Summary
We beschrijven een slaap deprivatie techniek die bekend staat als zachte behandeling waar onderzoekers zachtjes prod muizen elk moment slaap gedrag wordt waargenomen. Deze methode is een krachtig hulpmiddel waarmee onderzoekers de effecten die chronische slaap beperking in de gehele ontwikkeling op toekomstige hersenen fysiologie en gedrag hebben kan te bestuderen.
Abstract
Slaap is essentieel voor de goede ontwikkeling en Neurale plasticiteit. Bovendien, abnormale slaappatronen zijn kenmerkend voor veel neurologische aandoeningen. Bestuderen hoe chronische beperking van de slaap tijdens de ontwikkeling van invloed kan zijn op de volwassen gedrag kan toevoegen aan ons begrip van de opkomst van gedrags symptomen van neurologische aandoeningen. Hoewel er vele methoden die kunnen worden gebruikt om te slapen in knaagdieren, met inbegrip van gedwongen motoriek, verstoring van de constante, presentatie van een aversieve stimulus, of een elektrische schok te beperken, veel van deze methoden zijn zeer belastend en kunnen niet worden gebruikt bij neonatale muizen. We beschrijven hier, zachte behandeling, een slaap deprivatie techniek die kan gebruikt worden chronisch in de gehele ontwikkeling en in volwassenheid tot beperking van de slaap. Zachte behandeling omvat nauwkeurige observatie van de muizen gedurende de ontbering slaap en vereist de onderzoeker te zachtjes prod de dieren wanneer ze inactief worden of weer gedrag geassocieerd met slapen. In combinatie met EEG-opnamen, kan zachte behandeling worden gebruikt om een specifieke fase van de slaap zoals rapid eye movement (REM) slaap selectief te verstoren. De techniek van zachte behandeling is een krachtig hulpmiddel voor de studie van de effecten van chronische slaap beperking zelfs in de neonatale muizen die veel van de meer stress procedures gebruikt voor slaaptekort omzeilt.
Introduction
Slaap speelt een cruciale rol in de neuronale plasticiteit en synapse formatie en eliminatie tijdens1,2van de ontwikkeling van de hersenen. Rapid eye movement (REM) slaap is met name essentieel voor het vormen van stabiele synaptic circuits door beide versterking van specifieke synapsen en synaptische snoeien2. Farmacologische slaaptekort vroeg in het leven leidt tot veel fysiologische en gedragsmatige tekorten3,4. Naast farmacologische slaap deprivatie, andere vormen van slaaptekort zoals constante schudden, gedwongen motoriek of presentatie van een aversieve stimulus zijn geassocieerd met depressie-achtige symptomen tijdens volwassenheid, verschillende neurale activering patronen, en veranderingen in slaap tijd en slaap continuïteit tijdens een herstelperiode na ontbering5,6,7. Wanneer slaap het chronisch in muizen voor meer dan vijf weken tijdens de ontwikkeling beperkt is, de gedrags tekorten werden waargenomen na een maand van de slaap herstel8. Samen genomen, suggereren deze studies dat de verstoring van de slaap in de neonatale knaagdier later slaappatronen, hersenfunctie en -gedrag kan beïnvloeden. Wijzen op het belang van de slaap voor de ontwikkeling van de normale hersenen bij de mens, vele patiënten met neurologische aandoeningen, met inbegrip van Autisme Spectrum stoornissen, Tubereuze Sclerose Complex, fragiele X-syndroom en aandacht-Deficit/Hyperactivity Obsessieve compulsieve stoornis, verslag abnormaliteiten in slaappatronen naast allerlei gedrags tekorten1.
Gezien het aantal neurologische aandoeningen die gekoppeld aan abnormale slaappatronen zijn, is het belangrijk om te begrijpen hoe gebrek aan slaap beïnvloedt hersenfunctie en gedrag. Echter, ondanks de gegevens die het belang van slaap tijdens de ontwikkeling, ondersteunen de meeste methodologieën die te beperken of te ontnemen van slaap focus op volwassenen dieren. Deze technieken omvatten allerlei tests waarvoor gedwongen motorische activiteit (bijvoorbeeld, constante loopband), constante verstoring (bijvoorbeeld roteren Veger bar of voortdurende roman object presentatie), of het verstoren van het dier aan het begin van REM-slaap (bijvoorbeeld platform waterbeheersing)9,10. Hoewel deze methoden is de problemen in verband met slaaptekort bij volwassenen effectief gebleken, zijn geen van deze methoden geschikt voor knaagdieren pups vanwege hun beperkte mobiliteit, hoge slaap station en de schadelijke effecten van stress vroeg in het leven. Vanwege het belang van slaap tijdens de ontwikkeling is het essentieel om te begrijpen hoe beperkt slaap in neonatale pups beïnvloedt toekomstig gedrag tijdens volwassenheid.
Een techniek om te slapen, die kan worden gebruikt in knaagdier pups beperken is zachte behandeling. Zachte behandeling omvat de onderzoeker directe wisselwerking met de knaagdieren die ieder tijd slaap gedrag wordt waargenomen. Onderzoekers kunnen gebruiken hun handen, een penseel of presentatie van de nieuwe objecten fysiek verstoort slaap in neonatale knaagdieren8,10,11,12,13,14 . Slaap kan gedragsgestoorde worden bepaald door gebrek aan motorische activiteit, myoclonische spiertrekkingen en oog sluiting (in oudere knaagdier pups). EEG validatie bevestigt dat slaap verstoren met zachte behandeling op basis van deze gedragingen vermindert de totale slaaptijd met 91% in P12 ratten14. Andere technieken die zijn gebruikt om het ontnemen van de jonge muizen omvatten elektrische schok en presentatie van onaangename stimuli, maar deze technieken kunnen niet worden gebruikt voor chronische slaap beperking en zijn meer stress dan zachte behandeling7, 15. chronische slaap beperking kan ook worden bereikt door een schudden protocol dat kan worden gebruikt met of zonder EEG elektrode implantatie en bijbehorende computersoftware, maar dit protocol belet niet alle slaap en is daarom minder gecontroleerd ten opzichte van zachte behandeling4,16. De mogelijkheid om te beperken of te ontnemen van muizen van de slaap voor vele dagen in een rij zonder specifieke apparatuur, computersoftware of elektrode implantatie is een voordeel van de zachte behandeling techniek. Chronische slaap beperking via zachte behandeling effectief beperkt slaap in neonatale knaagdieren en produceert een scala aan gedragsveranderingen na de slaap deprivatie periode8,11,12, 17.
Hier beschrijven we resultaten waarin Chronisch slaaptekort gedurende drie uur per dag van postnatale dag 5 (P5) t P42 heeft grote invloed op gezelligheid van muizen na een herstelperiode van 30 dagen waarin slaap niet wordt verstoord. Deze resultaten wijzen op de lange termijn effecten van chronische slaap beperking tijdens ontwikkeling op toekomstig gedrag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Alle procedures werden goedgekeurd door het nationale Instituut voor geestelijke gezondheid Animal Care en gebruik Comité en uitgevoerd overeenkomstig de nationale instituten van gezondheid richtsnoeren inzake de zorg en het gebruik van dieren.
1. slaap deprivatie Setup
- Gebruik zachte schilderskwast zachtjes steken muizen als in slaap.
- Zorg ervoor dat het penseel kan passen door de tralies van de muis kooi feeder om ervoor te zorgen dat muizen toegang tot voedsel hebben en water ad libitum tijdens slaaptekort.
- Gebruik geen schilderskwast voor meerdere kooien om te voorkomen dat de overdracht van geuren tussen kooien. Wij stellen voor dat u elke borstel met zijn toegewezen kooi label en het gebruik ervan tot die kooi beperken.
- Het aanwijzen van een kamer waar alle slaaptekort zal plaatsvinden.
2. dierlijke Setup
- Willekeurig toewijzen elke kooi aan slaaptekort of controlegroep.
- Muizen toegang te geven tot voedsel en water ad libitum tijdens het experiment.
- Zorg ervoor dat de weergave van muizen wordt niet beperkt door beddengoed, nest materiaal of verrijking objecten in kooi.
- Het verwijderen van extra bedden of verrijking-objecten die de weergave van de muizen kunnen beperken.
- Als voedsel of water uitzicht op muizen beperkt, verplaatst u de muizen naar een gebied van kooi waar de weergave niet beperkt is.
- Als het voedsel een groot deel van de kooi blokkeert, verwijder wat te eten en plaats van pellets op de bodem van de kooi, zodat dieren toegang tot voedsel tijdens de slaap deprivatie periode behouden.
3. dierlijke voorwaarden
Opmerking: Wij kozen om te beginnen de drie uur slaap deprivatie periode om 11u, wanneer muizen zijn in het midden van hun inactieve fase, maar het tijdstip en de duur van slaaptekort kunnen worden gekozen op basis van de gewenste experimentele omstandigheden.
- Controlegroep.
- Verwijder de vader uit de kooi Fokker op P5, en laat de dam met de pups tot spenen (P21).
- Verplaatsen van muizen die zijn toegewezen aan de controlegroep aan het slaaptekort kamer en zachtjes prod de muizen met een kwast continu gedurende 10 minuten per dag voor de duur van het experiment (P5 aan P42).
- Na deze 10 minuten, de muizen terug te keren naar het dier kamer te houden en hen niet storen
- Slaap deprivatie groep.
- Verwijder de vader uit de kooi Fokker op P5, en laat de dam met de pups tot spenen (P21).
Opmerking: Slaaptekort vóór P5 kan resulteren in kannibalisatie van de pups. Wij deden niet observeren aanzienlijke kannibalisatie op P5 en later.
Opmerking: In de jonge pups, de drang om te slapen is zeer hoog waarbij vrijwel constant aaien. Als de muizen te ontwikkelen, met name na het spenen, de druk van de slaap is lager en ze hoeven niet constant porren. - Slaaptekort elke dag tot P42 voortzetten.
Opmerking: Slaap deprivatie protocollen kunnen variëren in lengte en uit te breiden voorbij P42 indien gewenst. - Verplaatsen muizen die zijn toegewezen aan de slaap deprivatie groep naar de slaap deprivatie kamer dagelijks tijdens de lichte cyclus waar ze zullen worden gevolgd. De precieze duur van slaaptekort kan worden aangepast op basis van de specifieke onderzoeksvraag.
Opmerking: In neonatale muizen slaaptekort die langer dan 3 uur duurt is moeilijk vanwege de toename van de slaap druk15.- Gedurende deze tijd, zachtjes prod de muizen met de verfkwast elk moment dat slaap duidelijk is. Bijzonderheden van slaaptekort worden toegelicht in de volgende sectie.
- Verwijder de vader uit de kooi Fokker op P5, en laat de dam met de pups tot spenen (P21).
4. de slaaptekort
- Zachtjes prod muis met penseel als vermoedelijk in slaap totdat een antwoord wordt waargenomen. Uitwijkmogelijkheid, omkeren van muizen en duwen op hun rug te slaap verstoren.
- Overwegen een muis als in slaap als een van de volgende optreedt: inactiviteit, spiertrekkingen (vooral met pups), of als hun ogen zijn gesloten (bij muizen ouder dan P12).
- Muizen worden wakker als ze bewegen, flip-over na wordt op hun rug of grooming zich willen overwegen.
- Als dam pups tijdens slaaptekort bedekt, zachtjes prod haar uit de buurt van pups zodat de weergave van de pups onbeperkt is.
5. na Slaapdeprivatie
- Wanneer de drie uur durende periode van slaaptekort voltooid is, zet u het beddengoed en voedsel dat kan zijn verwijderd terug en plaats het deksel terug op de kooi.
- Kooien terugkomen met dierlijke bedrijf kamer tot de volgende dag van slaaptekort.
6. latere experimenten
- Afhankelijk van het doel van de studie van slaap deprivatie, doorgaan met verdere experimenten.
- Oogst serum van dieren te bepalen corticosterone niveaus18.
- Voor een aantal gedrags proeven, met inbegrip van Open veld, RotaRod, verhoogde Plus doolhof, sociaal gedrag testen, marmer begraven, etc.8,19,20 deze tests gedrag wordt ook voorkomen dat de dieren uit handelingen slapen zodat moet rekening worden gehouden bij het bepalen van hoeveel dagen van continue slaaptekort te wenden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om te onderzoeken de effecten van chronische slaap beperking van gedrag, slapen we beperkt muizen gedurende drie uur dagelijks tussen 11:00 en 2:00 PM van P5 P428. Naar aanleiding van de beperking van de slaap, waren muizen ongemoeid gelaten voor vier weken en toegestaan om te herstellen van beperking van de slaap. Muizen werden getest voor gedrag na de vier weken durende herstelperiode. De test van sociaal gedrag van de drie-kamer werd gebruikt voor het beoordelen van gezelligheid (voorkeur voor een nieuwe muis ten opzichte van een roman-object) en sociale nieuwigheid (voorkeur voor een nieuwe muis in vergelijking met een bekende muis). Slapen in de test van de gezelligheid, beperkte vrouwtjes besteed meer tijd het snuiven van de vreemde muis dan controle vrouwtjes (p < 0,05) (figuur 1A) en slaap-beperkte mannen hebben de neiging om meer tijd te snuiven van het object ten opzichte van mannetjes bepalen (p = 0.077) (figuur 1A). In de sociale nieuwigheid fase van testen, slaap-beperkte vrouwelijke muizen bracht een verhoogde de hoeveelheid tijd snuiven van de roman muis dan vrouwelijke controles (p < 0,01) (figuur 1B).
Figuur 1: chronische slaap beperking verandert sociaal gedrag na een periode van 4 weken durende slaap herstel. (A) gezelligheid test: tijd besteed snuiven onthult dat mannelijke muizen die waren meer tijd met in slaap beperkt, snuiven van het nieuwe object ten opzichte van de besturingselementen mannetjes (p = 0.077). Slaap-beperkte vrouwelijke muizen besteed meer tijd snuiven de vreemdeling muis in vergelijking met controle vrouwtjes (*p < 0,05). Slaap-beperkte vrouwelijke muizen ook de neiging om meer tijd te snuiven van het object t.o.v. controle vrouwtjes (p = 0,065). (B) sociaal nieuwigheid test: tijd besteed aan het snuiven van de roman of vertrouwd muis geopenbaard dat slaap beperkt vrouwelijke muizen tijd statistisch significant meer snuiven van de roman muis ten opzichte van vrouwelijke muizen die niet slaap beperkt waren (**p < 0,01). De staven de middelen ± SEM in 11 controle man, 13 slaap-beperkte man, 22 controle vrouwelijke en 17 slaap-beperkte vrouwelijke muizen. Gegevens werden geanalyseerd door middel van post hoct-tests die na een ANOVA. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Sare et al. 20168. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we een methode voor slaaptekort, zachte behandeling, die kan worden gebruikt in zowel knaagdier pups en bij volwassenen. Zachte inleveren vereist onderzoekers te observeren van muizen voor de duur van een periode van slaap deprivatie en zachtjes prod de dieren wanneer ze inactief of twitching ter voorkoming van slaap. Voorafgaande slaap deprivatie studies hebt gecontroleerd door middel van gelijktijdige electroencephalogram (EEG) opnamen dat zachte behandeling beide REM voorkomt en niet REM NREM - slaap10. Terwijl zachte behandeling een van de enige slaap deprivatie methoden die kunnen worden gebruikt op jonge knaagdieren pups is, zijn er enkele beperkingen aan het gebruik ervan.
Eerste, zachte afhandeling afhankelijk sterk van de experimentator te kunnen zowel herkennen en snel reageren op gedrag vooraf te slapen. Wanneer het ontnemen van slaap in knaagdier pups, moeten de pups bijna constant geprikt of omgekeerd om te verzekeren dat ze wakker voor de gehele slaap beperking periode zijn. Erkenning van spiertrekkingen in jonge pups is cruciaal voor goed slaap21te voorkomen. Ten tweede moet worden erkend dat slaaptekort dat optreedt vóór het spenen, wanneer de pups nog steeds met hun moeder zijn, van invloed kan zijn op de Moederdag slaap als een neveneffect; de omvang van dit effect moet echter nog worden onderzocht. Ten derde, is het belangrijk om te erkennen dat elk slaap deprivatie proces inherent stressvol zal worden, en het is niet mogelijk om te scheiden van de gevolgen van Slaapgebrek van de stress die wordt veroorzaakt door de procedure. Echter, met behulp van het protocol van zachte behandeling hier beschreven pogingen om te minimaliseren van de stress van slaaptekort in vergelijking met andere slaap deprivatie protocollen. En ten slotte overwegende dat zachte afhandeling een handige techniek voor chronische neonatale Slaapgebrek is, is een omslachtige procedure voor onderzoekers als het is tijdrovend en constante aandacht vereist. Langere slaap deprivatie protocollen zijn ook moeilijk uit te voeren in neonatale muizen als gevolg van de stijgingen van de slaap druk over tijd15.
Ondanks deze beperkingen is zachte inleveren een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van de effecten van chronische slaap beperking in de gehele ontwikkeling en in volwassenheid en hoe slaap beperking zowel gedrag als hersenen fysiologie kan beïnvloeden. Belangrijkst, met deze methode kunt onderzoekers te blijven onderzoeken van de gevolgen die slaap beperking op een vroege leeftijd kan hebben op de ontwikkeling van de hersenen van beide onmiddellijk volgende beperking slapen en later in het leven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door de intramurale Research Program van de NIMH (ZIA MH00889). RMS werd ook ondersteund door een FRAXA Postdoctoral Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | Jackson Labs | 000664 | Wildtype mice used |
| Super Mouse 750 Mouse Cage | Lab Products, Inc. | Cages for the mice | |
| SANI-Chips Bedding | PJ Murphys | Bedding for the mice | |
| S&S Bristle Brush Assortment Pack | Staples | Item # 13764, Model AB37100 | Paint brushes are used to gently poke mice |
References
- Picchioni, D., Reith, R. M., Nadel, J. L., Smith, C. B. Sleep, plasticity and the pathophysiology of neurodevelopmental disorders: the potential roles of protein synthesis and other cellular processes. Brain Sci. 4 (1), 150-201 (2014).
- Li, W., Ma, L., Yang, G., Gan, W. B. REM sleep selectively prunes and maintains new synapses in development and learning. Nat Neurosci. 20 (3), 427-437 (2017).
- Peirano, P. D., Algarin, C. R. Sleep in brain development. Biol Res. 40 (4), 471-478 (2007).
- Mirmiran, M., et al. Effects of experimental suppression of active (REM) sleep during early development upon adult brain and behavior in the rat. Brain Res. 283 (2-3), 277-286 (1983).
- Feng, P., Ma, Y. Instrumental REM sleep deprivation in neonates leads to adult depression-like behaviors in rats. Sleep. 26 (8), 990-996 (2003).
- Frank, M. G., Morrissette, R., Heller, H. C. Effects of sleep deprivation in neonatal rats. Am J Physiol. 275 (1 Pt 2), R148-R157 (1998).
- Todd, W. D., Gibson, J. L., Shaw, C. S., Blumberg, M. S. Brainstem and hypothalamic regulation of sleep pressure and rebound in newborn rats. Behav Neurosci. 124 (1), 69-78 (2010).
- Sare, R. M., Levine, M., Hildreth, C., Picchioni, D., Smith, C. B. Chronic sleep restriction during development can lead to long-lasting behavioral effects. Physiol Behav. 155, 208-217 (2016).
- Colavito, V., et al. Experimental sleep deprivation as a tool to test memory deficits in rodents. Front Syst Neurosci. 7, 106 (2013).
- Franken, P., Dijk, D. J., Tobler, I., Borbely, A. A. Sleep deprivation in rats: Effects on EEG power spectra, vigilance states, and cortical temperature. Am J Physiol. 261 (1 Pt 2), R198-R208 (1991).
- Araujo, P., Coelho, C. A., Oliveira, M. G., Tufik, S., Andersen, M. L. Neonatal sleep restriction increases nociceptive sensitivity in adolescent mice. Pain Physician. 21 (2), E137-E148 (2018).
- Araujo, P., Tufik, S., Anderson, M. L. Sleep and pain: A relationship that begins in early life. Pain Physician. 17 (6), E787-E798 (2014).
- Hairston, I. S., et al. Sleep deprivation effects on growth factor expression in neonatal rats: a potential role for BDNF in the mediation of delta power. J Neurophysiol. 91 (4), 1586-1595 (2004).
- Hairston, I. S., et al. Sleep deprivation elevates plasma corticosterone levels in neonatal rats. Neurosci Lett. 315 (1-2), 29-32 (2001).
- Blumberg, M. S., Middlemis-Brown, J. E., Johnson, E. D. Sleep homeostasis in infant rats. Behav Neurosci. 118 (6), 1253-1261 (2004).
- Feng, P., Vogel, G. W., Obermeyer, W., Kinney, G. G. An instrumental method for long-term continuous REM sleep deprivation of neonatal rats. Sleep. 23 (2), 175-183 (2000).
- Xu, Z. Q., Gao, C. Y., Fang, C. Q., Zhou, H. D., Jiang, X. J. The mechanism and characterization of learning and memory impairment in sleep-deprived mice. Cell Biochem Biophys. 58 (3), 137-140 (2010).
- Barriga, C., Martin, M. I., Tabla, R., Ortega, E., Rodriguez, A. B. Circadian rhythm of melatonin, corticosterone and phagocytosis: Effect of stress. J Pineal Res. 30 (3), 180-187 (2001).
- Nadler, J. J., et al. Automated apparatus for quantitation of social approach behaviors in mice. Genes Brain Behav. 3 (5), 303-314 (2004).
- Thomas, A., et al. Marble burying reflects a repetitive and perseverative behavior more than novelty-induced anxiety. Psychopharmacology (Berl). 204 (2), 361-373 (2009).
- Karlsson, K. A., Blumberg, M. S. The union of the state: Myoclonic twitching is coupled with nuchal muscle atonia in infant rats. Behav Neurosci. 116 (5), 912-917 (2002).
