Summary
Nous décrivons une technique de privation de sommeil dite douce manipulation où les enquêteurs prod doucement souris tout moment sommeil comportement est observé. Cette méthode est un outil puissant qui permet aux chercheurs d’étudier les effets que la restriction chronique de sommeil au cours du développement peut avoir sur le comportement et la physiologie du cerveau futures.
Abstract
Le sommeil est essentiel pour assurer le bon développement et plasticité neurale. En outre, les habitudes de sommeil anormal sont caractéristique de nombreux désordres neurodéveloppementaux. Restriction de sommeil chronique Comment étudier au cours du développement peut affecter le comportement adulte peut ajouter à notre compréhension de l’apparition de symptômes comportementaux des troubles du développement neurologique. Bien qu’il existe beaucoup de méthodes qui peut être utilisé pour restreindre le sommeil chez les rongeurs, y compris la locomotion forcée, perturbation constante, présentation d’un stimulus aversif ou choc électrique, beaucoup de ces méthodes sont très stressants et ne peuvent être utilisés chez les souris néonatales. Nous décrivons ici la manipulation douce, une technique de privation de sommeil qui peut être utilisée chroniquement tout au long de l’élaboration et à l’âge adulte pour réaliser la restriction de sommeil. Manipulation douce implique une surveillance étroite des souris tout au long de la période de privation de sommeil et oblige le chercheur à prod doucement les animaux lorsqu’ils sont inactifs ou affichent des comportements associés à dormir. Couplé avec les enregistrements EEG, manipulation douce pourrait servir à interrompre sélectivement une phase spécifique de sommeil comme le sommeil paradoxal (REM). La technique de manipulation douce est un outil puissant pour l’étude des effets de la restriction de sommeil chronique même chez les souris néonatales qui contourne les nombreuses procédures plus stressantes utilisées pour la privation de sommeil.
Introduction
Sommeil joue un rôle essentiel dans la formation de la plasticité et la synapse neuronale et élimination pendant le développement de cerveau1,2. Plus précisément, sommeil paradoxal (REM) est essentiel pour la formation des circuits synaptiques stables en renforçant les deux synapses spécifiques et élagage synaptique2. Privation de sommeil pharmacologique tôt dans la vie conduit à de nombreux déficits physiologiques et comportementaux3,4. En plus de sommeil pharmacologique privation, autres formes de privation de sommeil comme une agitation constante, forcé de locomotion, ou présentation d’un stimulus aversif ont été associés à la dépression-comme des symptômes à l’âge adulte, différent neurones activation des modes et des changements dans la continuité de temps et de sommeil sommeil pendant une période de récupération après privation5,6,7. Lorsque le sommeil est chroniquement limité chez les souris pendant plus de cinq semaines au cours du développement, des déficits comportementaux ont été observés après un mois de sommeil récupération8. Pris ensemble, ces études suggèrent que la perturbation du sommeil chez le rongeur néonatal peut affecter les habitudes de sommeil plus tard, le fonctionnement du cerveau et le comportement. Soulignant l’importance du sommeil pour le développement normal du cerveau chez l’être humain, de nombreux patients souffrant de troubles du développement neurologique, y compris les troubles du spectre autistique, complexe de sclérose tubéreuse de Bourneville, Syndrome de le X Fragile et d’Attention-Déficit/hyperactivité Trouble, des anomalies de rapport dans les habitudes de sommeil en plus une variété de déficits comportementaux1.
Vu le nombre de désordres neurodéveloppementaux qui sont associés à des habitudes de sommeil anormal, il est important de comprendre comment le manque de sommeil affecte le fonctionnement du cerveau et comportement. Cependant, malgré les données qui confirment l’importance du sommeil au cours du développement, la plupart des méthodologies qui restreignent ou privent les animaux d’activité de sommeil sur les adultes. Ces techniques incluent une variété de tests qui requièrent contraint l’activité locomotrice (p. ex., tapis de course constante), constante perturbation (p. ex., rotation bar balayeuse ou présentation d’objet roman continue) ou déranger l’animal au début de la Le sommeil paradoxal (p. ex., la plate-forme au-dessus de l’eau)9,10. Bien que ces méthodes aient démontré efficacement les problèmes liés au manque de sommeil chez l’adulte, aucune de ces méthodes sont appropriées pour les petits rongeurs à cause de leur mobilité réduite, voiture de sommeil haute et les effets néfastes du stress tôt dans la vie. En raison de l’importance du sommeil au cours du développement, il est essentiel de comprendre comment restreint de sommeil dans le comportement futur de chiots nouveau-nés affecte à l’âge adulte.
Une technique pour limiter le sommeil qui peut être utilisé chez les petits rongeurs est manipulation douce. Manipulation douce implique l’enquêteur interagissant directement avec les rongeurs que tout comportement au moment du sommeil est observée. Enquêteurs peuvent utiliser leurs mains, un pinceau ou la présentation d’objets nouveaux perturber physiquement couchés sur des rongeurs nouveau-nés8,10,11,12,13,14 . Sommeil peut être déterminé sur le plan comportemental en manque d’activité motrice, secousses myocloniques et fermeture des yeux (chez les petits rongeurs plus âgés). Validation de l’EEG confirme que perturber le sommeil avec manipulation douce basée sur ces comportements réduit le temps de sommeil total de 91 % en P12 rats14. Autres techniques qui ont été utilisés pour priver les jeunes souris incluent électrocution et la présentation de stimuli désagréables, mais ces techniques ne peuvent être utilisés pour la restriction chronique de sommeil et sont plus stressantes que manipulation douce7, 15. restriction chronique de sommeil peut également être exécutée via un protocole de secousse qui peut être utilisé avec ou sans implantation d’électrode EEG et de logiciels connexes, mais ce protocole n’empêche pas tous dormir et est donc moins contrôlée par rapport à manutention douce4,16. La capacité de restreindre ou de priver les souris de sommeil pendant plusieurs jours d’affilée sans équipement spécifique, logiciels ou l’implantation de l’électrode est un avantage de la technique de manipulation douce. Restriction de sommeil chronique via manipulation douce effectivement limite le sommeil chez les rongeurs nouveau-nés et produit une gamme de changements de comportement après le sommeil privation période8,11,12, 17.
Nous décrivons ici les résultats dans laquelle privation de sommeil chronique pendant trois heures par jour du jour après la naissance 5 (P5) au P42 altèrent de sociabilité de souris après une période de récupération de 30 jours dans lequel sommeil n’est pas perturbé. Ces résultats mettent en évidence les effets à long terme de restriction chronique de sommeil au cours du développement sur le comportement futur.
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Protocol
NOTE : Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité de l’emploi et de National Institute of Mental Health Animal Care et effectués selon le National Institutes of Health Guidelines sur le soin et l’utilisation des animaux.
1. installation de privation de sommeil
- Pinceaux doux permet de pousser doucement les souris pendant que vous dormez.
- Assurez-vous que le pinceau peut s’adapter à travers les barreaux de la mangeoire cage de souris pour s’assurer que les souris ont accès à la nourriture et l’eau ad libitum au cours de la privation de sommeil.
- Ne pas utiliser de pinceaux pour plusieurs cages pour empêcher le transfert d’odeurs entre les cages. Nous suggérons que vous étiquetez chaque brosse avec sa cage attribuée et restreindre son utilisation à cette cage.
- Désigner une salle où se produira toutes les privations de sommeil.
2. animal Setup
- Répartissent de manière aléatoire chaque cage au manque de sommeil ou groupe de contrôle.
- Donne souris accès à la nourriture et d’eau ad libitum pendant l’expérience.
- Assurez-vous de voir des souris n’est pas restreint par la literie, matériel de nidification ou objets d’enrichissement dans la cage.
- Enlevez le linge de lit ou objets d’enrichissement qui pourraient restreindre l’affichage des souris.
- Si eau ni nourriture limite vue de souris, déplacer souris dans un endroit de la cage où la vue n’est pas limitée.
- Si la nourriture bloque une grande partie de la cage, enlever de la nourriture et placer les boulettes au fond de la cage afin que les animaux maintenir l’accès à l’alimentation pendant la période de privation de sommeil.
3. les Conditions
NOTE : Nous avons choisi de commencer la période de privation de sommeil à 11:00, quand les souris sont au milieu de leur phase inactive, mais l’heure du jour et la durée de la privation de sommeil peuvent être choisies selon les conditions expérimentales désirées de trois heures.
- Groupe de contrôle.
- Le P5, enlever le père de la cage de l’éleveur et laisser le barrage avec les petits jusqu’au sevrage (P21).
- Déplacer souris assignés au groupe témoin à la privation de sommeil chambre et prod doucement les souris avec un pinceau en continu pendant 10 minutes par jour pendant la durée de l’expérience (P5 à P42).
- Après ces 10 minutes, retourner les souris à l’animal, tenant la chambre et ne pas déranger les
- Groupe de privation de sommeil.
- Le P5, enlever le père de la cage de l’éleveur et laisser le barrage avec les petits jusqu’au sevrage (P21).
NOTE : Privation de sommeil avant P5 peut entraîner la cannibalisation des petits. Nous n’avons pas observé cannibalisation significative au P5 et plus tard.
Remarque : Chez les jeunes chiots, le lecteur en veille est très élevé nécessitant caressant presque constante. Comme les souris se développent, surtout après le sevrage, la pression de sommeil est plus faible et ils n’ont pas besoin des encouragements constants. - Continuer avec la privation de sommeil tous les jours jusqu'à P42.
NOTE : Protocoles de privation de sommeil peuvent varier en longueur et s’étendre P42 si vous le souhaitez. - Déplacez le souris assignés pour le groupe de privation de sommeil à la salle de la privation de sommeil par jour pendant le cycle de lumière où ils seront fera. La durée exacte de la privation de sommeil peut être réglée selon sur la question de recherche spécifiques.
Remarque : Chez les souris néonatales privation de sommeil qui dure plus de 3 heures est difficile en raison de l’augmentation de pression de sommeil15.- Pendant ce temps, doucement prod les souris avec le pinceau chaque fois que le sommeil est évident. Spécificités de la privation de sommeil sont expliquées dans la section suivante.
- Le P5, enlever le père de la cage de l’éleveur et laisser le barrage avec les petits jusqu’au sevrage (P21).
4. privation de sommeil
- Doucement prod souris avec un pinceau si soupçonnés d’être endormi jusqu'à ce qu’une réponse est observée. Vous pouvez également inverser la souris et pousser plus sur leur dos pour perturber le sommeil.
- Envisager une souris de dormir si une des actions suivantes se produit : inactivité, fasciculations (surtout avec les petits), ou si leurs yeux sont fermés (chez les souris âgées que P12).
- Examiner les souris d’être éveillé si ils se déplacent autour, essayant de retourner après avoir été sur le dos, ou toilettage eux-mêmes.
- Si le barrage est couvrant les chiots au cours de la privation de sommeil, doucement prod lui loin de chiots ainsi la vue des petits est sans restriction.
5. après privation de sommeil
- Lorsque la période de trois heures de privation de sommeil est terminée, mettre la literie et tout aliment qui peut avoir été retiré en arrière et remettre le couvercle sur la cage.
- Retour cages à animaux exploitation salle jusqu’au prochain jour de privation de sommeil.
6. les expériences
- Selon l’objectif de l’étude de la privation de sommeil, procéder à des expériences ultérieures.
- Récolter le sérum des animaux pour déterminer les niveaux de corticostérone18.
- Faire un certain nombre de tests comportementaux, y compris de plein champ, RotaRod, labyrinthe Plus élevée, le comportement Social stable, enterrant de marbre, etc.8,19,20 , ces tests de comportement empêchera également les animaux de dormir pour que devraient être pris en compte pour déterminer le nombre de jours de privation de sommeil continue d’employer.
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Representative Results
Afin d’étudier les effets de la restriction chronique de sommeil sur le comportement, nous dormons souris restreintes pendant trois heures tous les jours entre 11:00 et 14:00 de P5 à P428. Suite à la restriction de sommeil, les souris étaient laissés intacts pendant quatre semaines et a permis de récupérer de la restriction de sommeil. Souris ont été testées pour le comportement suivant la période de quatre semaines de récupération. Le test de comportement social de trois compartiments servait à évaluer la sociabilité (préférence pour une nouvelle souris par rapport à un objet nouveau) et la nouveauté sociale (préférence pour une nouvelle souris par rapport à une souris familière). Dans le test de sociabilité, dormir restreint les femmes passées plus de temps renifler la souris plus étrange que les femelles témoins (p < 0,05) (Figure 1 a) et sommeil restreint les hommes avaient tendance à passer plus de temps renifler l’objet par rapport à contrôler les hommes (p = 0,077) (Figure 1 a). Dans la phase sociale nouveauté de test, sommeil restreint des souris femelles a passé une augmentation du temps de renifler la souris roman que les femmes témoins (p < 0,01) (Figure 1 b).
Figure 1 : restriction chronique de sommeil modifie les comportements sociaux après une période de récupération de sommeil de 4 semaines. (A) test de sociabilité : temps passé renifler révèle que les souris mâles qui ont sommeil restreint passé plus de temps renifler l’objet novateur par rapport aux mâles témoins (p = 0,077). Sommeil-restreint des souris femelles passent plus de temps renifler la souris par un étranger par rapport aux femelles témoins (*p < 0,05). Sommeil restreint des souris femelles avaient tendance à passer plus de temps renifler l’objet par rapport aux femelles témoins (p = 0,065). Test de nouveauté sociale (B) : le temps passé à renifler le roman ou souris familière a révélé que le sommeil restreint des souris femelles séjournent statistiquement significative plus renifler la nouvelle souris par rapport à des souris femelles qui n’ont pas sommeil restreint (**p < 0,01). Les barres représentent le moyen ± SEM 11 mâle contrôle, 13 hommes sommeil restreint, contrôle 22 femmes et 17 sommeil restreint des souris femelles. Données ont été analysées au moyen de poster hoct-essais suite à une analyse de la variance. Ce chiffre a été modifié avec la permission de Sare et coll. 20168. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Nous décrivons ici une méthode pour la privation de sommeil, douce manipulation, qui peut être utilisée dans les deux petits rongeurs et chez les adultes. Remise douce oblige les chercheurs à observer des souris pendant la durée d’une période de privation de sommeil et prod doucement les animaux lorsqu’ils sont inactifs ou contractions pour empêcher le sommeil. Études de privation de sommeil préalable ont vérifié au moyen d’enregistrements simultanés électroencéphalogramme (EEG) que manipulation douce empêche les deux REM et non - REM NREM sommeil10. Tandis que la manipulation douce est l’un des seules méthodes de privation de sommeil qui peuvent être utilisés sur les petits rongeurs jeunes, il y a des limites à son utilisation.
Tout d’abord, douce manipulation dépend fortement de l’expérimentateur pour pouvoir les reconnaître et réagir promptement pour dormir des comportements. Lorsque la privation de sommeil chez les petits rongeurs, les chiots doivent être presque constamment poussés ou inversés afin de s’assurer qu’ils sont éveillés pour la période de restriction de sommeil ensemble. Reconnaissance des tics dans les chiots est important d’empêcher correctement sommeil21. En second lieu, il convient de reconnaître que la privation de sommeil qui survient avant le sevrage, quand les petits sont encore avec leur mère, pourrait affecter sommeil de la mère comme un effet secondaire ; Toutefois, l’ampleur de cet effet n’a pas encore à explorer. En troisième lieu, il est important de reconnaître que tout processus de privation de sommeil sera intrinsèquement stressante, et il n’est pas possible de séparer les effets de la privation de sommeil du stress causé par la procédure. Cependant, en utilisant le protocole de manipulation douce décrite ici tente de minimiser le stress du manque de sommeil par rapport à d’autres protocoles de privation de sommeil. Et enfin, considérant que manipulation douce est une technique utile pour privation chronique de sommeil néonatal, c’est une procédure lourde pour les chercheurs car elle prend beaucoup de temps et exige une attention constante. Des protocoles de privation de sommeil plus longues sont également difficiles à effectuer chez les souris néonatales due à l’augmentation de la pression de sommeil au cours du temps15.
Malgré ces limites, une remise douce est un outil puissant pour étudier les effets de la restriction chronique de sommeil tout au long de l’élaboration et à l’âge adulte et comment la restriction de sommeil peut affecter physiologie comportement et le cerveau. Plus important encore, cette méthode permet aux chercheurs de continuer à étudier les effets que le sommeil la restriction à un âge précoce peut avoir sur le développement du cerveau les deux immédiatement suit dormir restriction et plus tard dans la vie.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par le programme de recherche intra-muros de la NIMH (ZIA MH00889). RMS a été également soutenue par une bourse de recherche postdoctorale FRAXA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | Jackson Labs | 000664 | Wildtype mice used |
| Super Mouse 750 Mouse Cage | Lab Products, Inc. | Cages for the mice | |
| SANI-Chips Bedding | PJ Murphys | Bedding for the mice | |
| S&S Bristle Brush Assortment Pack | Staples | Item # 13764, Model AB37100 | Paint brushes are used to gently poke mice |
References
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