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Bioengineering

Skalierbare Fertigung von dehnbar, Dual Channel, mikrofluidischen Orgel Chips

Published: October 20, 2018 doi: 10.3791/58151
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Hier präsentieren wir eine Protokoll, die beschreibt die Herstellung von dehnbar, dual Channel, Orgel Chip mikrofluidischen Zelle Kultur Geräte zur Rekapitulation ORGANEBENE Funktionalität in Vitro.

Abstract

Eine beträchtliche Anzahl von Bleiverbindungen Scheitern in der pharmazeutischen Pipeline, weil tierexperimentellen Studien oft nicht klinische Reaktionen bei menschlichen Patienten vorherzusagen. Menschliche Organ-on-a-Chip (Orgel Chip) mikrofluidischen Zelle Kultur Geräte, die eine experimentelle in Vitro -Plattform zur Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität pharmakokinetischen (PK) Profile beim Menschen zur Verfügung stellen, möglicherweise bessere Prädiktoren der therapeutischen Wirksamkeit und Sicherheit in der Klinik im Vergleich zum Tierversuch. Diese Geräte verwendet werden, um die Funktion von praktisch jeder Orgel Art zu modellieren und strömungstechnisch verknüpft werden können, durch gemeinsame Endothel ausgekleidet Mikrokanäle in-vitro- Studien auf Orgel und ganze Körper-Ebene Humanphysiologie durchführen, ohne dass durchzuführen Sie Experimente am Menschen. Diese Orgel-Chips bestehen aus zwei PERFUNDIERTEN mikrofluidische Kanäle getrennt durch eine durchlässige gummielastischen Membran mit organspezifischen parenchymal Zellen auf der einen Seite und mikrovaskulären Endothel andererseits, die zyklisch gedehnt werden kann, bieten Organ-spezifische mechanische Signale (z. B. Bewegungen in Lunge atmen). Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von flexiblen, dual Channel, Orgel-Chips durch Gießen von Teilen mit 3D gedruckt Formen, ermöglicht die Kombination von mehreren Casting und Post-processing-Schritte. Poröse Poly (Dimethyl Siloxan) (PDMS) Membranen werden gegossen mit Mikrometer Größe Durchgangsbohrungen mit Silizium Säule Arrays unter Kompression. Fertigung und Montage der Orgel Chips beinhaltet Ausrüstung und Schritte, die außerhalb eines traditionellen Reinraum umgesetzt werden können. Dieses Protokoll bietet Forschern mit Zugang zum Orgel-Chip-Technologie für in-vitro- Körper und ORGANEBENE Studien in Drogeentdeckung, Sicherheit und Wirksamkeit zu testen sowie mechanistische Studien der grundlegenden biologischen Prozesse.

Introduction

Hier beschreiben wir die Herstellung von dual-Channel, vaskularisierte Orgel-on-a-Chip (Orgel Chip) mikrofluidischen Kultur Geräte mit einem skalierbaren Protokoll zugänglich für den Einsatz von Forschungsgruppen, die keinen Zugang zu Reinräumen und traditionelle weiche Lithographie Werkzeuge. Diese Geräte wurden entwickelt, um menschliche ORGANEBENE Funktionen für Verständnis Normal sowie Krankheit Physiologie und Droge Reaktionen in-vitro-1,2zu rekapitulieren. Entscheidend für die Entwicklung dieser Funktionalität sind zwei PERFUNDIERTEN mikrofluidische Kanäle getrennt durch eine semipermeable Membran (Abbildung 1). Dieses Design ermöglicht Erholung von Gewebe-Gewebe Schnittstellen zwischen mindestens zwei Arten von Gewebe, in der Regel parenchymatösen Organzellen auf der einen Seite der poröse Membran und vaskulären Endothel andererseits, sowie ihre Exposition gegenüber Flüssigkeitsströmung. Zusätzlich weil die Elastomere Polymer Poly (Dimethyl Siloxan) (PDMS), wird verwendet, um die Orgel Chip Körper zu fabrizieren und Membran Komponenten, zyklische mechanische Belastung aufgebracht werden, um die gesamte entwickelt Gewebe Gewebe Schnittstelle über die elastischen Membran, die natürlichen physischen Mikroumgebung lebende Organe, wie Atmung, Bewegungen in der Lunge und Peristaltik im Darm zu imitieren.

Figure 1
Abbildung 1: Querschnitt durch Orgel Chip. Orgel-Chips bestehen aus zwei Kanäle getrennt durch eine poröse, elastische Membran, die mit Zellen auf beiden Seiten ausgesät werden kann. Top-Channel Querschnitte sind 1 mm breit x 1 mm hoch, unten Kanal Kreuz Sektionen sind 1 mm breit x 0,2 mm hoch "und" Vakuum-Kanäle in beiden und Unterteile sind 0,3 mm breit, 0,5 mm hoch und Abstand von 0,3 mm aus den fluidischen Kanälen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Diese dehnbare, dual Channel, Orgel-Chips werden für den Nachweis der Auswirkungen der Atmung Bewegung auf Nanopartikel Absorption in der Lunge und Medikamenten-induzierten Lungenödem3,4; Auswirkungen der peristaltischen Bewegung auf Differenzierung5 und bakterielle Überwucherung im Darm5,6,7; und Einfluss der zyklischen Verformungen durch das Pulsieren des Herzens auf die Differenzierung und Reifung der glomerulären Podocytes in der Niere8. Darüber hinaus diese zwei Lumen-Geräte, die einen vaskulären Endothel ausgekleidet Kanal getrennt durch eine extrazelluläre Matrix (ECM) enthalten-beschichtete Membran aus parenchymal Zellen in einem separat zugänglichen Kanal eignen sich gut für die Charakterisierung des Medikaments PK Parameter und Ziel Neuentdeckung, die im einzelnen Perfusion begrenzt wurde Kanal Systeme. Darüber hinaus mehrere Orgel Chips kann verknüpft werden über ihre vaskulären Kanäle effektiv einen menschlichen Körper-on-Chips zu erstellen, die eine attraktive menschlichen in-vitro- Plattform für Therapeutika Entwicklung9bieten konnte, 10. Im Gegensatz zu Mikro-physiologische Systeme (MPS)11,12,13enthalten die Orgel-Chips zwei mikrofluidische Kanäle getrennt durch eine poröse Membran, die vaskuläre parenchymatösen Interaktionen erleichtert rekapitulieren Sie in Vivo Organfunktion. Dies vereinfacht nicht nur die Verknüpfung von verschiedenen Organen zusammen durch die Vorrichtung eines gemeinsamen Mediums durch die vaskulären Kanäle, sondern die Abschottung der Gewebe und Flüssigkeiten imitiert in Vivo Funktionen und unterstützt die pharmakokinetischen experimentieren und die Modellierung sowie in-Vitro-in Vivo Hochrechnung9,10 , die schwierig oder unmöglich in Einkanal MPS14,15,16. Die Popularität von PDMS in mikrofluidischen Geräten führte zu die Entwicklung von Werkzeugen, das Material innewohnende Fähigkeit, kleine Moleküle10,17zu überwinden. Allerdings erfordert die große Zahl an Chips zur Unterstützung der biologischen Studien, wo die mikrobiellen Agenten und PDMS-absorbierenden Substanzen nutzen Wiederverwendung des Orgel-Chips schwierig, erforderlich einen skalierbare Herstellungsprozess auch für kleine Arbeitsgruppen. Das hier beschriebene Protokoll stellt eine Methode für die Vorrichtung Herstellung geeignet für den Einsatz in wissenschaftlichen Labors, einschließlich derjenigen keinen Zugang zu Reinräumen und weiche Lithographie. Dieses Protokoll soll Zugriff auf Orgel-Chips durch eine breite Palette von Forschern suchen, dehnbar, Zweikanal-Geräte zu verwenden, für die Erkundung von grundlegenden biologischen Prozesse sowie translational therapeutische Entwicklung zu erweitern.

Nutzung von best Practices aus mikrofertigungstechnik Felder gepaart mit Design für Fertigung, entwickelte ein robuster Ansatz für die Herstellung von Orgel-Chip-Geräte in großen Stückzahlen mit hoher Reproduzierbarkeit und Ertrag. Das hier beschriebene Herstellung Protokoll bietet eine skalierbare Methode für Orgel Chip-Produktion. Wir beschreiben die Verwendung von ein optional Schimmel-in-Place Jig (MiP; Design-Details in Zusatzmaterialien) gepaart mit Polyurethan-Dichtung Streifen zu ermöglichen, Aufstockung der PDMS Druckgussteile. Die Glanzseite des Polyurethan-Streifen produzieren optisch glatte PDMS Teile, während die strukturierte Seite Entformung erleichtert. Wir beschreiben auch die Verwendung von einer optional automatisiert Membran Verarbeiter (AMF), die einheitliche Kompression der Membran Wafer Formen während der Härtung bietet für die Herstellung von bis zu 24 Membranen pro Charge. Das Design ist breit anwendbar für Studien der Organe, die aus Gewebe bestehen, die mechanische Belastung und Perfusion zu erleben, und diese Chips mit niedrigen Span-zu-Variabilität in erforderlich, um die Bedürfnisse der kleinen und großen Mengen hergestellt werden Forschungsgruppen gleichermaßen. Der Workflow ist ein Batch oder Fließband Format zugänglich und ohne weiteres kompatibel mit Qualität Bewertung Protokolle für die Steuerung von Produktionsprozessen, Personalschulung und reaktionsschnelle Problembehandlung. Wir hoffen, dass dieses Protokoll, Zugriff auf die Funktionen des dual-Channel, dehnbar, Orgel-Chips für Grundlagen- und Translationale Forschung erweitern.

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Protocol

1. allgemeine Vorbereitung

  1. Zur Vermeidung von Schmutz reinigen Sie Arbeitsbereich mit Klebeband und wischen Sie mit Reinraum wischen und Isopropyl-Alkohol.
  2. Mischen Sie für alle Schritte erfordern PDMS PDMS im Verhältnis 10:1 (10 g Vernetzung Agent, 100 g von Elastomer-Basis). Mischen von hand oder mit einem handelsüblichen Mixer. Verwenden Sie eine zentrifugale Planetenmischer hier: Mischen für 2 Minuten bei 2000 u/min, dann die PDMS für 2 Minuten bei 2200 u/min Entgasung.
  3. Reinigen Sie alle Formen mit Druckluftpistole Ausblasen von Schmutz vor dem Gebrauch.
    Vorsicht: Verwenden Sie keine Metall Pinzetten, um Ablagerungen zu entfernen, da es die Oberfläche der Werkzeuge beschädigen wird.

2. Top Channel Vorbereitung

  1. Wischen Sie die Glanzseite des jeweiligen Polyurethan mit Ethanol und Reinraum-Tücher. Stellen Sie sicher, dass alle restlichen Ethanol aus Polyurethan Oberfläche trocken ist.
  2. Platzieren Sie die Glanzseite des Polyurethans über die offene Seite des die MiP-Form, um eine Abdichtung auf der offenen Seite der Form, so dass nur eine gut-wie-Öffnung am oberen Rand der Form zum Gießen PDMS zu schaffen.
    Hinweis: Überprüfen Sie, dass jede Form von Polyurethan Stück sicher abgedeckt ist oder der PDMS aus Formen beim Gießen Leckage wird.
  3. Legen Sie die Schimmel und Polyurethan Baugruppen in eine MiP-Vorrichtung, mit der strukturierten Seite gegen das Ende der MiP Jig. Weiter, dies zu tun, bis alle Formen in der Spannvorrichtung platziert wurden.
  4. Ziehen Sie die MiP-Vorrichtung durch Drehen des Griffs mit einem Schraubenschlüssel, bis der Jig Abstand 25 mm in der Breite ist.
  5. Machen Sie ein Boot aus Aluminiumfolie, die rund um die MiP-Jig verhindern, dass überschüssiges PDMS auf Oberflächen undicht.
  6. Gut bis zur vollständigen Gießen Sie PDMS in jede der Formen.
    Hinweis: Jeder Chip oberste Komponente erfordert ca. 3 mL PDMS.
  7. Sobald die gesamte Vorrichtung gefüllt ist, legen Sie die Vorrichtung in das Vakuum Exsikkator. Ziehen Sie Vakuum bei-80 kPa 1 h zu PDMS zu entgasen.
  8. Entfernen Sie nach 1 h die MiP-Gigue aus der Exsikkator und im 60 ° C Ofen für mindestens 4 h PDMS zu heilen.
  9. Zerlegen die MiP-Vorrichtung mit einem Schraubenschlüssel, lösen Sie die Vorrichtung durch Drehen am Griff gegen den Uhrzeigersinn. Entfernen Sie Schimmelpilze sind frei von Kompression, Schimmel von Jig.
  10. Die Polyurethan-Streifen aus jeder Form entfernen und entsorgen.
  11. Sorgfältig de-Schimmel PDMS Teile aus ihren Formen und Feature-Seite nach oben legen.
  12. Richten Sie die Klinge der Fliese Schaber am Ende Registerkarte Kerbe, und schneiden Sie jedes Ende um strangförmige Top-Komponenten.
  13. Überprüfen Sie Teile für eines der folgenden Fehlermodi und verwerfen alle unbefriedigend Teile: Kratzer in den Hauptkanal, großen Trümmer über dem Kanal Bereich große Luftblasen vakuumkanäle verformt.
  14. Fertigteile in quadratische Petrischalen in positive Schränke Druck bei Zimmertemperatur aufbewahren.

(3) untere Kanal Vorbereitung

  1. Ca. 10,5 g PDMS in Formen zu gießen, bis die PDMS die Spitze des Hohlraums erreicht.
    1. Überprüfen Sie die unteren Kanal Form für PDMS auf den Boden der Form geheilt.
    2. Wenn schmutzig, kratzen Sie alte PDMS von der Unterseite der Form da eine unebene Fläche auf der Unterseite der Form ungleiche Stärke der letzten Teile führen kann.
      Hinweis: für kleine < 2 cm2 Bereiche aufgedeckt, die Air Gun können sehr vorsichtig verwendet werden, um PDMS über den Raum zu bewegen.
  2. Legen Sie Schimmel in Vakuum Exsikkator für 1 h.
  3. Nach 1 h, bewegen die Formen in einer Ebene 60 ° C Ofen für > 4 h.
  4. Legen Sie die Form auf Tisch in Laminar-Flow-Haube. Lösen Sie PDMS von einem Rand der Form.
  5. Greifen Sie einer Ecke und ziehen Sie vorsichtig die PDMS aus der Werkzeugoberfläche.
  6. Wenn vollständig entfernt, lag auf Arbeitsfläche, so dass Kanal Funktionen aufgedeckt sind.
  7. Schnittteile entlang der Außenkanten mit FLIESENSCHNEIDEMASCHINEN, Fliesen Schneidmesser in gekerbten PDMS wie in Schritt 2.12 platzieren.
  8. Legen Sie Teile Eigenschaft Seite nach oben auf Band, alle Ablagerungen zu entfernen.
  9. Entfernen Sie Teil von Klebeband. Ziehen Sie das lose Ende des Bauteils über der Folie. Das lose Ende wird mit dem Glas Laminat.
    Hinweis: Es ist wichtig zu vermeiden, Dehnung der Teil während zur Festlegung. Wenn Blase zwischen Rahmen und Glas gefangen ist, sanft heben Sie den Teil mit der Zange und neu legen.
  10. Führen Sie Qualitätskontrolle der Teile. Überprüfen Sie Teile für alle Ausfallarten und entsorgen Sie unbefriedigend Teile, darunter auch solche, die Kratzer in den Hauptkanal, großen Trümmer, große Luftblasen oder deformierte vakuumkanäle enthalten.
  11. Funktionen mit Klebeband abdecken.
  12. Teile in ein positiver Druck Kabinett bei Raumtemperatur aufbewahren.

4. PDMS-Membran-Vorbereitung

  1. Überprüfen Sie, dass die Wafer PDMS auf der Rückseite sind.
  2. Platzieren Sie jede Membran-Wafer in die dafür vorgesehenen Schlitze in die AMF-Fächer.
  3. Verwenden Sie 1 mL Spritze um 0,09 mL PDMS in die Mitte des jedes Membran Wafer Post Array platzieren. PDMS für ein Minimum von 5 min erlauben PDMS, verteilt sich auf die Beiträge des Wafers Membran sitzen zu lassen.
    Hinweis: Fahren Sie mit nächsten Schritt bis mindestens 75 % der Post-Array in PDMS bedeckt ist. Es verbessert die Qualität der Membranen, je länger die PDMS in Post Region Docht, so dass längere Wartezeiten in diesem Schritt bevorzugt werden darf.
  4. Plasma behandeln die Polycarbonat-Streifen bei 20 W für 45 s, O2 Gas bei 0,80 Mbar in einer plasmamaschine.
  5. Entfernen Sie die Polycarbonat-Blatt aus dem Plasma-Gerät und mit einer Schere die Polycarbonat-Platten in 45 x 45 mm Quadrate schneiden.
    Hinweis: Minimieren Sie Kontakt mit dem Plasma behandelten Oberfläche zu verhindern, dass Staub das Festhalten an dem Polycarbonat.
  6. Legen Sie sanft die Plasma behandelt Seite der Polycarbonat-Plätze auf dem flüssigen PDMS zentriert auf dem Membran-Wafer. Sicherstellen Sie, dass das Polycarbonat und dem PDMS in Kontakt stehen.
    Hinweis: Vermeiden Sie Luftblasen zwischen Polycarbonat und dem PDMS.
  7. Legen Sie die vorgeschnittenen PDMS-Abstandhalter in der Mitte des Platzes Polycarbonat.
  8. Legen Sie die vorgeschnittenen strukturierte Polycarbonat-Blatt auf dem PDMS-Block, die Versammlung von Verklebung auf die Kompression Platte zu halten.
  9. Setzen Sie die Schale, so dass Fach 3 auf der Rückseite ist Fach 2 in der Mitte ist und Fach 1 auf der Vorderseite ist. Fach 1 hat eine Kerbe für die Ausrichtung.
  10. Öffnen Sie das Ausgabe-Druckventil und öffnen Sie sehr langsam das Ventil Eingangsdruck. Erst dann schließen Sie das Ausgabe-Druckventil.
    Hinweis: Dies ist, so dass der Ausgang 4 kg Kraft allmählich angewendet wird, um jede Membran Wafer im Gegensatz zu sofort, welche die Wafer brechen kann.
  11. Drehen Sie den AMF-Schalter auf ON um den aushärtezyklus zu beginnen. Wafer unter 4 kg (16 kPa) Kompression und eine Rampen Temperatur-Zyklus in Tabelle 1aufgeführten zu heilen.
Schritt Temperatur (° C) Dauer (min.)
1 20 20
2 35 10
3 45 10
4 50 60
5 60 120
6 20 Halten

Tabelle 1 - Membran härtungsbedingungen

  1. Schließen Sie das Ventil Eingangsdruck und öffnen Sie das Ausgabe-Druck-Ventil um Druck aus dem Zylinder entweichen.
  2. Entfernen Sie die Fächer und bringt sie zu der Laminar-Flow-Haube.
  3. Das strukturierte Polycarbonat ziehen Sie sorgfältig ab und entfernen Sie vorsichtig die PDMS-Abstandhalter.
    Hinweis: Sehen Sie die PDMS-Abstandhalter um sicherzustellen, dass es der Polycarbonat-Träger auch nicht abziehen in diesem Fall Start peeling aus einer anderen Ecke.
    1. Überprüfen der PDMS-Membran durch die Polycarbonat-Träger für Bereiche mit Durchgangsbohrungen und verwenden Sie einen Stift zeichnen den Umriss des Bereichs durch-Loch und markieren Sie alle mögliche Löcher oder Mängel in den Membranen.
    2. Lösen Sie Wafer handling Zange verwenden, Wafer aus der Schale.
    3. Entfernen Sie jede Membran aus dem Wafer und legen in der Petrischale.
      Hinweis: Die PDMS-Membran wird de-Formen aus dem Membran-Wafer und das Polycarbonat sichern eingehalten werden. Wenn PDMS aus dem Polycarbonat-Träger abnehmen beginnt, schälen Sie sich aus einer anderen Region.
    4. Lagern Sie Membranen und Wafern in Petrischalen in ein positiver Druck Kabinett bei Raumtemperatur.

5. top Montage und Vorbereitung

  1. Mit mattem Klebeband, reinigen Sie die PDMS-Membranen als auch die Innenseiten der Petrischale, Ablagerungen zu entfernen.
  2. Gründlich mit Klebeband der Feature-Seite der einzelnen Top Komponenten, Ablagerungen zu entfernen.
  3. Top-Channel Teil ("Top") Funktion Seite nach oben in Petrischale mit PDMS Membran zu platzieren.
    Hinweis: Beachten Sie, dass einige Membranen für ein oder zwei Oberteile je nach Größe der Nutzfläche verwendet werden dürfen. Die Hauptkanäle jedes Oberteil sollten in den markierten Bereich der Membran passen.
  4. Laden Sie die Petrischalen in das Plasma-Gerät.
  5. Plasma behandeln Membran und Top 20 W 45 s, O2 Gas bei 0,80 Mbar.
  6. Sobald die Verklebung Zyklen beendet wurde, entfernen Sie die Gerichte und legen Sie die aktivierten Teile Feature-Seite oben auf die Membran und sicherzustellen Sie, dass Teil ist komplett laminiert mit Membran ohne Blasen.
  7. Legen Sie die Teile in 60 ° C Ofen für mindestens 2 h zu Tempern.
  8. Mit einem Skalpell, Umfahren Sie den Umfang der verklebten Top, Top-Membran-Einheit aus dem Polycarbonat-Träger zu trennen.
    Hinweis: Schneiden Sie den Träger nicht.
  9. Sobald das Teil verfolgt wird, ziehen Sie die Assembly aus dem Polycarbonat. Die PDMS-Membran, die an der Spitze verbunden ist sollte vom Träger schälen.
  10. Mit scharfen Spitzen Pinzette, entfernen Sie die Membran aus den Häfen, die den unteren Kanal zugreifen, und entfernen Sie Schmutz oder Staub mit der Pinzette unter ein Stereoskop.
    Hinweis: Lassen Sie keinen Teil der Membran, die den Zugang Port.

6. Chip-Montage

  1. Verfügen Sie Seite nach oben, Plasma Treat Baugruppen mit unteren Komponenten mit den Bedingungen in Schritt 5.5.
  2. Richten Sie unter einem inversen Mikroskop die oberste Baugruppe mit Mikroskop-Objektträger nach unten halb.
  3. Legen Sie im 60 ° C Ofen für mindestens 2 h.
  4. Chip-Qualitätskontrolle
    Hinweis: Achten Sie genau auf die wichtigsten Häfen und Kanal von Chip. Überprüfen Sie Versagensarten von Auge und auch unter dem Mikroskop.
    1. Um zu überprüfen, dass der Chip vollständig gebunden ist, ziehen Sie leicht an jeder Ecke des Chips für bohrungseintritt Teile zu überprüfen.
    2. Blick auf den Kanal des Chips für eine faltige oder schlaffe Membran zu überprüfen als ein Wellenmuster oder eine Lichtablenkung im Kanal angezeigt wird.
    3. Durchzuführen Sie eine Mikroskop-Inspektion auf Verunreinigungen im Hauptkanal inspizieren.
      Hinweis: Die Trümmer in unkritischen Bereichen wie die vakuumkanäle ist akzeptabel.
    4. Überprüfen Sie mit dem Chip noch auf den inversen Mikroskop Hauptkanal und vakuumkanäle für Delamination.
      Hinweis: Delamination in unkritischen Bereichen (z. B. den Rand des Chips) ist akzeptabel.
    5. Überprüfen Sie, dass die wichtigsten Kanäle innerhalb von 50-60 µm (1-2 Membranporen) ausgerichtet sind.
      Anmerkung: Es ist wichtig, dass die Kanäle nicht mit vakuumkanäle überlappen.
    6. Überprüfen Sie, dass die Membran zwischen die Hauptkanäle und den Einlass und Auslass-Kanäle ohne scheinbare Löcher intakt ist.
      Hinweis: Jedes Loch in der Membran führen zu einer undichten Chip oder Zellwachstum außerhalb der Kanäle.
  5. Speicher-chips in Petrischalen in einen Schrank bei Raumtemperatur Überdruck.

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Representative Results

Die hier vorgestellten Protokoll beschreibt die skalierbare Fertigung von PDMS-Orgel-Chips. Diese Geräte ermöglichen Kultur von zwei unterschiedlichen PERFUNDIERTEN Gewebetypen auf eine elastische poröse Membran (Abbildung 1). Die PDMS-Kanäle mit 3D gedruckten Formen, beschleunigt die Prototypen der neuen Designs (Abb. 2A und 2 b) gegossen. Top-Kanäle werden gegossen, in Formen unter Druck gegen eine konforme Polyurethan-Dichtung, Komponenten mit geformten Ports (Abbildung 2) zu produzieren, während die unteren Kanal Komponenten in Schalen gegossen und auf Objektträger sichern (Abb. 2D) behandelt. Diese Herstellung Ansatz kombiniert Multi-Skalen-Musterung der Teile in einem einzigen Schritt, das spart Zeit und verbessert die Reproduzierbarkeit und Nachvollziehbarkeit reduziert Ablagerungen erzeugt durch Port Stanzen und mehrere schneiden Schritte. Die porösen Membranen sind entscheidend für die Funktion des Orgel-Chips und die Herstellung Ansatz basierend auf casting gegen gemusterte Silizium-Wafer Ergebnisse in den Membranen der gleichmäßige Dicke und Oberflächengüte (Abbildung 3). Abwicklung über Polycarbonat Träger ermöglicht größere Batchproduktion und Lagerung.

Die montierten Orgel-Chip (Abbildung 4) besteht aus zwei Perfusion Kanälen in einer optisch transparenten Verpackung. In den überlappenden Bereich ermöglicht eine poröse Membran PDMS Gewebe Gewebe Interaktion von Metaboliten, Proteine, Therapeutik, Krankheitserregern und Zellen zu Chip Organfunktion zu rekapitulieren, während zwei parallele Kanäle auf beiden Seiten verwendet werden, um mechanische bieten Belastung mit zyklischen Vakuum Betätigung. Die Porosität des PDMS Membran biomimetisch unterstützt das Flussmittel von Metaboliten, Wachstumsfaktoren und sogar Zellen zwischen Gefäßsystem und Orgel Parenchym (Abbildung 5). Die scheinbare Durchlässigkeit (Papp, cm/s) der Membran wurde unter Verwendung die Farbstoff-Konzentration in den Outlet-Kanälen mit und ohne Caco2 Darm Zellen bestimmt. Die Darm-Chip Zellschichten stellen eine deutlich erhöhte Barriere Durchlässigkeit. Die Orgel-Chip kann mit der parallelen vakuumkanäle quantitativ und reproduzierbar zyklische Belastung auf der Membran und damit die kultivierten Gewebe (Abbildung 6) Laden anwenden betätigt werden. Diese zyklische Belastung verbunden mit Medien Perfusion unterstützt zellulare Unterscheidung um in Vivo Orgel Physiologie, wie z. B. Bildung von Villi in den Darm-Chip besser nachahmen.

Figure 2
Abbildung 2 : Kanal-Herstellung mit 3D gedruckt Formen. Orgel sind-Chip Gussteilen gegen hochauflösende 3D gedruckten Formen (A und B), ermöglicht eine größere Gestaltungsvielfalt und Prototyping als traditionelle weiche Lithographie. Top-Channel-Teile (C) sind unter Kompression, wodurch die Notwendigkeit zum Stanzen von Häfen in der Fertigteile geheilt. Jede dreifacher Casting ist vereinzelt mit einem einzigen Schnitt. Kanal-Unterteile (D) befinden sich auf Objektträgern, Benutzerfreundlichkeit und Bildgebung zu erleichtern. Maßstabsleisten sind ca. 1 cm in allen Bildern. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Die poröse Membran PDMS ist gegossen mit DRIE gemustert Silizium-Wafer. (A) Darstellung von 7 µm Durchmesser, 50 µm groß Micropillars mit DRIE in einem Silizium-Wafer geätzt. (B) PDMS ist auf diesem Array unter 4 kg Kompression (16 kPa) geheilt, Erstellen einer 50 µm dicken Membran mit einer Reihe von 7 µm Durchmesser, obwohl Löcher hexagonal 40 µm voneinander beabstandet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : Foto von einem montierten PDMS Orgel Chip. Roter Farbstoff füllt die größere apikalen Kanal für parenchymal Zellen verwendet, während der blaue Farbstoff der basalen typischerweise zum Gefäßendothels senderhighlights. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 : Durchlässigkeit der inerten Tracer Cascade blau durch die mikroporöse PDMS Membran. Kaskade blau hydrazid Farbstoff in Medium wurde in die Top-Channel von der Orgel-Chip geladen und bei 60 µL/h messen das Flussmittel des Farbstoffs durch die Membran in den unteren Kanal mit Medium durchströmt. Leere Chips waren im Vergleich zu Darm-Chips mit Caco2-BBe1 Zellen in der apikalen Kanal und menschlichen vascular endothelial Zellen (HUVECS) in den basalen Kanal für 6 Tage kultiviert. Fehlerbalken zeigen Standardfehler des Mittelwerts. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6 : Anwendung der Membran Belastung mit Vakuum Seitenarmen. Plot zeigt lineare Belastung Modulation der Membran als Reaktion auf ein Vakuum Druck. Zyklische einachsiger Belastung gilt einheitlich für Kultur und Umgebung der Orgel-Chip mit angewandten Vakuum parallel Seitenarmen. Der Stamm korreliert linear mit abnehmender Vakuumdruck bei ca. 1 % Dehnung für jede Veränderung-10 kPa Unterdruck (R2 = 0.992). Fehlerbalken zeigen Standardabweichung des Mittelwerts. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Zusatzmaterialien: Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Der Fertigungsprozess verlässt sich auf hochauflösenden 3D gedruckten Formen Muster die PDMS oben und unten Orgel Chip Karosserieteile mit Micromolded porösen PDMS Membranen gekoppelt. Dieser kritische Ansatz wählte Prototyping kombiniert mit raschen Übergang in skalierten, Herstellung und Austausch der Werkzeuge erleichtern soll. Die oberste Komponente Formen sollen Muster Häfen in genauen Standorte mit definierten vertikalen Profilen während der Casting-Schritt. Dies vermeidet nicht nur die Arbeit manuell Stanzen Zugangsports beteiligt, sondern reduziert auch Schmutz am Arbeitsplatz ermöglicht reproduzierbare Port Ausrichtung Schnittstelle Verteiler oder Instrumentierung, und produziert Teile mit Kontrolle über die Passform und Abdichtung des eingefügt Schläuche oder Pins für fluidische und pneumatische Anschlüsse. In einer Kompression Jig, getrennt durch konforme Polyurethan Blätter durch-Loch Gießen von Häfen zu erleichtern sind die Formen übereinander gestapelt. Durch das Stapeln mehrerer Teile in einem einzigen Jig, kann ein einzelner Benutzer große Mengen an Komponenten komplett mit Häfen in einem einzigen Schritt gewirkt. Auswahl der Materialien und Herstellungsverfahren für die Formen sind entscheidend für die notwendiges Merkmal Auflösung, geringe Oberflächenrauheit und hohe Ebenheit für Gerätemontage und anschließende imaging-Anwendungen zur Verfügung zu stellen. Stereolithographie kann diese Anforderungen erfüllen, auch wenn Materialien mit hoher Auslenkung Temperaturen (> 80 ° C) und Kompatibilität mit PDMS Aushärtung Bereich verfügbaren Polymer reduziert. Verschiedene handelsübliche Harze, einschließlich Glas gefüllten Harzen, erfüllen diese Kriterien.

Elastische poröse PDMS-Membran ist wohl die einzigartigsten und kritische Komponente eines Organs Chips während der komplexesten zu fabrizieren. Ein tief reaktive Ionen ätzt (DRIE) Prozess an einen Anbieter ausgelagert wird verwendet, um Microfabricate 50 x 50 mm Sechskant Arrays von Säulen (7 µm Durchmesser, Abstand 40 µm, 50 µm groß, C4F8 beschichtet), die verwendet werden, um die Poren in der Membran PDMS Muster. Die Qualität der Säule Arrays ist entscheidend für die Erreichung der robuste Membran Gießen. Insbesondere müssen Säulen geätzt werden, mit engen Toleranzen mit glatten vertikalen Profilen zu vermeiden Hinterschneidungen oder übermäßige Seitenwand Rauheit, die zum Scheitern zu Schimmel führen kann. Darauf sollte geachtet werden, um zu vermeiden, "Begrünung" am unteren Rand der geätzten Region, die Membran Entformung beeinflussen können und Zellhaftung. Membran-Fertigung mit erfolgreichen Durchgangsbohrung Musterung und Gerät Integration ist die einzigen komplexeste Abschnitt des Protokolls. Kritisch, gilt jeder Wafer 0,09 mL PDMS Inverkehrbringen und damit ausreichend Zeit für sie, zu verbreiten, unvollständig Durchgang Formteil zu vermeiden. Richtig ist Plasma behandelt das Polycarbonat Sicherung erforderlich, um robuste Unterstützung der Membran für die Entformung und Verklebung Schritte ohne Faltenbildung oder Strecken zu erreichen. Unterstützung bietet ein robustes Mittel zur Entformung der Besetzung Membran aus dem empfindlichen Siliziumwafer.

Die Druckbelastung auf jedem Wafer aufgebracht ist auch wichtig für die einheitliche Durchgangsbohrung Fertigung. Frühere Bemühungen mit Gewichten Membran Produktion behindert und schlechte Erträge durch ungleichmäßige Kräfteverteilung ergeben. Um die Produktion Engpass zu überwinden, wir optimiert die bisher veröffentlichten Membran Herstellung Protokoll18 und bauten eine automatisierte Membran Verarbeiter (AMF) um den Vorgang zu parallelisieren. Die AMF besteht aus 24 pneumatischen Kolben über eine programmierbare Herdplatte zu kontrollierten Druckkraft während einer programmierten PDMS Härtungsprozess unterstützt. Eine Polycarbonat Trägerfolie wird auf die noch nicht ausgehärteten PDMS gelegt und dann gleichmäßig komprimiert mit pneumatischen Kolben der AMF während erhitzt die PDMS polymerisieren. Wichtig ist es, die allmähliche Aushärtung in der Protokoll-Ergebnisse in höherer Qualität Membranen als einem einzigen Schritt auf die maximale Temperatur, wo Randschärfe Muster aus Entwicklung während der Aushärtung Blase beschrieben Prozess wurden beobachtet. Zwar optional, steigt die AMF Durchsatz deutlich über das hinaus, was möglich mit Gewichten in einem Ofen.

Fehlerbehebung der daraus resultierenden Orgel-Chips erfolgt auf zwei Ebenen: während der Fertigung und während Orgel Chip Kultur. Wir haben eine visuelle Methode zur Qualitätssicherung (QS) der Durchgangsbohrung Formation in der Besetzung Membranen entwickelt, die den Produktionsprozess stark beschleunigt, während Verbesserung der Qualität und Zuverlässigkeit der Orgel Chips montiert. Diese QS-Methode ermöglicht das Verfahren zur Problembehandlung, und wir empfehlen Aufzeichnungen über Prozessbedingungen Tracking Fertigung ermöglichen Probleme, die auftreten, während der Zellkultur. Während Orgel Chip Kultur sind inert Tracer Farbstoffe die einfachste Methode zur Messung der Barrierefunktion, um den Fertigungsprozess zu beheben und Zell-Kultur Schritte. Luzifer gelbe historisch aufgrund seiner kleinen Molekülmasse und angeborene Fluoreszenz verwendet wurde, aber blaue Kaskade bietet ähnliche Eigenschaften mit einer schmaleren Emissionsspektrum, das weniger mit nachgeschalteten Assays stören dürfte. Größere Moleküle, wie Poly-Ethylenglykol (PEG)- oder Dextran konjugiert Fluorophore sind größer und somit insgesamt geringere Permeabilität führen und Empfindlichkeit zu senken. Die scheinbare Durchlässigkeit (Papp, cm/s) der Tracer Farbstoffe kann zur Funktion Barriereeigenschaften von Organen oder Geweben (Abbildung 4) herangezogen werden. Die folgende Gleichung kann verwendet werden, um zwischen der Dosierung und empfangenden Kanal Papp berechnen und in erster Linie für Transwell Studien19,20 verwendeten Gleichungen abgeleitet ist und korrigiert für Tracer Farbstoff Verlust durch den Vergleich der zwei Ausgabe-Flows und nicht unter Berufung auf Massenbilanz Annahmen am Ausfluss verursacht durch Absorption in PDMS.

Equation 1

VR ist das Volumen in mL Kanal Abwasser nach der Zeit tzu erhalten; VD ist das Volumen in mL Dosierung Kanal Abwasser nach der Zeit t; A ist der Bereich der Membran durch-Loch Region cm2 (0,167 cm2 für dieses Gerät); t ist die Zeit des Abwasser-Sammlung in Sekunden; CR ist die gemessene Konzentration des Farbstoffs Tracer im empfangenden Kanal Abwasser; CD ist die gemessene Konzentration des Farbstoffs Tracer in der Dosierung Kanal Abwasser. Wichtige Annahmen für diese Gleichung gültig sein gehören: (1) stabile Tracer färben Dosierung Konzentration über Zeit t(2) die Konzentration von Cr ist klein im Vergleich zu Cdund (3) die Durchlässigkeit des Systems wird gleichmäßig verteilt in der Kultur-Region. Obwohl diese Gleichung für statische Systeme verwendet werden kann, muss darauf geachtet werden, zu prüfen, ob die Annahmen zutreffen. Elektrische Methoden, einschließlich der Trans-epithelialen elektrischen Widerstand (TEER) werden häufig in Transwell Studien umgesetzt und wurden vor kurzem in PDMS Orgel Chips für sofortigen und kontinuierlichen Barriere-Funktion-Messungen sowie21 aufgenommen ,22.

Einschränkungen dieses Protokolls umfassen die Elastizität des PDMS sowie den manuellen Gießen und Montage-Prozess, der Produktionsraten begrenzt. PDMS ist ein vielseitiges Polymer, das für Orgel Chips erfordern mechanische Beanspruchung Betätigung gut geeignet ist, aber seine Elastizität kann Produktion behindern. Teile können schwierig zu handhaben ohne Verformung und Membranen erfordern Filme für die Manipulation zu sichern. Automatisierung der Orgel Chip-Produktion kann dadurch eingeschränkt werden. Die Casting-Prozess, im Gegensatz zu Heißprägen oder Spritzguss für thermoplastische Polymere verwendet Batch basiert und daher auch Durchsatz begrenzt.

Orgel-Chips ermöglichen in-vitro- Studien des menschlichen Organ - und Körper-Level Funktionen in Vivo durch die Vorrichtung eines gemeinsamen Mediums durch die vaskulären Kanäle. Durch Neuaufbau physiologischen Gewebe Gewebe Schnittstellen, Fluss von Molekülen zwischen den Gefäß- und parenchymatösen Fächer, mechanische Signale und fluidische scher- und Transport, diese Geräte fördern Histodifferentiation und sind in der Lage, die Rekapitulation in Vivo-Funktionen von normalen und kranken Organen wie. Die Abschottung der Gewebe und Flüssigkeiten in zwei Fächern imitiert ihre in Vivo -Funktionen und Orgel Chip Studien sind offen für Zeitaufgelöste pharmakokinetischen Experimente sowie Modellierung und in Vitro-in vivo Hochrechnung9,10 ist schwierig oder unmöglich Einkanal MPS14,15,16. Die Microchannel-Strukturen können genutzt werden, für andere Anwendungen, einschließlich der Untersuchung der Auswirkungen dynamischer Tabakrauch Exposition mit bidirektionalen Atmung in der kleinen Atemwege Epithel, neue Biomarker der Lunge Schaden23zu entwickeln. Die definierten Positionen der planaren Membranen und hohe optische Klarheit der Geräte machen sie einzigartig für Image-basierte Analysen und Integration von integrierten Sensoren geeignet. Die mechanische Stimulation aktiviert durch integrierte vakuumkanäle und gummielastischen Materialien bietet Funktionalitäten in Transwell Systemen nicht möglich. Wir haben gezeigt, dass die mechanischer Belastung für Reprise bestimmter in Vivo physiologische Funktionen, einschließlich Nanopartikel Aufnahme in der Lunge4, Lungenödem3 und Differenzierung der Reifen entscheidend iPS-abgeleiteten glomerulären Podocytes8.

Zukünftige Anwendungen dieses Protokolls können Integration von verschiedenen Sensoren Modalitäten enthalten, die zur Bereitstellung von Echtzeit-Messwerte der Orgel Chip Reaktion auf Reize wie Drogen, Giftstoffen oder Strahlung. Die hier vorgestellten Protokoll könnte nicht PDMS-Materialien mit unterschiedlichen optischen, mechanischen und chemischen Eigenschaften, einschließlich biologisch abbaubaren Materialien erweitert werden. Die Orgel Chip-Protokoll hier vorgestellten sollen Forscher Geräte herzustellen, die bieten ein hohes Maß an Kontrolle über die Mikroumgebung von gesunden und pathophysiologische Geweben und Organen, die für die therapeutische Entwicklung genutzt werden können, einschließlich Zielen auf Entdeckung, Toxizität und pharmakokinetischen Bewertungen, sowie für die personalisierte Medizin.

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Disclosures

D.E.I. ist einer der Gründer und hält Eigenkapital in emulieren, Inc., und leitet den wissenschaftlichen Beirat. J.P ist derzeit Angestellter emulieren, Inc. R.N, Y.C, J.P., und D.E.I. sind Erfinder auf geistiges Eigentum, das zu emulieren, Inc. lizenziert wurde

Acknowledgments

Wir danken M. Rousseau und S. Kroll für Hilfe mit Fotografie und Videografie und M. Ingram, J. Nguyen, D. Shea und N. Wen für Beiträge zur ersten Herstellung Protokollentwicklung. Diese Forschung wurde gesponsert von Wyss-Institut für biologisch inspirierte Engineering an der Harvard University und der Defense Advanced Research Projects Agency unter Cooperative Agreements #W911NF-12-2-0036 und #W911NF-16-C-0050 und FDA gewähren # HHSF223201310079C, NIH gewährt #R01-EB020004 und #UG3-HL141797-01, und Bill und Melinda Gates-Stiftung gewährt #OPP1163237 und #OPP1173198 DEI. Ansichten und Schlussfolgerungen in diesem Dokument enthaltenen sind diejenigen der Autoren und nicht als Vertreter der offiziellen Politik, entweder ausdrücklich oder stillschweigend von der Defense Advanced Research Projects Agency, Food and Drug Administration, interpretiert werden die Nationale Institute der Gesundheit, oder die US-Regierung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Personal Protective Equipment
Hairnet VWR 89107-770
Tyvek lab coat VWR 13450-506
Extended cuff gloves VWR 89521-898
Equipment
Cutting mat VWR 102096-430
Tile cutter McMaster-Carr 26765A31
Mold-in-place (MIP) top molds Protolabs, Inc. custom printed in Prototherm 12120
Mold-in-place (MIP) bottom molds Protolabs, Inc. custom printed in Prototherm 12121
Duckbill curved forceps VWR 63041-864
Sharp tipped forceps Electron Microscopy Sciences 72700-D
Metal spatula VWR  82027-528
Deep reactive ion etch (DRIE)  pillar array wafers Sensera, Inc. custom Four 50 x 50 mm pillar arrays per wafer; pillars 7 um wide, 50 um tall, spaced hexagonally 40 um apart
Textured polycarbonate .01” thick McMaster-Carr 85585K33 cut to 45 mm square
PDMS blocks (40 x 40 x 5 mm) n/a custom
Laminar flow hood Germfree BVBI cast in-house
Air gun
60°C level oven
Vacuum desiccator
Mass balance accuracy to 0.1 g
Plasma machine Diener Nano oxygen plasma capability is critical
Supplies
Sylgard 184 poly (dimethylsiloxane) (PDMS) base/curing agent kit Ellsworth Adhesives  4019862
Mixing cup Ensure adequate ventilation when handling prepolymer due to low levels of ethylbenzene
1 mL syringe VWR 10099-395
Cleanroom wipes VWR TWTX1080
25 x 75 mm glass microscope slides VWR 48311-703
Packing tape VWR 500043-724
Scotch tape VWR 500026-873
Die-cut Polyurethane (PU) strips Atlantic Gasket, Inc. custom: AGWI2X3  1/8” thick; 60 Durometer Black Polyurethane; 2” x 3”
Polycarbonate film .005” thick McMaster-Carr 85585K102
100 x 100 x 15 mm square gridded petri dishes VWR 60872-480
 Aluminum foil
Optional Equipment
Thinky PDMS Mixer Thinky ARE-310
Mold-in place (MIP) jig in-house screw clamp compression jig
Automated membrane fabricator (AMF) in-house pneumatic compression piston array with programmable heater

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References

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  20. Henry, O. Y. F., et al. Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function. Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).
  21. Maoz, B. M., et al. Organs-on-Chips with combined multi-electrode array and transepithelial electrical resistance measurement capabilities. Lab on a Chip. 17 (13), 2294-2302 (2017).
  22. Benam, K. H., et al. Matched-Comparative Modeling of Normal and Diseased Human Airway Responses Using a Microengineered Breathing Lung Chip. Cell Systems. 3 (5), 456-466 (2016).

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Biotechnik Ausgabe 140 Orgel-on-a-Chip Microphysiological System Mikrofluidik mikrofabrikation PDMS poröse Membran Perfusion Microchannel zyklische Belastung

Erratum

Formal Correction: Erratum: Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips
Posted by JoVE Editors on 05/08/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips.  The Representative Results, Discussion, and References sections have been updated.

In the Representative Results section, the legend for Figure 5 has been updated from:

Figure 5: Permeability of inert tracer Cascade Blue through the microporous PDMS membrane. Cascade Blue hydrazide dye in medium was loaded into the top channel of the Organ Chip and perfused at 60 µL/h to measure the flux of the dye across the membrane into the bottom channel containing medium. Empty chips were compared to Gut Chips with Caco2-BBe1 cells in the apical channel and human vascular endothelial cells (HUVEC) in the basal channel cultured for 6 days. Error bars indicate standard error of the mean.

to:

Figure 5: Permeability of inert tracer Cascade Blue through the microporous PDMS membrane. Cascade Blue hydrazide dye in medium was loaded into the top channel of the Organ Chip and perfused at 60 µl/h to measure the flux of the dye across the membrane into the bottom channel containing medium. Empty chips were compared to Gut Chips with Caco2-BBe1 cells in the apical channel and human vascular endothelial cells (HUVEC) in the basal channel cultured for 6 days. The apparent permeability (Papp, cm/s) of the microporous PDMS membrane was determined using the dye concentration in the outlet channels. The gut chip cell layers provide a significantly increased barrier to permeability. Error bars indicate standard error of the mean. 

In the Discussion section, the fourth paragraph has been updated from:

Troubleshooting the resulting Organ Chips takes place at two levels: during the fabrication process and during Organ Chip culture. We have developed a visual method for quality assurance (QA) of through-hole formation in the cast membranes that greatly accelerates the production process while improving the quality and reliability of assembled Organ Chips. This QA method allows for process troubleshooting, and we recommend keeping a record of process conditions to enable tracking fabrication problems that may occur during cell culture. During Organ Chip culture, inert tracer dyes are the simplest method of measuring barrier function to troubleshoot the fabrication process and cell culture steps. Lucifer Yellow has been used historically due to its small molecular mass and innate fluorescence, but Cascade Blue offers similar properties with a narrower emission spectrum that is less likely to interfere with downstream assays. Larger molecules, such as poly-ethyleneglycol (PEG)- or dextran-conjugated fluorophores are larger and consequently result in lower permeability overall and lower sensitivity. The apparent permeability (Papp, cm/s) of tracer dyes can be used to determine barrier function properties of organs or tissues (Figure 4). The following equation can be used to calculate Papp between the dosing channel and receiving channel and is derived from equations used primarily for Transwell studies19,20 and corrects for tracer dye loss caused by absorption into PDMS by comparing the two output flows and not relying on mass balance assumptions at the outflow.

Equation 1

to:

Troubleshooting the resulting Organ Chips takes place at two levels: during the fabrication process and during Organ Chip culture. We have developed a visual method for quality assurance (QA) of through-hole formation in the cast membranes that greatly accelerates the production process while improving the quality and reliability of assembled Organ Chips. This QA method allows for process troubleshooting, and we recommend keeping a record of process conditions to enable tracking fabrication problems that may occur during cell culture. During Organ Chip culture, inert tracer dyes are the simplest method of measuring barrier function to troubleshoot the fabrication process and cell culture steps. Lucifer Yellow has been used historically due to its small molecular mass and innate fluorescence, but Cascade Blue offers similar properties with a narrower emission spectrum that is less likely to interfere with downstream assays. Larger molecules, such as poly-ethyleneglycol (PEG)- or dextran-conjugated fluorophores are larger and consequently result in lower permeability overall and lower sensitivity. The apparent permeability (Papp, cm/s) of tracer dyes can be used to determine barrier function properties of organs or tissues (Figure 5). The following equation derived by Tran, et al.19 can be used to calculate Papp between the dosing channel and receiving channel, which partially corrects for tracer dye loss caused by absorption into PDMS by averaging the two output flows and not relying on mass balance assumptions at the outflow.

Equation 1

The References section has been updated from:

  1. Blaser, D.W. Determination of drug absorption parameters in Caco-2 cell monolayers with a mathematical model encompassing passive diffusion, carrier-mediated efflux, non-specific binding and phase II metabolism. at <http://edoc.unibas.ch/655/1/DissB_7998.pdf> (2007).
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  3. Henry, O.Y.F. et al. Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function. Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).
  4. Maoz, B.M. et al. Organs-on-Chips with combined multi-electrode array and transepithelial electrical resistance measurement capabilities. Lab on a Chip. 17 (13), 2294-2302 (2017).
  5. Benam, K.H. et al. Matched-Comparative Modeling of Normal and Diseased Human Airway Responses Using a Microengineered Breathing Lung Chip. Cell Systems. 3 (5), 456-466.e4 (2016).

to:

  1. Tran, T.T. et al. Exact kinetic analysis of passive transport across a polarized confluent MDCK cell monolayer modeled as a single barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 93 (8), 2108–2123 (2004).
  2. Henry, O.Y.F. et al. Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function. Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).
  3. Maoz, B.M. et al. Organs-on-Chips with combined multi-electrode array and transepithelial electrical resistance measurement capabilities. Lab on a Chip. 17 (13), 2294-2302 (2017).
  4. Benam, K.H. et al. Matched-Comparative Modeling of Normal and Diseased Human Airway Responses Using a Microengineered Breathing Lung Chip. Cell Systems. 3 (5), 456-466.e4 (2016).
Skalierbare Fertigung von dehnbar, Dual Channel, mikrofluidischen Orgel Chips
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Cite this Article

Novak, R., Didier, M., Calamari, E., More

Novak, R., Didier, M., Calamari, E., Ng, C. F., Choe, Y., Clauson, S. L., Nestor, B. A., Puerta, J., Fleming, R., Firoozinezhad, S. J., Ingber, D. E. Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips. J. Vis. Exp. (140), e58151, doi:10.3791/58151 (2018).

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