Summary
Descriviamo una tecnica di privazione di sonno conosciuta come manipolazione delicata dove gli investigatori delicatamente prod topi qualsiasi momento viene osservato il comportamento di sonno. Questo metodo è un potente strumento che permette ai ricercatori di studiare gli effetti che la restrizione di sonno cronica nel corso dello sviluppo può avere sul comportamento e sulla fisiologia futuro cervello.
Abstract
Sonno è fondamentale per il corretto sviluppo e plasticità neurale. Inoltre, modelli di sonno anormale sono caratteristici di molti disturbi dello sviluppo neurologico. Restrizione di sonno cronica come studiare durante lo sviluppo possa influire sul comportamento adulto può aggiungere alla nostra comprensione della comparsa di sintomi comportamentali di disturbi dello sviluppo neurologico. Mentre ci sono molti metodi che possono essere utilizzati per limitare il sonno nei roditori tra cui locomozione forzata, costante interruzione, presentazione di uno stimolo avversivo, o scosse elettriche, molti di questi metodi sono molto stressanti e non può essere utilizzati in topi neonatali. Qui, descriviamo manipolazione delicata, una tecnica di privazione di sonno che può essere utilizzata cronicamente durante lo sviluppo e nell'età adulta per raggiungere la restrizione di sonno. Manipolazione delicata comporta la stretta osservazione dei topi per tutto il periodo di privazione di sonno e richiede al ricercatore di prod delicatamente gli animali quando sono inattivi o visualizzare i comportamenti associati al sonno. Accoppiato con le registrazioni di EEG, manipolazione delicata potrebbe essere utilizzata per distruggere selettivamente una specifica fase del sonno come sonno veloce del movimento oculare (REM). La tecnica di manipolazione delicata è un potente strumento per lo studio degli effetti della restrizione di sonno cronica anche in topi neonatali che aggira molte delle procedure più stressante utilizzate per la privazione di sonno.
Introduction
Il sonno gioca un ruolo critico nella formazione di plasticità e sinapsi neuronale e l'eliminazione durante lo sviluppo del cervello1,2. In particolare, sonno veloce del movimento oculare (REM) è essenziale per la formazione di circuiti sinaptici stabile attraverso entrambi rafforzamento di specifiche sinapsi e sinaptica potatura2. Privazione del sonno farmacologico presto nella vita conduce a molti deficit fisiologici e comportamentali3,4. Oltre al sonno farmacologico privazione, altre forme di privazione del sonno come agitazione costante, costretto locomozione o presentazione di uno stimolo avversivo sono stati associati con la depressione-come i sintomi durante l'età adulta, diverso neurale pattern di attivazione e cambiamenti nella continuità di tempo e il sonno sonno durante un periodo di recupero dopo privazione5,6,7. Quando il sonno è cronicamente limitato nei topi per cinque settimane durante lo sviluppo, deficit comportamentistici sono stati osservati dopo un mese di sonno recupero8. Presi insieme, questi studi suggeriscono che la rottura di sonno nel roditore neonatale possa influenzare successivi modelli di sonno, la funzione del cervello e comportamento. Evidenziando l'importanza del sonno per lo sviluppo normale del cervello in esseri umani, molti pazienti con disturbi dello sviluppo neurologico, tra cui disturbi dello spettro autistico, sclerosi tuberosa complessa, sindrome da X Fragile e Attention-Deficit/Hyperactivity Disordine, le anomalie di relazione nel ritmo del sonno oltre ad una varietà di deficit comportamentistici1.
Dato il numero di disturbi dello sviluppo neurologico che sono associati con modelli di sonno anormale, è importante capire come la mancanza di sonno influisce comportamento e funzione del cervello. Tuttavia, nonostante i dati che supportano l'importanza del sonno durante lo sviluppo, la maggior parte delle metodologie che limitano o privano gli animali di messa a fuoco di sonno sugli adulti. Queste tecniche comprendono una varietà di prove che richiedono forzati attività locomotrice (ad es., costante tapis roulant), costante interruzione (ad es., rotante barra spazzatrice o presentazione oggetto continuo di romanzo) o disturbare l'animale al momento della comparsa di Sonno di rem (ad es., piattaforma sull'acqua)9,10. Sebbene questi metodi hanno dimostrato in modo efficace i problemi legati alla privazione di sonno in adulti, nessuno di questi metodi sono appropriati per roditori cuccioli a causa della loro mobilità limitata, unità alto sonno e gli effetti negativi dello stress presto nella vita. Data l'importanza del sonno durante lo sviluppo, è fondamentale per capire come limitato sonno nel comportamento futuro di cuccioli neonatale colpisce durante l'età adulta.
Una tecnica per limitare il sonno che può essere utilizzato nei cuccioli roditore è una manipolazione delicata. Manipolazione delicata coinvolge l'investigatore che interagiscono direttamente con i roditori che qualsiasi comportamento di sonno ora è osservato. Gli investigatori possono utilizzare le loro mani, un pennello o presentazione di nuovi oggetti per fisicamente interrompe il sonno in roditori neonatale8,10,11,12,13,14 . Sonno può essere relativamente al comportamento determinato dalla mancanza di attività motoria, spasmi mioclonici e chiusura degli occhi (in più vecchi cuccioli roditori). Convalida di EEG conferma che interrompere il sonno con delicatezza basato su questi comportamenti riduce il tempo totale di sonno di 91% nel P12 ratti14. Altre tecniche che sono state utilizzate per privare i giovani topi includono scosse elettriche e presentazione di stimoli sgradevoli, ma queste tecniche non possono essere utilizzate per la restrizione di sonno cronica e sono più stressante di manipolazione delicata7, 15. la restrizione di sonno cronica può essere effettuata anche tramite un protocollo di agitazione che può essere utilizzato con o senza l'impianto di elettrodi EEG ed il software associato, ma questo protocollo non impediscono il sonno tutti e quindi è meno controllato rispetto a manipolazione delicata4,16. La capacità di limitare o privare topi di sonno per molti giorni di fila senza attrezzature specifiche, software per computer o l'impianto dell'elettrodo è un vantaggio della tecnica di manipolazione delicata. Restrizione di sonno cronica tramite manipolazione delicata efficacemente limita il sonno nei roditori neonatale e produce una varietà di cambiamenti comportamentali seguendo il sonno privazione periodo8,11,12, 17.
Qui, descriviamo i risultati in cui privazione di sonno cronica per tre ore al giorno dal giorno postnatale 5 (P5) al P42 influisce in modo significativo la socievolezza dei topi dopo un periodo di recupero di 30 giorni in cui il sonno non è disturbato. Questi risultati evidenziano gli effetti a lungo termine della restrizione di sonno cronica durante lo sviluppo il comportamento futuro.
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Protocol
Nota: Tutte le procedure erano approvate dal comitato di uso e National Institute di mentale salute Animal Care ed eseguite secondo gli istituti nazionali di salute orientamenti sull'uso degli animali e manutenzione.
1. installazione di privazione di sonno
- Usare i pennelli morbidi per colpire delicatamente topi durante il sonno.
- Assicurarsi che il pennello può adattarsi attraverso le sbarre dell'alimentatore del mouse gabbia per garantire che i topi hanno accesso al cibo e acqua ad libitum durante la privazione di sonno.
- Non utilizzare i pennelli per gabbie multiple per impedire il trasferimento di profumi tra gabbie. Suggeriamo che si etichetta ogni pennello con relativa gabbia assegnato e limitarne l'utilizzo a quella gabbia.
- Designare una camera dove si verificherà ogni privazione di sonno.
2. installazione animale
- Assegnare in modo casuale ogni gabbia o di privazione di sonno o di gruppo di controllo.
- Dare topi accesso a cibo e acqua ad libitum durante l'esperimento.
- Assicurarsi che la vista dei topi non è limitata da biancheria da letto, nido materiale o oggetti di arricchimento in gabbia.
- Rimuovere oggetti di arricchimento che potrebbero limitare la visualizzazione dei topi o biancheria da letto extra.
- Se il cibo o acqua limita la vista dei topi, spostare topi in un'area della gabbia dove la vista non è limitata.
- Se il cibo si blocca una grande porzione della gabbia, togliere alcuni alimenti e posizionare pellet nella parte inferiore della gabbia in modo che gli animali mantengono l'accesso al cibo durante il periodo di privazione di sonno.
3. animale condizioni
Nota: Abbiamo scelto di iniziare il periodo di privazione di sonno alle 11, quando i topi sono nel mezzo di loro fase inattiva, ma l'ora del giorno e la durata della deprivazione di sonno può essere scelto in base alle condizioni sperimentali desiderate di tre ore.
- Gruppo di controllo.
- Il P5, rimuovere il sire dalla gabbia allevatore e lasciare la diga con i cuccioli fino allo svezzamento (P21).
- Spostare topi assegnati al gruppo di controllo per la privazione di sonno in camera e delicatamente prod i topi con un pennello continuamente per 10 minuti al giorno per tutta la durata dell'esperimento (P5 di P42).
- Dopo questi 10 minuti, restituire i topi all'animale sala di detenzione e non li disturbare
- Gruppo di privazione di sonno.
- Il P5, rimuovere il sire dalla gabbia allevatore e lasciare la diga con i cuccioli fino allo svezzamento (P21).
Nota: La privazione di sonno prima del P5 può comportare di cannibalizzazione dei cuccioli. Non abbiamo osservato significativi cannibalizzazione a P5 e versioni successive.
Nota: Nei giovani cuccioli, in stop l'unità è molto alta che richiedono accarezzando quasi costante. Come i topi sviluppano, soprattutto dopo lo svezzamento, la pressione del sonno è inferiore e non hanno bisogno di costante incitamento. - Continuare con la privazione di sonno ogni giorno fino a P42.
Nota: Protocolli di privazione di sonno possono variare in lunghezza e oltrepassare P42, se lo si desidera. - Spostare topi assegnati al gruppo di privazione di sonno per la camera di deprivazione di sonno al giorno durante il ciclo di luce dove essi saranno monitorati. La durata esatta della privazione di sonno può essere regolata basata sulla domanda di ricerca specifici.
Nota: In topi neonatali privazione del sonno che dura più di 3 ore è difficile a causa dell'aumento in sonno pressione15.- Durante questo tempo, delicatamente prod i topi con il pennello ogni volta che il sonno è evidente. Specifiche della privazione di sonno sono spiegate nella sezione successiva.
- Il P5, rimuovere il sire dalla gabbia allevatore e lasciare la diga con i cuccioli fino allo svezzamento (P21).
4. privazione di sonno
- Delicatamente prod del mouse con il pennello se sospettate di essere addormentato fino a quando non si è osservata una risposta. In alternativa, invertire topi e spingere sopra le spalle a disturbare il sonno.
- Si consideri un mouse di dormire se si verifica una delle seguenti operazioni: inattività, spasmi muscolari (soprattutto con i cuccioli), o se i loro occhi sono chiusi (nei topi più vecchi di P12).
- Considera topi di essere sveglio se si stanno muovendo intorno, cercando di capovolgere dopo essere sulle loro spalle, o governare se stessi.
- Se diga copre cuccioli durante la privazione di sonno, delicatamente di prod lei lontano da cuccioli e la vista dei cuccioli è senza restrizione.
5. dopo privazione di sonno
- Quando il periodo di tre ore di privazione di sonno è completo, è possibile mettere la biancheria da letto e qualsiasi cibo che potrebbe essere stato rimosso indietro e rimettere il coperchio sulla gabbia.
- Tornare gabbie animali della holding della camera fino al giorno successivo della privazione di sonno.
6. successivi esperimenti
- A seconda l'obiettivo dello studio di privazione di sonno, procedere con esperimenti successivi.
- Raccolta del siero dagli animali per determinare livelli di corticosterone18.
- Fare qualsiasi di una serie di test comportamentali, tra cui campo aperto, RotaRod, labirinto elevato Plus, comportamento sociale test, seppellendo di marmo, ecc.8,19,20 questi test di comportamento eviterà anche gli animali da dormire in modo che dovrebbero essere presi in considerazione quando si determina il numero di giorni di privazione di sonno continuo di impiegare.
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Representative Results
Per studiare gli effetti della restrizione di sonno cronica sul comportamento, dormiamo limitati topi per tre ore ogni giorno tra le 11:00 e 14:00 da P5 a P428. Dopo la restrizione di sonno, topi sono stati lasciati indisturbati per quattro settimane e ha permesso di recuperare dalla restrizione di sonno. Topi sono stati testati per un comportamento dopo il periodo di recupero di quattro settimane. La prova di comportamento sociale tre-alloggiamento è stata usata per valutare socialità (preferenza per un romanzo del mouse rispetto a un oggetto romanzo) e novità sociale (preferenza per un romanzo del mouse rispetto ad un mouse familiarità). Nel test di socialità, dormire con restrizioni femmine trascorse più tempo annusando il mouse estraneo rispetto alle femmine di controllo (p < 0,05) (Figura 1A) e sonno-limitati i maschi hanno avuti una tendenza a passare più tempo annusando l'oggetto rispetto al i maschi di controllo (p = 0,077) (Figura 1A). Nella fase sociale novità del test, topi femminili sonno-limitati trascorso un'aumentata la quantità di tempo annusando il mouse romanzo di comandi femminili (p < 0.01) (Figura 1B).
Figura 1: la restrizione di sonno cronica altera il comportamento sociale, dopo un periodo di recupero di 4 settimane di sonno. (A) test di socialità: tempo trascorso sniffing rivela quel topo maschio che era sonno limitato trascorso più tempo annusando l'oggetto romanzo rispetto ai maschi controlli (p = 0,077). Topi femminili sonno-limitati trascorso più tempo annusando il mouse estraneo rispetto alle femmine di controllo (*p < 0,05). Topi femminili sonno-limitati anche la tendenza a spendere più tempo annusando l'oggetto rispetto alle femmine di controllo (p = 0,065). Test novità sociale (B) : tempo trascorso fiutando il romanzo o mouse familiare ha rivelato che il sonno topi femmina limitati trascorso statisticamente significativa più tempo annusando il mouse romanzo rispetto ai topi femminili che non erano sonno limitato (* *p < 0.01). Barre rappresentano il mezzo ± SEM in 11 controllo maschio, 13 Uomo sonno-limitati, 22 controllo femminile e 17 topi femminili sonno-limitati. I dati sono stati analizzati mediante post marino-test seguendo un'ANOVA. Questa figura è stata modificata con il permesso di Sare et al 20168. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui descriviamo un metodo per la privazione di sonno, movimentazione, che può essere utilizzato in entrambi cuccioli roditore e negli adulti di gentile. Consegna dolci richiede ai ricercatori di osservare i topi per la durata di un periodo di privazione di sonno e prod delicatamente gli animali quando sono inattivi o contrazioni per impedire il sonno. Gli studi di privazione di sonno precedente hanno verificato per mezzo di registrazioni simultanee elettroencefalogramma (EEG) che impedisce la manipolazione delicata sia REM e non - REM NREM sleep10. Mentre una manipolazione delicata è uno degli unici metodi di privazione di sonno che possono essere utilizzati su giovani cuccioli roditore, ci sono alcune limitazioni al suo utilizzo.
In primo luogo, delicata manipolazione dipende fortemente dallo sperimentatore per essere in grado di riconoscere sia prontamente rispondere per pre-sonno comportamenti. Quando privando sonno nei roditori cuccioli, i cuccioli devono essere quasi costantemente spronati o invertiti per assicurare che sono svegli per il periodo di restrizione di sonno intera. Riconoscimento delle contrazioni nei giovani cuccioli è essenziale per prevenire correttamente sonno21. In secondo luogo, va riconosciuto che la privazione di sonno che si verifica prima dello svezzamento, quando i cuccioli sono ancora con la loro madre, potrebbe influenzare il sonno della madre come un effetto secondario; Tuttavia, la portata di questo effetto ha ancora da esplorare. In terzo luogo, è importante riconoscere che qualsiasi processo di privazione di sonno sarà inerentemente stressante, e non è possibile separare gli effetti della privazione di sonno dallo stress causato dalla procedura. Tuttavia, utilizzando il protocollo di trattamento delicato descritto qui i tentativi di ridurre al minimo lo stress della privazione di sonno rispetto ad altri protocolli di privazione di sonno. E infine, considerando che una manipolazione delicata è una tecnica utile per la privazione di sonno cronica neonatale, è una procedura onerosa per i ricercatori come è che richiede tempo e richiede un'attenzione costante. Più protocolli di privazione di sonno sono anche difficili da eseguire in topi neonatali dovuto gli aumenti nella pressione del sonno sopra tempo15.
Nonostante queste limitazioni, consegnando dolci è un potente strumento per studiare gli effetti della restrizione di sonno cronica nel corso dello sviluppo e in età adulta e come la restrizione di sonno può influenzare la fisiologia del cervello e comportamento. La cosa più importante, questo metodo permette ai ricercatori di continuare ad esplorare gli effetti che il sonno restrizione in età precoce può avere sullo sviluppo del cervello sia immediatamente seguente restrizione del sonno e più tardi nella vita.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata finanziata dal programma di ricerca intramurale del NIMH (ZIA MH00889). RMS è stato supportato anche da una borsa di studio post-dottorato di FRAXA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | Jackson Labs | 000664 | Wildtype mice used |
| Super Mouse 750 Mouse Cage | Lab Products, Inc. | Cages for the mice | |
| SANI-Chips Bedding | PJ Murphys | Bedding for the mice | |
| S&S Bristle Brush Assortment Pack | Staples | Item # 13764, Model AB37100 | Paint brushes are used to gently poke mice |
References
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