מניעת שינה כרונית עכבר כלבלבים באמצעות עדין לטיפול

Summary

נתאר שיטת מניעת שינה המכונה טיפול עדין שבו החוקרים בעדינות ויפיצו עכברים עת שינה התנהגות נצפית. שיטה זו היא כלי רב עוצמה המאפשר לחוקרים לחקור את ההשפעות שינה כרונית הגבלה לאורך התפתחות שיכולה להכיל על המוח העתידי פיזיולוגיה והתנהגות.

Abstract

שינה היא קריטית עבור פיתוח תקין פלסטיות עצבית. יתר על כן, דפוסי שינה חריגים הם מאפיין של הפרעות התפתחותיות רבות. הגבלת שינה כרונית כיצד לומד במהלך הפיתוח יכול להשפיע על התנהגות המבוגרים יכולים להוסיף להבנת הופעתם של סימפטומים התנהגותיים של הפרעות התפתחותיות. בעוד ישנן שיטות רבות יכול לשמש כדי להגביל שינה בחולדות כולל גפיים בכפייה, הפרעה מתמדת, מצגת של גירוי aversive, או הלם חשמלי, מרבית השיטות האלה מאוד מלחיצים ולא ניתן להשתמש בעכברים neonatal. כאן, אנו מתארים טיפול עדין, טכניקה חסך שינה ניתן להשתמש בה באופן כרוני במהלך פיתוח לבגרות להשגת שינה ההגבלה. טיפול עדין כרוך תצפית קרובה של העכברים לאורך כל תקופת חסך שינה ודורש החוקר בעדינות ויפיצו את החיות בכל פעם הם אינם פעילים או להציג התנהגויות הקשורות שינה. יחד עם EEG הקלטות, טיפול עדין יכול לשמש באופן סלקטיבי לשבש שלב מסוים של שינה כגון תנועות עיניים מהירות (REM). בטכניקה של טיפול עדין הוא כלי רב עוצמה עבור חקר ההשפעות של הגבלת שינה כרונית אפילו בעכברים neonatal העוקפות רבים מההליכים יותר מלחיץ המשמש עבור מניעת שינה.

Introduction

שינה ממלאת תפקיד קריטי פלסטיות עצביים היווצרות סינפסה ולמניעת במהלך המוח פיתוח^1,2. באופן ספציפי, תנועות עיניים מהירות (REM) שינה חיונית להרכיב מעגלים סינפטית יציבה באמצעות שני חיזוק של הסינפסות ספציפיים וסינפטית גיזום². מניעת שינה תרופתי בשלב מוקדם בחיים מוביל פיזיולוגיים והתנהגותיים חסרונות רבים^3,4. בנוסף שינה תרופתי מניעת, צורות אחרות של מניעת שינה כגון טלטול מתמיד, נאלץ גפיים או מצגת של גירוי aversive קושרו עם תסמינים דמויי דיכאון במהלך הבגרות, שונה עצבית הפעלת תבניות, ושינויים רציפות הזמן ולישון שינה במהלך תקופת ההחלמה בעקבות מניעת^5,6,7. בעת שינה כרוני מוגבלת בעכברים עבור יותר מ-5 שבועות במהלך הפיתוח, חסרונות התנהגותיים נצפו לאחר חודש של שינה שחזור⁸. יחדיו, מחקרים אלה מראים כי הפרעות שינה, למכרסמים neonatal יכול להשפיע על דפוסי השינה מאוחר יותר, תפקוד המוח וההתנהגות. הדגשת חשיבות השינה לפיתוח מוח נורמלי בבני אדם, חולים רבים עם הפרעות התפתחותיות, כולל הפרעות הספקטרום האוטיסטי, טרשת נפוצה Tuberous מורכבים, תסמונת X שביר, תשומת לב-קשב/היפראקטיביות . הפרעת, דו ח ליקויים בדפוסי שינה בנוסף למגוון חסרונות התנהגותיים¹

בהינתן מספר הפרעות התפתחותיות המקושרים עם דפוסי שינה נורמלית, חשוב להבין איך חוסר שינה משפיע על תפקוד המוח וההתנהגות. עם זאת, למרות הנתונים התומכים את החשיבות של שינה במהלך הפיתוח, מתודולוגיות רוב להגביל או לשלול חיות של שינה דגש על מבוגרים. שיטות אלה כוללות מגוון של בדיקות הדורשות הכריחו גינקולוגיות הפעילות (למשל, הליכון קבוע), הפרעה מתמדת (למשל, סיבוב בר מטאטא או מתמיד באובייקט הרומן מצגת) או מפריע החיה עם תחילת ראם שינה (למשל, רציף מעל המים)^9,10. למרות ששיטות אלה הראו ביעילות בעיות הקשורות מניעת שינה אצל מבוגרים, כל השיטות האלה מתאימים עבור הגורים מכרסמים בשל ניידותו מוגבל, נסיעה גבוהה שינה, את ההשפעות השליליות של הלחץ בשלב מוקדם בחיים. בשל החשיבות של שינה במהלך הפיתוח, חיוני להבין איך מוגבלת לישון הגורים neonatal משפיעה על התנהגות עתידית בתקופת הבגרות.

טכניקה אחת כדי להגביל שינה יכול לשמש הגורים מכרסמים הוא טיפול עדין. טיפול עדין כרוך החוקר ישירות אינטראקציה עם המכרסמים שכל הזמן שינה התנהגות נצפית. החוקרים באפשרותך להשתמש את ידיהם, מברשת צבע או מצגת של הרומן אובייקטים כדי פיזית להפרעות בשינה מכרסמים neonatal^{8,10,11,12,13,14} . שינה יכול להיקבע בהתנהגותו על ידי חוסר פעילות מוטורית, להתעוות מיוקלונית, סגירת העין (ב הגורים מכרסמים בוגרים). EEG אימות מאשר כי שיבוש שינה עם טיפול עדין המבוסס על התנהגויות אלו מקצרת זמן שינה הכולל 91% P12 חולדות¹⁴... טכניקות אחרות שנוצלו לשלול עכברים צעירים כוללים הלם חשמלי, מצגת של גירויים לא נעימים, אבל טכניקות אלה אינם יכולים לשמש עבור הגבלת שינה כרונית ויש יותר מלחיץ טיפול עדין^{7, 15}. הגבלת שינה כרוני יכול להתבצע גם באמצעות פרוטוקול חזק שיכול לשמש עם או בלי EEG אלקטרודה השרשה ותוכנות מחשב משויך, אך פרוטוקול זה אינה מונעת כולנו לישון, ולכן הוא פחות נשלט לעומת טיפול עדינה^4,16. היכולת להגביל או לשלול עכברים של שינה במשך ימים רבים ברציפות ללא ציוד ספציפי, תוכנות מחשב או השתלת אלקטרודה היא יתרון לשיטת טיפול עדין. הגבלת שינה כרונית באמצעות טיפול עדין ביעילות מגביל שינה בחולדות neonatal ומייצרת מגוון של שינויים התנהגותיים בעקבות שינה חסך התקופה^{8,11,12, 17}.

כאן, אנו מתארים תוצאות בו מניעת שינה כרוניות במשך שלוש שעות לכל יום מיום כמחנכת 5 (P5) כדי P42 משפיע באופן משמעותי גדושה של עכברים בעקבות תקופה של 30 יום התאוששות שבו שינה לא מופרע. תוצאות אלו מדגישים את ההשפעות ארוכות הטווח של הגבלת שינה כרונית במהלך הפיתוח על התנהגות עתידית.

Protocol

הערה: כל ההליכים היו אושרה על ידי לאומי המכון של הנפש החיה שירותי הבריאות לשימוש הוועדה, שבוצעה בהתאם מוסדות לאומיים של בריאות להנחיות על טיפוח ועל השימוש של בעלי חיים.

1. שינה חסך ההתקנה

1. משתמשים במכחולים רכים לתקוע בעדינות עכברים כאשר ישנה.
   1. ודא שבמכחול יכולה להתאים דרך סורגי במזין כלוב עכבר כדי להבטיח כי עכברים יש גישה לאוכל ומים ad libitum במהלך שינה.
   2. אל תשתמש מכחולים עבור הכלובים מרובים כדי למנוע את העברת ריחות בין הכלובים. אנו מציעים לך לתייג כל מברשת בכלוב שהוקצו, להגביל את השימוש בו את הכלוב.
2. לייעד את חדר שבו כל שינה תתרחש.

2. בעלי חיים ההתקנה

1. להקצות באופן אקראי בכל כלוב או מניעת שינה או קבוצת הביקורת.
2. לתת עכברים גישה מזון ומים ad libitum במהלך הניסוי.
3. ודא תצוגה של עכברים הוא לא מוגבל על ידי מצעים, קן חומר או אובייקטים העשרה בכלוב.
   1. הסר המיטות הנוספות או אובייקטים העשרה יכול להגביל את התצוגה של העכברים.
4. אם אוכל או מים הגבלת התצוגה של עכברים, להעביר עכברים לאזור של הכלוב כאשר התצוגה אינה מוגבלת.
   1. אם האוכל חוסם חלק גדול של הכלוב, להסיר קצת אוכל, המקום כדורי בתחתית הכלוב כך חיות לשמור על גישה למזון במהלך תקופת חסך שינה.

3. בעלי חיים בתנאים

הערה: בחרנו להתחיל שעה שלושה תקופת חסך שינה בשעה 11:00, כאשר עכברים הם באמצע השלב שלהם לא פעיל, אך ניתן לבחור את השעה ביום, משך הזמן של מניעת שינה בהתאם לתנאים ניסיוני הרצוי.

1. קבוצת הביקורת.
   1. על פי-5, להסיר את אדוני הכלוב תרבית ולהשאיר את הסכר עם גוריה עד הגמילה (P21).
   2. להעביר עכברים שהוקצו לקבוצת הבקרה כדי מניעת השינה חדר ואת בעדינות ויפיצו העכברים עם מברשת הצבע באופן רציף במשך 10 דקות ליום עבור משך הזמן של הניסוי (P5 כדי P42).
   3. לאחר 10 דקות אלה, העכברים לשוב החיה מחזיק חדר, נא לא להפריע להם
2. קבוצת חסך שינה.
   1. על פי-5, להסיר את אדוני הכלוב תרבית ולהשאיר את הסכר עם גוריה עד הגמילה (P21).
      הערה: מניעת שינה לפני P5 עלול לגרום קניבליזציה של הגורים. אנחנו לא להתבונן קניבליזציה משמעותית-P5, ומאוחר יותר.
      הערה: בגורים צעירים, הכונן לישון הוא גבוה מאוד הדורשים ללטף כמעט קבוע. העכברים לפתח, במיוחד לאחר הגמילה, הלחץ שינה הוא נמוך יותר, הם לא צריך לדרבן מתמדת.
   2. להמשיך עם מניעת שינה כל יום עד P42.
      הערה: פרוטוקולים חסך שינה יכול להשתנות אורך ולהרחיב בעבר P42 במידת הצורך.
   3. להעביר עכברים שהוקצו לקבוצת חסך שינה לחדר חסך שינה מדי יום במהלך מחזור אור איפה הם יהיה פיקוח. משך הזמן המדויק של מניעת שינה ניתן להתאים בהתבסס על שאלת המחקר הספציפי.
      הערה: בעכברים neonatal מניעת שינה שנמשך יותר מ 3 שעות קשה עקב עליית הלחץ שינה¹⁵.
      1. במהלך תקופה זו, בעדינות ויפיצו העכברים במכחול ובכל זמן שינה מתבטא. הפרטים של מניעת שינה מוסברים בסעיף הבא.

4. מניעת שינה

1. בעדינות ויפיצו את העכבר עם מכחול אם חושדים שהוא ישן עד לתגובה נצפית. לחלופין, היפוך עכברים, לדחוף על גבם לגרום להפרעות בשינה.
   1. שקול עכבר ישנה אם כל אחת מהפעולות הבאות מתרחשות: חוסר פעילות, להתעוות (במיוחד עם הגורים), או אם עיניהם סגורים (בעכברים שגילם P12).
   2. שקול עכברים להיות ער אם הם נעים סביב, מנסה להתהפך לאחר להיות על גבם, או לטפח את עצמם.
2. אם הסכר מכסה הגורים במהלך שינה, בעדינות ויפיצו אותה מן הגורים אז התצוגה של הגורים היא בלתי מוגבלת.

5. בתום מניעת שינה

1. בתום תקופת שלוש שעות של חוסר שינה, לשים את המצעים. כל זה הוסר בחזרה ועם תחזיר המכסה על הכלוב.
2. לחזור כלובי בעלי חיים כמו באישיות עד למחרת של חוסר שינה.

6. לאחר מכן ניסויים

1. בהתאם המטרה של המחקר חסך שינה, להמשיך עם הניסויים הבאים.
   1. הקציר סרום מחיות כדי לקבוע corticosterone רמות¹⁸.
   2. בצע פעולה כלשהי מהפעולות מספר התנהגותיות בדיקות, כולל שדה פתוח, RotaRod, מבוך פלוס מוגברות, בדיקות, השיש קובר, ועוד^8,19,20 בדיקות התנהגות אלה גם תמנע את החיות של התנהגות חברתית מגורים כך צריך להיות בחשבון בקביעת כמה ימים של חוסר שינה מתמשך להעסיק.

Representative Results

כדי לחקור את ההשפעות של שינה כרונית ההגבלה על התנהגות, נישן עכברים מוגבלת במשך שלוש שעות מדי יום בין 11:00 לבין השעה 14:00 מ P5 P42⁸. בעקבות ההגבלה שינה, עכברים היו נותר ללא הפרעה במשך ארבעה שבועות, מותר להתאושש הגבלת שינה. עכברים נבדקו על התנהגות בעקבות תקופת ההחלמה ארבעה שבועות. הבדיקה 3-הקאמרית התנהגות חברתית שימש כדי להעריך גדושה (העדפה עכבר הרומן לעומת עצם הרומן) ואת החדשנות החברתית (העדפה עכבר הרומן לעומת עכבר מוכר). במבחן חברותיות, לישון נקבות מוגבלת מבלה יותר זמן לרחרח את העכבר זר מאשר נקבות שליטה (p < 0.05) (איור 1 א') והיה זכרים שינה מוגבלת הנטייה להקדיש יותר זמן לרחרח את האובייקט לעומת לשלוט זכרים (p = 0.077) (איור 1 א'). בשלב החדשנות החברתית של בדיקות, מוגבלת שינה עכברים הנשי בילה מוגבר כמות הזמן מרחרח את העכבר הרומן מאשר הנשי שולט (p < 0.01) (איור 1B).

איור 1: הגבלת שינה כרונית הפיצולים התנהגות חברתית בעקבות תקופת התאוששות שינה 4 שבועות. (א) גדושה מבחן: זמן היה מגלה לרחרח את זכר עכברים שהיו שינה מוגבלת מבלה יותר זמן לרחרח את האובייקט הרומן בהשוואה הזכרים פקדים (p = 0.077). מוגבלת שינה עכברים הנשי מבלה יותר זמן לרחרח את העכבר הזר לעומת נקבות שליטה (*p < 0.05). עכברים הנשי מוגבלת שינה נטו גם לבלות יותר זמן לרחרח את האובייקט לעומת שליטה נקבות (p = 0.065). מבחן החדשנות החברתית (B) : הזמן בילה מרחרח את הרומן או העכבר מוכר חשף זה שינה עכברים הנשי מוגבלת בילה זמן יותר משמעותית מבחינה סטטיסטית מרחרח את העכבר הרומן לעומת נקבות עכברים שלא היו שינה מוגבלת (* *p < 0.01). העמודות מייצגות את ± באמצעים SEM ב 11 שליטה זכר, זכר בעל הגבלת שינה 13, 22 שליטה נשית ועכברים 17 מוגבלת שינה הנשי. הנתונים נותחו באמצעות דואר hoct-בדיקות בעקבות של ANOVA. דמות זו שונתה באישור Sare. ואח 2016⁸. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

כאן אנו מתארים שיטה עבור מניעת שינה, עדין טיפול, יכול לשמש שני הגורים מכרסמים, אצל מבוגרים. מסירת עדין דורשת חוקרים לבחון עכברים למשך כל תקופת חסך שינה, בעדינות ויפיצו את החיות בכל פעם הם לא פעילים או עוויתות למניעת שינה. מחקרי חסך שינה מוקדמת יש לאמת באמצעות הקלטות העוויתיים סימולטני (EEG) כי טיפול עדין מונע הן REM, הלא - REM NREM לישון¹⁰. בזמן טיפול עדין באחת השיטות חסך שינה היחיד שניתן להשתמש בהם על הגורים מכרסמים צעיר, ישנן כמה מגבלות על השימוש בו.

טיפול ראשון, עדין מסתמכת במידה רבה על הנסיין יוכלו הן לזהות ולהגיב מיד לישון מראש התנהגויות. כאשר מפרק אותה לישון הגורים מכרסם הגורים יש כמעט כל הזמן דחק או הפוכה כדי להבטיח כי הם ערים עבור תקופת הגבלת שינה כולו. הכרה בפקעת של גורים צעירים חיוני למניעת שינה²¹כראוי. שנית, יש להכיר בכך כי מניעת שינה המתרחשת לפני הגמילה, כאשר הגורים הם עדיין עם אמם, יכול להשפיע על שינה האם כתופעת משני; עם זאת, מידת האפקט הזה טרם להבטיח את הזמנתכם. שלישית, חשוב להכיר כי כל תהליך מניעת שינה יהיה לחוץ מטבעו, זה בלתי אפשרי להפריד בין ההשפעות של חוסר שינה מן הלחץ הנגרם על ידי ההליך. עם זאת, באמצעות פרוטוקול טיפול עדין המתוארים כאן ניסיונות למזער את הלחץ של מניעת שינה לעומת פרוטוקולים חסך שינה אחרים. וזה בסופו של דבר, ואילו טיפול עדין היא טכניקה שימושית עבור מניעת שינה neonatal כרונית, הליך מעיק של חוקרים כמו זה זמן רב ודורש תשומת לב מתמדת. עוד פרוטוקולים חסך שינה קשים גם לבצע בעכברים neonatal עקב העליות בלחץ ישן מעל הזמן¹⁵.

למרות מגבלות אלו, עדין מוסר הוא כלי רב עוצמה כדי לחקור את ההשפעות של הגבלת שינה כרונית במהלך פיתוח ולתוך לבגרות, כיצד שינה הגבלת יכולות להשפיע על הפיזיולוגיה של ההתנהגות והן המוח. והכי חשוב, שיטה זו מאפשרת לחוקרים ממשיכים לחקור את ההשפעות זה שינה הגבלה בגיל מוקדם יכול להיות על ההתפתחות של המוח הן מיד הבאים ישנה הגבלה וגם מאוחר יותר בחיים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J mice	Jackson Labs	000664	Wildtype mice used
Super Mouse 750 Mouse Cage	Lab Products, Inc.		Cages for the mice
SANI-Chips Bedding	PJ Murphys		Bedding for the mice
S&S Bristle Brush Assortment Pack	Staples	Item # 13764, Model AB37100	Paint brushes are used to gently poke mice