Summary
我们描述一种被称为温和处理的睡眠剥夺技术, 调查人员在任何时候都轻轻地对老鼠进行睡眠行为观察。这种方法是一个强大的工具, 让研究人员研究慢性睡眠限制在整个发展可能对未来的大脑生理学和行为的影响。
Abstract
睡眠对于正确的发育和神经可塑性至关重要。此外, 异常睡眠模式是许多神经发育紊乱的特征。研究发展过程中慢性睡眠限制对成人行为的影响可能会增加我们对神经发育紊乱行为症状出现的理解。虽然有许多方法可以用来限制在啮齿类动物的睡眠, 包括强迫运动, 持续中断, 厌恶刺激的表现, 或电击, 许多这些方法是非常紧张的, 不能用于新生小鼠。在这里, 我们描述温和的处理, 睡眠剥夺技术, 可以长期使用在整个发展和成年, 以达到睡眠限制。轻柔的处理包括在睡眠剥夺期间对小鼠进行密切观察, 并要求研究者在不活跃或显示与睡眠相关的行为时, 轻轻地向动物进行刺激。加上脑电图记录, 轻柔的处理可用于选择性地扰乱睡眠的特定阶段, 如快速眼动 (REM) 睡眠。温和的处理技术是一个强大的工具, 研究慢性睡眠限制的影响, 甚至在新生小鼠, 绕过许多更紧张的程序, 用于睡眠剥夺。
Introduction
睡眠在大脑发育过程中对神经元可塑性和突触形成和消除起着至关重要的作用1,2。具体地说, 快速眼动 (REM) 睡眠对于通过加强特定突触和突触修剪2形成稳定的突触电路至关重要。在生命早期的药理睡眠剥夺导致许多生理和行为缺陷3,4。除了药理性睡眠剥夺, 其他形式的睡眠剥夺, 如恒定摇晃, 强迫运动, 或厌恶刺激的表现, 在成年时与抑郁症状的症状相关, 不同的神经激活模式, 以及睡眠时间和睡眠连续性的变化在剥夺5,6,7后的恢复期间。当睡眠在小鼠的长期限制在开发期间超过五周, 行为缺陷被观察后一个月的睡眠恢复8。这些研究表明, 新生啮齿动物的睡眠中断会影响以后的睡眠模式、大脑功能和行为。强调睡眠对人类正常大脑发育的重要性, 许多神经发育障碍患者, 包括自闭症谱系障碍, 结节性硬化症, 易碎 X 综合征, 和注意缺陷/多动紊乱, 报告在睡眠模式的反常性除了各种行为缺陷1。
考虑到与异常睡眠模式相关的神经发育紊乱的数量, 了解睡眠不足对大脑功能和行为的影响是很重要的。然而, 尽管数据支持睡眠在发展过程中的重要性, 但大多数限制或剥夺睡眠动物的方法都集中在成人身上。这些技术包括各种测试, 需要强迫运动活动 (例如,恒定跑步机), 持续中断 (例如,旋转清扫棒或持续新颖的对象演示), 或扰乱动物的起始REM 睡眠 (例如,平台在水上)9,10。虽然这些方法有效地显示了与成人睡眠剥夺相关的问题, 但这些方法都不适合啮齿类动物, 因为它们的流动性有限, 睡眠率高, 以及生活中早期压力的负面影响。由于睡眠在发育过程中的重要性, 了解新生儿幼崽的睡眠限制对成年期的未来行为有何影响至关重要。
一种限制可用于啮齿动物幼崽的睡眠的技术是温和处理。温和的处理涉及调查人员与啮齿动物直接互动的任何时间睡眠行为观察。调查人员可以使用他们的手, 画笔, 或演示新的对象来物理扰乱休眠在新生儿啮齿动物8,10,11,12,13,14.睡眠可以行为由缺乏运动活动, 肌阵挛抽搐和闭眼 (在老啮齿动物幼崽) 确定。脑电图验证证实, 根据这些行为, 以温和的处理中断睡眠, P12 大鼠14的总睡眠时间减少91%。其他用于剥夺幼鼠的技术包括电击和不愉快刺激的表现, 但这些技术不能用于慢性睡眠限制, 比温和处理7更有压力,15. 慢性睡眠限制也可以通过振动协议来完成, 可以与脑电图电极植入和相关的计算机软件一起使用, 但此协议不会阻止所有睡眠, 因此更少控制比温和处理4,16。在没有特定设备、计算机软件或电极植入的情况下连续数天限制或剥夺小鼠睡眠的能力是温和处理技术的一个好处。通过轻柔处理的慢性睡眠限制有效地限制了新生啮齿动物的睡眠, 并在睡眠剥夺期8、11、12之后产生各种行为变化,17。
在这里, 我们描述的结果, 其中慢性睡眠剥夺三小时每天从产后 5 (P5) 到 P42 显著影响小鼠的社交性, 在30天的恢复期内, 睡眠不受干扰。这些结果突显了长期睡眠限制在发展过程中对未来行为的长远影响。
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Protocol
注: 所有程序均经国家精神卫生动物护理和使用委员会批准, 并按照国家卫生研究院关于动物照料和使用的指导方针进行。
1. 睡眠剥夺设置
- 使用软画笔在睡觉时轻轻地戳老鼠。
- 确保画笔可以通过鼠标笼进纸器的条形进行安装, 以确保小鼠在睡眠剥夺期间能够获得食物和水广告随意。
- 不要将画笔用于多个保持架, 以防止在保持架之间传递气味。我们建议您使用其分配的框架对每个画笔进行标注, 并将其使用限制在该框架中。
- 指定一个房间, 所有睡眠剥夺都会发生。
2. 动物设置
- 随机将每个笼子分配给睡眠剥夺或控制组。
- 在实验中给老鼠提供食物和水广告随意。
- 确保小鼠的视野不受笼中的床上用品、巢材或浓缩物的限制。
- 移除可能限制鼠标视图的额外床上用品或浓缩物。
- 如果食物或水限制老鼠的观点, 将老鼠移到笼子的区域, 不受限制。
- 如果食物阻挡了笼子的很大一部分, 移除一些食物并将颗粒放在笼子的底部, 以便动物在睡眠剥夺期间保持食物的获取。
3. 动物条件
注意: 我们选择在上午11点开始三小时睡眠剥夺期, 当老鼠处于非活动阶段的中间时, 但白天和睡眠剥夺持续时间可以根据所需的实验条件来选择。
- 控制组。
- 在 P5 上, 从饲养笼中取出陛下, 将幼崽留在坝前, 直到断奶 (P21)。
- 将被分配到控制组的小鼠移到睡眠剥夺室, 在实验持续时间内, 每天用画笔连续10分钟轻轻地向小鼠 (P5 到 P42)。
- 10分钟后, 把老鼠送到动物饲养室, 不要打扰他们。
- 睡眠剥夺组。
- 在 P5 上, 从饲养笼中取出陛下, 将幼崽留在坝前, 直到断奶 (P21)。
注意: P5 前的睡眠剥夺可能导致幼崽拆用配件。在 P5 和以后, 我们没有观察到重要的拆用配件。
注意: 在幼崽, 睡眠的驱动器是非常高的需要几乎恒定的抚摸。随着小鼠的发展, 特别是断奶后, 睡眠压力较低, 不需要持续的刺激。 - 每天继续睡眠剥夺, 直到 P42。
注意: 睡眠剥夺协议的长度会有所不同, 如果需要, 可以延长过去的 P42。 - 每天将被分配到睡眠剥夺组的小鼠移动到睡眠剥夺室, 然后在光线循环中进行监测。睡眠剥夺的确切持续时间可以根据具体的研究问题进行调整。
注意: 在新生小鼠睡眠剥夺, 持续超过3小时是困难的, 因为增加了睡眠压力15。- 在这段时间里, 每当睡眠明显的时候, 用画笔轻轻地给老鼠用刷子。下一节将介绍睡眠剥夺的具体情况。
- 在 P5 上, 从饲养笼中取出陛下, 将幼崽留在坝前, 直到断奶 (P21)。
4. 睡眠剥夺
- 在观察到响应之前, 如果怀疑已入睡, 则轻轻地将鼠标放在画笔上。或者, 反转鼠标, 推到他们的背部, 扰乱睡眠。
- 如果出现以下任一情况, 请考虑将鼠标休眠: 不活动、抽搐 (特别是与幼崽), 或如果他们的眼睛闭合 (在小鼠比 P12 大)。
- 如果老鼠在四处走动, 试图在背部或自我梳理后翻转过来, 请考虑让他们清醒。
- 如果大坝在睡眠剥夺期间覆盖幼崽, 轻轻地将她从幼崽中赶走, 这样幼崽的观点是无限制的。
5. 睡眠剥夺后
- 当三小时的睡眠剥夺期完成后, 把床上用品和任何可能被移除的食物放回笼子里。
- 返回笼子到动物饲养室, 直到第二天的睡眠剥夺。
6. 后续实验
- 根据睡眠剥夺研究的目标, 继续进行后续实验。
- 从动物身上采集血清以确定皮质酮18级。
- 做任何的行为测试, 包括开放领域, 旋转, 高加迷宫, 社会行为测试, 大理石掩埋等.8,19,20这些行为测试也将防止动物睡眠, 以便在确定持续睡眠剥夺使用天数时应考虑到这些因素。
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Representative Results
为了研究慢性睡眠限制对行为的影响, 我们每天从 P5 到 P428的上午11:00 和下午2:00 之间睡眠限制小鼠三小时。在睡眠限制后, 老鼠被不受干扰地留了四周, 并允许从睡眠限制中恢复。在四周的恢复期后, 对小鼠进行了行为测试。三室社会行为测试用于评估社交 (与新的物体相比, 对新老鼠的偏爱) 和社会新奇 (与熟悉的老鼠相比, 对新老鼠的偏爱)。在社交测试中, 睡眠限制女性花更多的时间嗅陌生人鼠标比控制女性 (p < 0.05) (图 1A) 和睡眠限制的男性有倾向花更多的时间嗅探对象时, 相比控制雄性 (p = 0.077) (图 1A)。在测试的社会新奇阶段, 睡眠限制的雌性老鼠花了比女性控制 (p < 0.01) 更长的时间嗅探新老鼠 (图 1B)。
图 1: 慢性睡眠限制改变了4周睡眠恢复期后的社会行为。(A)社交测试: 花时间嗅探揭示了睡眠限制的雄性小鼠花更多的时间嗅探小说对象与对照雄性 (p = 0.077)。睡眠限制的雌性老鼠花更多的时间嗅到陌生人老鼠相比控制女性 (*p < 0.05)。睡眠限制雌性小鼠也往往花费更多的时间嗅探对象相比控制雌性 (p = 0.065)。(B)社会新奇测试: 花时间嗅闻小说或熟悉的老鼠, 发现睡眠限制雌性老鼠花了统计学意义上更多的时间嗅探新老鼠相比, 没有睡眠限制的雌性老鼠 (**p< 0.01)。条形代表的手段± SEM 在11控制男性, 13 睡眠限制男性, 22 控制女性和17睡眠限制的雌性小鼠。通过对方差分析后的后 hoct测试, 对数据进行了解析。这一数字已被修改的权限从萨雷et 等. 20168。请点击这里查看这个数字的更大版本.
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Discussion
在这里, 我们描述了一种睡眠剥夺, 温和的处理方法, 可用于啮齿动物幼崽和成人。轻柔的处理要求研究人员在睡眠剥夺期期间观察老鼠, 并在不活动或抽搐时轻轻地刺激动物以防止睡眠。以前的睡眠剥夺研究通过同步脑电图 (EEG) 记录进行验证, 轻柔处理可防止 rem 和非 rem (NREM) 睡眠10。虽然温和的处理是唯一可以用于幼鼠幼崽的睡眠剥夺方法之一, 但它的使用有一些局限性。
首先, 温和的处理很大程度上依赖于实验者能够识别并及时响应睡眠前的行为。在啮齿动物幼崽中剥夺睡眠时, 幼崽必须几乎不断地被刺激或反转, 以确保他们在整个睡眠限制期内都醒着。年轻幼崽的抽搐识别是正确防止睡眠21的关键。其次, 应该承认, 在断奶前发生的睡眠剥夺, 当幼崽仍然与他们的母亲, 可能影响母亲的睡眠作为次要影响;然而, 这种影响的程度还有待探讨。第三, 重要的是要认识到, 任何睡眠剥夺的过程将是内在的压力, 并且不可能分离睡眠剥夺的影响由程序引起的压力。然而, 使用这里描述的温和处理协议, 试图尽量减少睡眠剥夺的压力与其他睡眠剥夺协议相比。最后, 虽然温和的处理是一个有用的技术, 慢性新生儿睡眠剥夺, 这是一个繁重的程序, 研究人员, 因为它是耗时的, 需要不断的关注。更长的睡眠剥夺协议也很难执行在新生小鼠由于睡眠压力的增加随着时间的推移15。
尽管有这些局限性, 温和的处理是一个强大的工具, 研究慢性睡眠限制在整个发展和成年期间的影响, 以及如何睡眠限制可以影响行为和大脑生理学。最重要的是, 这种方法允许研究人员继续探索睡眠限制在早期可能对大脑发育的影响, 在睡眠限制之后和以后的生活中。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究是由镍氢 (MH00889) 的内科学研究计划资助的。RMS 也得到了 FRAXA 博士后奖学金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | Jackson Labs | 000664 | Wildtype mice used |
| Super Mouse 750 Mouse Cage | Lab Products, Inc. | Cages for the mice | |
| SANI-Chips Bedding | PJ Murphys | Bedding for the mice | |
| S&S Bristle Brush Assortment Pack | Staples | Item # 13764, Model AB37100 | Paint brushes are used to gently poke mice |
References
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