleur kleurstof (AC, rode) bijhouden. De apoptotic cellen is onderverdeeld in meerdere fragmenten tijdens het proces van internalisatie, resulterend in versnipperde opname- en de vorming van meerdere efferosomes (pijlen). Schaal bar = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: met behulp van fluorescerende transgenen te onderzoeken Efferocytic signalering. Een J774.2 macrofaag was transfected met een plasmamembraan GFP-gelabeld marker (PM, groen) en FYVE-RFP constructie, die bindt de signalering lipide PI (3) P (rood). Efferocytosis vormt een ontluikende plasmamembraan afkomstige efferosome waarin PI (3) P, ontdekt door FYVE-RFP indienstneming (pijl). De dynamiek van de PI (3) P signalering werd gekwantificeerd als intensiteit ten opzichte van het FYVE-RFP signaal aanwezig is op het punt van efferosome sluiting vouwen (t = 0, grafiek). Dit experiment gebruikt een apoptotic cel nabootsen kraal (pijl, DIC) in plaats van apoptotic cellen. Schaal bar = 5 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De methoden die worden beschreven in dit protocol inschakelen beeldvorming en kwantificering van het proces van dynamische efferocytic, met behulp van zowel vaste-cel en live-cel benaderingen. Deze benaderingen bieden verscheidene voordelen over algemeen werknemer stroom cytometry gebaseerde methoden23,24. Het gebruik van binnenstebuiten kleuring met vaste monsters biedt een meer robuuste en nauwkeurige kwantificering van het tarief en de omvang van efferocytosis-inderdaad, veel stroom cytometry gebaseerde methoden gewoon label apoptotic cellen en macrofagen met verschillende fluorophores, en Score efferocytosis als de breuk van de macrofagen mede kleuring met de apoptotic cel markering, dus ontbreekt de mogelijkheid om te differentiëren tussen gebonden versus verinnerlijkte apoptotic cel materiaal. Alternatieve stroom cytometry benaderingen omvatten die gebruik maken van het label van apoptotic cellen24pHrodo. pHrodo, is een pH-gevoelige fluorophore die in helderheid bij zure pH oploopt. Terwijl deze fluorophore betere resolutie tussen niet biedt-geïnternaliseerd versus verinnerlijkte materialen, als de verhogingen van de fluorescentie name na internalisering van de apoptotic cel en verzuring van de efferosome, kunnen de resultaten verward door ziekteprocessen die afbreuk doen aan efferosome verzuring34,35, en deze methode zal het missen van efferosomes in de vroege stadia van de (pre verzuring) van efferocytosis36, gelegen in verzuring-arme regio's van de cel27, of in de cellen die zwak breng hun lysosomen37. Een tweede voordeel van de in dit protocol beschreven methode is het gebruik van live-cel imaging voor het meten van de dynamiek van efferocytosis, als processen zoals het indringende, de vorming van de synaps efferocytic, en de intracellulaire handel in efferosomes kan niet worden gedetecteerd met behulp van stroom cytometry gebaseerde benaderingen.

Hoewel deze methode veel voordelen biedt, experimenten waarbij de kwantificering van vele honderden cellen — bijvoorbeeld experimenten opsporen van zeldzame gebeurtenissen, of zeer variabel processen te kwantificeren — kunnen moeilijk, met analyse van deze grote datasets het nemen van een buitensporige hoeveelheid tijd. High-throughput imaging benaderingen zoals imaging stroom cytometry38 kunnen toestemming geven voor hogere doorvoersnelheid dan conventionele microscopie, hoewel in onze huidige geautomatiseerde afbeelding ervaring analyse programma's niet altijd geschikt zijn voor nauwkeurig segmenteren niet-geïnternaliseerd versus verinnerlijkte materialen. Met name de strakke efferocytic SYNAPS die tussen de apoptotic cellen en efferocyte vormt kunt uitsluiten daar kleuring, en als zodanig een afhankelijke apoptotic cel wordt vaak weergegeven als een vaste massa in de cel bijhouden kleurstof kanaal, dat gedeeltelijk is omgeven door daar kleuring (Figuur 2). Dus, terwijl efferosomes zijn algoritmisch gemakkelijk geïdentificeerd, het afhankelijke deel van de apoptotic cellen is vaak onrechte als een efferosome als gevolg van de moeilijkheid van de boekhouding voor de gedeeltelijke streptavidine kleuring. We hebben nog een programma dat nauwkeurig kan identificeren en kwantificeren van de versnipperde opname van apoptotic cellen zonder menselijke hulp te vinden, hebben we gevonden dat trainbaar semi-geautomatiseerde systemen39 kan aanzienlijk versnellen analyse, vermindering van de Fractie efferocytosed metingen van 2-3 min naar < 60 s per cel. Als alternatief, de Nabootsers van de niet-verteerbare apoptotic cellen of celtypes die minimaal fragment op apoptosis, kan in plaats daarvan worden gebruikt. Dit vereenvoudigt de detectie zodat één, grotere structuren, die wellicht meer vatbaar voor geautomatiseerde benaderingen en kan elimineren de behoefte van de z-stapelen. Zelfs met deze vooruitgang, de verwerving en analyse snelheid van deze methode blijft beperkt, en als zodanig stroom cytometry blijft de meest haalbare methode wanneer analyses van grote cel nummers is vereist23.

Hoewel wij deze methode met behulp van cel-lijn en primaire menselijke macrofagen als efferocytes en de apoptotic Jurkat cellen (een lijn van de T-cel) als doelen hebben beschreven, kan deze methode worden toegepast op elke efferocytic cel type of apoptotic cel target. Soortgelijke benaderingen zijn inderdaad, gebruikt om efferocytosis in de hepatocyten en epitheliale cellen9,40,41, en de efferocytosis van klinisch relevante doelen zoals tumor cellen42te onderzoeken. Wellicht tot wijziging van dit protocol bij gebruik van niet-immune efferocytes, of wanneer specifieke efferocytic gebeurtenissen te modelleren. Bijvoorbeeld, Jurkat cellen zijn niet-aanhanger en daarom zijn waarschijnlijk niet volledig recapituleren de mechanische krachten en ruimtelijke beperkingen efferocytes tegenkomen wanneer de interactie met aanhangend apoptotic cellen of apoptotic cellen binnen vaste weefsels. Veel celtypen hechting zal handhaven tijdens apoptosis en daarom kunnen worden gebruikt als aanhangend doelen; HeLa cellen ondergaan als een voorbeeld, reproducibly staurosporine-veroorzaakte apoptosis, fosfatidylserine versluiering, en blebbing gedurende een periode van 4 – 6 h terwijl het handhaven van de hechting van de cel lichaam43. Cellen gesuspendeerd in een collageen matrix of stamcel afkomstige organoids44 mogelijk potentiële modellen voor de studie van efferocytosis in stevige weefsels, hoewel we niet op de hoogte van alle studies die deze benaderingen hebben gebruikt. Voor sommige modellen immune cellen zoals de cellen van de Jurkat en neutrofielen mag niet worden gebruikt als apoptotic doelen, zoals deze cellen cytokine gebaseerde vrijkomen kunnen "vinden-me" signalen zoals CX3CL1 die wellicht een storende factor in modellen waar inflammatoire of trekkende processen zijn onderzochte45. Dus, terwijl de veelzijdigheid van deze bepaling kan worden gebruikt om te verkennen van efferocytosis in een heel scala van celtypes en modelsystemen voorziet, moet worden gezorgd om te selecteren van passende efferocytes, target cellen en kweekomstandigheden beste model de fysiologische onderzochte verwerken.

De analysemethoden die in dit protocol worden beschreven zijn alleen bedoeld als een startpunt, met de beeldvorming gebaseerde aard van deze experimenten waardoor een breed scala aan analyses. Bijvoorbeeld, efferosome positionering en diameter metingen kunnen worden verzameld bij het uitvoeren van de Fractie efferocytosed metingen of gemeten in live-cel tijd-cursussen, om te onderzoeken van processen zoals de intracellulaire mensenhandel efferosomes en het tarief van apoptotic cellen afbraak13,15. Immunokleuring (Figuur 4) kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de aanwerving van eiwitten aan efferosomes, terwijl live-cel imaging gecombineerd met morfologische analyse kan worden gebruikt om processen te kwantificeren dergelijke bindende werkzaamheid en de tarieven van engulfment30 , 46. we presteren vaak deze testen in macrofagen uiting van fluorescerende transgenen dat verslag signalering van de activering van het molecuul of de activiteit van cellulaire gebeurtenissen tijdens efferocytosis (Figuur 6). Deze verslaggevers bieden de mogelijkheid bewaken signalering processen tijdens efferocytosis; bijvoorbeeld, zijn wij gewend fluorescently-tagged Rab GTPases verkennen van de rol van Rab5, Rab7 en Rab17 in het bemiddelen van verwerking van de efferosome en de daaropvolgende handel in apoptotic cel-afgeleide antigenen13,15. Ook kan de opname van verslaggevers van celdood, efferosome pH, reactieve zuurstof soorten productie en andere cellulaire processen in levende cellen experimenten worden gebruikt voor het onderzoeken van de processen die bemiddelen van de achteruitgang van de efferosomes31 ,47. Een gemeenschappelijke uitdaging in deze experimenten is het identificeren van transgenen of verslaggevers met compatibele fluorophores; vaak, zullen wij de cel bijhouden kleurstof en/of daar naar vrije kanalen voor imaging-andere fluorophores elimineren. Voor sommige experimenten is het gunstig voor de apoptotic cel vervangen door een niet-fragmenteren nabootsen. Dit zorgt voor de kwantificering van signalering van dynamiek en cellulaire processen zonder de complexiteit van de meerdere efferosomes afgeleid van een enkele apoptotic cel bijhouden. Zie Evans et al. voor instructies over de voorbereiding van apoptotic cellen bootst28.

Het meest voorkomende probleem bij het ontwerpen van deze experimenten is het vinden van een combinatie van fluorophores waarmee de gewenste processen worden beeld, terwijl het minimaliseren van photobleaching en fototoxiciteit29. Fluorophore selectie is grotendeels ingegeven door de lasers/excitatie-filters, dichroics/kubussen en filters van de emissie van de Microscoop, en dus de keuze van fluorophores vaak specifiek is voor individuele microscopen. Over het algemeen langere golflengte fluorophores (oranje aan far-red, bijvoorbeeld emissie maxima > 580 nm) zijn minder gevoelig aan photobleaching en deze golflengten zijn minder storend aan cellen. Groene fluorophores (emissie maxima ~ 525 nm) kan worden gebruikt, maar zorg moet worden genomen ter beperking van de fototoxiciteit aan de cellen. Fluorophores die bij golflengten minder dan 480 prikkelen nm (violet en blauw) dient vermeden te worden wegens hun hoge fototoxiciteit en neiging voor deze golflengten excitatie aan andere fluorophores29bleekmiddel. Waar mogelijk, moeten hoge-helderheid en een stabiel fluorophores worden geselecteerd. Ook de afbeelding overname parameters moeten worden aangepast om te minimaliseren photobleaching en fototoxiciteit — bijvoorbeeld langere blootstelling bij lage excitatie-intensiteit zijn voorkeur over hogere excitatie-intensiteit48. De toevoeging van anti-oxidanten zoals rutine en verwijdering van sommige media-onderdelen kunnen verbeteren van beide fotostabiliteit en verminderen van fototoxiciteit49. Zelfs met een zorgvuldige selectie van fluorophores en imaging voorwaarden vereist de noodzaak te beperken photobleaching vaak de opname van beelden met lage signal-to-noise ratio's (Zie Figuur 5 voor een voorbeeld). Als de intensiteit van de fluorescentie te kwantificeren, moet zorgvuldig worden genomen ter beperking van de beeldverwerking artefacten; raw-beelden zonder enige vorm van verwerking moeten idealiter worden geanalyseerd. Als deconvolving beelden vóór kwantificering, moet een algoritme deconvolutie die fluorescerende intensiteiten bewaart gebruikte50,51.

Levende cel acquisities kunnen bijzonder lastig, met succesvolle experimenten waarbij een zorgvuldige balans tussen excitatie-intensiteit, belichtingstijd, framesnelheid en duur van het experiment. Excitatie-intensiteit en de blootstelling tijd moet minimaliseren fototoxiciteit zoals hierboven beschreven, met het voorbehoud dat langere belichtingstijden kunnen in beweging artefacten als gevolg van beweging van de cel resulteren of het beperken van de framesnelheid van de overname worden aangepast. De framesnelheid kan variëren afhankelijk van de experimentele vereisten. Lagere framesnelheid (5-30 min. tussen frames) toestaan voor beeldvorming over langdurig van tijd (12 h of meer) maar minimale gegevens verschaffen over verschijnselen zoals de dynamiek van de membraan en post-efferocytosis handel in efferosomes. Hoge framesnelheid (zo snel als 1 beeld per seconde) bieden uitstekende temporele resolutie van efferocytic evenementen en efferosome handel — maar zelfs met een zorgvuldige selectie van fluorophores, excitatie-intensiteit en belichtingstijden — photobleaching of fototoxiciteit Beperk meestal deze experimenten tot minder dan een uur duren. In onze ervaring, elke 1-2 min, verwerven van beelden over experimentele perioden van 2 – 6 h, zijn een aanvaardbaar compromis waarmee kwantificeerbare beelden van een voldoende aantal efferocytic gebeurtenissen, met redelijke temporele resolutie.

Gewijzigde en mislukte efferocytosis is bekend worden betrokken in de pathologie van kanker, atherosclerose en meerdere auto-immune aandoeningen, met efferocytosis-targeting therapieën beloven weergegeven: grote klinische7,52, 535554,,. Verdere ontwikkeling op deze gebieden vereist identificatie en karakterisering van de cellulaire processen, receptoren en signaalroutes tot regeling van de efferocytosis. De bepaling in dit protocol gepresenteerd vertegenwoordigt een krachtig hulpmiddel voor deze studies en kan worden aangepast voor het kwantificeren van veel van de processen van het cellulaire en signalering regulering van de efferocytosis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Acknowledgments

Deze studie werd gefinancierd door de Canadese instituten van gezondheid onderzoek (CIHR) operationele subsidie MOP-123419, natuurwetenschappen en Engineering onderzoek Raad van Canada Discovery Grant 418194, en een Ontario ministerie van onderzoek en innovatie vroege Research Award aan BH. DGW bijgedragen enkele van de beelden gepresenteerd, de optimalisatie van de protocollen en het schrijven van het manuscript; Hij werd gefinancierd door een subsidie van de pomp-priming van de Universiteit van Liverpool. CY wordt gefinancierd door een Vanier Graduate beurs en CIHR MD/PhD studententijd. De financieringsinstanties had geen rol in de studie ontwerp, gegevensverzameling en analyse, besloten tot bekendmaking of voorbereiding van het manuscript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Media Wisent 3500-000-EL
DMEM Media Wisent 319-005-CL
Fetal Bovine Serum (FBS) Wisent 080-150
PBS Wisent 311-010-CL
18 mm circular glass coverslips #1.5 thickness Electron Microscopy Sciences 72290-08 Size and shape of coverslip is not critical, but 18 mm fit into the wells of a standard 12-well plate which simplifies cell culture
Staurosporine Cayman Chemical 81590 Dissolve in DMSO at 1 mM (1,000x stock solution)
Annexin V-Alexa 488 ThermoFisher R37174
EZ-Link NHS-Biotin ThermoFisher 20217 Store in a dessicator. Do not prepare a stock solution.
DMSO Sigma-Aldrich D2650
CellTrace FarRed ThermoFisher C34572
CellTrace Orange ThermoFisher C34851
Hoescht 33342 ThermoFisher 62249
FITC-Streptavadin ThermoFisher SA1001
Lympholyte-poly cell sepration medium Cedarlane Labs CL5071
Recombinant Human M-CSF Peprotech 200-04
Recombinant Human IL-4 Peprotech 300-25
J774.2 Macrophage Cell Line Sigma-Aldrich 85011428-1VL
THP-1 Human Monocyte Cell Line ATCC TIB-202
Jurkat T Cell Line ATCC TIB-152

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elmore, S. Apoptosis: A review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
  2. Toda, S., Hanayama, R., Nagata, S. Two-step engulfment of apoptotic cells. Molecular and Cellular Biology. 32 (1), 118-125 (2012).
  3. Ravichandran, K. S. Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: Progress and conundrums. The Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).
  4. Fadok, V. A., Voelker, D. R., Campbell, P. A., Cohen, J. J., Bratton, D. L., Henson, P. M. Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages. Journal of Immunology. 148 (7), 2207-2216 (1992).
  5. Bevers, E. M., Comfurius, P., van Rijn, J. L., Hemker, H. C., Zwaal, R. F. Generation of prothrombin-converting activity and the exposure of phosphatidylserine at the outer surface of platelets. European Journal of Biochemistry. 122 (2), 429-436 (1982).
  6. Callahan, M. K., Williamson, P., Schlegel, R. A. Surface expression of phosphatidylserine on macrophages is required for phagocytosis of apoptotic thymocytes. Cell Death and Differentiation. 7 (7), 645-653 (2000).
  7. Kojima, Y., et al. CD47-blocking antibodies restore phagocytosis and prevent atherosclerosis. Nature. 536, 86-90 (2016).
  8. Seitz, H. M., Camenisch, T. D., Lemke, G., Earp, H. S., Matsushima, G. K. Macrophages and dendritic cells use different Axl/Mertk/Tyro3 receptors in clearance of apoptotic cells. Journal of Immunology. 178, 5635-5642 (2007).
  9. Ichimura, T., Asseldonk, E. J. P. V., Humphreys, B. D., Gunaratnam, L., Duffield, J. S., Bonventre, J. V. Kidney injury molecule-1 is a phosphatidylserine receptor that confers a phagocytic phenotype on epithelial cells. The Journal of Clinical Investigation. 118 (5), 1657-1668 (2008).
  10. Flannagan, R. S., Canton, J., Furuya, W., Glogauer, M., Grinstein, S. The phosphatidylserine receptor TIM4 utilizes integrins as coreceptors to effect phagocytosis. Molecular Biology of the Cell. 25 (9), 1511-1522 (2014).
  11. Park, D., et al. BAI1 is an engulfment receptor for apoptotic cells upstream of the ELMO/Dock180/Rac module. Nature. 450 (7168), 430-434 (2007).
  12. Elliott, M. R., Koster, K. M., Murphy, P. S. Efferocytosis Signaling in the Regulation of Macrophage Inflammatory Responses. Journal of Immunology. 198 (4), 1387-1394 (2017).
  13. Yin, C., Kim, Y., Argintaru, D., Heit, B. Rab17 mediates differential antigen sorting following efferocytosis and phagocytosis. Cell Death & Disease. 7 (12), e2529 (2016).
  14. Kinchen, J. M., et al. A pathway for phagosome maturation during engulfment of apoptotic cells. Nature Cell Biology. 10 (5), 556-566 (2008).
  15. Yin, C., Argintaru, D., Heit, B. Rab17 mediates intermixing of phagocytosed apoptotic cells with recycling endosomes. Small GTPases. 0 (0), 1-9 (2017).
  16. Silva, M. T. Secondary necrosis: The natural outcome of the complete apoptotic program. FEBS letters. 584 (22), 4491-4499 (2010).
  17. Thorp, E. B. Mechanisms of failed apoptotic cell clearance by phagocyte subsets in cardiovascular disease. Apoptosis. 15 (9), 1124-1136 (2010).
  18. Sarantis, H., Grinstein, S. Monitoring phospholipid dynamics during phagocytosis: application of genetically-encoded fluorescent probes. Methods in Cell Biology. 108, 429-444 (2012).
  19. Steinberg, B. E., Grinstein, S. Analysis of macrophage phagocytosis: Quantitative assays of phagosome formation and maturation using high-throughput fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 531, 45-56 (2009).
  20. Wang, J., Hossain, M., Thanabalasuriar, A., Gunzer, M., Meininger, C., Kubes, P. Visualizing the function and fate of neutrophils in sterile injury and repair. Science. 358 (6359), 111-116 (2017).
  21. Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. The Journal of Cell Biology. 169 (1), 139-149 (2005).
  22. Greenlee-Wacker, M. C., Rigby, K. M., Kobayashi, S. D., Porter, A. R., DeLeo, F. R., Nauseef, W. M. Phagocytosis of Staphylococcus aureus by human neutrophils prevents macrophage efferocytosis and induces programmed necrosis. Journal of Immunology. 192 (10), 4709-4717 (2014).
  23. Wootton, D. G., et al. Recovery from pneumonia requires efferocytosis which is impaired in smokers and those with low body mass index and enhanced by statins. Thorax. 71 (11), 1052-1054 (2016).
  24. Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
  25. Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator. Biophysical Journal. 74 (3), 1591-1599 (1998).
  26. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  27. Johnson, D. E., Ostrowski, P., Jaumouillé, V., Grinstein, S. The position of lysosomes within the cell determines their luminal pH. The Journal of Cell Biology. 212 (6), 677-692 (2016).
  28. Evans, A. L., Blackburn, J. W. D., Yin, C., Heit, B. Quantitative efferocytosis assays. Methods in Molecular Biology. 1519, 25-41 (2017).
  29. Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), (2017).
  30. Flannagan, R. S., Harrison, R. E., Yip, C. M., Jaqaman, K., Grinstein, S. Dynamic macrophage "probing" is required for the efficient capture of phagocytic targets. The Journal of Cell Biology. 191 (6), 1205-1218 (2010).
  31. Joshi, G. N., Gilberti, R. M., Knecht, D. A. Single cell analysis of phagocytosis, phagosome maturation, phagolysosomal leakage, and cell death following exposure of macrophages to silica particles. Methods in Molecular Biology. 1519, 55-77 (2017).
  32. Karaji, N., Sattentau, Q. J. Efferocytosis of Pathogen-Infected Cells. Frontiers in Immunology. 8 (DEC), 1863 (1863).
  33. Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. Phagosomes fuse with late endosomes and/or lysosomes by extension of membrane protrusions along microtubules: role of Rab7 and RILP. Molecular and Cellular Biology. 23 (18), 6494-6506 (2003).
  34. Reiners, J. J., Kleinman, M., Kessel, D., Mathieu, P. A., Caruso, J. A. Nonesterified cholesterol content of lysosomes modulates susceptibility to oxidant-induced permeabilization. Free Radical Biology & Medicine. 50 (2), 281-294 (2011).
  35. Boya, P., et al. Lysosomal membrane permeabilization induces cell death in a mitochondrion-dependent fashion. The Journal of Experimental Medicine. 197 (10), 1323-1334 (2003).
  36. Fairn, G. D., Grinstein, S. How nascent phagosomes mature to become phagolysosomes. Trends in Immunology. , 1-9 (2012).
  37. Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages. Molecular Biology of the Cell. 25 (21), 3330-3341 (2014).
  38. Phanse, Y., et al. Analyzing cellular internalization of nanoparticles and bacteria by multi-spectral imaging flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (64), e3884 (2012).
  39. Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 230-233 (2011).
  40. Davies, S. P., Reynolds, G. M., Stamataki, Z. Clearance of apoptotic cells by tissue epithelia: A putative role for hepatocytes in liver efferocytosis. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
  41. Ismail, O. Z., Zhang, X., Bonventre, J. V., Gunaratnam, L. G protein α12(Gα12) is a negative regulator of kidney injury molecule-1-mediated efferocytosis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 310 (7), F607-F620 (2016).
  42. Vaught, D. B., Stanford, J. C., Cook, R. S. Efferocytosis creates a tumor microenvironment supportive of tumor survival and metastasis. Cancer Cell & Microenvironment. 2 (1), (2015).
  43. Heit, B., Yeung, T., Grinstein, S. Changes in mitochondrial surface charge mediate recruitment of signaling molecules during apoptosis. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 300 (1), C33-C41 (2011).
  44. Múnera, J. O., Wells, J. M. Generation of Gastrointestinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1597, 167-177 (2017).
  45. Truman, L. A., et al. CX3CL1/fractalkine is released from apoptotic lymphocytes to stimulate macrophage chemotaxis. Blood. 112 (13), 5026-5036 (2008).
  46. Evans, A. L., et al. Antagonistic Coevolution of MER Tyrosine Kinase Expression and Function. Molecular Biology and Evolution. , (2017).
  47. Flannagan, R. S., Heit, B., Heinrichs, D. E. Intracellular replication of Staphylococcus aureus in mature phagolysosomes in macrophages precedes host cell death, and bacterial escape and dissemination. Cellular Microbiology. , (2015).
  48. Mubaid, F., Brown, C. M. Less is More: Longer Exposure Times with Low Light Intensity is Less Photo-Toxic. Microscopy Today. 25 (06), 26-35 (2017).
  49. Bogdanov, A. M., Kudryavtseva, E. I., Lukyanov, K. A. Anti-fading media for live cell GFP imaging. PloS One. 7 (12), e53004 (2012).
  50. Rossner, M., Yamada, K. M. What's in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166 (1), 11-15 (2004).
  51. Sage, D., et al. DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy. Methods. 115, 28-41 (2017).
  52. Ma, G. Z. M., Stankovich, J., Kilpatrick, T. J., Binder, M. D., Field, J. Polymorphisms in the receptor tyrosine kinase MERTK gene are associated with multiple sclerosis susceptibility. PloS One. 6 (2), e16964 (2011).
  53. Thorp, E., Cui, D., Schrijvers, D. M., Kuriakose, G., Tabas, I. Mertk receptor mutation reduces efferocytosis efficiency and promotes apoptotic cell accumulation and plaque necrosis in atherosclerotic lesions of apoe-/- mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (8), 1421-1428 (2008).
  54. Nguyen, K. -Q. N., et al. Overexpression of MERTK Receptor Tyrosine Kinase in Epithelial Cancer Cells Drives Efferocytosis in a Gain-of-Function Capacity. The Journal of Biological Chemistry. 289 (37), 25737-25749 (2014).
  55. Morimoto, K., et al. Lovastatin enhances clearance of apoptotic cells (efferocytosis) with implications for chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Immunology. 176 (12), 7657-7665 (2006).

Tags

Immunologie en infecties probleem 138 Efferocytosis fagocytose apoptosis microscopie fagocytensysteem macrofaag
Kwantificering van Efferocytosis door eencellige fluorescentie microscopie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Taruc, K., Yin, C., Wootton, D. G.,… More

Taruc, K., Yin, C., Wootton, D. G., Heit, B. Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (138), e58149, doi:10.3791/58149 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter