Summary
يصف لنا نوم حرمان تقنية تعرف باسم لطيف التعامل فيها المحققون بلطف همز الفئران أي وقت النوم السلوك الملاحظ. هذا الأسلوب هو أداة قوية أن يسمح للباحثين بدراسة الآثار التي يمكن أن يكون التقييد النوم المزمن في جميع أنحاء التنمية على المخ مستقبلا علم وظائف الأعضاء والسلوك.
Abstract
النوم ضروري للنمو السليم واللدونه العصبية. وعلاوة على ذلك، تتميز أنماط النوم غير طبيعي للعديد من الاضطرابات النمائية. دراسة تقييد النوم كيف المزمنة خلال التنمية يمكن أن تؤثر على سلوك الكبار قد تضيف إلى فهمنا لظهور الأعراض السلوكية للاضطرابات النمائية. وبينما هناك العديد من الأساليب التي يمكن استخدامها لتقييد النوم في القوارض بما في ذلك الحركة القسرية، والتعطيل المستمر، والعرض التقديمي للتحفيز البرود، أو صدمة كهربائية، العديد من هذه الأساليب هي مجهدة للغاية ولا يمكن استخدامه في الفئران حديثي الولادة. هنا، نحن تصف التعامل مع لطيف، أسلوب حرمان نوم التي يمكن استخدامها المزمن في التنمية وفي مرحلة البلوغ لتحقيق تقييد النوم. معالجة لطيف ينطوي على المراقبة الدقيقة للفئران طوال فترة الحرمان من النوم ويحتاج الباحث همز الحيوانات بلطف كلما كانت خاملة أو عرض السلوكيات المرتبطة بالنوم. مقترنا مع تسجيلات التخطيط الدماغي، يمكن معالجة لطيف لتعطيل بشكل انتقائي بمرحلة معينة من النوم مثل نوم حركة العين السريعة (REM). أسلوب التعامل مع لطيف هو أداة قوية لدراسة آثار تقييد النوم المزمنة حتى في الفئران حديثي الولادة التي تلتف العديد من الإجراءات أكثر إرهاقاً المستخدمة للحرمان من النوم.
Introduction
النوم يلعب دوراً حاسما في تشكيل الخلايا العصبية اللدونة والمشبك والقضاء خلال الدماغ التنمية1،2. على وجه التحديد، أمر أساسي لتشكيل الدوائر متشابك مستقرة من خلال تعزيز كلا نهايات محددة وتشذيب متشابك2نوم حركة العين السريعة (REM). الحرمان من النوم الدوائي المبكر في الحياة يؤدي إلى كثير من حالات العجز الفسيولوجية والسلوكية3،4. بالإضافة إلى النوم الدوائي الحرمان، وأشكال أخرى من الحرمان من النوم مثل الهز المستمر، أجبرت الحركة، أو تقديم حافز البرود ارتبطت بأعراض مثل الاكتئاب خلال مرحلة البلوغ، مختلفة العصبية أنماط التنشيط، والتغييرات في استمرارية النوم الوقت والنوم خلال فترة انتعاش عقب الحرمان5،،من67. عندما يتم تقييد النوم المزمن في الفئران لأكثر من خمسة أسابيع خلال التنمية، لوحظت العجز السلوكية بعد شهر من النوم الانتعاش8. أخذت معا، تشير هذه الدراسات إلى أن اضطراب النوم في القوارض حديثي الولادة يمكن أن تؤثر على أنماط النوم لاحق ووظيفة الدماغ والسلوك. تسليط الضوء على أهمية النوم لنمو الدماغ الطبيعي في البشر، والعديد من المرضى الذين يعانون من اضطرابات عصبية، بما في ذلك اضطرابات طيف التوحد والتصلب درني المعقدة ومتلازمة X الهشة والاهتمام-العجز/فرط النشاط اضطراب، تقرير شذوذ في أنماط النوم بالإضافة إلى مجموعة متنوعة من العجز السلوكية1.
نظراً للعدد الاضطرابات النمائية المرتبطة بأنماط النوم غير طبيعي، من المهم أن نفهم كيف تؤثر قلة النوم على وظيفة الدماغ والسلوك. ومع ذلك، وعلى الرغم من البيانات التي تدعم أهمية النوم أثناء التطوير، معظم المنهجيات التي تقييد أو حرمان الحيوانات من النوم التركيز على البالغين. هذه التقنيات تشمل مجموعة متنوعة من الاختبارات التي تتطلب القسري النشاط الحركي (مثلاً المطحنة ثابتة) أو التعطيل المستمر (مثلاً، بالتناوب شريط كاسحة أو العرض التقديمي كائن رواية المستمر)، أو إزعاج الحيوان في بداية 9،النوم rem (مثلاً، منصة عبر المياه)10. ورغم أن هذه الأساليب أثبتت فعالية المشاكل المرتبطة بالحرمان من النوم عند البالغين، أيا من هذه الأساليب مناسبة الجراء القوارض بسبب قدرتها المحدودة على الحركة ومحرك أقراص النوم عالية، والآثار السلبية للإجهاد في مرحلة مبكرة من الحياة. نظراً لأهمية النوم أثناء التطوير، من المهم فهم النوم كيف مقيد في الجراء المواليد يؤثر على السلوك المستقبلي خلال مرحلة البلوغ.
أسلوب واحد لتقييد النوم التي يمكن استخدامها في الجراء القوارض مناولة لطيف. معالجة لطيف ينطوي على المحقق التفاعل مباشرة مع القوارض هو لاحظ أي سلوك وقت النوم. يمكن استخدام المحققين أيديهم، الرسام، أو العرض التقديمي لكائنات جديدة لعرقلة جسديا النوم في الأطفال حديثي الولادة القوارض8،10،11،،من1213،14 . يمكن تحديد النوم سلوكيا بقلة النشاط الحركي والوخز رمعيه، وإغلاق العين (في الجراء القوارض القديمة). التحقق من صحة التخطيط الدماغي يؤكد أن تعطيل وضع السكون مع معالجة لطيف استناداً إلى هذه السلوكيات يقلل وقت النوم الإجمالية بنسبة 91% في الفئران P1214. غيرها من التقنيات التي استخدمت لحرمان الفئران الصغار تشمل الصدمات الكهربائية وتقديم المحفزات غير سارة، ولكن هذه التقنيات لا يمكن استخدامها لتقييد النوم المزمنة وهي أكثر إرهاقاً من مناولة لطيف7، 15-تقييد النوم المزمن أيضا يمكن أن يتحقق عن طريق بروتوكول هز التي يمكن استخدامها مع أو بدون زرع قطب كهربائي EEG والبرامج الحاسوبية المرتبطة بها، ولكن لا يمنع من النوم كل هذا البروتوكول وذلك هو أقل تسيطر مقارنة بالتعامل مع لطيف4،16. هو القدرة على تقييد أو حرمان فئران نوم لأيام عديدة في صف دون معدات معينة، وبرامج الكمبيوتر، أو زرع قطب كهربائي الاستفادة من تقنية المعالجة لطيف. تقييد النوم المزمن عن طريق التعامل مع لطيف فعال يحد من النوم في الأطفال حديثي الولادة من القوارض وتنتج مجموعة متنوعة من التغيرات السلوكية بعد النوم الحرمان فترة8،،من1112، 17.
هنا، نحن تصف النتائج التي يؤثر بها الحرمان من النوم المزمن لمدة ثلاث ساعات كل يوم من يوم الولادة 5 (P5) إلى P42 إلى حد كبير الاجتماعية للفئران بعد فترة نقاهة مدتها 30 يوما فيه عدم تعكير النوم. وتبرز هذه النتائج الآثار الطويلة الأجل لتقييد النوم المزمن أثناء التطوير في المستقبل السلوك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: وافق الوطني المعهد من العقلية الرعاية الصحية والحيوانية واستخدام اللجنة جميع الإجراءات وتنفيذها وفقا للمبادئ "التوجيهية الوطنية للمعاهد الصحية" على الرعاية واستخدام الحيوانات.
1. إعداد الحرمان من النوم
- استخدم فرشاة التلوين الناعمة برفق لكزه الفئران عند النوم.
- تأكد من أنه يمكن أن يصلح الرسام من خلال قضبان تغذية القفص الماوس لضمان أن الفئران الحصول على الغذاء والمياه libitum الإعلانية من خلال الحرمان من النوم.
- لا تستخدم فرشاة التلوين لاقفاص متعددة لمنع نقل الروائح بين الأقفاص. ونحن نقترح يمكنك تسمية كل فرشاة بقفصة المعينة وقصر استخدامه على هذا القفص.
- تعيين غرفة حيث تحدث جميع والحرمان من النوم.
2-الحيوان الإعداد
- تعيين كل قفص عشوائياً للحرمان من النوم أو مجموعة عنصر التحكم.
- إعطاء الفئران الوصول إلى الغذاء والمياه libitum الإعلانية أثناء التجربة.
- تأكد من عرض فئران غير مقيد بالفراش أو مواد العش أو كائنات الإثراء في قفص.
- إزالة الأسرة الإضافية أو كائنات تخصيب اليورانيوم التي يمكن أن تحد من وجهة نظر الفئران.
- إذا كان الغذاء أو المياه يحد من عرض للفئران، نقل الفئران إلى منطقة القفص حيث لا يقتصر العرض.
- إذا كان الطعام يمنع جزء كبير من القفص، إزالة بعض المواد الغذائية ومكان الكريات في الجزء السفلي من القفص حتى الحيوانات الحفاظ على إمكانية الحصول على الغذاء أثناء فترة الحرمان من النوم.
3-الحيوان الشروط
ملاحظة: لقد اخترنا أن تبدأ الثلاث ساعات فترة الحرمان من النوم الساعة 11:00 ص، عندما هم الفئران في منتصف مرحلة غير نشطة، ولكن يمكن اختيار الوقت من اليوم ومدة الحرمان من النوم استناداً إلى الشروط التجريبية المطلوبة.
- مجموعة عنصر التحكم.
- على P5، إزالة المولى من قفص مولده وترك السد الجراء حتى الفطام (P21).
- نقل الفئران المعينة إلى مجموعة المراقبة للحرمان من النوم الغرف ولطف همز الفئران مع فرشاة طلاء بشكل مستمر لمدة 10 دقائق يوميا لمدة التجربة (P5 إلى P42).
- بعد هذه الدقائق العشر، تعود الفئران إلى الحيوان عقد الغرفة وعدم الإزعاج لهم
- مجموعة الحرمان من النوم.
- على P5، إزالة المولى من قفص مولده وترك السد الجراء حتى الفطام (P21).
ملاحظة: قد يؤدي الحرمان من النوم قبل P5 الإبدال الجراء. ونحن لم يلاحظ الإبدال هامة في P5 والإصدارات الأحدث.
ملاحظة: في الجراء الصغار، محرك الأقراص إلى وضع السكون عالية جداً تتطلب الجرة ثابتة تقريبا. كما وضع الفئران، خصوصا بعد الفطام، ضغط النوم أقل ولا يحتاجون الحث المستمر. - تواصل مع الحرمان من النوم كل يوم حتى P42.
ملاحظة: يمكن أن تختلف في الطول البروتوكولات الحرمان من النوم وتمديد الماضي P42 إذا رغبت في ذلك. - نقل الفئران المعينة لمجموعة الحرمان النوم في غرفة النوم الحرمان يوميا خلال دورة خفيفة حيث سيتم رصد. يمكن ضبط مدة الدقيقة للحرمان من النوم استناداً إلى مسألة بحثية محددة.
ملاحظة: في الفئران حديثي الولادة والحرمان من النوم الذي يستمر لفترة أطول من 3 ساعات أمر صعب بسبب الزيادة في النوم ضغط15.- وخلال هذا الوقت، بلطف همز الفئران مع الرسام أي وقت النوم واضح. وأوضح التفاصيل المحددة للحرمان من النوم في المقطع التالي.
- على P5، إزالة المولى من قفص مولده وترك السد الجراء حتى الفطام (P21).
4-الحرمان من النوم
- بلطف همز الماوس مع الرسام إذا كان يشتبه في كونه نائماً حتى يتم ملاحظة استجابة. وبدلاً من ذلك، عكس الفئران ودفع أكثر على ظهورهم لتعطيل وضع السكون.
- النظر بماوس لتكون نائماً في حالة حدوث أي مما يلي: الخمول، الوخز (لا سيما مع الجراء)، أو إذا كان يتم إغلاق عيونهم (في الفئران أقدم P12).
- النظر في الفئران لتكون مستيقظا إذا كانوا يتحرك، تحاول أن اقلب بعد على ظهورهم، أو الاستمالة أنفسهم.
- إذا كان السد يغطي الجراء أثناء الحرمان من النوم، بلطف همز لها بعيداً عن الجراء حيث يرى الجراء غير مقيد.
5-وبعد الحرمان من النوم
- عند الانتهاء من فترة ثلاث ساعات للحرمان من النوم، وضع الفراش والأغذية التي قد تم إزالتها مرة أخرى أي ضع الغطاء مرة أخرى في القفص.
- عودة الأقفاص إلى غرفة عقد الحيوان حتى اليوم التالي للحرمان من النوم.
6-بعد ذلك تجارب
- حسب هدف الدراسة حرمان النوم، المضي قدما في التجارب اللاحقة.
- حصاد المصل من الحيوانات لتحديد المستويات القشري18.
- القيام بأي عدد من الاختبارات السلوكية، بما في ذلك حقل مفتوح، روتارود، مرتفعة بالإضافة إلى المتاهة، اختبار، "دفن الرخام"، إلخ8،،من1920 كما سيمنع هذه الاختبارات سلوك الحيوانات من السلوك الاجتماعي النوم حيث أنه ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار عند تحديد عدد الأيام للحرمان من النوم المتواصل لتوظيف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
للتحقيق في آثار النوم المزمن تقييد السلوك، ننام الفئران مقيد لمدة ثلاث ساعات يوميا بين 11:00 ص و 02:00 م من P5 P428. وبعد تقييد النوم، بقي دون عائق لمدة أربعة أسابيع الفئران ويسمح باسترداد من تقييد النوم. تم اختبار الفئران للسلوك بعد انتهاء فترة استرداد مدتها أربعة أسابيع. اختبار السلوك الاجتماعي ثلاثة-غرفة استخدمت لتقييم الاجتماعية (تفضيل ماوس رواية مقارنة بكائن رواية) والجدة الاجتماعية (الأفضلية لماوس رواية مقارنة بماوس على دراية). في اختبار الاجتماعية، النوم مقيد الإناث تنفق المزيد من الوقت استنشاق الماوس غريب من الإناث التحكم (p < 0.05) (الشكل 1A) والذكور مقيدة بالنوم قد تميل إلى قضاء مزيد من الوقت استنشاق الكائن بالمقارنة مع التحكم في الذكور (p = 0.077) (الشكل 1A). في المرحلة الاجتماعية والجدة من الاختبار، الفئران الإناث محظور من النوم قضى زيادة مقدار الوقت استنشاق الماوس رواية من ضوابط الإناث (ف < 0.01) (الشكل 1B).
رقم 1: تقييد النوم المزمن يغير السلوك الاجتماعي بعد فترة انتعاش نوم 4 أسابيع. (A) اختبار الاجتماعية: الوقت الذي يقضيه استنشاق يكشف أن ذكور الفئران التي كانت النوم مقيد قضى وقتاً أطول استنشاق الكائن الرواية مقارنة بالذكور عناصر التحكم (p = 0.077). مقيدة بالنوم الفئران الإناث قضى وقتاً أطول استنشاق الماوس غريبا مقارنة بالإناث التحكم (*p < 0.05). مقيدة بالنوم الفئران الإناث يميل أيضا إلى قضاء مزيد من الوقت استنشاق الكائن بالمقارنة مع الإناث التحكم (p = 0.065). (ب) اختبار "الجدة الاجتماعية": الوقت الذي يقضيه استنشاق الرواية أو الماوس مألوفة وكشفت أن النوم الفئران الإناث مقيد قضى وقتاً أطول إحصائيا استنشاق الماوس الرواية مقارنة بالإناث من الفئران التي لم تكن من النوم مقيد (* *p < 0.01). تمثل الأشرطة يعني ± ووزارة شؤون المرأة في 11 التحكم ذكر وأنثى مقيدة بالنوم 13 والإناث 22 مراقبة والفئران الإناث 17 مقيدة بالنوم. وجرى تحليل البيانات عن طريق وظيفة المخصص-الاختبارات التالية ANOVA. لقد تم تعديل هذا الرقم مع إذن من ساري et al. عام 20168. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا يمكننا وصف أسلوب لطيف للحرمان من النوم، والمناولة، التي يمكن استخدامها في كلا الجراء القوارض والبالغين. تسليم لطيف يحتاج الباحثون مراقبة الفئران لمدة فترة الحرمان من النوم وهمز الحيوانات بلطف كلما كانت خاملة أو الوخز لمنع النوم. التحقق من الدراسات الحرمان من النوم السابقة عن طريق التسجيلات المتزامنة للالكهربائي (EEG) أن يمنع التعامل مع لطيف كلا REM والنوم غير REM نريم-10. أثناء معالجة لطيف هو واحد من الأساليب الحرمان النوم الوحيدة التي يمكن استخدامها في الجراء القوارض الشباب، هناك بعض القيود على استخدامها.
معالجة لطيف، الأولى تعتمد اعتماداً كبيرا على المجرب لتكون قادرة على حد سواء الاعتراف والاستجابة السريعة لما قبل النوم السلوكيات. عندما يحرم من النوم في الجراء القوارض، الجراء يجب تقريبا باستمرار محثوث أو مقلوب أن أؤكد أنهم مستيقظا لفترة تقييد أسرة النوم. الاعتراف بالوخز في الجراء الشباب أمر حاسم لمنع النوم21بشكل صحيح. وثانيا، ينبغي الإقرار بأن الحرمان من النوم الذي يحدث قبل الفطام، عند الجراء لا تزال مع أمهاتهم، يمكن أن تؤثر على النوم الأم كأثر ثانوي؛ ومع ذلك، لم استكشاف مدى هذا التأثير. ثالثا، من المهم الاعتراف بأن أي عملية الحرمان من النوم سوف تكون مرهقة أصلاً، وأنه لا يمكن فصل الآثار للحرمان من النوم من الإجهاد بسبب الإجراء. ومع ذلك، استخدام بروتوكول المعالجة لطيف الموصوفة هنا محاولات للتقليل من إجهاد الحرمان من النوم بالمقارنة مع البروتوكولات الأخرى للحرمان النوم. وأخيراً، حين التعامل مع لطيف تقنية مفيدة للحرمان من النوم الوليدي المزمن، إجراء مرهقة للباحثين كما أنها تستغرق وقتاً طويلاً وتتطلب اهتماما مستمرا. أطول البروتوكولات الحرمان من النوم أيضا صعوبة في أداء في الفئران حديثي الولادة بسبب الزيادات في ضغط النوم على مدى الساعة15.
وعلى الرغم من هذه القيود، تسليم لطيف أداة قوية دراسة آثار تقييد النوم المزمن في التنمية وفي مرحلة البلوغ، وكيف يمكن أن تؤثر على تقييد النوم فسيولوجيا السلوك والمخ. الأهم من ذلك، هذا الأسلوب يسمح الباحثين على مواصلة استكشاف الآثار أن النوم يمكن أن يكون التقييد في سن مبكرة على تطوير الدماغ على حد سواء على الفور عقب النوم التقييد وفي وقت لاحق في الحياة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذه الأبحاث بتمويل من "برنامج البحوث الداخلية" NIMH (ضياء MH00889). كما أيد RMS "زمالة ما بعد الدكتوراه فراشة".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | Jackson Labs | 000664 | Wildtype mice used |
| Super Mouse 750 Mouse Cage | Lab Products, Inc. | Cages for the mice | |
| SANI-Chips Bedding | PJ Murphys | Bedding for the mice | |
| S&S Bristle Brush Assortment Pack | Staples | Item # 13764, Model AB37100 | Paint brushes are used to gently poke mice |
References
- Picchioni, D., Reith, R. M., Nadel, J. L., Smith, C. B. Sleep, plasticity and the pathophysiology of neurodevelopmental disorders: the potential roles of protein synthesis and other cellular processes. Brain Sci. 4 (1), 150-201 (2014).
- Li, W., Ma, L., Yang, G., Gan, W. B. REM sleep selectively prunes and maintains new synapses in development and learning. Nat Neurosci. 20 (3), 427-437 (2017).
- Peirano, P. D., Algarin, C. R. Sleep in brain development. Biol Res. 40 (4), 471-478 (2007).
- Mirmiran, M., et al. Effects of experimental suppression of active (REM) sleep during early development upon adult brain and behavior in the rat. Brain Res. 283 (2-3), 277-286 (1983).
- Feng, P., Ma, Y. Instrumental REM sleep deprivation in neonates leads to adult depression-like behaviors in rats. Sleep. 26 (8), 990-996 (2003).
- Frank, M. G., Morrissette, R., Heller, H. C. Effects of sleep deprivation in neonatal rats. Am J Physiol. 275 (1 Pt 2), R148-R157 (1998).
- Todd, W. D., Gibson, J. L., Shaw, C. S., Blumberg, M. S. Brainstem and hypothalamic regulation of sleep pressure and rebound in newborn rats. Behav Neurosci. 124 (1), 69-78 (2010).
- Sare, R. M., Levine, M., Hildreth, C., Picchioni, D., Smith, C. B. Chronic sleep restriction during development can lead to long-lasting behavioral effects. Physiol Behav. 155, 208-217 (2016).
- Colavito, V., et al. Experimental sleep deprivation as a tool to test memory deficits in rodents. Front Syst Neurosci. 7, 106 (2013).
- Franken, P., Dijk, D. J., Tobler, I., Borbely, A. A. Sleep deprivation in rats: Effects on EEG power spectra, vigilance states, and cortical temperature. Am J Physiol. 261 (1 Pt 2), R198-R208 (1991).
- Araujo, P., Coelho, C. A., Oliveira, M. G., Tufik, S., Andersen, M. L. Neonatal sleep restriction increases nociceptive sensitivity in adolescent mice. Pain Physician. 21 (2), E137-E148 (2018).
- Araujo, P., Tufik, S., Anderson, M. L. Sleep and pain: A relationship that begins in early life. Pain Physician. 17 (6), E787-E798 (2014).
- Hairston, I. S., et al. Sleep deprivation effects on growth factor expression in neonatal rats: a potential role for BDNF in the mediation of delta power. J Neurophysiol. 91 (4), 1586-1595 (2004).
- Hairston, I. S., et al. Sleep deprivation elevates plasma corticosterone levels in neonatal rats. Neurosci Lett. 315 (1-2), 29-32 (2001).
- Blumberg, M. S., Middlemis-Brown, J. E., Johnson, E. D. Sleep homeostasis in infant rats. Behav Neurosci. 118 (6), 1253-1261 (2004).
- Feng, P., Vogel, G. W., Obermeyer, W., Kinney, G. G. An instrumental method for long-term continuous REM sleep deprivation of neonatal rats. Sleep. 23 (2), 175-183 (2000).
- Xu, Z. Q., Gao, C. Y., Fang, C. Q., Zhou, H. D., Jiang, X. J. The mechanism and characterization of learning and memory impairment in sleep-deprived mice. Cell Biochem Biophys. 58 (3), 137-140 (2010).
- Barriga, C., Martin, M. I., Tabla, R., Ortega, E., Rodriguez, A. B. Circadian rhythm of melatonin, corticosterone and phagocytosis: Effect of stress. J Pineal Res. 30 (3), 180-187 (2001).
- Nadler, J. J., et al. Automated apparatus for quantitation of social approach behaviors in mice. Genes Brain Behav. 3 (5), 303-314 (2004).
- Thomas, A., et al. Marble burying reflects a repetitive and perseverative behavior more than novelty-induced anxiety. Psychopharmacology (Berl). 204 (2), 361-373 (2009).
- Karlsson, K. A., Blumberg, M. S. The union of the state: Myoclonic twitching is coupled with nuchal muscle atonia in infant rats. Behav Neurosci. 116 (5), 912-917 (2002).
