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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Quantificazione del fagosoma da microscopia di fluorescenza di cella singola

Published: August 18, 2018 doi: 10.3791/58149
Automatic Translation
1, 1, 2,3, 1
1Department of Microbiology and Immunology and the Center for Human Immunology, University of Western Ontario, 2Institute of Infection and Global Health, University of Liverpool, 3Department of Respiratory Research, Aintree University Hospital NHS Foundation Trust

Summary

Fagosoma, la rimozione fagocitica delle cellule apoptotiche, è necessaria per mantenere l'omeostasi ed è facilitata dalla recettori e vie di segnalazione che consentono il riconoscimento, il engulfment e interiorizzazione delle cellule apoptotiche. Qui, presentiamo un protocollo di microscopia di fluorescenza per la quantificazione del fagosoma e l'attività delle vie di segnalazione efferocytic.

Abstract

Studiare il regolamento del fagosoma richiede metodi che sono in grado di quantificare con precisione l'assorbimento delle cellule apoptotiche e per sondare i processi di segnalazione e cellulari che controllano fagosoma. Questa quantificazione può essere difficile da eseguire, come le cellule apoptotiche sono spesso efferocytosed frammentario, così necessitando metodi che possono delineare con precisione fra la parte di efferocytosed di un target di apoptotic contro residuo unengulfed cellulare frammenti. L'approccio descritto nel presente documento utilizza approcci dual-etichettatura per quantificare con precisione la dinamica della capacità fagosoma ed efferocytic di efferocytes quali i macrofagi. Il citosol della cellula apoptotica è marcati con un colorante di cella-tracking per abilitare il monitoraggio di tutti i materiali di derivati da cellule apoptotiche, mentre superficie biotinilazione della cellula apoptotica consente una differenziazione tra interiorizzata e non interiorizzato frazioni di cellule apoptotiche. La capacità di efferocytic di efferocytes è determinata prendendo immagini fluorescenti delle cellule dal vivo o fisse e quantificare l'importo limite contro bersagli interiorizzati, come differenziato dalla macchiatura streptavidina. Questo approccio offre diversi vantaggi rispetto a metodi quali la citometria a flusso, vale a dire la precisa delineazione di non efferocytosed contro efferocytosed apoptotica frazioni cellulari, la capacità di misurare efferocytic dinamica da microscopia di cellule vive e la capacità di eseguire studi di segnalazione cellulare in cellule che esprimono transgeni fluorescente etichettati. I metodi descritti in questo protocollo combinato, servono come base per un approccio sperimentale flessibile che può essere utilizzato per quantificare con precisione efferocytic attività e interrogare le vie di segnalazione cellulare attive durante fagosoma.

Introduction

L'apoptosi, o morte programmata delle cellule, è un processo fisiologico altamente regolamentato che si verifica nella maggior parte degli organismi multicellulare ed è cruciale per il loro sviluppo e omeostasi1. Oltre a essere coinvolti nel turnover cellulare normale e lo sviluppo embrionale, apoptosi consente l'eliminazione delle cellule infette o danneggiate dai tessuti e possono essere attivato in risposta all'infezione, infiammazione, tumore e anche di interventi medici ad esempio, la radioterapia o steroidi1. Le cellule apoptotiche espongono "mangiare-me" segnali sulla superficie cellulare che vengono riconosciuti dai recettori su una gamma di fagociti professionali e non professionali, indicate collettivamente come "efferocytes". Impegno di questi recettori induce l'assorbimento e la degradazione della cellula apoptotica di efferocyte attraverso un processo noto come fagosoma2,3. La fosfatidilserina è il meglio caratterizzato mangiare-me segnale guida fagosoma. Normalmente è confinata all'opuscolo interno della membrana plasmatica, con apoptosi attivando un scramblase del lipido che sconvolge questa asimmetria di membrana, esponendo così la fosfatidilserina sulla superficie delle cellule4. La fosfatidilserina è trovata sulla superficie extracellulare di alcune cellule non apoptotiche, come macrofagi maturi e piastrine attivate. Tuttavia, queste cellule non sono efferocytosed a causa della presenza di segnali "non mangiarmi", come CD47, il loro cellulare superficiale5,6,7. Esposta la fosfatidilserina è riconosciuta da una matrice di efferocytic recettori espressi da efferocytes. Il legame di questi recettori di fosfatidilserina, direttamente o tramite l'ausilio di opsonine, attiva vie di segnalazione che promuovono la fagocitazione della cellula apoptotica in un vacuolo membrana-limita, chiamato il efferosome8, 9 , 10 , 11 , 12. il efferosome in sequenza si fonde con gli endosomi e lisosomi, che trasportano il macchinario molecolare necessario acidificare il efferosome e degradare l'apoptosi delle cellule di carico13,14. Una volta degradata, i materiali derivati da cellule apoptotiche sono vittime della tratta per il riciclaggio endosoma — un processo che limita la risposta immunitaria agli antigeni derivati da cellule apoptotiche, e che può consentire il recupero di sostanze nutritive dalla apoptotica delle cellule13, 15. Si verifica un errore nel fagosoma in distanza alterata delle cellule apoptotiche; Queste cellule non liquidate alla fine subiscono la necrosi secondaria. Le cellule necrotiche rilasciano contenuto citosolico pro-infiammatorie, agenti patogeni e autoantigeni nell'ambiente extracellulare, guidando così una gamma di malattie infettive, infiammatorie e autoimmuni16,17. Insieme, apoptosi e fagosoma facilita la rimozione delle cellule morte e morte e consentire il mantenimento dell'omeostasi tissutale.

Indagando i meccanismi molecolari sottostanti fagosoma richiede metodi che forniscono una chiara quantificazione dell'assorbimento delle cellule apoptotiche. Questa quantificazione è complicata dal fatto che a differenza di altri l'assorbimento meccanismi quali endocitosi e fagocitosi18,19, Fagosoma non possono provocare il engulfment cella obiettivo intatto, conseguente l'assorbimento a fasi della cellula apoptotica di efferocyte20. Il protocollo descritto nel presente documento descrive un in vitro fagosoma saggio che fornisce precisa delineazione dell'interiorizzato contro non interiorizzato porzioni delle cellule apoptotiche individuale e può essere combinato con una varietà di cellula fissa e approcci di microscopia di cellule vive. Saggi di fagocitosi tradizionale aggiungere gli anticorpi specifici per la destinazione fagocitica alla fine dell'esperimento al fine di etichettare gli obiettivi non interiorizzato, dove, come il nostro metodo differisce di etichettatura il bersaglio apoptotiche con biotina covalentemente21 , 22. mentre gli anticorpi specifici di cellule apoptotiche possono essere usati per questo test, l'approccio di biotinilazione consente per qualsiasi destinazione di proteina-cuscinetto di essere etichettato ed evita potenziali problemi con cross-reattività dell'anticorpo secondario se immunostaining viene eseguita . In particolare, delineiamo la preparazione delle cellule Jurkat apoptotiche che sono stati a doppia colorazione con un colorante di rilevamento delle cellule e la biotina. La cella traccianti consente apoptotica materiali derivati da cellule di essere monitorati durante Fagosoma, mentre biotinylation superficie consente la discriminazione di interiorizzato da porzioni non interiorizzato delle cellule apoptotiche efferocytosed. Descriviamo anche la cultura e la preparazione delle linee cellulari J774.2 e THP-1 per uso come efferocytes murine ed umane, macrofagi monocito-derivati M2 come esempio di cellula primaria fagosoma e cellule Jurkat per uso come efferocytic obiettivi. Questi metodi possono essere applicati facilmente ad altre linee cellulari o cellule primarie, a cellule bersaglio che subiscono ogni forma di morte cellulare (ad es. apoptosi, necrosi e necroptosis) che imita micron imprese che simulano le cellule apoptotiche attraverso rivestimenti del lipido o rivestimento con ligandi specifici di un recettore efferocytic di interesse.

Il metodo descritto in questo protocollo ha parecchi vantaggi sopra i metodi di base di citometria a flusso comunemente utilizzati nel campo23,24. Da imaging direttamente l'interazione delle cellule fagocita-apoptotici, combinato con etichettatura chiaro di entrambi materiale a cellule apoptotiche totale e non interiorizzato, è possono effettuare misure quantitative del fagosoma. Inoltre, l'uso di pH-insensibile fluorofori limita fattori di confondimento quali la soppressione della fluorescenza FITC e GFP a pH lisosomiale che confonde alcuni metodi alternativi25. Infine, mentre non è descritto in dettaglio, questi metodi possono essere impiegati utilizzando efferocytes esprimendo fluorescente etichettati transgeni, o con immunostaining post-fissazione, per consentire la quantificazione delle attività della molecola di segnalazione e monitoraggio della processi cellulari durante fagosoma.

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Protocol

Raccolta di sangue dai volontari sani è stato approvato dal comitato di etica in salute scienza ricerca della University of Western Ontario. Il prelievo è stato effettuato conformemente agli orientamenti della Tri-Consiglio informativa sulla ricerca umana.

1. la cultura e la preparazione della linea cellulare di monociti THP-1

  1. Monociti THP-1 di cultura come una coltura di sospensione in matracci T25 a 37 ° C + 5% CO2. Le cellule devono essere coltivate in 5 mL di Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) + 10% siero bovino fetale (FBS).
  2. Le celle di sospensione ogni giorno in modo uniforme in tutta la media di crescita agitando delicatamente il pallone, quindi immediatamente contare le celle con un emocitometro. Le cellule devono essere attraversate una volta densità cellulare raggiunge 1 x 106 cellule/mL:
    1. Pre-riscaldare RPMI 1640 + 10% FBS in bagnomaria a 37 ° C.
    2. Trasferire5 2 x 10 in una microcentrifuga da 1,5 mL o in una provetta conica da 15 mL e pellet cellule mediante centrifugazione a 500 x g a temperatura ambiente per 5 min.
    3. Rimuovere il sopranatante senza disturbare il pellet cellulare e risospendere il pellet in 1 mL (provetta per microcentrifuga da 1,5 mL) o 5 mL (provetta conica da 15 mL) di tampone fosfato salino (PBS).
    4. Centrifugare la provetta a 500 x g a temperatura ambiente per 5 minuti rimuovere il PBS senza disturbare il pellet cellulare.
    5. Risospendere il pellet in 1 mL di RPMI 1640 fresco + 10% FBS.
    6. In un posto nuovo per la boccetta T25 4 mL di supporti riscaldati e a questo aggiungere il sedimento celle 1.2.5. Cultura in incubatore a 37 ° C + 5% CO2 fino a quando le cellule richiedono passaggio (in genere 3 giorni), o fino a quando le cellule sono necessarie per un esperimento.
  3. Per un esperimento con i macrofagi THP-1-derivati, rimuovere il numero necessario di cellule dalla boccetta e piastra prima del passaggio:
    1. Inserire il numero desiderato di lamelle di vetro circolare di 18 mm (spessore #1.5) nei pozzetti di una piastra 12-pozzetti — in genere 1 vetrino coprioggetto per condizione e/o timepoint. In ciascuna Beh aliquota 5 x 104 THP-1 monociti. Il numero di celle aggiunto in ogni pozzetto può essere modificato, se necessario.
    2. Portare il volume totale di ciascuna cella contenente ben a 1 mL utilizzando RPMI + 10% FBS riscaldato a 37 ° C.
    3. Aggiungere 100 nM phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA) in ciascun pozzetto e cultura per 3 giorni per indurre la differenziazione dei monociti THP-1 in macrofago-come le cellule.

2. la cultura e la preparazione della linea cellulare del macrofago J774.2

  1. Cellule di J774.2 cultura in matracci T25 a 37 ° C + 5% CO2. Le cellule devono essere coltivate in 5 mL di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) + 10% FBS e attraversate una volta che raggiunge la cultura confluency di 80-90%. A cellule del passaggio:
    1. Rimuovere tutti i supporti dalla beuta e l'aumento di una volta con 5 mL di PBS.
    2. Rimuovere PBS dal pallone e sostituirli con 5 mL di fresco DMEM + 10% FBS.
    3. Utilizzando un raschietto di cella, raschiare il fondo del pallone di sospendere le cellule nei media. Vigorosamente dispensare le cellule diverse volte per spezzare qualsiasi aggregazione di cellule.
    4. Diluire 1:5 celle rimuovendo 4 mL della sospensione delle cellule dalla beuta e sostituendolo con 4 mL di terreno fresco. Sospensione delle cellule restanti possa essere scartata, utilizzata per avviare una nuova cultura delle cellule in una boccetta di T25 fresca o utilizzata per un esperimento.
  2. Per impostare per un'analisi di fagosoma usando cellule J774.2:
    1. Un giorno prima dell'inizio dell'esperimento, sospendere le cellule J774.2 in 5 mL di terreno fresco, secondo la procedura 2.1.1–2.1.3. Contare le celle utilizzando un emocitometro e preparare il volume necessario di cellule ad una concentrazione di 5 x 104 cellule/mL.
    2. Inserire il numero necessario di lamelle di vetro circolare di 18 mm (spessore #1.5) nei pozzetti di una piastra 12-pozzetti. In ciascuna Beh aliquota 1 mL della sospensione delle cellule di 5 x 104 cellule/mL.
    3. Cultura durante la notte per consentire alle cellule di aderire il vetrino coprioggetto e recuperare dal passaggio.

3. la cultura dei macrofagi primari umani M2

  1. Raccogliere 10 mL di sangue eparinato umano per ogni piatto 12-pozzetti di macrofagi M2 richiesto.
  2. In una provetta da centrifuga da 15 mL, strato 5 mL di sangue umano in cima a 5 mL di mezzo di separazione cellulare Lympholyte-poli pre-riscaldato. Preparare i tubi multipli se elaborazione > 5 mL di sangue, piuttosto che utilizzando tubi di volume maggiore.
  3. Centrifugare a 300 x g per 35 min, utilizzando accelerazione media e nessuna rottura.
  4. Rimuovere con cautela la banda ricca di cellule mononucleate superiore utilizzando una pipetta di plastica e trasferimento in una provetta da centrifuga 50 mL. Se tubi multipli sono stati preparati al punto 3.2, le bande possono essere riunite in una provetta singola 50 mL. Portare il volume del tubo fino a 50 mL con PBS.
  5. Centrifugare a 300 x g per 8 min e rimuovere il surnatante. Durante questo passaggio posto in autoclave 18 mm diametro circolare coprioggetti (#1.5 spessore) in ciascun pozzetto di una piastra 12-pozzetti.
  6. Risospendere il pellet cellulare a 300 µ l di siero RPMI 1640 al numero desiderato di pozzi; ad esempio, se 10 mL di sangue è stato elaborato per preparare un piatto ben 12, sospendere il pellet cellulare in 3,6 mL di media.
  7. Aggiungere 300 µ l di sospensione cellulare per ogni vetrino coprioggetti-contenente ben nella piastra 12-pozzetti. Incubare per 1 h a 37 ° C + 5% CO2.
  8. Lavare delicatamente il vetrino coprioggetti 3 x con 1 mL di PBS riscaldato per rimuovere eventuali cellule non aderenti.
  9. Aggiungere 1 mL di RPMI 1640 + 10% FBS + ricombinante di 10 ng/mL umano M-CSF + cella cultura antibiotico/antimicotico. Incubare a 37 ° C + 5% CO2 per 5 giorni.
  10. Sostituire il supporto con RPMI 1640 + 10% FBS + 10 ng/mL ricombinante umano M-CSF + 10 ng/mL ricombinante umano IL-4 + cella cultura antibiotico/antimicotico. Incubare a 37 ° C + 5% CO2 per 2 giorni completare la polarizzazione M2.
  11. Macrofagi polarizzati devono essere utilizzati entro i prossimi 3 giorni.

4. preparazione delle cellule Apoptotic Jurkat

  1. Coltura di cellule Jurkat in 5 mL di RPMI 1640 + 10% FBS a 37 ° C + 5% CO2. Jurkats sono una linea cellulare di sospensione e possa essere mantenuta dal passaggio 1:5 in media fresco, pre-riscaldato ogni 3 – 5 giorni.
  2. Per preparare le cellule apoptotiche, consentire la cultura di Jurkat a crescere ad alta densità (4 – 5 giorni dopo il passaggio). Aliquotare 1,5 mL in un 1,5 mL microcentrifuga tubo pellet cellule con centrifugazione a 500 x g per 5 min.
  3. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di medium RPMI 1640 senza siero contenente 1 µM staurosporine.
  4. Incubare per 16 h a 37 ° C + 5% CO2 per eseguire il rendering di cellule apoptotiche.
  5. Se desiderato, confermare l'induzione di apoptosi mediante colorazione con annessina v:
    1. Aliquotare e 100 µ l della coltura delle cellule Jurkat staurosporine-trattati in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL. Pellet di cellule mediante centrifugazione a 500 x g per 5 min, eliminare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 100 µ l di medium RPMI 1640 senza siero.
    2. Aggiungere 1 µ l di isotiocianato di fluorescina (FITC)-coniugato Annessina V e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente al buio.
    3. Aggiungere 900 µ l di PBS e trasferire l'intero volume in un unico pozzetto di una piastra 12-pozzetti contenenti un 18mm circolare vetrino coprioggetti (#1.5 spessore). Rotazione verso il basso in una centrifuga dotata di una piastra di adattamento a 200 x g per 1 min forzare le celle a rispettare il vetrino coprioggetti. In alternativa, le cellule possono essere inserite in una diapositiva chambered per l'imaging.
    4. Immagine utilizzando un microscopio a fluorescenza.

5. quantificare l'assorbimento Efferocytic e dinamiche utilizzando una cella fissa fagosoma Assay e la macchiatura Inside-out

  1. Preparare, macrofagi umani THP-1, J774.2 o M2 come descritto nelle sezioni 1-3, rispettivamente.
  2. La sera prima dell'inizio dell'esperimento preparare apoptotic cellule Jurkat come descritto nella sezione 4.
  3. Immediatamente prima dell'esperimento, contare le cellule apoptotiche usando un emocitometro. Trasferire un numero sufficiente di cellule apoptotiche in una microcentrifuga da 1,5 mL – di solito aggiungiamo 5 x 105 cellule/pozzetto, fornendo un rapporto di destinazione: efferocyte di 10:1.
  4. Pellet di cellule Jurkat mediante centrifugazione a 500 x g per 5 min e risospendere in 500 μL di PBS.
  5. Durante la centrifugazione, aliquota 10 µ l di DMSO in un nuovo tubo per microcentrifuga da 1,5 mL. Sciogliere in DMSO una quantità minima di N-hydroxysuccinimidobiotin (NHS-biotina). 5-10 cristalli (~0.005 mg) è sufficiente.
  6. Trasferire la sospensione di cellule/PBS di 500 μL apoptotica il DMSO/NHS-biotina contenente tubo. Diluire una cella traccianti per concentrazione consigliata dal produttore in sospensione delle cellule apoptotiche. Accertarsi di selezionare una cella traccianti che non si sovrapponga spettralmente con FITC-streptavidina (per esempio rosso o da' cellulare tracciante).
  7. Incubare la sospensione per 20 min a temperatura ambiente al buio. Aggiungere un volume equivalente di RPMI 1640 + 10% FBS e incubare per 5 min a temperatura ambiente al buio per placare qualsiasi colorante non reagito.
  8. Pellet di cellule mediante centrifugazione a 500 x g per 5 min, eliminare il surnatante e risospendere le cellule apoptotiche macchiato in 100 µ l di RPMI 1640 + 10% FBS per pozzetto dei macrofagi.
  9. Aggiungere 100 µ l della sospensione di cellule apoptotiche macchiato goccia a goccia in ciascun pozzetto dei macrofagi. Centrifugare a 200 x g per 1 min in una centrifuga dotata di una piastra di adattamento per forzare il contatto tra macrofagi e cellule apoptotiche.
  10. Incubare la piastra per il periodo di tempo a 37 ° C + 5% CO2 in un incubatore di coltura del tessuto desiderato. Per i macrofagi, efferocytosed materiale è solitamente primo rilevabile dopo 20 – 30 minuti e viene completata dopo 120 – 180 min.
  11. Al momento desiderato punto (i) rimuovono le cellule dall'incubatrice. Lavare le cellule due volte con 1 mL di PBS per interrompere fagosoma e rimuovere cellule apoptotiche non-efferocytosed di temperatura.
  12. Aggiungere streptavidina FITC coniugato ad una diluizione di 1:1,000 ad ogni pozzetto e incubare per 20 minuti al buio. Questo verrà assegnata l'etichetta la biotina esposta su qualsiasi materiale a cellule apoptotiche non-efferocytosed.
    Nota: Se lo si desidera, i nuclei delle cellule possono essere macchiati durante questo passaggio tramite l'aggiunta di diluizione di 1: 20,000 di Hoechst 33342 o 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, dicloridrato (DAPI).
  13. Lavare le cellule 3 volte con 1 mL di PBS, delicatamente agitando o a dondolo i campioni per 5 min per risciacquo. Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% (PFA) in PBS per 20 min a temperatura ambiente. Sciacquare le cellule una volta con PBS per rimuovere l'eccesso PFA.
  14. Montare le lamelle su un vetrino per imaging e trasferimento al microscopio a fluorescenza. Z-pile di un numero sufficiente di cellule per la quantificazione accurata di catturare — in genere 10 – 30 cellule per condizione. Materiale a cellule apoptotiche interiorizzato non sarà evidente nell'immagine risultante come cellulare tracciante con etichettata materiale avvolto dalla macchiatura FITC-streptavidina, mentre efferocytosed materiale forma discreta cellulare tracciamento tintura puncta gratuitamente qualsiasi streptavidina la macchiatura.
  15. Quantificare fagosoma nelle immagini risultanti attraverso una varietà di misure:
    1. Calcolare l'indice di efferocytic determinando il numero medio di efferosomes discreti (cella colorante+/streptavidin– puncta di rilevamento) per macrofago. Quantificare solo macrofagi contenenti ≥ 1 efferosomes visibile o associato a delle cellule apoptotiche. Macrofagi record associato a delle cellule apoptotiche, ma manca efferosomes discreti, come avendo un indice di efferocytic pari a 0.
    2. Calcolare l'efficienza efferocytic misurando la frazione di macrofagi contenenti ≥ 1 efferosome.
    3. Calcolare il tasso di fagosoma dalle cellule formazione immagine fissa e macchiato in più tempo-punti. Solo i macrofagi di immagine associato a cellule apoptotiche, o contenenti efferosomes visibile, con z-stack catturato di ciascuna cella. Una volta ripreso, determinare il tasso del fagosoma:
      1. Utilizzando la colorazione di streptavidina come una guida e lo strumento di selezione a mano libera o un poligono in FIJI/ImageJ26 (o altro pacchetto di software di analisi di immagine), cerchia tutti della cella colorante+/streptavidin– (ad es. interiorizzato) di rilevamento materiale in un unico piano dello z-stack. Misura l'intensità integrata della cella traccianti di questa regione. Misure individuali per ogni efferosome (ad esempio diametro, posizionamento rispetto al bordo della cella o nucleo, ecc.)15,27 possono facilmente essere acquisiti contemporaneamente con queste misurazioni, notevolmente aumentando i dati raccolti durante l'analisi.
      2. Sulla z-sezione stessa, utilizzando la streptavidina colorazione come una guida e lo strumento di selezione a mano libera o poligono, cerchia tutti della cella colorante+/streptavidin+ (ad es. non interiorizzato) di rilevamento materiale in un unico piano dello z-stack . Includere solo colorazione da cellule apoptotiche a contatto con il fagocita. Misurare l'intensità integrato di questa regione.
      3. Ripetere i passaggi 4.2.3.1 a 4.2.3.2 per le restanti z-sezioni dell'immagine. Somma l'intensità integrata dei efferocytosed (ΣFEP) e dei materiali non-efferocytosed (Σne). La frazione della cellula apoptotica che è stato efferocytosed può essere calcolata per la cella come:
        Equation
      4. Quantificare la frazione efferocytosed per tutte le celle in tutti i punti di tempo. Si noti che l'intensità di fluorescenza di cellule apoptotiche/efferosomes può variare tra immagini a causa della variabilità nell'assorbimento della cella coloranti di rilevamento di cellule apoptotiche individuali e a causa di cambiamenti nei parametri di acquisizione immagine come tempo di esposizione. Come tale, solo confrontare normalizzato valori come la frazione Efferocytosed, o i valori di intensità-indipendente come indice di efferocytic ed efferocytic efficienza, tra immagini, tra condizioni sperimentali e tra ripetere esperimenti.
    4. Per garantire che il dataset risultante riflette accuratamente la variazione nel fagosoma tra cellule, condurre queste analisi sul numero massimo di celle possibili in ogni esperimento.
      Nota: Indice di efficienza ed efferocytic di Efferocytic possa essere calcolata rapidamente (pochi secondi/cella), e in genere, ci proponiamo di analizzare almeno 100 cellule per esperimento, ripetendo ogni esperimento almeno 3 volte. Calcolare la frazione di efferocytosed materiale e misure specifiche per efferosome sono più laboriosi, in genere prendendo 2 – 3 min/cella per un analista esperto. Per questi calcoli quantifichiamo un minimo di 15 cellule per condizione, ogni esperimento.
    5. Indice di efferocytic record, frazione efferocytosed ed efferosome singoli dati su base per cella.
      Nota: In questo modo per l'analisi dei dati utilizzando approcci unicellulare, consentendo in tal modo variazioni inter-cellulare da quantificare. Analisi del livello di popolazione ancora possono essere condotta su questi DataSet calcolando unicellulare dati acquisiti in singoli esperimenti. Efferosome-specifiche misure possono essere analizzate a livello di popolazione, a livello di singola cellula e come Ensemble (ad es. come popolazioni di efferosomes indipendente delle cellule che li contengono)15.

6. tensione delle cellule fagosoma analisi usando cellule apoptotiche

  1. Preparare i macrofagi THP-1, J774.2 o M2 come descritto nei passaggi 1-3, rispettivamente. Se necessario, le cellule dovrebbero essere trasfettate con transgeni o altri genetica costruisce almeno 18 h prima di eseguire qualsiasi esperimenti.
  2. La sera prima dell'inizio dell'esperimento, preparare apoptotic cellule Jurkat come descritto nelle sezioni 4 e 5 con le seguenti modifiche:
    1. Diluire le cellule ed inducono apoptosi secondo 4.1-4.3 e raccogliere il numero necessario di cellule apoptotiche secondo 5.3 – 5.4.
    2. Aggiungere una cella tracciante a concentrazione consigliata dal produttore per la sospensione delle cellule apoptotiche. Incubare la sospensione per 20 min a temperatura ambiente al buio. Aggiungere un volume equivalente di RPMI 1640 + 10% FBS e incubare per 5 min a temperatura ambiente al buio per placare qualsiasi colorante non reagito. Non aggiungere NHS-biotina per questi esperimenti.
    3. Pellet di cellule mediante centrifugazione a 500 x g per 5 min, eliminare il surnatante e risospendere le cellule apoptotiche macchiato in 100 µ l di RPMI 1640 + 10% FBS per pozzetto dei macrofagi.
  3. Se necessario, etichetta i macrofagi rimuovendo i mezzi di coltura da ciascun pozzetto e aggiungendo 500 µ l di PBS contenente i produttori consigliato diluizione di una cella traccianti che non si sovrapponga spettralmente con il cellulare tracciante aggiunto a cellule apoptotiche o ad uno qualsiasi fluorescente transgeni espresso dai macrofagi. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente al buio, quindi aggiungere un volume equivalente di DMEM + 10% FBS e incubare per 5 min a temperatura ambiente al buio per placare qualsiasi colorante non reagito.
  4. Trasferire il coprioggetto macrofago-contenente una camera di Leiden. Aggiungere 400 µ l di DMEM + 10% FBS, seguita da 100 µ l della sospensione delle cellule apoptotiche con etichetta. Mescolare pipettando delicatamente media 2 – 3 volte.
  5. Trasferire la camera di Leiden a CO2e una riscaldata-camera irrorato di un microscopio a fluorescenza cellula viva.
    Nota: Per le installazioni di microscopio che mancano di capacità di aspersione di CO2 , uso del tessuto di coltura con 1 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acido tamponato (HEPES) piuttosto che di bicarbonato di sodio per mantenere il pH fisiologico, mentre il cultura è esposto all'aria.
  6. Acquisire una serie di time-lapse contenente un'immagine di luce bianca (contrasto di fase o DIC) e le immagini di tutte le etichette fluorescenti:
    1. Utilizzare un obiettivo obiettivo 100 X per esperimenti dove risolvere dettagli fini è richiesto (ad es. dinamiche di membrana delle interazioni cellula fagocita-apoptotica). Nel frattempo, misure più generali (tasso di assorbimento delle cellule apoptotiche, tempo di interazione tra macrofagi e cellule apoptotiche, ecc.) sono evidenziati più chiaramente utilizzando un 60 X o 63 X obiettivo.
    2. Se disponibile, utilizzare il punto-visita all'immagine più campi di vista durante una singola acquisizione, aumentando così il numero di eventi efferocytic catturato in un singolo esperimento
    3. Perché efferocytes inghiottire spesso piccoli frammenti di cellule apoptotiche, piuttosto che cellule intatte, è meglio catturare z-stack. Per minimizzare la fototossicità, catturare z-sezioni separate dalla profondità focale del vostro obiettivo di microscopi (tipicamente 0,5-1,0 µm), attraverso lo spessore della cella (in genere 8-10 µm per i macrofagi, ad es. 8 – 20 fette/cella). Questo assicura che tutti i engulfment ed eventi di traffici sarà visibili in almeno un piano z. In alternativa, utilizzare grandi (1-5 micron di diametro) apoptotica delle cellule imita o cellule apoptotiche che subiscono frammentazione minima durante fagosoma (ad esempio calore scioccati neutrofili) invece senza accatastamento da z. Abbiamo descritto la preparazione di mimica e di neutrofili apoptotic precedentemente28.
    4. Per minimizzare photobleaching, utilizzare brillante fluorofori e cattura immagini utilizzando le impostazioni di acquisizione che riducono al minimo photobleaching — ad esempio eccitazione di basso-intensità combinata con fotocamera ad alta guadagno e breve esposizione volte29. Si consiglia di utilizzare un microscopio equipaggiato con una telecamera ad alta sensibilità elettromagnetica charge coupled device (EM-CCD) o confocale a disco rotante e una fase meccanica piezoelettrica ad alta velocità, per questa forma di imaging.
  7. Il numero di metodi di analisi possibili che possono essere applicati a questi video time-lapse è vasto e oltre la nostra capacità di rivedere qui. Come alcuni esempi, utilizzare manuali o automatizzati software di monitoraggio per monitorare la fusione, la fissione e la circolazione delle efferosomes all'interno di cellule15, quantificare dinamica di fusione di efferosome con endolysosomes da analisi di colocalizzazione nei macrofagi che esprimono transgeni fluorescente specifico vano13, i processi di assorbimento monitor ad esempio di sondaggio e Coppa formazione30, determinare le dinamiche di reclutamento di segnalazione e il traffico di proteine al efferosome13, e/o quantificare l'attività degradativa di efferosomes utilizzando cellule apoptotiche etichettate con fluorofori pH sensibili, ossidante-sensibile o attivati da proteasi31.

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Representative Results

Una notte di cultura delle cellule Jurkat con risultati di staurosporine 1 µM in apoptosi di > 95% delle cellule, che possono essere confermate con Annessina V macchiatura (Figura 1). Altri tipi di cellule possono essere utilizzati per questi esperimenti, anche se la concentrazione di staurosporine e la durata del trattamento staurosporine dovranno essere ottimizzati per ogni linea cellulare. Per un rilevamento affidabile e la quantificazione del fagosoma, > 80% delle cellule dovrebbe essere apoptotiche prima di aggiungerli alla efferocytes. Altri induttori di apoptosi (es. scossa di calore, etoposide e luce UV) possono anche essere utilizzati, ma nella nostra esperienza, questi producono un più eterogeneo induzione di apoptosi e risultato in popolazioni di cellule miste contenenti apoptotico, secondaria necrotico e cellule bersaglio non-apoptotica.

Per formazione immagine fissa-cella con la macchiatura di dentro-fuori, interazioni cellula strettamente apposed efferocyte-apoptotico dovrebbero essere osservati in tutti i punti di tempo, con ben delineata non-efferocytosed (valore di streptavidina++traccianti) e efferocytosed (valore di streptavidina–rilevamento+) materiali visibili (Figura 2). È importante notare che la sinapsi che si forma tra la efferocyte e la cellula apoptotica è spesso abbastanza stretta per escludere streptavidina, e quindi qualsiasi cellulare tracciante macchiato oggetto recante streptavidina in qualsiasi punto sulla sua circonferenza dovrebbe essere considerata un associato delle cellule e non un efferosome. Nella maggior parte degli esperimenti la frazione delle cellule apoptotiche che sono efferocytosed aumenterà in modo dipendente dal tempo, o fino a quando non non interiorizzato apoptotica delle cellule rimangano materiali, o finché il fagocita raggiunge la capacità massima efferocytic (Figura 3). l'analisi è in genere eseguita e registrata per le singole celle (Figura 3A), tuttavia, dati possono essere media attraverso le celle all'interno di singoli esperimenti e i valori medi da più ripetizioni sperimentali analizzate con convenzionale approcci statistici (Figura 3B). Questo protocollo standardizzato potranno subire modifiche per consentire per l'utilizzo di tipi di cellula primaria, bersagli alternativi efferocytic e per la colorazione aggiuntiva da includere. Ad esempio, la figura 4 Mostra un macrofago umano M2-polarizzata primario che ha efferocytosed apoptotica imita cella composta di 3 µm diametro perle di silice rivestiti in una miscela di fosfatidilserina e fosfatidilcolina28, seguita da fissazione successiva, permeabilizzazione e immunostaining per il riciclaggio endosoma marcatore Rab17.

Durante live cell imaging fagociti professionali efferocytic sarà osservato estendere e ritrarre piccoli processi in un processo chiamato "sondare"30 (Figura 5, t = 0); Quando questi processi incontrano un bersaglio saldamente aderiscono alla destinazione e disegnarlo per il fagocita. Questa sondaggio attività non possono essere osservate con fagociti non professionali quali le cellule epiteliali. Il efferocyte poi formeranno una stretta "sinapsi efferocytic"32 tra sé e la cellula apoptotica, con questa sinapsi avvolgente spesso una grande porzione della cellula apoptotica (Figura 5, t = 10). Il efferocyte trarrà quindi pezzi della cellula apoptotica da questa sinapsi in sua cytosol (Figura 5, 10 – 30 min). Presto dopo la loro formazione, sono vittime della tratta questi efferosomes nascente dalla sinapsi e verso l'area peri-nucleare, un risultato di Rab7/RILP/dynein-dynactin mediata trasporto33. Nel corso del tempo si ridurrà il efferosomes e nei materiali di risulta degradati ridistribuiti in tutta la cellula, dove sono probabili assorbito o riciclati13,15. La capacità di rilevare questi processi dipende fortemente l'acquisizione frame-rate e la durata dell'esperimento. Processi rapidi come sondaggio non possono essere osservati a bassi frame-rate, mentre eventi lenti (traffico di efferosome e assorbimento) richiedono lunghi periodi di imaging — in entrambi i casi, queste acquisizioni di grande immagine spesso richiedono l'acquisizione di immagini di basso-intensità per limitare photobleaching e fototossicità (Figura 5). Come con l'analisi di fisso-delle cellule, la versione di cellule vive di questo dosaggio può essere modificata per soddisfare le esigenze del ricercatore. Figura 6 Mostra un singolo fotogramma di un'acquisizione di cellule vive di macrofagi J774.2 esprimendo transgeni che demark fluorescente sulla membrana plasmatica (PM-GFP) e che si lega selettivamente il segnalazione del lipido PI (3) P (FYVE-RFP). Generazione di PI (3) P sulla membrana efferosome possa essere individuati come co-localizzazione di FYVE-RFP con la membrana di efferosome PM-GFP+ . Di quantificare l'intensità di FYVE-RFP sui efferosome, le dinamiche di PI (3) P segnalazione sul efferosome possono essere quantificate (Figura 6).

Figure 1
Figura 1: Annessina V macchiatura di Apoptotic e cellule Jurkat Non - Apoptotic. Annessina V etichette la fosfatidilserina "mangiare-me" segnale esposti da cellule apoptotiche. (In alto) Cellule Jurkat (UT) non trattate visualizzare una sana (liscia e arrotondata) morfologia (DIC) e non si colorano con annessina V. (in basso) Jurkat cellule coltivate durante la notte con 1 µM staurosporine (STS) assumono una morfologia apoptotica (irregolare e blebbed) e macchia con Barra di Annexin V. scala = 10 µm, intensità di immagine viene visualizzata come una mappa a colori. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Engulfment precoce e tardiva di Apoptotic Jurkat Cells dai macrofagi J774.2. Le immagini sono dei macrofagi ad un precoce (60 min) e fine (120 min) fase del fagosoma. Luce bianca (DIC) immagine illustra l'interfaccia stretto tra il macrofago (mφ) e delle cellule apoptotiche (AC). Cellulare tracciante (CTD, rosso) rivela la posizione di tutti i materiali derivati da cellule di apoptotic. FITC-streptavidina macchiatura (Str, verde) identifica la parte della cellula apoptotica che non ha ancora stato travolto dal macrofago. I nuclei del macrofago erano pre-colorati con DAPI (blu). Efferosomes (rosso) contro la parte non interiorizzato della cellula apoptotica (verde/giallo) sono identificati prontamente in un overlay della streptavidina e di rilevamento delle immagini di tintura. Si noti l'assenza di streptavidina colorazione all'interfaccia cellulare del macrofago-apoptotica al timepoint iniziale, creato dall'esclusione di streptavidina da sinapsi strettamente formata efferocytic (*). Il nucleo del macrofago è identificato da Hoechst colorazione (blu). Barra della scala = 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: corso di tempo della frazione di Efferocytosed delle cellule apoptotiche da parte dei macrofagi J774.2. Fagosoma analisi sono state eseguite per l'indicato volte e la frazione di materiale a cellule apoptotiche tratta determinata in ogni punto del tempo utilizzando cella macchiatura tintura/Streptavadin di rilevamento. (A) frazione di efferocytosed materiali all'interno dei macrofagi individuali, i dati vengono presentati da singole celle, barra orizzontale indica la media. 12 – 17 cellule per condizione, dati da 1 dei 5 esperimenti indipendenti. (B) frazione di materiali efferocytosed, media attraverso 5 esperimenti indipendenti, almeno 10 cellule/condizione/ripetizione. p < 0,05 rispetto ai 30 min, test di Kruskal-Wallis con la correzione di Dunn. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: analisi delle assunzioni di Rab17 al Efferosomes in macrofagi umani primari. Un macrofago M2-polarizzata inghiottito imita di apoptotic delle cellule (frecce) ed era immunostained per Rab17 (verde) 60 min dopo il engulfment. Barra della scala = 5 µm. nucleo cellulare è macchiato con Hoeschst, DIC immagine mostra la morfologia delle cellule e viene utilizzato per identificare mimici delle cellule apoptotiche. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: analisi diretta delle cellule di fagosoma. Una cella colorante labeledJ774.2 del macrofago (mφ, verde) di rilevamento è stata registrata come inghiottito una cella di Jurkat apoptotica etichettata con una cella di colore diverso tracciante (AC, rosso). La cellula apoptotica è suddiviso in frammenti multipli durante il processo di internalizzazione, con conseguente assorbimento frammentario e formazione di più efferosomes (frecce). Barra della scala = 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: utilizzando transgeni fluorescente per indagare la segnalazione Efferocytic. Un macrofago J774.2 era trasfettato con un marcatore di membrana plasmatica di GFP-etichettato (PM, verde) e costrutto FYVE-RFP, che lega il segnalazione del lipido PI (3) P (rosso). Fagosoma forma una nascente efferosome membrana del plasma-derivato contenente PI (3) P, come rilevato dal reclutamento FYVE-RFP (freccia). Le dinamiche di PI (3) P segnalazione è stata quantificata come piegare intensità rispetto al segnale di FYVE-RFP presente al punto di chiusura di efferosome (t = 0, grafico). Questo esperimento ha utilizzato un tallone di che imita delle cellule apoptotiche (freccia, DIC) piuttosto che di cellule apoptotiche. Barra della scala = 5 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

I metodi descritti in questo protocollo permettono la formazione immagine e la quantificazione del processo dinamico efferocytic, utilizzando approcci sia fisso-cellula e cellule vive. Questi approcci offrono diversi vantaggi rispetto ai metodi basati su citometria a flusso comunemente impiegate23,24. L'uso di dentro-fuori la macchiatura con campioni fissati fornisce una più robusta e precisa quantificazione del tasso e l'entità del fagosoma — infatti, molti metodi basati su cytometry di flusso semplicemente etichettare le cellule apoptotiche e macrofagi con fluorofori diversi, e fagosoma Punteggio come la frazione dei macrofagi co-macchiatura con l'indicatore delle cellule apoptotic, così manca la capacità di differenziare tra vincolato rispetto al materiale a cellule apoptotiche interiorizzato. Approcci di citometria a flusso alternativo includono coloro che utilizzano pHrodo con l'etichetta di cellule apoptotiche24. pHrodo è un fluoroforo pH sensibili che aumenta di luminosità a pH acido. Mentre questo fluoroforo forniscono la migliore risoluzione tra non-interiorizzato rispetto interiorizzati materiali, come l'aumento di fluorescenza specificamente seguito interiorizzazione della cellula apoptotica e acidificazione del efferosome, i risultati possono essere confusi dai processi di malattia che alterano l'acidificazione efferosome34,35, e questo metodo mancherà efferosomes nelle prime fasi (pre-acidificazione) del fagosoma36, situato nelle regioni di acidificazione-poveri di la cella27, o nelle cellule che debolmente acidificano loro lisosomi37. Un secondo vantaggio del metodo descritto in questo protocollo è l'utilizzo di live cell imaging per misurare la dinamica del fagosoma, come processi come sondaggio, la formazione della sinapsi efferocytic, e il traffico intracellulare di efferosomes non può essere rilevati tramite approcci basati su citometria a flusso.

Mentre questo metodo offre molti vantaggi, esperimenti che richiedono la quantificazione di molte centinaia di cellule — ad esempio esperimenti rilevazione eventi rari, o quantificare i processi altamente variabili — può essere difficile, con l'analisi di questi DataSet di grandi dimensioni assunzione di una quantità eccessiva di tempo. Approcci, come flusso di imaging di imaging ad alta velocità cytometry38 può consentire per un throughput più elevato rispetto a microscopia convenzionale, anche se nella nostra esperienza attuale immagine automatica programmi di analisi non sono sempre in grado di segmentazione con precisione non-interiorizzato rispetto interiorizzati materiali. In particolare, la sinapsi efferocytic stretto che si forma tra le cellule apoptotiche ed efferocyte possibile escludere streptavidina macchiatura e come tale una cellula apoptotica associato spesso apparirà come una massa solida nella cella monitoraggio canale di colorante, che è parzialmente avvolto da streptavidina macchiatura (Figura 2). Così, mentre efferosomes sono identificati prontamente algoritmicamente, la porzione associata della cellula apoptotica è spesso erroneamente identificata come un efferosome a causa della difficoltà di contabilità per la colorazione parziale streptavidina. Mentre dobbiamo ancora trovare un programma che possa identificare accuratamente e quantificare l'assorbimento a fasi di cellule apoptotiche senza assistenza umana, abbiamo trovato che sistemi semi-automatici trainable39 può notevolmente accelerare analisi, riducendo la frazione efferocytosed misure da 2 – 3 min a < 60 s per cella. In alternativa, delle cellule apoptotiche non digeribili imita o tipi di cellule che come minimo frammentano all'apoptosi, può essere utilizzato invece. Questo semplifica il rilevamento alle strutture singole, più grande, che possono essere più suscettibili agli approcci automatizzati e possono eliminare la necessità per l'impilamento di z. Anche con questi progressi, la velocità di acquisizione e analisi di questo metodo rimane limitante, e come tale flusso cytometry rimane il metodo più praticabile quando analisi dei numeri di grandi cellule è richiesto23.

Anche se abbiamo descritto questo metodo utilizzando la linea cellulare e macrofagi umani primari come efferocytes e Jurkat cellule apoptotiche (una linea a cellula T) come bersagli, questo metodo può essere applicato a qualsiasi destinazione efferocytic cella tipo o apoptotica delle cellule. Infatti, approcci simili sono stati utilizzati per indagare fagosoma in epatociti e cellule epiteliali9,40,41e il fagosoma di bersagli clinicamente rilevanti come tumore cellule42. Può essere necessario modificare questo protocollo quando si utilizza efferocytes non immune, o quando efferocytic specifici eventi di modellazione. Ad esempio, le cellule Jurkat sono non aderente e quindi sono difficilmente completamente ricapitolare le forze meccaniche e limitazioni spaziali efferocytes incontro quando si interagisce con le cellule apoptotiche aderente o cellule apoptotiche all'interno di tessuti solidi. Molti tipi di cellule manterranno adesione durante l'apoptosi e pertanto possono essere utilizzati come bersagli aderente; ad esempio, cellule HeLa riproducibile subiscono apoptosi indotti staurosporine, fosfatidilserina rimescolando e blebbing su un periodo di 4 – 6 h mantenendo aderenza del corpo cellulare43. Cellule sospese in una matrice di collagene o derivati da cellule staminali organoids44 possono essere potenziali modelli per lo studio fagosoma in tessuti solidi, anche se siamo ignari di tutti gli studi che hanno utilizzato questi approcci. Per alcuni modelli di cellule immuni quali cellule Jurkat e neutrofili non devono essere utilizzati come target apoptotici, come queste cellule possono rilasciare basati a citochina "trovare-me" segnali come CX3CL1 che può essere un fattore di confusione nei modelli dove infiammatoria o migratori i processi sono studiati45. Così, mentre la versatilità di questo dosaggio permette affinché possa essere utilizzato per esplorare fagosoma attraverso una gamma di tipi di cellule e sistemi modello, deve prestare attenzione a selezionare appropriato efferocytes, cellule bersaglio e condizioni di coltura al miglior modello fisiologico processo in esame.

I metodi di analisi descritti nel presente protocollo sono destinati solo come punto di partenza, con la natura basata su formazione immagine di questi esperimenti che consente un'ampia gamma di analisi. Ad esempio, misure di posizionamento e di diametro di efferosome possono essere raccolti durante l'esecuzione di misure di efferocytosed di frazione o misurate all'interno di cellule vive ora-corsi, al fine di indagare i processi quali il traffico intracellulare di efferosomes e il tasso di apoptosi delle cellule degradazione13,15. Immunostaining (Figura 4) può essere utilizzato per indagare l'assunzione di proteine di efferosomes, mentre cellule vive imaging combinato con analisi morfologiche possono essere utilizzate per quantificare i processi tale efficacia vincolante e tariffe di engulfment30 , 46. eseguiamo frequentemente queste analisi nei macrofagi che esprimono transgeni fluorescenti che segnalano l'attivazione della molecola o l'attività degli eventi cellulari di segnalazione durante fagosoma (Figura 6). Questi giornalisti permettono il monitoraggio dei processi di segnalazione durante fagosoma; ad esempio, utilizziamo fluorescente etichetta Rab GTPases per esplorare il ruolo di Rab5, Rab7 e Rab17 nel mediare l'elaborazione efferosome e la successiva tratta di antigeni derivati da cellule apoptotiche13,15. Allo stesso modo, l'incorporazione dei reporter di morte delle cellule, efferosome pH, produzione di specie reattive dell'ossigeno e di altri processi cellulari in cellule vive esperimenti può essere utilizzato per studiare i processi che mediano la degradazione di efferosomes31 ,47. Una sfida comune in questi esperimenti è l'identificazione transgeni o reporter con fluorofori compatibili; spesso, elimineremo la cella rilevamento colorante e/o streptavidina gratuita canali per imaging altri fluorofori. Per alcuni esperimenti è utile sostituire l'apoptotica delle cellule con un mimo non frammentare. Questo consente per la quantificazione della segnalazione dinamiche e processi cellulari senza la complessità di rilevamento il più efferosomes derivati da una cella singola apoptotica. Vedere Evans et al. per istruzioni su come preparare apoptotica delle cellule imita28.

La difficoltà più comune durante la progettazione di questi esperimenti è trovare una combinazione di fluorofori che consentono i processi desiderati essere imaged, riducendo al minimo photobleaching e fototossicità29. Selezione fluoroforo è in gran parte dettata dai filtri laser/eccitazione, dicroici/cubi e filtri di emissione del microscopio e quindi la scelta di fluorofori spesso è specifico per microscopi individuali. Generalmente, più lungo lunghezza d'onda fluorofori (arancione alla maxima di emissione da', ad es. > 580 nm) sono meno inclini a photobleaching e queste lunghezze d'onda sono meno dannoso per le cellule. Verde fluorofori (emissione maxima ~ 525 nm) possono essere utilizzato, ma la cura deve essere adottate per limitare la fototossicità alle cellule. Fluorofori che eccitano a lunghezze d'onda inferiore a 480 nm (viola e blu) deve essere evitato a causa della loro elevata fototossicità e la propensione per queste lunghezze d'onda di eccitazione di candeggina altri fluorofori29. Ove possibile, dovrebbero essere selezionati ad alta luminosità e stabile fluorofori. Allo stesso modo, i parametri di acquisizione di immagine devono essere regolati per ridurre al minimo photobleaching e fototossicità — ad esempio le esposizioni più lunghe ad intensità bassa eccitazione sono preferite rispetto a più alta intensità di eccitazione48. L'aggiunta di antiossidanti quali la rutina e la rimozione di alcuni componenti di media può migliorare entrambi fotostabilità e ridurre la fototossicità49. Anche con un'attenta selezione di fluorofori e condizioni di imaging, la necessità di limitare photobleaching spesso richiede l'acquisizione di immagini con bassi rapporti segnale-rumore (per un esempio, vedere Figura 5 ). Se quantificare l'intensità di fluorescenza, grande cura deve essere presa per limitare l'elaborazione dell'immagine manufatti; Idealmente, dovrebbero essere analizzati immagini raw senza alcuna forma di trattamento. Se deconvolving le immagini prima di quantificazione, un algoritmo di deconvoluzione che conserva intensità fluorescente dovrà essere usate50,51.

Vivere cella acquisizioni possono essere particolarmente difficile, con successo esperimenti che richiedono un attento equilibrio tra intensità di eccitazione, tempo di esposizione, frame rate e la durata dell'esperimento. Eccitazione intensità e tempo di esposizione deve essere regolato per ridurre al minimo la fototossicità come descritto sopra, con l'avvertenza che i tempi di esposizione più lunghi possono causare artefatti di movimento a causa di movimento cellulare o limitare la frequenza fotogrammi dell'acquisizione. Il frame rate può variare a seconda delle esigenze sperimentali. Telaio-tassi più bassi (5 – 30 min tra i fotogrammi) consentono per l'imaging per un periodo prolungato di tempo (12 h o più) ma forniscono dati minimi sui fenomeni come membrana dinamica e post-fagosoma traffico di efferosomes. Frame rate elevati (più velocemente di 1 fotogramma al secondo) forniscono un'eccellente risoluzione temporale di eventi efferocytic ed efferosome traffico — ma anche con un'attenta selezione di fluorofori, intensità di eccitazione e tempi di esposizione — photobleaching o fototossicità solito limiterà questi esperimenti a meno di un'ora di durata. Nella nostra esperienza, l'acquisizione di immagini per ogni 1-2 min, nel corso di periodi sperimentali di 2 – 6 h, sono un compromesso accettabile che fornisce immagini quantificabili di un numero sufficiente di eventi efferocytic, con risoluzione temporale ragionevole.

Fagosoma alterato e non riuscita è conosciuto per essere coinvolti nella patologia del cancro, aterosclerosi e malattie autoimmuni multiple, con terapie fagosoma-targeting mostrando grande clinica promessa7,52, 53,54,55. Ulteriore sviluppo in questi settori richiederà l'identificazione e la caratterizzazione dei meccanismi molecolari, recettori e vie di segnalazione che regolano fagosoma. L'analisi presentata in questo protocollo rappresenta un potente strumento per questi studi e può essere modificato per quantificare molti dei processi cellulari e segnalazione che regolano fagosoma.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Acknowledgments

Questo studio è stato finanziato dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR) operano Grant MOP-123419, scienze naturali e ingegneria ricerca Consiglio del Canada Discovery Grant 418194 e un ministero di Ontario di ricerca e innovazione primi Research Award a BH. DGW contribuito alcune delle immagini presentate, per l'ottimizzazione dei protocolli e la scrittura del manoscritto; Egli era finanziato da una sovvenzione di innesco della pompa dal Università di Liverpool. CY è finanziato da una borsa di studio laureato Vanier e CIHR MD/PhD Studentship. Le agenzie di finanziamento non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Media Wisent 3500-000-EL
DMEM Media Wisent 319-005-CL
Fetal Bovine Serum (FBS) Wisent 080-150
PBS Wisent 311-010-CL
18 mm circular glass coverslips #1.5 thickness Electron Microscopy Sciences 72290-08 Size and shape of coverslip is not critical, but 18 mm fit into the wells of a standard 12-well plate which simplifies cell culture
Staurosporine Cayman Chemical 81590 Dissolve in DMSO at 1 mM (1,000x stock solution)
Annexin V-Alexa 488 ThermoFisher R37174
EZ-Link NHS-Biotin ThermoFisher 20217 Store in a dessicator. Do not prepare a stock solution.
DMSO Sigma-Aldrich D2650
CellTrace FarRed ThermoFisher C34572
CellTrace Orange ThermoFisher C34851
Hoescht 33342 ThermoFisher 62249
FITC-Streptavadin ThermoFisher SA1001
Lympholyte-poly cell sepration medium Cedarlane Labs CL5071
Recombinant Human M-CSF Peprotech 200-04
Recombinant Human IL-4 Peprotech 300-25
J774.2 Macrophage Cell Line Sigma-Aldrich 85011428-1VL
THP-1 Human Monocyte Cell Line ATCC TIB-202
Jurkat T Cell Line ATCC TIB-152

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References

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Immunologia e infezione problema 138 Fagosoma fagocitosi apoptosi microscopia fagocita macrofago
Quantificazione del fagosoma da microscopia di fluorescenza di cella singola
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Taruc, K., Yin, C., Wootton, D. G., Heit, B. Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (138), e58149, doi:10.3791/58149 (2018).

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