Summary
Wir beschreiben eine Schlaf Entbehrungen Technik bekannt als schonende Behandlung wo Ermittler sanft Mäuse jederzeit prod Schlafverhalten beobachtet wird. Diese Methode ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das erlaubt es den Forschern, die Auswirkungen zu untersuchen, die chronische Schlaf Einschränkung während der gesamten Entwicklung auf zukünftige Gehirnphysiologie und das Verhalten haben kann.
Abstract
Schlaf ist wichtig für die richtige Entwicklung und neuronale Plastizität. Darüber hinaus sind abnorme Schlafrhythmus charakteristisch für viele neuroentwicklungsstörungen. Studieren wie chronische Schlaf Einschränkung während der Entwicklung Erwachsener Verhalten beeinflussen kann kann zum Verständnis der Entstehung von Verhaltensstörungen Symptome der neuroentwicklungsstörungen hinzufügen. Zwar gibt es viele Methoden, die verwendet werden, um Schlaf bei Nagetieren einschließlich erzwungene Fortbewegung, ständige Unterbrechungen, Präsentation eines aversiven Stimulus oder Stromschlag zu beschränken, viele dieser Methoden sind sehr belastend und können nicht bei Neugeborenen Mäusen verwendet werden. Hier beschreiben wir sanfte Handhabung, eine Schlaf-Entzug-Technik, die chronisch während der gesamten Entwicklung und bis ins Erwachsenenalter verwendet werden, um Schlaf Einschränkung zu erreichen. Schonende Behandlung beinhaltet Beobachtung der Mäuse während der gesamten Schlaf Entbehrungen und den Forscher zu sanft prod die Tiere, wenn sie inaktiv sind oder Verhaltensweisen im Zusammenhang mit Schlaf erfordert. Gepaart mit EEG-Ableitungen, könnte schonenden Umgang verwendet werden, um gezielt eine bestimmte Phase des Schlafes wie REM (REM) Schlaf stören. Die Technik der schonenden Umgang ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung der Auswirkungen der chronischen Schlaf Einschränkung sogar bei Neugeborenen Mäusen, die viele mehr Stress Verfahren zur Schlafentzug umgeht.
Introduction
Schlaf spielt eine entscheidende Rolle in neuronale Plastizität und Synapse Bildung und Beseitigung im Gehirn Entwicklung1,2. Rem (REM) Schlaf ist unerlässlich für die Bildung stabiler synaptischer Schaltungen durch beide Stärkung der spezifische Synapsen und synaptische Schnitt2. Pharmakologische Schlafentzug schon früh im Leben führt zu vielen physiologischen und verhaltensbezogenen Defizite3,4. Neben der pharmakologischen Schlaf Entbehrung, andere Formen der Schlafentzug wie Konstante schütteln, gezwungen Fortbewegung oder Präsentation einen aversiven Reiz wurden im Zusammenhang mit Depressionen-ähnliche Symptome im Erwachsenenalter, verschiedenen neuronalen Aktivierungsmuster und Änderungen der Zeit und Schlaf schlafkontinuität während einer Erholungsphase nach Entbehrung5,6,7. Wenn Schlaf chronisch bei Mäusen über fünf Wochen während der Entwicklung eingeschränkt wird, wurden Verhaltensstörungen Defizite nach einem Monat der Schlaf Erholung8beobachtet. Zusammen genommen, diese Studien deuten darauf hin, dass Störungen des Schlafes in der neonatalen Nager später Schlafmuster, Gehirnfunktion und Verhalten beeinflussen kann. Hervorhebung der Bedeutung des Schlafes für die normale Gehirnentwicklung beim Menschen, viele Patienten mit Neurodevelopmental Störungen, inklusive Autismus-Spektrum-Störungen, Tuberöse Sklerose Complex, Fragile X-Syndrom und Aufmerksamkeit-Defizit/Hyperaktivität Störung, Bericht Auffälligkeiten im Schlaf-Muster neben einer Vielzahl von Verhaltensstörungen Defizite1.
Angesichts der Zahl von Neurodevelopmental Störungen, die mit abnormen Schlafrhythmus verbunden sind, ist es wichtig zu verstehen, wie Mangel an Schlaf Gehirnfunktion und Verhalten auswirkt. Jedoch trotz der Daten unterstützen, die Bedeutung des Schlafes während der Entwicklung, die meisten Methoden, die einschränken oder Tiere des Schlafes Fokussierung auf Erwachsene zu berauben. Diese Techniken umfassen eine Vielzahl von Tests, die erfordern gezwungen lokomotorischen Tätigkeit (z. B. ständige Laufband), ständige Unterbrechung (z. B. rotierende Kehrmaschine Bar oder kontinuierliche Roman Objektdarstellung) oder stören das Tier zu Beginn der REM-Schlaf (z. B. Plattform über Wasser)9,10. Obwohl diese Methoden effektiv Probleme im Zusammenhang mit Schlafentzug bei Erwachsenen gezeigt haben, sind keine dieser Methoden für Nager Welpen wegen ihrer begrenzten Mobilität, hohe Schlaf fahren und die negativen Auswirkungen von Stress schon früh im Leben. Aufgrund der Bedeutung des Schlafes während der Entwicklung ist es wichtig zu verstehen, wie eingeschränkt Schlaf bei Neugeborenen Welpen wirkt sich auf zukünftiges Verhalten im Erwachsenenalter.
Eine Technik, um Schlaf zu beschränken, die Nager Welpen einsetzbar ist schonende Behandlung. Schonende Behandlung beinhaltet die Ermittler, die direkte Interaktion mit den Nagetieren, die jedes Mal Schlafverhalten beobachtet wird. Ermittler können ihre Hände, Pinsel oder Präsentation von neuen Objekten verwenden, um physisch stören Schlaf bei Neugeborenen Nagetiere8,10,11,12,13,14 . Schlaf kann verhaltensrelevanten durch mangelnde motorische Aktivität, myoklonische Zuckungen und Augenschluß (in älteren Nagetier Welpen) bestimmt werden. EEG-Validierung bestätigt, dass 91 % in P12 Ratten14stören Schlaf mit schonenden Umgang basierend auf diese Verhaltensweisen Gesamt-Schlafdauer reduziert. Andere Techniken, die verwendet wurden, um jungen Mäusen zu berauben Stromschlag und Präsentation von unangenehmen reizen, sondern diese Techniken nicht für chronische Schlaf-Einschränkung verwendet werden und sind mehr Stress als schonenden Umgang mit7, 15. chronische Schlaf Einschränkung kann auch erreicht werden, durch ein schütteln Protokoll, das mit oder ohne EEG Elektroden Implantation und damit verbundenen Computer-Software verwendet werden kann, aber dieses Protokoll nicht verhindern, dass alle schlafen und ist deshalb weniger gesteuert im Vergleich zum schonenden Umgang mit4,16. Die Fähigkeit zu beschränken oder zu berauben Mäuse Schlaf für viele Tage hintereinander ohne spezielle Ausrüstung, Computer-Software oder Elektrode Implantation ist ein Vorteil der schonenden Umgang mit Technik. Chronische Schlaf Einschränkung über sanfte Handhabung effektiv begrenzt Schlaf bei Neugeborenen Nagern und produziert eine Vielzahl von Verhaltensänderungen, die nach dem Schlaf Entbehrungen Periode8,11,12, 17.
Hier beschreiben wir Ergebnisse in denen Chronischer Schlafentzug für drei Stunden pro Tag von postnatale Tag 5 (P5) bis P42 erheblich beeinträchtigt Geselligkeit von Mäusen nach einer 30-Tage Erholungszeit in der Schlaf nicht gestört wird. Diese Ergebnisse zeigen die langfristigen Auswirkungen der chronischen Schlaf Einschränkung während der Entwicklung auf zukünftiges Verhalten.
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Protocol
Hinweis: Die Verfahren wurden durch die nationale Institut für geistige Gesundheit Animal Care and Use Committee genehmigt und durchgeführt in Übereinstimmung mit den nationalen Institute der Gesundheitsrichtlinien auf die Pflege und Nutzung von Tieren.
(1) Sleep Deprivation Setup
- Verwenden Sie weiche Pinsel sanft Mäuse Schlaf stecken.
- Stellen Sie sicher, dass der Pinsel durch die Gitterstäbe der Maus Käfig Feeder passen kann, um sicherzustellen, dass Mäuse Zugang zu Nahrung haben und Wasser Ad Libitum während Schlafentzug.
- Verwenden Sie Pinsel für mehrere Käfige nicht zur Verhinderung des Transfers von Düften zwischen Käfige. Wir empfehlen, dass Sie jede Bürste mit seinem zugewiesenen Käfig beschriften und seine Verwendung in diesem Käfig zu beschränken.
- Benennen Sie einen Raum, wo alle Schlafentzug auftreten wird.
(2) Tier Setup
- Ordnen Sie jeder Käfig nach dem Zufallsprinzip entweder Schlafentzug oder Kontrollgruppe zu.
- Mäuse Zugang zu Nahrung und Wasser Ad Libitum während des Experiments.
- Stellen Sie sicher, Blick von Mäusen durch Bettzeug, Nistmaterial oder Bereicherung Gegenständen im Käfig nicht eingeschränkt ist.
- Entfernen Sie Zustellbetten oder Bereicherung Objekte, die den Blick auf die Mäuse beschränken könnte.
- Wenn Nahrung oder Wasser Blick auf Mäuse beschränkt, stellen Sie Mäuse an einem Käfig, wo die Sicht nicht eingeschränkt wird.
- Wenn das Essen einen großen Teil des Käfigs blockiert, entfernen Sie etwas zu essen und Pellets auf den Boden des Käfigs damit Tiere Zugang zu Nahrungsmitteln den Schlaf Entbehrungen Zeitraum beibehalten.
3. Tier Bedingungen
Hinweis: Wir haben die dreistündige beginnen Schlaf Entbehrungen Punkt am 11:00, wenn Mäuse sind in der Mitte ihrer inaktiven Phase, aber die Uhrzeit und Dauer der Schlafentzug gewählt werden können basierend auf den gewünschten experimentellen Bedingungen.
- Kontrollgruppe.
- Entfernen Sie auf P5 der Vater aus dem Züchter Käfig zu und lassen Sie den Damm mit den Welpen bis Entwöhnung (P21).
- Mäuse, die Kontrollgruppe, die Schlafentzug zugewiesen Raum und sanft prod die Mäuse mit einem Pinsel kontinuierlich für 10 Minuten pro Tag für die Dauer des Experiments bewegen (P5, P42).
- Nach diesen 10 Minuten das Tier Raum hält die Mäuse wieder und nicht stören
- Sleep Deprivation Gruppe.
- Entfernen Sie auf P5 der Vater aus dem Züchter Käfig zu und lassen Sie den Damm mit den Welpen bis Entwöhnung (P21).
Hinweis: Schlafentzug vor P5 führen Kannibalisierung der Welpen. Wir nicht signifikante Kannibalisierung P5 und später beobachten.
Hinweis: In jungen Welpen ist die Fahrt zum schlafen sehr hoch erfordern nahezu konstant streicheln. Die Mäuse bei der Entwicklung vor allem nach dem absetzen, der Schlaf-Druck ist niedriger und sie brauchen keine ständige drängen. - Fahren Sie mit Schlafentzug täglich bis P42.
Hinweis: Sleep Deprivation Protokolle können variieren in der Länge und vorbei an P42 zu verlängern, falls gewünscht. - Bewegen Sie Mäuse der Schlaf Entbehrungen Gruppe in den Schlaf Entbehrungen Raum täglich während der lichtzyklus zugewiesen, wo werden sie überwacht werden. Die genaue Dauer der Schlafentzug kann anhand der spezifischen Fragestellung angepasst werden.
Hinweis: Bei Neugeborenen Mäusen ist Schlafentzug, der länger als 3 Stunden dauert wegen der Zunahme der Schlaf Druck15schwierig.- Während dieser Zeit sanft prod die Mäuse mit dem Pinsel jede Zeit, die Schlaf ersichtlich ist. Besonderheiten der Schlafentzug werden im nächsten Abschnitt erläutert.
- Entfernen Sie auf P5 der Vater aus dem Züchter Käfig zu und lassen Sie den Damm mit den Welpen bis Entwöhnung (P21).
(4) Schlafentzug
- Sanft prod Maus mit Pinsel, wenn Verdacht, schlafend, bis eine Reaktion beobachtet wird. Alternativ invertieren Sie Mäuse zu und schieben Sie über auf den Rücken, Schlaf zu stören.
- Betrachten Sie eine Maus zu schlafen, wenn eine der folgenden auftreten: Inaktivität, zucken (insbesondere bei Welpen), oder wenn ihre Augen (bei Mäusen älter als P12) geschlossen sind.
- Mäuse werden wach, wenn sie versuchen, nach, auf dem Rücken, oder pflegen sich umdrehen bewegen, sind zu berücksichtigen.
- Wenn Damm Welpen während Schlafentzug verdeckt, prod ihr sanft vom Welpen, so ist der Blick auf die Welpen uneingeschränkt.
5. nach Schlafentzug
- Wenn die drei-Stunden-Zeitraum von Schlafentzug abgeschlossen ist, setzen Sie das Bettzeug und Speisen, die wieder entfernt wurden und setzen Sie der Deckel wieder auf den Käfig.
- Käfige bis zum nächsten Tag der Schlafentzug Tier halten Zimmer zurück.
6. nachfolgende Experimente
- Je nach dem Ziel der Entbehrung Schlafuntersuchung fahren Sie mit weiteren Experimenten.
- Ernten Sie Serum von Tieren, Corticosteron18Ebenen zu bestimmen.
- Führen Sie einen der eine Reihe von Verhaltens-Tests, einschließlich Freiland, RotaRod, erhöhte Plus Maze, Sozialverhalten, Tests, Marmor begraben, etc.8,19,20 diese Verhaltens-Tests werden auch verhindern, dass die Tiere aus schlafen, so dass beim bestimmen, wie viele Tage der ständigen Schlafentzug zu beschäftigen einkalkuliert werden sollte.
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Representative Results
Um die Auswirkungen der chronischen Schlaf Einschränkung Verhalten zu untersuchen, schlafen wir eingeschränkte Mäuse für drei Stunden täglich von 11:00 bis 14:00 von P5 auf P428. Im Anschluss an die Schlaf-Einschränkung Mäuse blieben vier Wochen lang ungestört und zur Wiederherstellung Schlaf Einschränkung erlaubt. Mäuse wurden für das Verhalten nach der vierwöchigen Erholungsphase getestet. Der Dreikammer-Sozialverhalten-Test wurde zur Geselligkeit (Präferenz für eine neue Maus im Vergleich zu einem neuen Objekt) und soziale Neuheit (Präferenz für eine neue Maus im Vergleich zu einer vertrauten Maus) zu bewerten. Schlafen in der Geselligkeit-Test beschränkt Frauen mehr Zeit schnüffeln die fremde Maus als Steuerelement Weibchen (p < 0,05) (Abbildung 1A) und Schlaf eingeschränkt Männchen hatten eine Tendenz zu mehr Zeit für das Objekt im Vergleich zu schnüffeln Männer zu kontrollieren (p = 0.077) (Abb. 1A). In der sozialen Neuheit Testphase, Schlaf eingeschränkt weibliche Mäusen eine erhöhte verbrachte Zeit schnüffeln die neuartige Maus als weibliche Kontrollen (p < 0,01) (Abbildung 1 b).
Abbildung 1: chronische Schlaf Einschränkung ändert Sozialverhalten nach einer 4-wöchigen Schlaf Erholungszeit. (A) Geselligkeit Test: Zeit Schnupfen zeigt, dass männliche Mäuse, die Schlaf eingeschränkt verbrachte mehr Zeit für das neue Objekt im Vergleich zu Kontrollen Männchen schnüffeln (p = 0.077). Schlaf eingeschränkt weibliche Mäuse mehr Zeit die fremde Maus im Vergleich zur Kontrolle Weibchen schnüffeln (*p < 0,05). Weibliche Mäusen Schlaf eingeschränkt tendenziell auch mehr Zeit für das Objekt im Vergleich zur Kontrolle Weibchen schnüffeln (p = 0,065). (B) soziale Neuheit-Test: Zeit des Romans schnüffeln oder vertrauten Maus offenbart, dass der Schlaf eingeschränkt weibliche Mäusen statistisch signifikant mehr Zeit schnüffeln die neuartige Maus im Vergleich zu weiblichen Mäusen, die nicht Schlaf eingeschränkt wurden (**p < 0,01). Balken stehen für die Mittel ± SEM in 11 Kontrolle männlich, 13 Schlaf eingeschränkt männlich, weiblich 22 Kontrolle und 17 Schlaf eingeschränkt weiblichen Mäusen. Daten wurden analysiert mittels Hoct post-Tests nach einer ANOVA. Diese Zahl wurde mit freundlicher Genehmigung von Sare Et Al. 20168geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Hier beschreiben wir eine Methode für Schlafentzug, schonende Behandlung, die in beiden Nager Welpen und Erwachsene verwendet werden können. Schonende Übergabe erfordert Forscher beobachten Mäuse für die Dauer der ein Schlaf Entbehrungen und sanft prod die Tiere, wenn sie inaktiv oder zucken, Schlaf zu verhindern sind. Vorherige Entbehrung schlafstudien haben durch gleichzeitige Elektroenzephalogramm (EEG) Aufnahmen bestätigt, dass schonende Behandlung verhindert, beide REM dass und non - REM NREM Schlaf10. Während schonende Behandlung die einzigen Sleep Deprivation Methoden, die auf Nagetier Jungspunde verwendet werden können gehört, gibt es einige Beschränkungen auf ihren Einsatz.
Erste, sanfte Behandlung stützt sich stark auf den Versuchsleiter, dass man sowohl erkennen und umgehend zu reagieren, um Verhaltensweisen bereits schlafen. Beim schlafen in Nagetier Welpen zu berauben, müssen die Welpen fast ständig stieß oder invertiert um sicherzustellen, dass sie für die gesamte Schlaf Sperrfrist wach sind. Anerkennung von zucken in junge Welpen ist entscheidend für Schlaf21richtig zu verhindern. Zweitens sollte anerkannt werden, dass Schlafentzug, der Auftritt vor dem absetzen, wenn die Welpen noch mit ihrer Mutter, die Mutter Schlaf als Nebeneffekt beeinträchtigen könnten; das Ausmaß dieses Effekts muss jedoch noch erkundet werden. Drittens ist es wichtig zu erkennen, dass jeder Schlaf Entzug Prozess wird von Natur aus stressig sein, und es ist nicht möglich, die Auswirkungen von Schlafentzug vom Stress zu trennen, die durch das Verfahren verursacht wird. Jedoch beschriebenen mit dem schonenden Umgang mit Protokoll hier Versuche, den Stress der Schlafentzug im Vergleich zu anderen Schlaf Entbehrungen Protokolle zu minimieren. Und schließlich, während sanfte Handhabung eine nützliche Technik für neonatale Chronischer Schlafentzug ist, ist es eine aufwändige Prozedur für Forscher wie es zeitaufwendig ist und ständige Aufmerksamkeit erfordert. Länger schlafen Entbehrungen Protokolle sind auch schwierig bei Neugeborenen Mäusen durch die angestiegene Schlaf Druck über Zeit15durchzuführen.
Trotz dieser Einschränkungen ist die schonende Übergabe ein leistungsfähiges Werkzeug zur Studie über die Auswirkungen der chronischen Schlaf Einschränkung während der gesamten Entwicklung und Erwachsenenalter und wie Schlaf Einschränkung Verhalten und Gehirn Physiologie beeinflussen kann. Am wichtigsten ist, mit dieser Methode können weiterhin die Auswirkungen untersuchen Forscher, dass der Schlaf Einschränkung in einem frühen Alter auf die Entwicklung des Gehirns beide sofort folgende Einschränkung schlafen und später im Leben haben kann.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde durch das intramurale Forschungsprogramm des NIMH (ZIA MH00889) finanziert. RMS wurde auch durch eine FRAXA Postdoctoral Fellowship unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | Jackson Labs | 000664 | Wildtype mice used |
| Super Mouse 750 Mouse Cage | Lab Products, Inc. | Cages for the mice | |
| SANI-Chips Bedding | PJ Murphys | Bedding for the mice | |
| S&S Bristle Brush Assortment Pack | Staples | Item # 13764, Model AB37100 | Paint brushes are used to gently poke mice |
References
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