Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Kvantifiering av Efferocytosis av Single-cell fluorescensmikroskopi

Published: August 18, 2018 doi: 10.3791/58149
Automatic Translation
1, 1, 2,3, 1
1Department of Microbiology and Immunology and the Center for Human Immunology, University of Western Ontario, 2Institute of Infection and Global Health, University of Liverpool, 3Department of Respiratory Research, Aintree University Hospital NHS Foundation Trust

Summary

Efferocytosis, att fagocytos av apoptotiska celler, krävs för att upprätthålla homeostas och underlättas av receptorer och signalvägar som tillåter erkännandet, omvälvning och internalisering av apoptotiska celler. Häri, presenterar vi ett fluorescence mikroskopi protokoll för kvantifiering av efferocytosis och aktiviteten av efferocytic signalvägar.

Abstract

Studera regleringen av efferocytosis kräver metoder som har möjlighet att exakt kvantifiera upptaget av apoptotiska celler och sond signalering och cellulära processer som styr efferocytosis. Denna kvantifiering kan vara svårt att utföra eftersom apoptotiska celler är ofta efferocytosed bit för bit, vilket kräver metoder som exakt kan avgränsa mellan den efferocytosed delen av ett apoptotiska mål kontra resterande unengulfed cellular fragment. Det synsätt som beskrivs häri använder tredjeparts dual-märkning angreppssätt för att exakt kvantifiera dynamiken i efferocytosis och efferocytic kapacitet efferocytes såsom makrofager. Cytosolen i apoptotiska cellen är märkt med ett cell-tracking färgämne till möjliggöra övervakning av alla apoptotiska cell-derived material, medan ytan biotinylation av cellen apoptotiska möjliggör differentiering mellan internaliserade och icke-internaliserat apoptotiska celler fraktioner. Efferocytic kapacitet efferocytes bestäms genom att ta fluorescerande bilder av levande eller fasta celler och kvantifiera mängden bundna kontra internaliserade mål, som differentieras efter streptividin färgning. Denna metod erbjuder flera fördelar jämfört med metoder såsom flödescytometri, nämligen den korrekt avgränsningen av icke-efferocytosed kontra efferocytosed apoptotiska celler fraktioner, förmågan att mäta efferocytic dynamics av live-cell mikroskopi, och den kapacitet att utföra studier på cellulär signalering i celler som uttrycker fluorescently-märkt transgener. Kombinerat, ligga de metoder som anges i detta protokoll till grund för en flexibel experimentella tillvägagångssätt som kan användas för att exakt kvantifiera efferocytic aktivitet och förhöra cellulära signalvägar som är aktiva under efferocytosis.

Introduction

Apoptos är, programmerad celldöd, en starkt reglerade fysiologisk process som förekommer i de flesta flercelliga organismer och är avgörande för deras utveckling och homeostas1. Förutom att vara involverad i normala cellförnyelse och embryoutveckling, apoptos möjliggör eliminering av infekterade eller skadade celler från vävnader och kan utlösas som svar på infektion, inflammation, cancer, och också av medicinska åtgärder till exempel strålbehandling eller steroider1. Apoptotiska celler exponerar ”äta-mig” signaler på sin cellyta som erkänns av receptorer på en rad professionella och icke-professionella fagocyter, kollektivt refereras till som ”efferocytes”. Engagemang av dessa receptorer inducerar de upptag och nedbrytning av apoptotiska cellen genom efferocyte genom en process som kallas efferocytosis2,3. Fosfatidylserin är bäst kännetecknas äta-mig signalerar drivande efferocytosis. Det är normalt begränsad till de inre bipacksedeln av plasmamembranet, med apoptos aktivera en lipid-scramblase som stör denna membran asymmetri, därmed utsätta fosfatidylserin på cell surface4. Fosfatidylserin finns på extracellulära ytan av vissa icke-apoptotiska celler, såsom mogen makrofager och aktiverade trombocyter. Dessa celler är dock inte efferocytosed på grund av ”inte Ät mig” signaler, såsom CD47, för på deras cell surface5,6,7. Exponerade fosfatidylserin är erkänd av en array av efferocytic receptorer uttrycks av efferocytes. Bindning av dessa receptorer att fosfatidylserin, aktiverar antingen direkt eller genom hjälp av opsonins, signalvägar som främjar omvälvning av den apoptotiska cellen till en membran-bundna vakuol kallas den efferosome8, 9 , 10 , 11 , 12. efferosome säkringar sekventiellt med endosomes och lysosomer, som levererar den molekylära maskinen som nödvändigt att syrsätt efferosome och försämra apoptotiska cell Last13,14. När förstörd, apoptotiska cell-derived material smugglas till den återvinning endosome – en process som begränsar immunsvar mot apoptotiska cell-derived antigener, och som kan möjliggöra återvinning av näringsämnen från den apoptotiska celler13, 15. Ett misslyckande i efferocytosis resulterar i nedsatt clearance av apoptotiska celler; dessa ej godkänd celler genomgår så småningom sekundära nekros. Nekrotiska celler släppa pro-inflammatoriska cytosoliska innehållet, patogener och autoantigener i den extracellulära miljön, vilket driver en rad infektiös, inflammatoriska och autoimmuna sjukdomar16,17. Tillsammans, apoptos och efferocytosis underlätta avlägsnande av döende och döda celler och möjliggör upprätthållandet av vävnad homeostas.

Undersöka de molekylära mekanismerna bakom efferocytosis kräver metoder som ger en tydlig kvantifiering av apoptotiska celler upptag. Denna kvantifiering kompliceras av det faktum att till skillnad från andra upptag mekanismer såsom endocytos och fagocytos18,19, efferocytosis inte kan leda omvälvning av intakt målcellen, vilket resulterar i det planlösa upptaget apoptotiska cellen av de efferocyte20. Protokollet beskrivs häri beskriver en in vitro- efferocytosis analysmetod som ger korrekt avgränsning av de internaliserade kontra icke-internaliserat delar av enskilda apoptotiska celler och kan kombineras med en mängd fast-cell och Live-cell mikroskopi metoder. Traditionella fagocytos analyser lägga till antikroppar som är specifika för fagocytos målet i slutet av experimentet för att märka icke-internaliserat mål, där som vår metod skiljer sig genom märkning apoptotiska målet med kovalent-länkade biotin21 , 22. medan apoptotiska celler specifika antikroppar kan användas i denna analys, metoden med biotinylation möjliggör alla protein-bärande mål att vara märkta och undviker eventuella problem med sekundär antikropp korsreaktivitet om immunfärgning utförs . Specifikt, redogöra vi för beredning av apoptotiska Jurkat celler som har dual-fläckade både en cell tracking färgämne och biotin. Cellen spårning dye tillåter att apoptotiska cell-derived material kan vara spåras under efferocytosis, medan ytan biotinylation tillåter diskriminering av internaliserat från icke-internaliserat delar av efferocytosed apoptotiska celler. Vi beskriver också kultur och beredning av J774.2 och THP-1 cellinjer användas som murina och mänskliga efferocytes, monocyt-derived M2 makrofager som ett exempel på primär cell efferocytosis, och Jurkat celler för användning som efferocytic mål. Dessa metoder kan enkelt appliceras till andra cellinjer och primära celler, målceller som genomgår någon form av celldöd (e.g. apoptos, nekros och necroptosis) och micron stora härmar som simulerar apoptotiska celler genom lipid beläggningar eller beläggning med ligander specifikt för en efferocytic receptor av intresse.

Den metod som anges i detta protokoll har flera fördelar jämfört med de flöde flödescytometri baserade metoder som vanligen används i fält23,24. Genom direkt imaging fagocytsystemet-apoptotiska celler interaktionen, kombinerat med tydlig märkning av både totalt och icke-internaliserat apoptotiska cell material, kan kvantitativa åtgärder av efferocytosis göras. Dessutom begränsar användningen av pH-okänsliga fluorophores störfaktorer såsom förtryck av FITC och god Jordbrukarsed fluorescens vid lysosomal pH som förvirrar några alternativa metoder25. Slutligen, medan inte beskrivas i detalj, dessa metoder kan vara anställda använder efferocytes uttrycker fluorescently-märkt transgener, eller med efter fixering immunfärgning, att möjliggöra kvantifiering av signalering molekyl verksamhet och övervakning av den cellulära processer under efferocytosis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Insamling av blod från friska frivilliga godkändes av etikprövningsnämnd Health Science forskning på University of Western Ontario. Venpunktion utfördes i enlighet med riktlinjerna i Tri-rådets politiska uttalande om mänsklig forskning.

1. kultur och förberedelse av raden THP-1 monocyt Cell

  1. Kultur THP-1 monocyter som en suspension kultur i T25 kolvar vid 37 ° C + 5% CO2. Cellerna bör odlas i 5 mL Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) + 10% fetalt bovint Serum (FBS).
  2. Varje dag suspend celler jämnt i hela tillväxtmassmedia genom att försiktigt skaka kolven, sedan räkna omedelbart celler med en hemocytometer. Cellerna bör vara passaged när cell densiteten når 1 x 106 celler/mL:
    1. Pre värma RPMI 1640 + 10% FBS i 37 ° C vattenbad.
    2. Överföra 2 x 105 celler i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör eller en 15 mL konisk slang och pellet celler genom centrifugering vid 500 x g i rumstemperatur i 5 min.
    3. Ta bort supernatanten utan att störa cellpelleten och återsuspendera pelleten i 1 mL (1,5 mL mikrocentrifug rör) eller 5 mL (15 mL koniska rör) fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS).
    4. Centrifugera röret vid 500 x g i rumstemperatur i 5 min. ta bort PBS utan att störa cellpelleten.
    5. Återsuspendera pelleten i 1 mL färsk RPMI 1640 + 10% FBS.
    6. Till en ny T25 kolv plats 4 mL värmde media, och till detta lägga till återsuspenderade cellerna från 1.2.5. Kultur i en 37 ° C + 5% CO2 inkubator tills cellerna kräver passaging (normalt 3 dagar), eller celler krävs för ett experiment.
  3. För ett experiment med THP-1-härledda makrofager, tar du bort det nödvändiga antalet celler från kolven och plattan innan passaging:
    1. Placera det nödvändiga antalet 18 mm runda glas coverslips (nr 1.5 tjocklek) i brunnar 12-well platta — typiskt 1 täckglas per tillstånd och/eller tidpunkt. I varje väl alikvotens 5 x 104 THP-1 monocyter. Antalet celler läggas till varje brunn kan ändras, om det behövs.
    2. Ta upp den totala volymen av varje cell som innehåller väl till 1 mL med hjälp av RPMI + 10% FBS värmas till 37 ° C.
    3. Tillsätt 100 nM phorbol 12-isopropylmyristat 13-acetat (PMA) till varje brunn och kultur i 3 dagar till inducerar differentiering av THP-1 monocyter in makrofag-liknande celler.

2. kultur och förberedelse av raden J774.2 makrofag Cell

  1. Kultur J774.2 celler i T25 kolvar vid 37 ° C + 5% CO2. Cellerna bör odlas i 5 mL Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) + 10% FBS och anpassade när kulturen når 80-90% konfluens. Till passagen celler:
    1. Ta bort allt material från kolven och upphov en gång med 5 mL PBS.
    2. Ta bort PBS från kolven och ersätta med 5 mL färsk DMEM + 10% FBS.
    3. Använda en cell-skrapa, skrapa botten av kolven att avbryta cellerna i media. Kraftfullt Pipettera cellerna flera gånger för att bryta upp någon cell aggregat.
    4. Späd 1:5 celler genom att ta bort 4 mL cellsuspension från kolven och ersätta den med 4 mL färsk media. Återstående cellsuspensionen kan kasseras, används för att starta en ny cellkultur i en färsk T25 kolv, eller användas för ett experiment.
  2. Ställa in för ett efferocytosis test med J774.2 celler:
    1. En dag före början av experimentet, upphäva J774.2 celler i 5 mL färsk media, enligt steg 2.1.1–2.1.3. Räkna celler som använder en hemocytometer och förbereda den nödvändiga mängden celler vid en koncentration på 5 x 104 celler/mL.
    2. Placera det nödvändiga antalet 18 mm runda glas coverslips (nr 1.5 tjocklek) i brunnar 12-bra platta. Tja alikvotens 1 mL cellsuspension 5 x 104 celler/mL i varje.
    3. Kultur över natten så att cellerna att följa täckglaset och återhämta sig från passaging.

3. kultur av primära mänskliga M2 makrofager

  1. Samla 10 mL hepariniserad humant blod för varje 12-väl tallrik M2 makrofager krävs.
  2. I en 15 mL centrifugrör, lager 5 mL av humanblod ovanpå 5 mL före värmde Lympholyte-poly cell separation medium. Förbereda flera rör om bearbetning > 5 mL blod i stället för att använda större volym rör.
  3. Centrifugera vid 300 x g i 35 min, med medelstora acceleration och ingen paus.
  4. Ta försiktigt bort övre mononukleära celler rika bandet med en plast vi rekommenderar och överföring till en 50 mL centrifugrör. Om flera rör var beredd att i steg 3,2 kan banden slås samman till en enda 50 mL tub. Få volym av rör upp till 50 mL med PBS.
  5. Centrifugera vid 300 x g i 8 min och avlägsna supernatanten. Under detta steg placera Ånghärdad 18 mm diameter cirkulär coverslips (nr 1.5 tjocklek) i varje brunn 12-bra platta.
  6. Återsuspendera cellpelleten i 300 µL serum-fri RPMI 1640 per önskat antal brunnar; t.ex. om 10 mL blod bearbetades för att förbereda en hela 12 väl platta, avbryta cellpelleten i 3,6 mL av media.
  7. Lägga till 300 µL cellsuspension varje täckglas-innehållande väl i 12-väl plattan. Inkubera i 1 timme vid 37 ° C + 5% CO2.
  8. Försiktigt tvätta täckglas 3 x med 1 mL värmde PBS ta bort icke-anhängare celler.
  9. Tillsätt 1 mL RPMI 1640 + 10% FBS + 10 ng/mL rekombinant human M-CSF + cell kultur antibiotikum/antimycotic. Inkubera vid 37 ° C + 5% CO2 i 5 dagar.
  10. Ersätta media med RPMI 1640 + 10% FBS + 10 ng/mL rekombinant humant M-CSF + 10 ng/mL rekombinant humant IL-4 + cell kultur antibiotikum/antimycotic. Inkubera vid 37 ° C + 5% CO2 i 2 dagar att slutföra M2 polarisering.
  11. Polariserade makrofager bör användas inom 3 dagar.

4. beredning av apoptotiska Jurkat celler

  1. Kultur Jurkat celler i 5 mL RPMI 1640 + 10% FBS vid 37 ° C + 5% CO2. Jurkats är en suspension cellinje och kan upprätthållas av passaging 1:5 i färska, pre värmde media var 3 – 5 dagar.
  2. För att förbereda apoptotiska celler, Tillåt den Jurkat kulturen att växa till hög densitet (4 – 5 dagar efter passaging). Alikvotens 1,5 mL i en 1,5 mL mikrocentrifug rör och pellet celler genom centrifugering vid 500 x g i 5 min.
  3. Avlägsna supernatanten och slamma cellpelleten i 1 mL serumfritt RPMI 1640 medium innehållande 1 µM staurosporine.
  4. Inkubera 16 h vid 37 ° C + 5% CO2 att återge celler apoptotiska.
  5. Om du vill bekräfta induktion av apoptos genom färgning med Annexin V:
    1. Alikvotens 100 µL av staurosporine-behandlade Jurkat cellkultur i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör. Pellet celler genom centrifugering vid 500 x g i 5 min, Kassera supernatanten och slamma cellpelleten i 100 µL serum-fri RPMI 1640 medium.
    2. Tillsätt 1 µL av fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC)-konjugerat Annexin V och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur i mörkret.
    3. Tillsätt 900 µL av PBS och överföra hela volymen till en enda väl 12-well platta innehållande en 18 mm runda täckglas (nr 1.5 tjocklek). Snurra ner i en centrifug som utrustade med en tallrik adapter vid 200 x g för 1 min att tvinga celler att följa täckglaset. Alternativt kan celler placeras i en kamrar bild för avbildning.
    4. Bild med fluorescens Mikroskop.

5. kvantifiera Efferocytic upptag och dynamik med hjälp av en fast Cell Efferocytosis Assay och Inside-out infärgning

  1. Förbereda THP-1, J774.2 eller M2 mänskliga makrofager som beskrivs i avsnitten 1-3, respektive.
  2. Kvällen före start av experimentet förbereda apoptotiska Jurkat celler som beskrivs i avsnitt 4.
  3. Omedelbart före experimentet, räkna apoptotiska celler med hjälp av en hemocytometer. Överföra tillräckligt antal apoptotiska celler i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör – vi lägger vanligtvis 5 x 105 celler per brunn, som tillhandahåller target: efferocyte förhållandet 10:1.
  4. Pellet Jurkat celler genom centrifugering vid 500 x g i 5 min och återsuspendera i 500 μL av PBS.
  5. Under centrifugeringen, alikvotens 10 µL av DMSO till en ny 1,5 mL mikrocentrifug rör. Lös in DMSO en minimal mängd av N-hydroxysuccinimidobiotin (NHS-Biotin). 5-10 kristaller (~0.005 mg) är tillräckligt.
  6. Överföra 500 μL apoptotiska celler/PBS suspensionen till den DMSO/NHS-biotin som innehåller tube. Späd sedan en cell tracking dye till tillverkarens rekommenderade koncentrationen i apoptotiska cellsuspension. Se till att markera en cell tracking färgämne som inte överlappar spektralt med FITC-streptividin (t.ex. röd eller mån cell tracking färgämne).
  7. Inkubera suspensionen i 20 min i rumstemperatur i mörkret. Tillsätt en motsvarande volym RPMI 1640 + 10% FBS och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur i mörkret att släcka någon oreagerad färgämne.
  8. Pellet celler genom centrifugering vid 500 x g i 5 min, Kassera supernatanten och slamma färgade apoptotiska celler i 100 µL av RPMI 1640 + 10% FBS per brunn av makrofager.
  9. Tillsätt 100 µL av färgade apoptotiska cellsuspension droppvis till varje brunn av makrofager. Centrifugera 200 x g för 1 min i en centrifug som utrustade med en tallrik adapter att tvinga kontakt mellan makrofager och apoptotiska celler.
  10. Inkubera plattan i den önskvärda tidsperioden vid 37 ° C + 5% CO2 i en vävnadskultur inkubator. Makrofager, efferocytosed material är vanligtvis först upptäckas efter 20 – 30 min, och slutförs efter 120 – 180 min.
  11. Vid önskad tid (s) ta bort celler från inkubatorn. Tvätta cellerna två gånger med 1 mL av rumstemperatur PBS att stoppa efferocytosis och ta bort icke-efferocytosed apoptotiska celler.
  12. Lägg till FITC-konjugerad streptividin vid en 1:1,000 spädning till varje brunn och inkubera i 20 min i mörker. Detta kommer att beteckna den exponerade biotin på icke-efferocytosed apoptotiska cell material.
    Obs: Om så önskas, cellkärna kan färgas under detta steg genom tillsats av 1:20,000 utspädning av Hoechst 33342 eller 4', 6-diamidin-2-fenylindol, dihydroklorid (DAPI).
  13. Tvätta cellerna 3 gånger med 1 mL PBS, försiktigt skaka eller gunga proverna för 5 min per skölj. Fixa celler med 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS i 20 min i rumstemperatur. Skölj celler en gång med PBS ta bort överflödig PFA.
  14. Montera coverslips på en bild för avbildning och överföring till fluorescens Mikroskop. Fånga z-högar av ett tillräckligt antal celler för exakt kvantifiering — normalt 10 – 30 celler per tillstånd. Icke-internaliserat apoptotiska cell material skall framgå i den resulterande bilden som cell tracking dye märkt material omsluten av FITC-streptividin färgning, medan efferocytosed material bildar diskret cell tracking dye puncta gratis av någon streptividin färgning.
  15. Kvantifiera efferocytosis i de resulterande bilderna via en rad åtgärder:
    1. Beräkna efferocytic index genom att bestämma Genomsnittligt antal diskreta efferosomes (cell tracking dye+/streptavidin– puncta) per makrofag. Kvantifiera endast makrofager bunden till en apoptotiska cell eller innehåller ≥1 synliga efferosomes. Spela in makrofager bunden till en apoptotiska cell, men saknar diskreta efferosomes, ha ett efferocytic index 0.
    2. Beräkna efferocytic effektivitet genom att mäta fraktionen av makrofager som innehåller ≥ 1 efferosome.
    3. Beräkna efferocytosis av imaging cellerna fixeras och färgas vid flera tidpunkter. Enda bild makrofager bunden till apoptotiska celler eller innehåller synliga efferosomes, med z-stackar fångas i varje cell. När avbildas, avgöra graden av efferocytosis:
      1. Med streptividin färgningen som en guide och freehand eller polygon markeringsverktyget i FIJI/ImageJ26 (eller andra avbildningspaket analys programvara), cirkel alla cellens spårning dye+/streptavidin– (e.g. internaliserat) material i ett enda plan av z-stacken. Mäta integrerade intensiteten i cellen spårning dye denna region. Individuella åtgärder för varje efferosome (e.g. diameter, positionering i förhållande till den cellens kantlinje eller nucleus, etc.)15,27 kan enkelt förvärvas samtidigt med dessa mätningar, kraftigt öka data som samlats in under analys.
      2. På samma z-avsnitt med hjälp av den streptividin färgning som en guide och freehand eller polygon markeringsverktyget och cirkeln alla cellens spårning dye+/streptavidin+ (t.ex. icke-internaliserat) material i ett enda plan av z-stacken . Endast omfatta färgning från apoptotiska celler i kontakt med fagocytsystemet. Mäta integrerade intensiteten i denna region.
      3. Upprepa steg 4.2.3.1 till 4.2.3.2 för de återstående z-avsnitten av bilden. Summera integrerad intensiteten av efferocytosed (Σeff) och icke-efferocytosed (Σne) material. Fraktionen av apoptotiska cellen som har varit efferocytosed kan beräknas för cellen som:
        Equation
      4. Kvantifiera den fraktion efferocytosed för alla celler vid alla tidpunkter. Observera att apoptotiska celler/efferosomes fluorescerande intensitet kan variera mellan bilder på grund av variationer i upptaget av cell tracking färgämnen genom enskilda apoptotiska celler, och på grund av förändringar i bild förvärv parametrar såsom exponeringstid. Som sådan, endast jämför normaliserade värden såsom bråkdel Efferocytosed eller intensitet-oberoende värden såsom efferocytic index och efferocytic effektivitet, mellan bilder, mellan experimentella förhållanden och mellan upprepa experiment.
    4. För att säkerställa den resulterande datauppsättningen återspeglar variationen i efferocytosis mellan celler, genomför dessa analyser på det maximala antalet celler som möjligt i varje experiment.
      Anmärkning: Efferocytic effektivitet och efferocytic index kan beräknas snabbt (några sekunder/cell) och vi vanligtvis syftar till att analysera minst 100 celler per experiment, upprepa varje experiment minst 3 gånger. Beräkning av andelen av efferocytosed material och efferosome-specifika åtgärder är mer arbetskrävande, vanligtvis tar 2 – 3 min/cell för en erfaren analytiker. För dessa beräkningar kvantifiera vi minst 15 celler per tillstånd, per experiment.
    5. Spela in efferocytic index, bråkdel efferocytosed och enskilda efferosome data på basis per cell.
      Obs: Detta tillåter för dataanalys med encelliga metoder, vilket möjliggör mellan cell variationer att kvantifieras. Populationsnivå analyser kan fortfarande utföras på dessa datamängder av genomsnitt encelliga data förvärvade i individuella experiment. Efferosome-specifika mätningar kan analyseras på populationsnivå, encelliga nivå, och som ensembler (t.ex. som populationer av efferosomes oberoende av de celler som innehåller dem)15.

6. levande Cell Efferocytosis Assay använder apoptotiska celler

  1. Förbereda THP-1, J774.2 eller M2 makrofager som beskrivs i steg 1-3, respektive. Om så krävs, celler bör vara transfekterade med transgener eller andra genetiska konstruerar minst 18 h innan du utför några experiment.
  2. Kvällen före start av experimentet, förbereda apoptotiska Jurkat celler som beskrivs i avsnitten 4 och 5 med följande ändringar:
    1. Späd cellerna och inducera apoptos enligt 4.1 – 4.3, och samla erforderligt antal apoptotiska celler enligt 5.3-5.4.
    2. Lägga till en cell tracking färgämne på tillverkarens rekommenderade koncentrationen till apoptotiska cellsuspension. Inkubera suspensionen i 20 min i rumstemperatur i mörkret. Tillsätt en motsvarande volym RPMI 1640 + 10% FBS och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur i mörkret att släcka någon oreagerad färgämne. Lägg inte till NHS-biotin för dessa experiment.
    3. Pellet celler genom centrifugering vid 500 x g i 5 min, Kassera supernatanten och slamma färgade apoptotiska celler i 100 µL RPMI 1640 + 10% FBS per brunn av makrofager.
  3. Om så krävs, etikett makrofager genom att ta bort kultur media från varje brunn och lägga till 500 µL PBS med tillverkarna rekommenderas spädning av en cell tracking färgämne som inte överlappar spektralt med cellen spårning färgämne tillsätts de apoptotiska cellerna eller någon fluorescerande transgener uttryckt av makrofager. Inkubera i 20 min i rumstemperatur i mörkret, tillsätt en motsvarande volym av DMEM + 10% sedan FBS och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur i mörkret att släcka någon oreagerad färgämne.
  4. Överföra det makrofag-innehållande täckglaset till en Leiden kammare. Lägga till 400 µL DMEM + 10% FBS, följt av 100 µL av märkt apoptotiska cellsuspension. Blanda genom att försiktigt pipettering media 2 – 3 gånger.
  5. Överföra Leiden kammaren till en uppvärmd och CO2-perfunderade kammare av en levande cell fluorescerande Mikroskop.
    Obs: För Mikroskop uppställningar som saknar CO2 perfusion funktioner, Använd vävnad odlingsmedium buffras med 1 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syra (HEPES) snarare än natriumbikarbonat till upprätthålla fysiologiska pH medan den kultur utsätts för luft.
  6. Fånga en time-lapse serie innehållande ett vitt ljus (faskontrast eller DIC) bild och bilder av alla fluorescerande etiketter:
    1. Använd en 100 X objektiv för experiment där lösa fina detaljer är krävs (t.ex. membran dynamics fagocytsystemet-apoptotiska cell interaktioner). Under tiden, mer allmänna åtgärder (andelen apoptotiska celler upptag, interaktion tid mellan makrofager och apoptotiska celler, etc.) är bäst avbildas med en 60 X eller 63 X-objektiv.
    2. Om tillgängligt, Använd punkt-besök till bild flera fält-of-view under ett enda förvärv, vilket ökar antalet efferocytic händelser fångas i ett enda experiment
    3. Eftersom efferocytes uppsluka ofta små fragment av apoptotiska celler, i stället för intakta celler, är det bäst att fånga z-stackar. För att minimera fototoxicitet, fånga z-grupper åtskilda av fokal djupet av ditt Mikroskop mål (vanligtvis 0,5-1,0 µm), genom tjockleken på cellen (vanligtvis 8-10 µm för makrofager, e.g. 8 – 20 skivor/cell). Detta säkerställer att alla omvälvning och människohandel händelser kommer att vara synliga i minst en z-planet. Alternativt kan du använda stora (1 – 5 µm diameter) apoptotiska celler härmar eller apoptotiska celler som genomgår minimal fragmentering under efferocytosis (t.ex. värme chockad neutrofiler) istället utan z-stapling. Vi har beskrivit att förbereda både härmar och apoptotiska neutrofiler tidigare28.
    4. Att minimera fotoblekning, Använd ljusa fluorophores och fånga bilder med förvärvet inställningar som minimerar fotoblekning — t.ex. lågintensiva excitation kombinerat med hög kamera vinst och kort exponering gånger29. Vi rekommenderar att du använder ett mikroskop som är utrustat med en hög känslighet elektromagnetisk kostnad – tillsammans enhet (EM-CCD) kamera eller spinning-disk confocal och en höghastighets piezoelektriska mekaniska scen, för denna form av imaging.
  7. Antalet möjliga analysmetoder som kan tillämpas på dessa time-lapse video är omfattande och bortom vår förmåga att granska här. Som några exempel, använda manuell eller automatisk spårning programvara för att spåra fusion, fission och rörlighet för efferosomes inom celler15, kvantifiera efferosome fusion dynamics med endolysosomer av colocalization analys i makrofager uttrycker kupé-specifika fluorescerande transgener13, monitor upptag processer såsom sondering och kopp bildandet30, bestämma rekrytering dynamiken i signalering och människohandel proteiner till efferosome13, eller kvantifiera nedbrytningsvägar aktiviteten av efferosomes använder apoptotiska celler märkta med pH-känsliga, antioxidant-känslig eller proteas-aktiverad fluorophores31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Övernattning kultur av Jurkat celler med 1 µM staurosporine resultat i apoptos av > 95% av celler, som kan bekräftas med Annexin V färgning (figur 1). Andra celltyper kan användas för dessa experiment, men koncentrationen av staurosporine och staurosporine behandlingstiden kommer att behöva optimeras för varje cellinje. För tillförlitlig detektering och kvantifiering av efferocytosis, > 80% av celler bör vara apoptotiska innan du lägger till dem till efferocytes. Andra inducerare av apoptos (t.ex. värme-chock, etoposid och UV-ljus) kan också användas, men enligt vår erfarenhet, dessa producerar en mer heterogen induktion av apoptos och resultatet i blandad cellpopulationer innehållande apoptotiska, sekundär nekrotisk och icke-apoptotiska målceller.

För fast-cell imaging med inifrån och ut färgning, nära apposed efferocyte-apoptotiska cell interaktioner bör observeras vid alla tidpunkter, med tydligt avgränsad icke-efferocytosed (streptividin+/cell spårning dye+) och efferocytosed (streptividin–/cell spårning+) material synliga (figur 2). Det är viktigt att Observera att synapsen som bildas mellan efferocyte och den apoptotiska cellen är ofta hårt nog för att utesluta streptividin, och således valfri cell tracking dye målat objekt med streptividin vid någon punkt på dess omkrets bör betraktas som en bundna cellen och inte en efferosome. I de flesta experiment kommer att fraktionen av apoptotiska celler som är efferocytosed öka i en tidsberoende mode, antingen tills inga icke-internaliserat apoptotiska cell material återstår, eller tills fagocytsystemet når sin maximala efferocytic kapacitet (figur 3). analys utförts och registrerats för enskilda celler (figur 3A) vanligtvis, men data kan vara i genomsnitt över celler inom enskilda experiment och medelvärdena från flera experimentella repetitioner analyseras med konventionella statistiska metoder (figur 3B). Ändringar i detta standardiserade protokoll kan göras att möjliggöra användning av primära celltyper, alternativa efferocytic mål, och för ytterligare färgning som ska ingå. Figur 4 visar exempelvis en primär M2-polariserade mänskliga makrofager som har efferocytosed apoptotiska celler härmar består av 3 µm diameter kiseldioxid pärlor belagda i en blandning av fosfatidylserin och fosfatidylkolin28, följt av efterföljande fixering, permeabilisering och immunfärgning för återvinning endosome markören Rab17.

Under levande cell imaging efferocytic professionella fagocyter kommer att observeras att utvidga och dra tillbaka små processer i en process som kallas ”sondera”30 (figur 5, t = 0); När dessa processer möter ett mål de fast följer målet och dra det till fagocytsystemet. Denna sondering verksamhet kan inte observeras med icke-professionella fagocyter som epitelceller. Efferocyte bildar en tät ”efferocytic synaps”32 mellan sig och apoptotiska cellen, med denna synaps ofta omsluter en stor del av apoptotiska cellen (figur 5, t = 10). Efferocyte kommer att sedan dra bitar av cellen apoptotiska från denna synaps i sin cytosol (figur 5, 10-30 min). Snart efter sin bildning smugglas dessa begynnande efferosomes från synapsen och mot peri-nukleära området, ett resultat av Rab7/RILP/dynein-dynactin medierad transport33. Över tiden efferosomes kommer att krympa och de resulterande försämrade material omfördelas i hela cellen, där de sannolikt absorberas eller återvunnet13,15. Förmågan att upptäcka dessa processer är starkt beroende av förvärv-bildhastighet och varaktigheten av experimentet. Snabba processer såsom sondering kan inte observeras på ram-lägre, medan långsam händelser (efferosome människohandel och absorption) kräver längre imaging perioder – i båda fallen dessa stor bild förvärv ofta kräver avskiljning av lägre intensitet bilder att begränsa fotoblekning och fototoxicitet (figur 5). Som med fast-cell analysen, kan den live-cell versionen av denna analys modifieras för att passa behoven hos utredaren. Figur 6 visar en enskild bildruta i en levande cell förvärv av J774.2 makrofager uttrycker transgener som fluorescently demark plasmamembranet (PM-GFP) och som selektivt binder den signalering lipid PI (3) P (FYVE-RFP). Generation av PI (3) P på efferosome membranet kan upptäckas som samtidig lokalisering av FYVE-RFP med PM-GFP+ efferosome membranet. Genom att kvantifiera FYVE-RFP intensitet på efferosome, dynamiken i PI (3) P signalering på efferosome kan kvantifieras (figur 6).

Figure 1
Figur 1: Annexin V färgning av apoptotiska och Jurkat för icke - apoptotiska celler. Annexin V etiketter fosfatidylserin ”äta-mig” signal som exponeras av apoptotiska celler. (Överst) Obehandlad (UT) Jurkat celler Visa en frisk (slät och rundad) morfologi (DIC) och fläcken inte med Annexin V. (nederst) Jurkat celler odlade över natten med 1 µM staurosporine (STS) ta på en apoptotiska morfologi (oregelbunden och blebbed) och fläcken med Annexin V. skalstapeln = 10 µm, bild intensitet visas som en färgkarta. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: tidiga och sena omvälvning av apoptotiska Jurkat celler av J774.2 makrofager. Bilderna är av makrofager vid en tidig (60 min) och sena (120 min) skede av efferocytosis. Vitt ljus (DIC) bilden illustrerar det snäva gränssnittet mellan makrofag (mφ) och apoptotiska celler (AC). Cell tracking färgämne (CTD, röd) avslöjar platsen för alla apoptotiska cell-derived material. FITC-streptividin färgning (Str, grön) identifierar delen av cellen apoptotiska som inte har ännu varit uppslukat av makrofager. Makrofag kärnor var pre betsad med DAPI (blå). Efferosomes (röd) kontra icke-internaliserat portion av cellen apoptotiska (grön/gul) identifieras lätt i en överlagring av streptividin och cell tracking dye bilder. Notera avsaknaden av streptividin färgning på gränssnittet makrofag-apoptotiska celler vid en tidig tidpunkt, skapad av uteslutandet av streptividin från tätt bildade efferocytic synapsen (*). Makrofag kärnan identifieras av Hoechst färgning (blå). Skalstapeln = 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: tid-kurs för fraktionen av apoptotiska Cell Efferocytosed av J774.2 makrofager. Efferocytosis analyser utfördes för den angivna tider och fraktionen av uppslukas apoptotiska cell material bestäms vid varje tidpunkt med hjälp av cell tracking färgämne/Streptavadin färgning. (A) bråkdel av efferocytosed material inom enskilda makrofager, data presenteras från enskilda celler, horisontell stapel anger medelvärdet. 12 – 17 celler per tillstånd, data från 1 5 oberoende experiment. (B) bråkdel av efferocytosed material, i genomsnitt över 5 oberoende experiment, minst 10 celler/skick/repetera. p < 0,05 jämfört med 30 min, Kruskal-Wallis test med Dunn korrigering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: analys av Rab17 rekrytering till Efferosomes i primära mänskliga makrofager. Ett M2-polariserade makrofag omslöt apoptotiska celler härmar (pilar) och var immunostained för Rab17 (grön) 60 min efter omvälvning. Skalstapeln = 5 µm. cellkärnan är målat med Hoeschst, DIC bilden visar cellmorfologi och används för att identifiera apoptotiska celler härmar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: levande cell efferocytosis assay. En cell tracking dye labeledJ774.2 makrofag (mφ, grön) spelades in som det omslöt en apoptotiska Jurkat cell märkt med en annan färg cell tracking färgämne (AC, röd). Apoptotiska cellen delas i flera fragment under processen internalisering, vilket resulterar i planlösa upptag och bildandet av flera efferosomes (pilar). Skalstapeln = 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: använda fluorescerande transgener för att undersöka Efferocytic signalering. En J774.2 makrofag var transfekterade med GFP-märkta plasmamembranet markör (PM, grön) och FYVE-RFP konstruktion, som binder den signalering lipid PI (3) P (röd). Efferocytosis bildar en begynnande plasmamembran-derived efferosome som innehåller PI (3) P, som detekteras av FYVE-RFP rekrytering (pil). Dynamiken i PI (3) P signalering kvantifierades som vik intensitet i förhållande till den FYVE-RFP-signalen som är närvarande vid tidpunkten för efferosome stängning (t = 0, graf). Detta experiment används en apoptotiska cell-härma pärla (pil, DIC) snarare än apoptotiska celler. Skalstapeln = 5 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De metoder som anges i detta protokoll aktiverar imaging och kvantifiering av processen dynamisk efferocytic med metoder som både fast-cell och live-cell. Dessa metoder erbjuder flera fördelar över vanligt sysselsatta flöde flödescytometri-baserade metoder23,24. Användningen av inifrån-ut färgning med fasta prover ger en mer robust och exakt kvantifiering av hastigheten och omfattningen av efferocytosis — faktiskt många flöde flödescytometri-baserade metoder helt enkelt märka apoptotiska celler och makrofager med olika fluorophores, och Poäng efferocytosis som fraktionen av makrofager Co färgning med apoptotiska cell markören, således saknar förmåga att skilja mellan bundna kontra internaliserade apoptotiska cell material. Alternativa flöde flödescytometri metoder inkluderar de som använder pHrodo märkt apoptotiska celler24. pHrodo är en pH-känsliga fluorophore som ökar i ljusstyrka vid surt pH. Medan denna fluorophore ger bättre upplösning mellan icke-internaliserat kontra internaliserade material, eftersom fluorescens ökar specifikt efter internalisering av cellen apoptotiska och försurning av efferosome, kan resultaten vara tvetydiga på grund av sjukdomsprocesser som försämrar efferosome försurning34,35, och denna metod kommer att missa efferosomes (före försurning) tidigt i efferocytosis36, ligger i försurning-fattiga regioner i i cell27, eller i celler som svagt syrsätt deras lysosomer37. En andra fördel med den metod som beskrivs i detta protokoll är användningen av live-cell imaging för att mäta dynamiken i efferocytosis, som processer såsom sondera, bildandet av efferocytic synapsen, och efferosomes intracellulära människohandeln kan inte detekteras med hjälp av flödet flödescytometri-baserade metoder.

Även denna metod erbjuder många fördelar, experiment som kräver kvantifiering av många hundratals celler — e.g. experiment att upptäcka sällsynta händelser, eller kvantifiera mycket varierande processer — kan vara svårt, med analys av dessa stora datamängder tar orimligt mycket tid. Hög genomströmning imaging metoder såsom imaging flöde flödescytometri38 kan tillåta högre genomströmning än konventionella mikroskopi, även om i vår erfarenhet nuvarande automatiserad bild analysprogram inte kan alltid exakt segmentera icke internaliserat-kontra internaliserade material. Specifikt, snäva efferocytic synapsen som bildar mellan apoptotiska celler och efferocyte kan utesluta streptividin färgning, och som sådan en bunden apoptotiska cell visas ofta som en fast massa i cellen spårning dye kanal, som delvis är höljebärande av streptividin färgning (figur 2). Således, medan efferosomes identifieras lätt algoritmiskt, den bundna delen av cellen apoptotiska är ofta feltolkat som en efferosome på grund av svårigheten att redovisning för partiell streptividin färgning. Medan vi har ännu att hitta ett program som kan korrekt identifiera och kvantifiera planlösa upptaget av apoptotiska celler utan mänsklig hjälp, har vi hittat den trainable semi automatiserade system39 kan avsevärt påskynda analys, minska bråk efferocytosed mätningar från 2 – 3 min till < 60 s per cell. Alternativt, icke-smältbara apoptotiska celler härmar eller celltyper som minimalt fragment på apoptos, kan användas i stället. Detta förenklar upptäckt att enda större strukturer, som kan vara mer mottagliga för automatiserade metoder och kan eliminera behovet av z-stapling. Även med dessa framsteg, förvärv och analys hastigheten på denna metod fortfarande begränsande, och som sådan flödescytometri förblir den mest hållbara metoden när analyser av stora cell nummer är krävs23.

Även om vi har beskrivit denna metod med cell-linjen och primära mänskliga makrofager som efferocytes och apoptotiska Jurkat celler (en T-cell linje) som mål, kan denna metod tillämpas på alla efferocytic cell typ eller apoptotiska cell mål. Faktiskt har liknande metoder använts för att undersöka efferocytosis i hepatocyter och epitelceller9,40,41, och efferocytosis av kliniskt relevanta mål såsom tumör celler42. Det kan vara nödvändigt att ändra detta protokoll när du använder icke-immun efferocytes eller modell specifika efferocytic händelser. Exempelvis Jurkat celler är icke-anhängare och är därför osannolikt att fullt sammanfatta de mekaniska styrkorna och rumsliga begränsningar efferocytes möter när de interagerar med vidhäftande apoptotiska celler eller apoptotiska celler inom fasta vävnader. Många celltyper behåller vidhäftning under apoptos och kan därför användas som vidhäftande mål; som ett exempel genomgå HeLa cells reproducibly staurosporine-inducerad apoptos, fosfatidylserin hastigt och blebbing under 4 – 6 h bibehållen vidhäftning av cellkroppen43. Celler upphängd i en kollagenmatrisen eller stamceller-derived organoids44 kan vara potentiella modeller för att studera efferocytosis i fasta vävnader, även om vi inte känner till några studier som har använt dessa metoder. För vissa modeller immunceller som Jurkat celler och neutrofiler bör inte användas som apoptotiska mål, eftersom dessa celler kan släppa cytokinbaserad ”hitta-mig” signaler såsom CX3CL1 som kan vara en störande faktor i modeller där inflammatorisk eller flyttande processer är undersökta45. Således, medan mångsidigheten hos denna analys tillåter att användas för att utforska efferocytosis inom en rad olika celltyper och modellsystem, var noga att välja lämplig efferocytes, målceller och odlingsbetingelser till bästa modell fysiologiska bearbeta under utredning.

De analysmetoder som beskrivs i detta protokoll är endast avsedda som en utgångspunkt, med imaging-baserade naturen av dessa experiment som möjliggör ett brett spektrum av analyser. Exempelvis efferosome positionering och diameter mätningar kan samlas in när du utför bråkdel efferocytosed mätningar, eller mätt inom live-cell tid-kurser, för att undersöka processer såsom intracellulära människohandel efferosomes och den apoptotiska cell nedbrytning13,15. Immunfärgning (figur 4) kan användas för att undersöka rekrytering av proteiner till efferosomes, medan live-cell imaging kombinerat med morfologiska analyser kan användas för att kvantifiera processer sådana bindande effekt och priser av omvälvning30 , 46. vi ofta utför dessa analyser i makrofager uttrycker fluorescerande transgener som rapporterar signalering molekyl aktivering eller aktiviteten av cellulära händelser under efferocytosis (figur 6). Dessa reportrar aktivera övervakning av signalering processer under efferocytosis; till exempel har vi använt fluorescently-taggade Rab GTPases för att utforska Rab5, Rab7 och Rab17 roll i medla efferosome bearbetning och efterföljande människohandel apoptotiska cell-derived antigener13,15. Likaså kan införlivandet av reportrar av celldöd, efferosome pH, reaktivt syre arter produktion och andra cellulära processer i live-cell experiment användas för att undersöka de processer som medierar nedbrytning av efferosomes31 ,47. En gemensam utmaning i dessa experiment är att identifiera transgener eller reportrar med kompatibla fluorophores; vi ofta, kommer att eliminera cellen spårning färgämne eller streptividin till Gratis kanaler för imaging andra fluorophores. För vissa experiment är det fördelaktigt att ersätta apoptotiska cellen med en icke-fragmentera härma. Detta möjliggör kvantifiering av signalering dynamics och cellulära processer utan komplexiteten i spårning den flera efferosomes härrör från en enda apoptotiska cell. Se Evans et al. anvisningar om förbereder apoptotiska celler härmar28.

Den vanligaste svårigheten vid utformningen av dessa experiment är att hitta en kombination av fluorophores som möjliggör de önska processerna att avbildas, samtidigt minimera fotoblekning och fototoxicitet29. Fluorophore urval styrs till stor del av lasrar/magnetisering filtren, dichroics/kuber och utsläpp filter av mikroskopet, och därmed valet av fluorophores är ofta specifika för enskilda Mikroskop. Generellt längre våglängd fluorophores (orange till mån, t.ex. utsläpp maxima > 580 nm) är mindre benägna att fotoblekning och dessa våglängder är mindre störande för celler. Grön fluorophores (utsläpp maxima ~ 525 nm) kan användas, men måste vidtas för att begränsa fototoxicitet till cellerna. Fluorophores som exciterar våglängder mindre än 480 nm (violett och blått) bör undvikas på grund av sin höga fototoxicitet och benägenhet för dessa excitation våglängder att bleka andra fluorophores29. Om möjligt, bör hög ljusstyrka och stabil fluorophores väljas. Likaså förvärv bildparametrarna bör justeras för att minimera fotoblekning och fototoxicitet — t.ex. längre exponeringar med låg excitation intensitet är att föredra framför högre excitation stödnivåer48. Tillägg av antioxidanter som rutin och avlägsnande av vissa mediekomponenter kan förbättra både photostability och minska fototoxicitet49. Även med noggrant urval av fluorophores och imaging villkor kräver behovet av att begränsa fotoblekning ofta att fånga bilder med lågt signal-till-brus-förhållande (se figur 5 för ett exempel). Om kvantifiera fluorescensintensiteten, behöver stor omsorg vidtas för att begränsa bildbehandling artefakter; idealiskt, raw-bilder utan någon form av bearbetning bör analyseras. Om deconvolving bilder före kvantifiering, vara en avfaltning algoritm som bevarar fluorescerande stödnivåer används50,51.

Levande cellen förvärv kan särskilt utmanande, med framgångsrika experiment som kräver en noggrann avvägning mellan excitation intensitet, exponeringstid, bildhastighet och experiment varaktighet. Magnetiseringen intensitet och exponering tid bör justeras för att minimera fototoxicitet som beskrivs ovan, med förbehållet att längre exponeringstider kan resultera i rörelse artefakter på grund av cellers rörelser eller begränsa bildfrekvensen av förvärvet. Bildhastigheten kan variera beroende på de experimentella krav. Ram-lägre (5-30 min mellan ramar) tillåter imaging över längre perioder (12 h eller mer) men samtidigt minimal data på företeelser som membran dynamics och post-efferocytosis handel med efferosomes. Hög-bildfrekvens (så fort 1 bildruta per sekund) ger utmärkt temporal upplösning av efferocytic händelser och efferosome handel — men även med noggrant urval av fluorophores, excitation intensitet och exponeringstider — fotoblekning eller fototoxicitet kommer vanligtvis att begränsa dessa experiment till mindre än en timme i varaktighet. Vår erfarenhet, förvärva bilder varje 1 – 2 min, experimentell period av 2 – 6 h, är en godtagbar kompromiss som ger mätbara bilder av ett tillräckligt antal efferocytic händelser, med rimlig temporal upplösning.

Förändrad och misslyckade efferocytosis är kända för att vara inblandade i patologi cancer, åderförkalkning och flera autoimmuna sjukdomar, med efferocytosis-inriktade terapier visar stora kliniska lovar7,52, 53,54,55. Ytterligare utveckling inom dessa områden kommer att kräva identifiering och karakterisering av de cellulära processerna, receptorer och signalvägar som reglerar efferocytosis. Analysen presenteras i detta protokoll utgör ett kraftfullt verktyg för dessa studier och kan modifieras för att kvantifiera många av de cellulära och signalering processer som reglerar efferocytosis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar någon intressekonflikt.

Acknowledgments

Denna studie har finansierats av Canadian Institutes of Health Research (CIHR) löpande Grant MOP-123419, naturvetenskap och Engineering Research rådet av Kanada upptäckt Grant 418194, och en Ontario ministeriet för forskning och Innovation tidigt Research Award till BH. DGW bidragit bilder fram, för optimering av protokollen och författande av manuskript; Han har finansierats av en pump-priming bidrag från universitetet i Liverpool. CY finansieras av en Vanier Graduate stipendium och CIHR MD/PhD UNIVERSITETSSTIPENDIUM. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut om att offentliggöra eller beredning av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Media Wisent 3500-000-EL
DMEM Media Wisent 319-005-CL
Fetal Bovine Serum (FBS) Wisent 080-150
PBS Wisent 311-010-CL
18 mm circular glass coverslips #1.5 thickness Electron Microscopy Sciences 72290-08 Size and shape of coverslip is not critical, but 18 mm fit into the wells of a standard 12-well plate which simplifies cell culture
Staurosporine Cayman Chemical 81590 Dissolve in DMSO at 1 mM (1,000x stock solution)
Annexin V-Alexa 488 ThermoFisher R37174
EZ-Link NHS-Biotin ThermoFisher 20217 Store in a dessicator. Do not prepare a stock solution.
DMSO Sigma-Aldrich D2650
CellTrace FarRed ThermoFisher C34572
CellTrace Orange ThermoFisher C34851
Hoescht 33342 ThermoFisher 62249
FITC-Streptavadin ThermoFisher SA1001
Lympholyte-poly cell sepration medium Cedarlane Labs CL5071
Recombinant Human M-CSF Peprotech 200-04
Recombinant Human IL-4 Peprotech 300-25
J774.2 Macrophage Cell Line Sigma-Aldrich 85011428-1VL
THP-1 Human Monocyte Cell Line ATCC TIB-202
Jurkat T Cell Line ATCC TIB-152

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elmore, S. Apoptosis: A review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
  2. Toda, S., Hanayama, R., Nagata, S. Two-step engulfment of apoptotic cells. Molecular and Cellular Biology. 32 (1), 118-125 (2012).
  3. Ravichandran, K. S. Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: Progress and conundrums. The Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).
  4. Fadok, V. A., Voelker, D. R., Campbell, P. A., Cohen, J. J., Bratton, D. L., Henson, P. M. Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages. Journal of Immunology. 148 (7), 2207-2216 (1992).
  5. Bevers, E. M., Comfurius, P., van Rijn, J. L., Hemker, H. C., Zwaal, R. F. Generation of prothrombin-converting activity and the exposure of phosphatidylserine at the outer surface of platelets. European Journal of Biochemistry. 122 (2), 429-436 (1982).
  6. Callahan, M. K., Williamson, P., Schlegel, R. A. Surface expression of phosphatidylserine on macrophages is required for phagocytosis of apoptotic thymocytes. Cell Death and Differentiation. 7 (7), 645-653 (2000).
  7. Kojima, Y., et al. CD47-blocking antibodies restore phagocytosis and prevent atherosclerosis. Nature. 536, 86-90 (2016).
  8. Seitz, H. M., Camenisch, T. D., Lemke, G., Earp, H. S., Matsushima, G. K. Macrophages and dendritic cells use different Axl/Mertk/Tyro3 receptors in clearance of apoptotic cells. Journal of Immunology. 178, 5635-5642 (2007).
  9. Ichimura, T., Asseldonk, E. J. P. V., Humphreys, B. D., Gunaratnam, L., Duffield, J. S., Bonventre, J. V. Kidney injury molecule-1 is a phosphatidylserine receptor that confers a phagocytic phenotype on epithelial cells. The Journal of Clinical Investigation. 118 (5), 1657-1668 (2008).
  10. Flannagan, R. S., Canton, J., Furuya, W., Glogauer, M., Grinstein, S. The phosphatidylserine receptor TIM4 utilizes integrins as coreceptors to effect phagocytosis. Molecular Biology of the Cell. 25 (9), 1511-1522 (2014).
  11. Park, D., et al. BAI1 is an engulfment receptor for apoptotic cells upstream of the ELMO/Dock180/Rac module. Nature. 450 (7168), 430-434 (2007).
  12. Elliott, M. R., Koster, K. M., Murphy, P. S. Efferocytosis Signaling in the Regulation of Macrophage Inflammatory Responses. Journal of Immunology. 198 (4), 1387-1394 (2017).
  13. Yin, C., Kim, Y., Argintaru, D., Heit, B. Rab17 mediates differential antigen sorting following efferocytosis and phagocytosis. Cell Death & Disease. 7 (12), e2529 (2016).
  14. Kinchen, J. M., et al. A pathway for phagosome maturation during engulfment of apoptotic cells. Nature Cell Biology. 10 (5), 556-566 (2008).
  15. Yin, C., Argintaru, D., Heit, B. Rab17 mediates intermixing of phagocytosed apoptotic cells with recycling endosomes. Small GTPases. 0 (0), 1-9 (2017).
  16. Silva, M. T. Secondary necrosis: The natural outcome of the complete apoptotic program. FEBS letters. 584 (22), 4491-4499 (2010).
  17. Thorp, E. B. Mechanisms of failed apoptotic cell clearance by phagocyte subsets in cardiovascular disease. Apoptosis. 15 (9), 1124-1136 (2010).
  18. Sarantis, H., Grinstein, S. Monitoring phospholipid dynamics during phagocytosis: application of genetically-encoded fluorescent probes. Methods in Cell Biology. 108, 429-444 (2012).
  19. Steinberg, B. E., Grinstein, S. Analysis of macrophage phagocytosis: Quantitative assays of phagosome formation and maturation using high-throughput fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 531, 45-56 (2009).
  20. Wang, J., Hossain, M., Thanabalasuriar, A., Gunzer, M., Meininger, C., Kubes, P. Visualizing the function and fate of neutrophils in sterile injury and repair. Science. 358 (6359), 111-116 (2017).
  21. Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. The Journal of Cell Biology. 169 (1), 139-149 (2005).
  22. Greenlee-Wacker, M. C., Rigby, K. M., Kobayashi, S. D., Porter, A. R., DeLeo, F. R., Nauseef, W. M. Phagocytosis of Staphylococcus aureus by human neutrophils prevents macrophage efferocytosis and induces programmed necrosis. Journal of Immunology. 192 (10), 4709-4717 (2014).
  23. Wootton, D. G., et al. Recovery from pneumonia requires efferocytosis which is impaired in smokers and those with low body mass index and enhanced by statins. Thorax. 71 (11), 1052-1054 (2016).
  24. Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
  25. Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator. Biophysical Journal. 74 (3), 1591-1599 (1998).
  26. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  27. Johnson, D. E., Ostrowski, P., Jaumouillé, V., Grinstein, S. The position of lysosomes within the cell determines their luminal pH. The Journal of Cell Biology. 212 (6), 677-692 (2016).
  28. Evans, A. L., Blackburn, J. W. D., Yin, C., Heit, B. Quantitative efferocytosis assays. Methods in Molecular Biology. 1519, 25-41 (2017).
  29. Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), (2017).
  30. Flannagan, R. S., Harrison, R. E., Yip, C. M., Jaqaman, K., Grinstein, S. Dynamic macrophage "probing" is required for the efficient capture of phagocytic targets. The Journal of Cell Biology. 191 (6), 1205-1218 (2010).
  31. Joshi, G. N., Gilberti, R. M., Knecht, D. A. Single cell analysis of phagocytosis, phagosome maturation, phagolysosomal leakage, and cell death following exposure of macrophages to silica particles. Methods in Molecular Biology. 1519, 55-77 (2017).
  32. Karaji, N., Sattentau, Q. J. Efferocytosis of Pathogen-Infected Cells. Frontiers in Immunology. 8 (DEC), 1863 (1863).
  33. Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. Phagosomes fuse with late endosomes and/or lysosomes by extension of membrane protrusions along microtubules: role of Rab7 and RILP. Molecular and Cellular Biology. 23 (18), 6494-6506 (2003).
  34. Reiners, J. J., Kleinman, M., Kessel, D., Mathieu, P. A., Caruso, J. A. Nonesterified cholesterol content of lysosomes modulates susceptibility to oxidant-induced permeabilization. Free Radical Biology & Medicine. 50 (2), 281-294 (2011).
  35. Boya, P., et al. Lysosomal membrane permeabilization induces cell death in a mitochondrion-dependent fashion. The Journal of Experimental Medicine. 197 (10), 1323-1334 (2003).
  36. Fairn, G. D., Grinstein, S. How nascent phagosomes mature to become phagolysosomes. Trends in Immunology. , 1-9 (2012).
  37. Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages. Molecular Biology of the Cell. 25 (21), 3330-3341 (2014).
  38. Phanse, Y., et al. Analyzing cellular internalization of nanoparticles and bacteria by multi-spectral imaging flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (64), e3884 (2012).
  39. Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 230-233 (2011).
  40. Davies, S. P., Reynolds, G. M., Stamataki, Z. Clearance of apoptotic cells by tissue epithelia: A putative role for hepatocytes in liver efferocytosis. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
  41. Ismail, O. Z., Zhang, X., Bonventre, J. V., Gunaratnam, L. G protein α12(Gα12) is a negative regulator of kidney injury molecule-1-mediated efferocytosis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 310 (7), F607-F620 (2016).
  42. Vaught, D. B., Stanford, J. C., Cook, R. S. Efferocytosis creates a tumor microenvironment supportive of tumor survival and metastasis. Cancer Cell & Microenvironment. 2 (1), (2015).
  43. Heit, B., Yeung, T., Grinstein, S. Changes in mitochondrial surface charge mediate recruitment of signaling molecules during apoptosis. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 300 (1), C33-C41 (2011).
  44. Múnera, J. O., Wells, J. M. Generation of Gastrointestinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1597, 167-177 (2017).
  45. Truman, L. A., et al. CX3CL1/fractalkine is released from apoptotic lymphocytes to stimulate macrophage chemotaxis. Blood. 112 (13), 5026-5036 (2008).
  46. Evans, A. L., et al. Antagonistic Coevolution of MER Tyrosine Kinase Expression and Function. Molecular Biology and Evolution. , (2017).
  47. Flannagan, R. S., Heit, B., Heinrichs, D. E. Intracellular replication of Staphylococcus aureus in mature phagolysosomes in macrophages precedes host cell death, and bacterial escape and dissemination. Cellular Microbiology. , (2015).
  48. Mubaid, F., Brown, C. M. Less is More: Longer Exposure Times with Low Light Intensity is Less Photo-Toxic. Microscopy Today. 25 (06), 26-35 (2017).
  49. Bogdanov, A. M., Kudryavtseva, E. I., Lukyanov, K. A. Anti-fading media for live cell GFP imaging. PloS One. 7 (12), e53004 (2012).
  50. Rossner, M., Yamada, K. M. What's in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166 (1), 11-15 (2004).
  51. Sage, D., et al. DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy. Methods. 115, 28-41 (2017).
  52. Ma, G. Z. M., Stankovich, J., Kilpatrick, T. J., Binder, M. D., Field, J. Polymorphisms in the receptor tyrosine kinase MERTK gene are associated with multiple sclerosis susceptibility. PloS One. 6 (2), e16964 (2011).
  53. Thorp, E., Cui, D., Schrijvers, D. M., Kuriakose, G., Tabas, I. Mertk receptor mutation reduces efferocytosis efficiency and promotes apoptotic cell accumulation and plaque necrosis in atherosclerotic lesions of apoe-/- mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (8), 1421-1428 (2008).
  54. Nguyen, K. -Q. N., et al. Overexpression of MERTK Receptor Tyrosine Kinase in Epithelial Cancer Cells Drives Efferocytosis in a Gain-of-Function Capacity. The Journal of Biological Chemistry. 289 (37), 25737-25749 (2014).
  55. Morimoto, K., et al. Lovastatin enhances clearance of apoptotic cells (efferocytosis) with implications for chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Immunology. 176 (12), 7657-7665 (2006).

Tags

Immunologi och infektion fråga 138 Efferocytosis fagocytos apoptos mikroskopi fagocytsystemet makrofag
Kvantifiering av Efferocytosis av Single-cell fluorescensmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Taruc, K., Yin, C., Wootton, D. G.,… More

Taruc, K., Yin, C., Wootton, D. G., Heit, B. Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (138), e58149, doi:10.3791/58149 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter