Summary
Vi beskriver en søvn berøvelse teknik kendt som skånsom håndtering hvor efterforskere forsigtigt prod mus helst sove adfærd er observeret. Denne metode er et kraftfuldt værktøj, der giver forskere til at studere de effekter, som kronisk søvn begrænsning i hele udvikling kan have på fremtidige hjernens fysiologi og adfærd.
Abstract
Søvn er afgørende for korrekt udvikling og neural plasticitet. Derudover er unormalt søvnmønster karakteristiske for mange forstyrrelser i nervesystemets. At studere hvordan kronisk søvn begrænsning under udvikling kan påvirke voksne adfærd kan føje til vores forståelse af fremkomsten af adfærdsmæssige symptomer på nervesystemets udvikling. Mens der er mange metoder, der kan bruges til at begrænse søvn i gnavere herunder tvungen bevægelse, konstante forstyrrelser, præsentation af et afskrækningsmiddel stimulus, eller elektrisk stød, mange af disse metoder er meget stressende og kan ikke bruges i neonatal mus. Vi beskriver her, skånsom håndtering, en sleep afsavn teknik, der kan bruges kronisk hele udvikling og ind i voksenalderen for at opnå søvn begrænsning. Skånsom håndtering indebærer tæt observation af mus i hele perioden søvn berøvelse og kræver forsker at forsigtigt prod dyrene, når de er inaktive eller vise adfærd forbundet med søvn. Kombineret med EEG optagelser, kan skånsom håndtering anvendes til selektivt forstyrre en bestemt fase i søvn som hurtige øjenbevægelser (REM) søvn. Skånsom håndtering teknik er et kraftfuldt værktøj til undersøgelse af virkningerne af kronisk søvn restriktion selv i neonatal mus, der omgår mange af mere stressende metoder til søvnmangel.
Introduction
Søvn spiller en afgørende rolle i neuronal plasticitet og synapse dannelse og eliminering under hjerne udvikling1,2. Specifikt, er hurtige øjenbevægelser (REM) søvn afgørende for at danne stabile synaptic kredsløb gennem begge styrkelse af specifikke synapser og synaptic beskæring2. Farmakologiske søvnmangel tidligt i livet fører til mange fysiologiske og adfærdsmæssige underskud3,4. Ud over farmakologiske søvn berøvelse, andre former for søvnmangel som konstant ryster, tvunget bevægelse eller præsentation af et afskrækningsmiddel stimulus har været forbundet med depression-lignende symptomer i voksenalderen, forskellige neurale aktivisering mønstre, og ændringer i søvn tid og søvn kontinuitet i et opsving periode efter afsavn5,6,7. Når søvn er kronisk begrænset i mus i over fem uger under udvikling, blev adfærdsmæssige underskud observeret efter en måned af søvn recovery8. Taget sammen, tyder disse undersøgelser på, at forstyrrelse af søvn i neonatal gnaver kan påvirke senere søvnmønster, hjernefunktion og adfærd. Fremhævelsen af betydningen af søvn i normal hjernens udvikling hos mennesker, mange patienter med nervesystemets, autismespektrumforstyrrelser, knolde sklerose komplekse, skrøbelige X syndrom og Attention-Deficit/Hyperactivity Lidelse, rapport abnormiteter i søvnmønstre ud over en række adfærdsmæssige underskud1.
I betragtning af antallet af nervesystemets, der er forbundet med unormale søvnmønstre, er det vigtigt at forstå, hvordan mangel på søvn påvirker hjernefunktion og adfærd. Trods de data, der understøtter betydningen af søvn under udvikling, de fleste metoder, som begrænser eller fratage dyr i søvn fokus på voksne. Disse teknikker omfatter en række test, der kræver tvunget bevægeapparatet aktivitet (f.eks. konstant løbebånd), konstante forstyrrelser (fx, roterende sweeper bar eller løbende roman objekt præsentation) eller forstyrrende dyr i starten af REM-søvn (fx platform over vand)9,10. Selv om disse metoder har effektivt vist problemerne i forbindelse med søvn hos voksne, er ingen af disse metoder passende for gnavere unger på grund af deres begrænsede mobilitet, høje søvn drev og de negative virkninger af stress tidligt i livet. Betydningen af søvn under udvikling er det vigtigt at forstå, hvordan begrænset søvn i neonatal pups påvirker fremtidige adfærd i voksenalderen.
En teknik til at begrænse søvn, der kan bruges i gnavere unger er skånsom håndtering. Skånsom håndtering indebærer investigator direkte interagere med gnavere enhver tid sleep behavior er observeret. Efterforskere kan bruge deres hænder, en pensel eller præsentation af nye objekter til fysisk forstyrre søvn i neonatal gnavere8,10,11,12,13,14 . Søvn kan bestemmes behaviorally ved manglende motorisk aktivitet, myoklon trækninger og øje lukning (i ældre gnaver pups). EEG validering bekræfter, at forstyrre søvn med skånsom håndtering baseret på disse adfærdsmønstre reducerer total sleep-tid med 91% i P12 rotter14. Andre teknikker, der er blevet brugt til at fratage unge mus omfatter elektrisk stød og præsentation af ubehagelige stimuli, men disse teknikker kan ikke bruges til kronisk søvn begrænsning og er mere stressende end skånsom håndtering7, 15. kronisk søvn begrænsning kan også ske gennem en rystende protokol, der kan bruges med eller uden EEG elektrode implantation og tilknyttede computersoftware, men denne protokol forhindrer ikke alle sove og derfor er mindre kontrolleres i forhold til skånsom håndtering4,16. Evnen til at begrænse eller fratage mus søvn for mange dage i træk uden særlige udstyr, computersoftware eller elektrode implantation er en fordel for skånsom håndtering teknik. Kronisk søvn begrænsning via skånsom håndtering effektivt begrænser søvn i neonatal gnavere og producerer en række adfærdsmæssige ændringer efter den søvn berøvelse periode8,11,12, 17.
Her, beskriver vi resultater som kronisk søvnmangel tre timer om dagen fra postnatal dag 5 (P5) til P42 væsentligt påvirker selskabelighed i mus efter en 30 dages tilbagebetalingsperioden, hvor søvn ikke er forstyrret. Disse resultater fremhæve de langsigtede virkninger af kronisk søvn begrænsning under udvikling på fremtidige adfærd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Alle procedurer blev godkendt af det nationale Institut for Mental sundhed Animal Care og brug udvalg og udføres i overensstemmelse med de nationale institutter sundhed retningslinjer for pleje og brug af dyr.
1. søvn berøvelse Setup
- Brug bløde pensler til at forsigtigt stikke mus når søvn.
- Sørg for pensel kan passe gennem tremmerne af musen bur feeder til at sikre, at mus har adgang til mad og vand ad libitum under søvn.
- Brug ikke pensler til flere bure for at forhindre overførsel af dufte mellem bure. Vi foreslår at du mærke hver pensel med sin tildelte bur og begrænse dets anvendelse til at buret.
- Udpege et rum, hvor alle søvnmangel vil forekomme.
2. animalske Setup
- Tilfældigt tildele hvert bur til enten søvnmangel eller kontrolgruppe.
- Give mus adgang til mad og vand ad libitum under forsøget.
- Sørg for visning af mus ikke er begrænset af sengetøj, rede materiale eller berigelse objekter i bur.
- Fjerne ekstra sengetøj eller berigelse objekter, som kan begrænse visningen af mus.
- Hvis fødevarer eller vand begrænser visning af mus, Flyt mus til et område af bur, hvor udsigten ikke er begrænset.
- Hvis maden blokerer for en stor del af buret, fjerne nogle fødevarer og placere pellets i bunden af buret, så dyr opretholde adgang til fødevarer i søvn berøvelse periode.
3. dyrenes betingelser
Bemærk: Vi valgte at begynde de tre timers søvn berøvelse periode på 11: 00, når musene er midt i deres inaktive fase, men tidspunktet på dagen og varighed af søvnmangel kan vælges baseret på de ønskede forsøgsbetingelser.
- Kontrolgruppe.
- På P5, fjerne far fra opdrætter bur og forlade dæmningen med hvalpene indtil fravænning (P21).
- Flyt mus tildelt at kontrolgruppen til søvnmangel værelse og forsigtigt prod mus med en pensel løbende i 10 minutter om dagen for varigheden af forsøget (P5 til P42).
- Efter disse 10 minutter, returnere mus til dyret holde værelse og ikke forstyrre dem
- Søvn berøvelse gruppe.
- På P5, fjerne far fra opdrætter bur og forlade dæmningen med hvalpene indtil fravænning (P21).
Bemærk: Søvn før P5 kan resultere i cannibalization af hvalpene. Vi ikke observere betydelig kannibalisering på P5 og senere.
Bemærk: Ung pups, drevet til at sove er meget høje, kræver næsten konstant strøg. Som mus udvikler, især efter fravænning, søvn trykket er lavere, og de behøver ikke konstant prodding. - Fortsætte med søvnmangel hver dag indtil P42.
Bemærk: Søvn berøvelse protokoller kan variere i længde og udvide forbi P42, hvis det ønskes. - Flytte mus tildeles gruppen søvn afsavn til søvn berøvelse værelse dagligt i løbet af lys cyklus, hvor de vil blive overvåget. Den nøjagtige varighed af søvnmangel kan justeres baseret på den specifikke forskningsspørgsmål.
Bemærk: I neonatal mus søvnmangel, der varer længere end 3 timer er vanskelig på grund af stigningen i søvn pres15.- I løbet af denne tid, forsigtigt prod musene med pensel søvn er indlysende. Detaljerne af søvnmangel er forklaret i næste afsnit.
- På P5, fjerne far fra opdrætter bur og forlade dæmningen med hvalpene indtil fravænning (P21).
4. søvnmangel
- Forsigtigt prod mus med pensel, hvis mistænkes for at være i søvn indtil et svar er observeret. Alternativt kan du invertere mus og skub på ryggen til at forstyrre søvn.
- Overveje en mus til at være i søvn, hvis et af følgende sker: inaktivitet, trækninger (især med unger), eller hvis deres øjne er lukkede (i mus ældre end P12).
- Overveje mus at være vågen, hvis de bevæger sig rundt, forsøger at flip-over efter at være på deres rygge, eller grooming selv.
- Hvis dæmningen dækker unger under søvn, forsigtigt prod hende væk fra unger, så visningen af hvalpene er ubegrænset.
5. efter søvnmangel
- Når en tre-timers periode under søvn er færdig, sæt strøelse og noget mad, der kan have været fjernet tilbage og Læg låget tilbage på buret.
- Returnere bure til dyr bedrift værelse indtil den næste dag af søvnmangel.
6. efterfølgende eksperimenter
- Afhængig af målet med søvn berøvelse undersøgelse fortsætte med efterfølgende forsøg.
- Høste serum fra dyr til at bestemme corticosterone niveauer18.
- Gøre nogen af en række adfærdsmæssige test, herunder friland, RotaRod, forhøjet Plus labyrint, Social adfærd test, marmor begrave, etc.8,19,20 disse adfærd test vil også forhindre dyrene fra sove så skal indregnes ved fastsættelsen af hvor mange dage for kontinuerlig søvn til at ansætte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at undersøge virkningerne af kronisk søvn begrænsning på adfærd, sover vi begrænset mus i tre timer dagligt mellem 11:00:00 og 2:00 fra P5 til P428. Efter søvn begrænsning, var mus venstre uforstyrret i fire uger og lov til at inddrive fra søvn begrænsning. Mus blev testet for adfærd efter fire ugers tilbagebetalingsperioden. De tre-kammer sociale adfærd test blev brugt til at vurdere selskabelighed (præference for en roman mus i forhold til en roman objekt) og sociale nyhed (præference for en roman mus sammenlignet med en velkendt mus). I selskabelighed test, sove begrænset hunner brugt mere tid på at snuse den stranger mus end kontrol kvinder (p < 0,05) (figur 1A) og søvn-begrænset mænd havde en tendens til at tilbringe mere tid på at snuse objektet i forhold til styre hanner (p = 0.077) (figur 1A). I den sociale nyhed fase af test, søvn-begrænset hunmus tilbragte en øget mængden af tid, snuse den roman mus end kvindelige kontrol (p < 0,01) (figur 1B).
Figur 1: kronisk søvn begrænsning ændrer sociale adfærd efter en 4-ugers søvn tilbagebetalingsperioden. (A) selskabelighed test: tid brugt snuse afslører at mandlige mus, der var søvn begrænset brugt mere tid sniffing roman objektet i forhold til kontrol hanner (p = 0.077). Søvn-begrænset hunmus brugt mere tid sniffing stranger musen sammenlignet med kontrol kvinder (*p < 0,05). Søvn-begrænset hunmus også tendens til at tilbringe mere tid på at snuse objektet sammenlignet med kontrol kvinder (p = 0,065). (B) sociale nyhed test: tid brugt sniffing romanen eller fortrolig mus viste at sove begrænset hunmus brugt statistisk signifikant mere tid sniffing roman musen i forhold til kvindelige mus, der ikke var søvn begrænset (**p < 0,01). Søjler repræsenterer middel ± SEM i 11 kontrol mand, 13 søvn-begrænset mand, 22 kontrol kvindelige og 17 søvn-begrænset hunmus. Data blev analyseret ved hjælp af post hoct-test efter en ANOVA. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Sare et al. 20168. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her vi beskrive en metode for søvnmangel, skånsom håndtering, der kan bruges i både gnaver unger og voksne. Blid aflevering kræver forskere at observere mus for varigheden af en søvn berøvelse periode og forsigtigt prod dyrene, når de er inaktive eller trækninger at forhindre søvn. Forudgående søvn berøvelse undersøgelser har bekræftet ved hjælp af samtidige elektroencefalografi (EEG) optagelser, skånsom håndtering forhindrer både REM og ikke - REM NREM søvn10. Mens skånsom håndtering er en af de eneste søvn berøvelse metoder, der kan bruges på unge gnaver unger, er der nogle begrænsninger for dens anvendelse.
Første, skånsom håndtering er stærkt afhængig af eksperimentatoren at både genkender og straks reagere på forhånd sove adfærd. Når fratage søvn i gnavere unger, skal hvalpene næsten konstant prodded eller omvendt for at sikre, at de er vågen for hele søvn begrænsning periode. Anerkendelse af trækninger i unge unger er kritisk for korrekt at sove21. For det andet, det bør erkendes, at søvnmangel, der opstår før fravænning, når hvalpene er stadig med deres mor, kunne påvirke moderens søvn som en sekundær effekt; men omfanget af denne effekt har endnu at blive udforsket. For det tredje er det vigtigt at erkende, at enhver søvn berøvelse proces vil være i sig selv stressende, og det er ikke muligt at adskille virkningerne af søvnmangel fra den stress, der er forårsaget af proceduren. Men ved hjælp af blide håndtering protokollen beskrevet her forsøg på at minimere stress og søvnmangel i forhold til andre søvn berøvelse protokoller. Og endelig, skånsom håndtering er en nyttig teknik for kronisk neonatal søvnmangel, det er en besværlig procedure for forskere som det er tidskrævende og kræver konstant opmærksomhed. Længere søvn berøvelse protokoller er også vanskeligt at udføre i neonatal mus som følge af stigninger i søvn pres over tid15.
På trods af disse begrænsninger er blid aflevering et kraftfuldt værktøj til at undersøge virkningerne af kronisk søvn begrænsning i hele udvikling og ind i voksenlivet og hvordan søvn begrænsning kan påvirke både adfærd og hjernens fysiologi. Vigtigst, denne metode giver forskere til at fortsætte med at undersøge virkningerne at sove begrænsning i en tidlig alder kan have for udviklingen af hjernen begge umiddelbart følgende sove begrænsning og senere i livet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Denne forskning er finansieret af murene forskningsprogrammet NiMH (ZIA MH00889). RMS blev også støttet af en FRAXA postdoc stipendium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | Jackson Labs | 000664 | Wildtype mice used |
| Super Mouse 750 Mouse Cage | Lab Products, Inc. | Cages for the mice | |
| SANI-Chips Bedding | PJ Murphys | Bedding for the mice | |
| S&S Bristle Brush Assortment Pack | Staples | Item # 13764, Model AB37100 | Paint brushes are used to gently poke mice |
References
- Picchioni, D., Reith, R. M., Nadel, J. L., Smith, C. B. Sleep, plasticity and the pathophysiology of neurodevelopmental disorders: the potential roles of protein synthesis and other cellular processes. Brain Sci. 4 (1), 150-201 (2014).
- Li, W., Ma, L., Yang, G., Gan, W. B. REM sleep selectively prunes and maintains new synapses in development and learning. Nat Neurosci. 20 (3), 427-437 (2017).
- Peirano, P. D., Algarin, C. R. Sleep in brain development. Biol Res. 40 (4), 471-478 (2007).
- Mirmiran, M., et al. Effects of experimental suppression of active (REM) sleep during early development upon adult brain and behavior in the rat. Brain Res. 283 (2-3), 277-286 (1983).
- Feng, P., Ma, Y. Instrumental REM sleep deprivation in neonates leads to adult depression-like behaviors in rats. Sleep. 26 (8), 990-996 (2003).
- Frank, M. G., Morrissette, R., Heller, H. C. Effects of sleep deprivation in neonatal rats. Am J Physiol. 275 (1 Pt 2), R148-R157 (1998).
- Todd, W. D., Gibson, J. L., Shaw, C. S., Blumberg, M. S. Brainstem and hypothalamic regulation of sleep pressure and rebound in newborn rats. Behav Neurosci. 124 (1), 69-78 (2010).
- Sare, R. M., Levine, M., Hildreth, C., Picchioni, D., Smith, C. B. Chronic sleep restriction during development can lead to long-lasting behavioral effects. Physiol Behav. 155, 208-217 (2016).
- Colavito, V., et al. Experimental sleep deprivation as a tool to test memory deficits in rodents. Front Syst Neurosci. 7, 106 (2013).
- Franken, P., Dijk, D. J., Tobler, I., Borbely, A. A. Sleep deprivation in rats: Effects on EEG power spectra, vigilance states, and cortical temperature. Am J Physiol. 261 (1 Pt 2), R198-R208 (1991).
- Araujo, P., Coelho, C. A., Oliveira, M. G., Tufik, S., Andersen, M. L. Neonatal sleep restriction increases nociceptive sensitivity in adolescent mice. Pain Physician. 21 (2), E137-E148 (2018).
- Araujo, P., Tufik, S., Anderson, M. L. Sleep and pain: A relationship that begins in early life. Pain Physician. 17 (6), E787-E798 (2014).
- Hairston, I. S., et al. Sleep deprivation effects on growth factor expression in neonatal rats: a potential role for BDNF in the mediation of delta power. J Neurophysiol. 91 (4), 1586-1595 (2004).
- Hairston, I. S., et al. Sleep deprivation elevates plasma corticosterone levels in neonatal rats. Neurosci Lett. 315 (1-2), 29-32 (2001).
- Blumberg, M. S., Middlemis-Brown, J. E., Johnson, E. D. Sleep homeostasis in infant rats. Behav Neurosci. 118 (6), 1253-1261 (2004).
- Feng, P., Vogel, G. W., Obermeyer, W., Kinney, G. G. An instrumental method for long-term continuous REM sleep deprivation of neonatal rats. Sleep. 23 (2), 175-183 (2000).
- Xu, Z. Q., Gao, C. Y., Fang, C. Q., Zhou, H. D., Jiang, X. J. The mechanism and characterization of learning and memory impairment in sleep-deprived mice. Cell Biochem Biophys. 58 (3), 137-140 (2010).
- Barriga, C., Martin, M. I., Tabla, R., Ortega, E., Rodriguez, A. B. Circadian rhythm of melatonin, corticosterone and phagocytosis: Effect of stress. J Pineal Res. 30 (3), 180-187 (2001).
- Nadler, J. J., et al. Automated apparatus for quantitation of social approach behaviors in mice. Genes Brain Behav. 3 (5), 303-314 (2004).
- Thomas, A., et al. Marble burying reflects a repetitive and perseverative behavior more than novelty-induced anxiety. Psychopharmacology (Berl). 204 (2), 361-373 (2009).
- Karlsson, K. A., Blumberg, M. S. The union of the state: Myoclonic twitching is coupled with nuchal muscle atonia in infant rats. Behav Neurosci. 116 (5), 912-917 (2002).
