Summary
Мы описываем метод лишение сна, известный как нежный обработки, где следователи нежно подталкивать мышей любое время сна поведение наблюдается. Этот метод является мощным инструментом, который позволяет исследователям изучить последствия, имеющие хронические сна ограничение на протяжении развития на будущих мозга физиологии и поведения.
Abstract
Сон имеет решающее значение для правильного развития и нейронных пластичности. Кроме того ненормальные сна характерны многие нервной расстройств. Изучение как хронический ограничение сна во время разработки может повлиять на поведение взрослых могут добавлять в наше понимание появления поведенческие симптомы нервной расстройств. Хотя есть много методов, которые могут быть использованы для ограничения сна в грызунов включая принудительное передвижение, постоянные нарушения, презентация отрицательной стимул, или электрическим током, многие из этих методов являются очень напряженный и не может использоваться в новорожденных мышей. Здесь мы описываем, нежный обработки, метод лишение сна, который может использоваться хронически всей разработки и в зрелом возрасте для достижения ограничение сна. Деликатное обращение предполагает тщательное наблюдение мышей в течение периода лишения сна и требует исследователь мягко подтолкнуть животных всякий раз, когда они являются неактивными или отображения поведения, связанные с сна. В сочетании с записи ЭЭГ, Деликатное обращение может использоваться выборочно нарушать конкретные фазы сна как быстрое движение глаз (REM) сна. Техника Деликатное обращение является мощным инструментом для изучения последствий хронического сна ограничения даже в новорожденных мышей, которая позволяет обойти многие из более напряженный процедур, используемых для лишения сна.
Introduction
Сон играет решающую роль в нейрональных пластичности и СИНАПС формирования и ликвидации во время мозга развития1,2. В частности быстрое движение глаз (REM) сон имеет важное значение для формирования стабильной синаптических цепей через как укрепление конкретных синапсов и синаптическую обрезка2. Фармакологических спать рано в жизни приводит к многие физиологические и поведенческие недостатки3,4. Помимо медикаментозного сна лишений, другие формы лишения сна, таких как постоянная тряска, принудительное передвижение или презентация отрицательной стимул были связаны с симптомами депрессии как во взрослом возрасте, различные нервные Активация шаблонов и изменения в непрерывности время и сна сна в период восстановления после лишения5,6,7. Когда сон хронически ограничено в мышей в течение пяти недель во время разработки, поведенческие недостатки наблюдались после сна восстановления8в месяц. Взятые вместе, эти исследования показывают, что нарушения сна в неонатальной грызун может повлиять на более поздних сна, функции мозга и поведение. Подчеркивая важность сна для развития нормального мозга у людей, у многих пациентов с нервной расстройств, включая расстройств аутистического спектра, клубневые склероз комплекс, хрупкий X синдром и внимание-дефицит/гиперактивности Расстройства, докладе аномалии в сон Помимо разнообразных поведенческих дефицита1.
Учитывая количество нервной расстройств, которые связаны с ненормальные сна, важно понять, как недостаток сна влияет на функцию мозга и поведение. Однако несмотря на данные, которые поддерживают значение сна во время разработки, большинство методик, которые ограничивают или лишают сна сосредоточиться на взрослых животных. Эти методы включают в себя целый ряд тестов, которые требуют принудительного двигательной активности (например, постоянные беговая дорожка), постоянные нарушения (например, вращающиеся подметально бар или постоянное Роман объекта презентации) или тревожных животных на начальном этапе REM сна (например, платформа над водой)9,10. Хотя эти методы эффективно показали проблемы, связанные с лишением сна у взрослых, ни один из этих методов являются подходящими для грызунов щенков ввиду их ограниченной мобильности, диск высокой сна и неблагоприятных последствий стресса в начале жизни. Ввиду важности сна во время разработки важно, чтобы понять как ограниченные сна в новорожденных щенков влияет на будущее поведение во взрослом возрасте.
Одним из способов ограничить сна, которые могут быть использованы в детенышей грызунов является нежный обработки. Деликатное обращение предполагает следователь, непосредственно взаимодействующих с грызунами, что любое время сна поведение наблюдается. Следователи можно использовать свои руки, кисти или презентация новых объектов для физически нарушить сон в неонатальной грызунов8,10,11,12,13,14 . Сон может определяться поведенчески отсутствия двигательной активности, миоклоническая подергивания и закрытие глаз (в старых детенышей грызунов). ЭЭГ проверки подтверждает, что нарушения сна с нежным обработки на основе этих поведений уменьшает время сна на 91% в P12 крыс14. Другие методы, которые были использованы, чтобы лишить молодых мышей включают электрическим током и презентация неприятные стимулы, но эти методы не могут использоваться для ограничения хронической сна и более стрессовым, чем Деликатное обращение7, 15. ограничение хронический сна также может быть достигнуто путем встряхивания протокол, который может использоваться с или без имплантации электродов ЭЭГ и связанных компьютерного программного обеспечения, но этот протокол не отменяет все спать и поэтому менее контролируемые по сравнению с нежным обработки4,16. Возможность ограничить или лишить мышей сна в течение многих дней подряд без специального оборудования, компьютерного программного обеспечения или имплантации электродов является преимуществом метода Деликатное обращение. Ограничение хроническая сон через нежный обработки эффективно ограничивает сна в неонатальной грызунов и производит целый ряд поведенческих изменений после сна лишений периода8,11,12, 17.
Здесь мы описываем результаты, в которых хронические спать на три часа в день от послеродового день 5 (P5) P42 существенно влияет на коммуникабельность мышей после восстановления 30-дневного периода, в котором не нарушается сон. Эти результаты подчеркивают долгосрочные последствия хронического сна ограничения во время разработки на будущее поведение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Все процедуры были утверждены Национальный институт психического здоровья животных ухода и использования Комитетом и в соответствии с национальных институтов здравоохранения руководящие принципы по уходу и использованию животных.
1. Сон лишение установки
- Используйте мягкие кисти мягко совать мышей, когда спит.
- Убедитесь, что кисть может поместиться через решетку фидер клетки мыши для обеспечения что мышей имеют доступ к продовольствию и воды ad libitum во время лишение сна.
- Не использовать кисти для нескольких клеток для предотвращения передачи ароматов между клетками. Мы предлагаем что вы этикетке каждой кисти с его назначенных клетку и ограничить его использование в этой клетке.
- Назначьте помещение, где будет происходить все лишения сна.
2. животных установки
- Случайным образом назначьте каждой клетке лишение сна или контрольной группы.
- Дать мышей доступ к продовольствию и воды ad libitum во время эксперимента.
- Убедитесь, что вид мышей не ограничивается постельных принадлежностей, гнездо или обогащения объектов в клетке.
- Удаление дополнительных кроватей или обогащения объекты, которые могут ограничить вид мышей.
- Если пищи или воды ограничивает вид мышей, мышей перенести области клетки, где мнение не ограничен.
- Если еда блокирует большую часть клетки, удалите некоторые продукты питания и место окатышей в нижней части клетки так, что животные поддерживают доступ к продовольствию в период лишения сна.
3. животных условия
Примечание: Мы решили начать три часа, период лишения сна в 11 утра, когда мышей в середине их неактивной фазы, но времени суток и продолжительности лишения сна могут быть выбраны на основе требуемой экспериментальных условиях.
- Контрольной группы.
- P5 удалите отец из Канары и оставить плотины с щенков до отъема (P21).
- Переместить мышь, назначенных группе управления на лишение сна обслуживание и мягко подтолкнуть мышей с кистью, непрерывно для 10 минут в день в течение всего эксперимента (P5 P42).
- После этих 10 минут вернуть животное, холдинг номер мышей и не беспокоить их
- Группа лишение сна.
- P5 удалите отец из Канары и оставить плотины с щенков до отъема (P21).
Примечание: Лишение сна до P5 может привести к каннибализации детенышей. Мы не наблюдали значительное раскулачивание P5 и позже.
Примечание: В молодых детенышей, диск спать очень высокий, требующих почти постоянного поглаживания. Как развивать мышей, особенно после отнятия от груди, сон давление ниже, и они не нуждаются в постоянном подталкивание. - Продолжите с лишение сна каждый день до P42.
Примечание: Протоколы лишение сна можно различаются по длине и расширить прошлом P42 при желании. - Перемещение мыши, присвоенные группе лишение сна в комнату лишение сна ежедневно во время свет цикла где они будут контролироваться. Точная продолжительность лишения сна может быть скорректирована по вопросу конкретных исследований.
Примечание: У новорожденных мышей лишение сна, который длится дольше, чем 3 часа затруднено из-за увеличения сна давление15.- В это время мягко подтолкнуть мышей с кисть любое время, что сон является очевидным. В следующем разделе описаны особенности лишения сна.
- P5 удалите отец из Канары и оставить плотины с щенков до отъема (P21).
4. лишение сна
- Аккуратно произ мышь с кистью, если подозреваемых спит до тех пор, пока ответ наблюдается. Кроме того инвертировать мышей и прижмите их спиной к нарушению сна над.
- Рассмотрим мыши спал, при возникновении любого из следующих действий: бездействия, твичинг (особенно с щенков), или если их глаза закрыты (у мышей старше P12).
- Рассмотрим мышей, чтобы бодрствовать, если они движутся вокруг, пытаясь перевернуться после на их спинах, или холить себя.
- Если плотина перекрывает щенков во время лишения сна, нежно произ ее от щенков так по мнению щенков является неограниченным.
5. после лишения сна
- При завершении периода три часа лишения сна, положите постельные принадлежности и любых продуктов, которые могут быть удалены обратно и положил обратно крышку на клетке.
- Возвращение клетки животных Холдинг комнату до следующего дня лишения сна.
6. последующие эксперименты
- В зависимости от цели исследования лишение сна продолжите последующих экспериментов.
- Урожай сыворотки от животных, чтобы определить, что кортикостерона уровнях18.
- Выполните любое из ряда поведенческие тесты, включая открытое поле, RotaRod, повышенные плюс лабиринт, социальное поведение, тестирования мрамор хоронить,8, и т.д.19,20 эти тесты поведение также предотвратит животных от спать так, что следует учитывать при определении сколько дней непрерывного сна лишений на работу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы исследовать эффекты хронического сна ограничения на поведение, мы спим ограничены мышей за три часа ежедневно с 11:00 утра и 2:00 PM от P5-P428. После сна ограничения мышей были уехал безмятежный четырех недель и возможность оправиться от сна ограничения. Мыши были протестированы на поведение после периода восстановления четыре недели. Для оценки коммуникабельность (предпочтение Роман мыши, по сравнению с Роман объект) и социальной Новинка (предпочтение Роман мыши, по сравнению с знакомой мышью) использовался тест-трехкамерный социальное поведение. В тесте, коммуникабельность, спать ограничены женщин провел больше времени, нюхают чужой мыши самок (p < 0,05) управления (рис. 1A) и ограниченный сна мужчины имели тенденцию тратить больше времени, нюхают объект по сравнению с контролировать мужчин (p = 0.077) (рис. 1A). В социальной новизна фазе тестирования, ограниченный сна самок мышей провел увеличение количества времени, нюхают Роман мыши чем женщины контроля (p < 0.01) (рис. 1B).
Рисунок 1: хроническая сон ограничение изменяет социальное поведение после сна 4-недельного периода восстановления. (A) коммуникабельность тест: время, затраченное нюхают показывает что самцов мышей, которые были ограничены сна провел больше времени, нюхают Роман объект, элементы управления мужчин (p = 0.077). Сон ограничено самок мышей провел больше времени, нюхают чужой мыши, по сравнению с управления женщины (*p < 0,05). Сна ограничено самок мышей также, как правило, тратят больше времени, нюхают объект, по сравнению с управления женщин (p = 0,065). (B) социальной новизна тест: время, затраченное нюхают роман или знакомые мыши показали, что сон, ограниченных самок мышей статистически больше времени нюхают Роман мыши, по сравнению с самок мышей, которые не были ограничены сна (**p < 0.01). Бары представляют собой средства ± SEM в 11 управления мужчины, 13 сна ограничено мужских, 22 управления женщин и 17 сна ограничено самок мышей. Данные были проанализированы с помощью пост hoct-тесты после ANOVA. Эта цифра была изменена с разрешения Sare et al. 20168. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описываем метод для лишения сна, щадящая обработка, который может использоваться в обеих грызунов щенков и взрослых. Нежный вручать требует исследователи соблюдать мышей в течение периода лишения сна и нежно подталкивать животных всякий раз, когда они являются неактивными или подергивания для предотвращения сна. До сна лишений исследования подтвердили посредством одновременного электроэнцефалограммы (ЭЭГ) записи что нежный обработки предотвращает оба REM и не NREM REM - сна10. В то время как Деликатное обращение является одним из только методы лишение сна, которые могут быть использованы на молодых детенышей грызунов, существуют некоторые ограничения на его использование.
Во-первых, нежный обработки полагается на экспериментатор, чтобы иметь возможность признать и оперативно реагировать на предварительно спать поведения. Когда лишение сна в грызунов щенков, щенки должны почти постоянно ткнул или перевернутый заверить, что они просыпаются для ограничения периода весь сон. Признание подергивания в молодых детенышей имеет решающее значение для надлежащего предотвращения сна21. Во-вторых следует признать, что лишение сна, которое происходит до отлучения, когда щенки еще с их матерью, могут повлиять на сон матери как вторичный эффект; Однако масштабы этого эффекта еще предстоит изучить. В-третьих важно признать, что любой процесс лишения сна будет по сути стрессовой, и это не невозможно отделить последствия лишения сна от стресса, вызванного процедура. Однако используя протокол нежный обработки описано здесь попытки свести к минимуму стресс лишения сна, по сравнению с другими протоколами лишение сна. И наконец, тогда как нежный обработка является полезным методом для хронической новорожденных спать, обременительные процедуры для исследователей как он отнимает много времени и требует постоянного внимания. Также трудно выполнить в новорожденных мышей за счет увеличения давления сна в течение времени15больше протоколы лишение сна.
Несмотря на эти ограничения нежный передачи является мощным инструментом для изучения последствий хронического сна ограничения на протяжении развития и в зрелом возрасте и как ограничение сна может повлиять на поведение и мозг физиология. Самое главное, этот метод позволяет исследователям продолжать изучать последствия что сон ограничение в раннем возрасте может иметь на развитие мозга оба сразу следующее ограничение сна и позднее в жизни.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Это исследование финансировалось интрамуральных исследовательской программы NIMH (Зия MH00889). RMS был также поддержан FRAXA докторантура стипендий.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | Jackson Labs | 000664 | Wildtype mice used |
| Super Mouse 750 Mouse Cage | Lab Products, Inc. | Cages for the mice | |
| SANI-Chips Bedding | PJ Murphys | Bedding for the mice | |
| S&S Bristle Brush Assortment Pack | Staples | Item # 13764, Model AB37100 | Paint brushes are used to gently poke mice |
References
- Picchioni, D., Reith, R. M., Nadel, J. L., Smith, C. B. Sleep, plasticity and the pathophysiology of neurodevelopmental disorders: the potential roles of protein synthesis and other cellular processes. Brain Sci. 4 (1), 150-201 (2014).
- Li, W., Ma, L., Yang, G., Gan, W. B. REM sleep selectively prunes and maintains new synapses in development and learning. Nat Neurosci. 20 (3), 427-437 (2017).
- Peirano, P. D., Algarin, C. R. Sleep in brain development. Biol Res. 40 (4), 471-478 (2007).
- Mirmiran, M., et al. Effects of experimental suppression of active (REM) sleep during early development upon adult brain and behavior in the rat. Brain Res. 283 (2-3), 277-286 (1983).
- Feng, P., Ma, Y. Instrumental REM sleep deprivation in neonates leads to adult depression-like behaviors in rats. Sleep. 26 (8), 990-996 (2003).
- Frank, M. G., Morrissette, R., Heller, H. C. Effects of sleep deprivation in neonatal rats. Am J Physiol. 275 (1 Pt 2), R148-R157 (1998).
- Todd, W. D., Gibson, J. L., Shaw, C. S., Blumberg, M. S. Brainstem and hypothalamic regulation of sleep pressure and rebound in newborn rats. Behav Neurosci. 124 (1), 69-78 (2010).
- Sare, R. M., Levine, M., Hildreth, C., Picchioni, D., Smith, C. B. Chronic sleep restriction during development can lead to long-lasting behavioral effects. Physiol Behav. 155, 208-217 (2016).
- Colavito, V., et al. Experimental sleep deprivation as a tool to test memory deficits in rodents. Front Syst Neurosci. 7, 106 (2013).
- Franken, P., Dijk, D. J., Tobler, I., Borbely, A. A. Sleep deprivation in rats: Effects on EEG power spectra, vigilance states, and cortical temperature. Am J Physiol. 261 (1 Pt 2), R198-R208 (1991).
- Araujo, P., Coelho, C. A., Oliveira, M. G., Tufik, S., Andersen, M. L. Neonatal sleep restriction increases nociceptive sensitivity in adolescent mice. Pain Physician. 21 (2), E137-E148 (2018).
- Araujo, P., Tufik, S., Anderson, M. L. Sleep and pain: A relationship that begins in early life. Pain Physician. 17 (6), E787-E798 (2014).
- Hairston, I. S., et al. Sleep deprivation effects on growth factor expression in neonatal rats: a potential role for BDNF in the mediation of delta power. J Neurophysiol. 91 (4), 1586-1595 (2004).
- Hairston, I. S., et al. Sleep deprivation elevates plasma corticosterone levels in neonatal rats. Neurosci Lett. 315 (1-2), 29-32 (2001).
- Blumberg, M. S., Middlemis-Brown, J. E., Johnson, E. D. Sleep homeostasis in infant rats. Behav Neurosci. 118 (6), 1253-1261 (2004).
- Feng, P., Vogel, G. W., Obermeyer, W., Kinney, G. G. An instrumental method for long-term continuous REM sleep deprivation of neonatal rats. Sleep. 23 (2), 175-183 (2000).
- Xu, Z. Q., Gao, C. Y., Fang, C. Q., Zhou, H. D., Jiang, X. J. The mechanism and characterization of learning and memory impairment in sleep-deprived mice. Cell Biochem Biophys. 58 (3), 137-140 (2010).
- Barriga, C., Martin, M. I., Tabla, R., Ortega, E., Rodriguez, A. B. Circadian rhythm of melatonin, corticosterone and phagocytosis: Effect of stress. J Pineal Res. 30 (3), 180-187 (2001).
- Nadler, J. J., et al. Automated apparatus for quantitation of social approach behaviors in mice. Genes Brain Behav. 3 (5), 303-314 (2004).
- Thomas, A., et al. Marble burying reflects a repetitive and perseverative behavior more than novelty-induced anxiety. Psychopharmacology (Berl). 204 (2), 361-373 (2009).
- Karlsson, K. A., Blumberg, M. S. The union of the state: Myoclonic twitching is coupled with nuchal muscle atonia in infant rats. Behav Neurosci. 116 (5), 912-917 (2002).
