ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल है कि recapitulating अंग स्तर की कार्यक्षमता के लिए इन विट्रो मेंखिंचाव, दोहरी चैनल, अंग चिप microfluidic सेल संस्कृति उपकरणों के निर्माण का वर्णन करता है पेश करते हैं ।
Abstract
क्योंकि पशु अध्ययन अक्सर मानव रोगियों में नैदानिक प्रतिक्रियाओं की भविष्यवाणी करने में विफल सीसा यौगिकों की एक महत्वपूर्ण संख्या दवा पाइपलाइन में विफल । मानव अंग पर एक चिप (अंग चिप) microfluidic सेल संस्कृति उपकरणों, जो इन विट्रो मंच प्रभावकारिता, विषाक्तता का आकलन करने के लिए प्रदान करता है, और pharmacokinetic (PK) मनुष्यों में प्रोफाइल, चिकित्सकीय प्रभावकारिता के बेहतर अनुमान लगाने वाले हो सकता है और पशु अध्ययन की तुलना में क्लिनिक में सुरक्षा. इन उपकरणों के लिए वस्तुतः किसी भी अंग प्रकार के समारोह मॉडल और fluidically आम endothelium के माध्यम से जोड़ा जा सकता है लाइन microchannels के लिए मानव अंग स्तर और पूरे शरीर स्तर शरीर क्रिया विज्ञान पर इन विट्रो अध्ययन में प्रदर्शन किया जा सकता है लोगों पर प्रयोगों का संचालन । ये अंग चिप्स दो perfused microfluidic एक तरफ अंग विशिष्ट parenchymal कोशिकाओं के साथ एक पारगंय elastomeric झिल्ली से अलग चैनलों से मिलकर बनता है और दूसरे पर microvascular endothelium, जो चक्रीय प्रदान करने के लिए बढ़ाया जा सकता है अंग-विशिष्ट यांत्रिक cues (जैसे, फेफड़ों में गति श्वास) । इस प्रोटोकॉल 3 डी मुद्रित molds का उपयोग भागों के कास्टिंग के माध्यम से लचीला, दोहरी चैनल, अंग चिप्स के निर्माण का ब्यौरा, कई कास्टिंग और पोस्ट प्रसंस्करण कदम के संयोजन को सक्षम करने से । छिद्रित पाली (dimethyl siloxane) (PDMS) झिल्ली संपीड़न के तहत सिलिकॉन स्तंभ सरणियों का उपयोग कर छेद के माध्यम से आकार माइक्रोमीटर के साथ डाली जाती है । निर्माण और अंग चिप्स के विधानसभा उपकरण और कदम है कि एक पारंपरिक cleanroom के बाहर लागू किया जा सकता है शामिल है । इस प्रोटोकॉल में इन विट्रो अंग के लिए अंग चिप प्रौद्योगिकी के लिए उपयोग के साथ शोधकर्ताओं प्रदान करता है-और शरीर के ड्रग डिस्कवरी, सुरक्षा और प्रभावकारिता परीक्षण में स्तर के अध्ययन, साथ ही मौलिक जैविक प्रक्रियाओं के यंत्रवत अध्ययन.
Introduction
यहां, हम दोहरे चैनल के निर्माण का वर्णन, शरीर पर एक-चिप (अंग चिप) microfluidic संस्कृति अनुसंधान cleanrooms और पारंपरिक नरम लिथोग्राफी उपकरण के लिए उपयोग कमी समूहों द्वारा उपयोग के लिए उत्तरदायी एक स्केलेबल प्रोटोकॉल का उपयोग कर. इन उपकरणों को सामान्य और रोग फिजियोलॉजी को समझने के लिए मानव अंग-स्तर के कार्यों को दोहराऊंगा करने के लिए विकसित किया गया है, साथ ही इन विट्रो मेंदवा प्रतिक्रियाओं1,2. इंजीनियरिंग के लिए महत्वपूर्ण इस कार्यशीलता दो perfused microfluidic एक अर्द्ध पारगंय झिल्ली (चित्रा 1) द्वारा अलग चैनल हैं । यह डिजाइन ऊतकों के कम से दो प्रकार के बीच ऊतक ऊतक इंटरफेस का मनोरंजन सक्षम बनाता है, आमतौर पर अंग parenchymal कोशिकाओं को एक तरफ छिद्रित झिल्ली और संवहनी endothelium के दूसरे पर, साथ ही द्रव प्रवाह के लिए अपने जोखिम. इसके अलावा, क्योंकि elastomeric बहुलक, पाली (dimethyl siloxane) (PDMS), अंग चिप शरीर और झिल्ली घटकों, चक्रीय यांत्रिक तनाव के निर्माण के लिए प्रयोग किया जाता है पूरे इंजीनियर ऊतक के लिए लागू किया जा सकता है-लोचदार के माध्यम से ऊतक इंटरफेस झिल्ली फेफड़ों और आंत में क्रमाकुंचन में श्वास गति के रूप में रहने वाले अंगों के प्राकृतिक शारीरिक microenvironment की नकल करने के लिए ।
चित्रा 1: अंग चिप क्रॉस सेक्शन । अंग चिप्स दोनों पक्षों पर कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त किया जा सकता है कि एक असुरक्षित, लोचदार झिल्ली से अलग दो चैनलों से मिलकर बनता है । शीर्ष चैनल क्रॉस वर्गों 1 मिमी चौड़े x 1 मिमी उच्च हैं, नीचे चैनल क्रॉस वर्गों 1 मिमी चौड़े x ०.२ मिमी उच्च हैं, और दोनों और नीचे भागों में निर्वात चैनल ०.३ मिमी चौड़ा, ०.५ मिमी उच्च, और द्रव चैनलों से स्थान ०.३ मिमी हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
इन स्केलेबल, दोहरी चैनल, अंग चिप्स फेफड़े और दवा प्रेरित फुफ्फुसीय शोफ3,4में nanoparticle अवशोषण पर गति श्वास के प्रभाव का प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है; 5,6,7और आंत में भेदभाव5 और बैक्टीरियल वृद्धि पर सिकुड़नेवाला गति के प्रभाव; और गुर्दे8में भेदभाव और glomerular podocytes की परिपक्वता पर हृदय की धड़कन के कारण चक्रीय विकृति के प्रभाव । साथ ही, इन दो-लुमेन डिवाइस जिनमें एक endothelium-पंक्तिबद्ध संवहनी चैनल एक extracellular मैट्रिक्स (ECM) से अलग-लेपित झिल्ली parenchymal कोशिकाओं से एक अलग से सुलभ चैनल के भीतर दवा PK के लक्षण वर्णन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं पैरामीटर और नए लक्ष्य डिस्कवरी, जो एकल छिड़काव चैनल सिस्टम में सीमित किया गया है । इसके अलावा, कई अंग चिप्स एक साथ उनके संवहनी चैनल के माध्यम से जोड़ा जा सकता है प्रभावी रूप से एक मानव शरीर बनाने के लिए-on-चिप्स, जो इन विट्रो मंच में उपचारात्मक विकास9के लिए एक आकर्षक मानव की पेशकश कर सकता है, 10. सबसे सूक्ष्म शारीरिक प्रणालियों के विपरीत (सांसदों)11,12,13, अंग चिप्स दो microfluidic एक छिद्रित झिल्ली कि संवहनी parenchymal बातचीत की सुविधा से अलग चैनल होते है vivo अंग फंक्शन में दोहराऊंगा । यह न केवल विभिंन अंगों को जोड़ने के एक साथ संवहनी चैनलों के माध्यम से एक आम माध्यम perfusing द्वारा, लेकिन ऊतकों और तरल पदार्थ की compartmentalization vivo कार्यों में नकल और pharmacokinetic प्रयोग का समर्थन करता है और मॉडलिंग के रूप में अच्छी तरह के रूप में के रूप में इन विट्रोमें-vivo एक्सट्रपलेशन9,10 कि एकल चैनल सांसदों में मुश्किल या असंभव है14,15,16. microfluidic उपकरणों में PDMS की लोकप्रियता उपकरणों के विकास के लिए है सामग्री निहित करने के लिए छोटे अणुओं को अवशोषित करने की क्षमता को दूर करने के लिए नेतृत्व किया गया है10,17. हालांकि, चिप्स की बड़ी संख्या जैविक अध्ययन का समर्थन करने के लिए आवश्यक है जहां माइक्रोबियल एजेंटों और PDMS-अवशोषित यौगिकों का उपयोग अंग चिप्स का पुनः प्रयोग मुश्किल छोटे अनुसंधान समूहों के लिए भी एक स्केलेबल विनिर्माण प्रक्रिया आवश्यक । प्रोटोकॉल यहां वर्णित उपकरण निर्माण के लिए एक विधि प्रस्तुत शैक्षणिक प्रयोगशालाओं में उपयोग के लिए उपयुक्त, cleanrooms और शीतल लिथोग्राफी के लिए उन कमी का उपयोग भी शामिल है । इस प्रोटोकॉल के लिए मूल जैविक प्रक्रियाओं के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अनुवाद चिकित्सीय विकास की खोज के लिए विस्तृत, दोहरे चैनल उपकरणों का उपयोग करने की मांग शोधकर्ताओं की एक विस्तृत रेंज द्वारा अंग चिप्स के लिए उपयोग व्यापक करना है ।
विनिर्माण के लिए डिजाइन के साथ युग्मित micromanufacturing क्षेत्रों से सर्वोत्तम प्रथाओं का इस्तेमाल, एक मजबूत दृष्टिकोण उच्च reproducibility और उपज के साथ बड़ी मात्रा में अंग चिप उपकरणों के निर्माण के लिए विकसित किया गया था । निर्माण प्रोटोकॉल यहां वर्णित अंग चिप उत्पादन के लिए एक स्केलेबल विधि प्रदान करता है । हम एक वैकल्पिक मोल्ड में जगह जिग के उपयोग का वर्णन (MiP; पूरक सामग्रीमें डिजाइन विवरण) के साथ युग्मित गैसकेट स्ट्रिप्स कास्टिंग PDMS घटकों के ऊपर स्केलिंग को सक्षम करने के लिए । टुकड़े स्ट्रिप्स के चमकदार पक्ष ऑप्टिकली चिकनी PDMS भागों का उत्पादन करते हुए textured पक्ष को ढाल की सुविधा । हम भी बैच प्रति 24 झिल्ली के निर्माण के लिए इलाज के दौरान झिल्ली वेफर मोल्ड के समान संपीड़न प्रदान करता है कि एक वैकल्पिक स्वचालित झिल्ली किर (AMF) के उपयोग का वर्णन । डिजाइन मोटे तौर पर कि ऊतकों का अनुभव है कि यांत्रिक तनाव और छिड़काव से बना रहे हैं अंगों के अध्ययन के लिए लागू है, और इन चिप्स छोटे और बड़े की जरूरतों को पूरा करने के लिए आवश्यक मात्रा में कम चिप के लिए चिप परिवर्तनशीलता के साथ उत्पादन किया जा सकता अनुसंधान समूह एक जैसे । कार्यप्रवाह एक बैच या असेंबली लाइन स्वरूप के लिए उत्तरदायी है, और उत्पादन प्रक्रियाओं, कार्मिक प्रशिक्षण, और उत्तरदायी समस्या निवारण के नियंत्रण के लिए गुणवत्ता मूल्यांकन प्रोटोकॉल के साथ आसानी से संगत. हमें उंमीद है कि इस प्रोटोकॉल दोहरी चैनल की क्षमताओं के उपयोग का विस्तार होगा, स्केलेबल, बुनियादी और शोधों अनुसंधान के लिए अंग चिप्स ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. सामान्य तैयारी
- मलबे से बचने के लिए, स्वच्छ कार्य क्षेत्र टेप पैकिंग और एक cleanroom पोंछ और isopropyl शराब के साथ नीचे क्षेत्र पोंछ का उपयोग ।
- PDMS की आवश्यकता होती है सभी चरणों के लिए, एक 10:1 अनुपात (क्रॉस जोड़ने एजेंट, elastomer बेस के १०० g के 10 ग्राम) पर PDMS मिश्रण । हाथ से या एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मिक्सर के साथ मिश्रण । यहां एक ग्रहों केंद्रापसारक मिक्सर का प्रयोग करें: २००० rpm पर 2 मिनट के लिए मिश्रण है, तो २२०० rpm पर 2 मिनट के लिए PDMS degassing ।
- हवा बंदूक के साथ सभी मोल्ड साफ करने के लिए उपयोग करने से पहले मलबे बाहर उड़ा ।
सावधानी: मलबे को हटाने के लिए मेटल संदंश का इस्तेमाल न करें क्योंकि इससे मोल्ड्स की सतह को नुकसान होगा ।
2. शीर्ष चैनल की तैयारी
- इथेनॉल और cleanroom पोंछे के साथ एक टुकड़ा टुकड़े के चमकदार पक्ष नीचे पोंछ । सुनिश्चित करें कि सभी अवशिष्ट इथेनॉल के टुकड़े सतह से सूख गया है ।
- MiP मोल्ड के खुले पक्ष पर एक टुकड़े के चमकदार पक्ष प्लेस मोल्ड के खुले पक्ष पर एक मुहर बनाने के लिए, केवल एक अच्छी तरह से छोड़ने PDMS डालने के लिए मोल्ड के शीर्ष पर जैसे खोलने ।
नोट: जांच करें कि हर सांचे में ढालना सुरक्षित रूप से कवर किया जाता है टुकड़े या PDMS डालने के दौरान molds से रिसाव होगा । - एक MiP जिग में मोल्ड और टुकड़े विधानसभाओं प्लेस, MiP जिग के अंत के खिलाफ textured पक्ष के साथ । यह करने के लिए जारी रखें जब तक सभी मोल्ड जिग में रखा गया है ।
- जिग रिक्ति चौड़ाई में 25 मिमी है जब तक एक रिंच का उपयोग कर संभाल मोड़ द्वारा MiP जिग कस ।
- MiP जिग आसपास एल्यूमीनियम पंनी की एक नाव बनाओ सतहों पर लीक से अधिक PDMS को रोकने के लिए ।
- मोल्ड के प्रत्येक में अच्छी तरह से पूरा जब तक PDMS डालो ।
नोट: प्रत्येक चिप शीर्ष घटक PDMS के बारे में 3 मिलीलीटर की आवश्यकता है । - एक बार पूरा जिग भर जाए तो जिग को वैक्यूम desiccator में लगाएं । पुल निर्वात पर-८० केपीए 1 ज के लिए degas PDMS.
- 1 ज के बाद, desiccator से MiP जिग को हटा दें और ६० ° c ओवन में जगह के लिए PDMS इलाज के लिए कम से 4 ज ।
- एक रिंच का उपयोग कर MiP जिग जुदा, संभाल काउंटर दक्षिणावर्त मोड़ द्वारा जिग ढीला । एक बार molds संपीड़न से मुक्त हैं, जिग से मोल्ड हटा दें ।
- प्रत्येक सांचे से टुकड़े स्ट्रिप्स निकालें और त्यागें ।
- ध्यान से de-मोल्ड उनके मोल्ड से भागों PDMS और उंहें सुविधा-साइड अप करना ।
- अंत टैब पायदान पर टाइल खुरचनी के ब्लेड अप लाइन और प्रत्येक के अंत में कटौती करने के लिए शीर्ष घटकों singulate ।
- किसी भी निम्न विफलता मोड के लिए भागों की जाँच करें और किसी भी असंतोषजनक भागों को छोड़ दें: मुख्य चैनल में खरोंच, चैनल क्षेत्र के ऊपर बड़ा मलबा, बड़े बुलबुले, विकृत निर्वात चैनल.
- कमरे के तापमान पर दबाव सकारात्मक अलमारियां के भीतर स्क्वायर पेट्री व्यंजन में समाप्त भागों की दुकान ।
3. नीचे चैनल तैयारी
- PDMS के लगभग १०.५ ग्राम मोल्ड्स में डालो जब तक PDMS गुहा के ऊपर पहुंचता है ।
- मोल्ड के नीचे करने के लिए ठीक PDMS के लिए नीचे चैनल मोल्ड निरीक्षण ।
- यदि गंदे, मोल्ड के तल से पुराने PDMS स्क्रैप मोल्ड के तल पर एक असमान सतह के बाद से अंतिम भागों की असमान मोटाई पैदा कर सकता है ।
नोट: खुला है छोटे < 2 cm2 क्षेत्रों के लिए, हवा बंदूक अंतरिक्ष पर PDMS स्थानांतरित करने के लिए बहुत धीरे से इस्तेमाल किया जा सकता है ।
- 1 घंटे के लिए वैक्यूम desiccator में मोल्ड प्लेस ।
- 1 घंटे के बाद, एक स्तर ६० डिग्री सेल्सियस ओवन > 4 एच के लिए मोल्ड्स ले जाएं ।
- लामिना फ्लो हूड में मेज पर मोल्ड प्लेस । मोल्ड के एक किनारे से PDMS को ढीला कर दीजिये ।
- पकड़ एक कोने और धीरे मोल्ड सतह से PDMS वापस छील ।
- जब पूरी तरह से हटा दिया, काम की सतह पर रखना है, ताकि चैनल सुविधाओं का सामना कर रहे हैं ।
- टाइल कटर के साथ किनारों के बाहर के साथ भागों में कटौती, चरण २.१२ में के रूप में पायदान PDMS में टाइल कटर ब्लेड रखकर ।
- किसी भी मलबे को हटाने के लिए टेप पर भागों सुविधा पक्ष रखना ।
- टेप पैकिंग से भाग निकालें । स्लाइड में भाग के ढीले सिरे को खींचें । ढीला अंत कांच के साथ टुकड़े करना होगा ।
नोट: यह हिस्सा खींच से बचने के लिए महत्वपूर्ण है, जबकि यह बिछाने नीचे। यदि बुलबुला भाग और कांच के बीच फंस गया है, धीरे संदंश और फिर से रखना के साथ भाग उठा । - भागों की गुणवत्ता नियंत्रण निरीक्षण करते हैं । किसी भी विफलता मोड के लिए भागों की जाँच करें और मुख्य चैनल, बड़े मलबे, बड़े बुलबुले, या विकृत निर्वात चैनलों में खरोंच शामिल हैं कि लोगों सहित किसी भी असंतोषजनक भागों, त्यागें ।
- टेप के साथ कवर सुविधाओं ।
- कमरे के तापमान पर एक सकारात्मक दबाव कैबिनेट में भागों की दुकान ।
4. PDMS झिल्ली की तैयारी
- जांच लें कि वेफर्स की पीठ पर PDMS से मुक्त हैं ।
- AMF ट्रे में निर्दिष्ट स्लॉट में प्रत्येक झिल्ली वेफर प्लेस ।
- 1 मिलीलीटर सिरिंज प्रत्येक झिल्ली वेफर पोस्ट सरणी के केंद्र पर PDMS के ०.०९ मिलीलीटर जगह का प्रयोग करें । चलो PDMS 5 मिनट की एक ंयूनतम के लिए बैठने के लिए PDMS झिल्ली वेफर के पदों भर में फैल अनुमति देते हैं ।
नोट: करने के लिए अगले चरण के लिए आगे नहीं जब तक कम से ७५% पोस्ट सरणी के PDMS में शामिल है । झिल्ली की गुणवत्ता में सुधार अब PDMS पद क्षेत्र में बाती की अनुमति दी है अब इस चरण में प्रतीक्षा बार पसंद कर रहे हैं । - प्लाज्मा एक प्लाज्मा मशीन में ०.८० mbar में ४५ एस, ओ2 गैस के लिए 20 डब्ल्यू में पाली कार्बोनेट पट्टी का इलाज ।
- प्लाज्मा मशीन से कार्बोनेट शीट निकालें और ४५ mm x ४५ mm चौकों में पाली कार्बोनेट शीट काटने के लिए कैंची का उपयोग करें ।
नोट: प्लाज्मा इलाज सतह के साथ संपर्क को कम करने के लिए पाली कार्बोनेट से चिपके से धूल को रोकने के । - धीरे से झिल्ली वेफर पर केंद्रित तरल PDMS पर पाली कार्बोनेट वर्गों के प्लाज्मा इलाज करना । सुनिश्चित करें कि पाली कार्बोनेट और PDMS संपर्क में हैं ।
नोट: पाली कार्बोनेट और PDMS के बीच हवा जेब से बचें । - पूर्व से ही कट PDMS स्पेसर को पाली कार्बोनेट चौक के केंद्र पर रखें ।
- PDMS ब्लॉक पर पूर्व में काट textured कार्बोनेट शीट प्लेस संपीड़न प्लेट को बांडिंग से विधानसभा रखने के लिए ।
- ट्रे संमिलित करें ताकि ट्रे 3 वापस, ट्रे 2 में है बीच में है, और ट्रे 1 सामने है । ट्रे 1 संरेखण के लिए एक पायदान है ।
- आउटपुट दबाव वाल्व खोलें और बहुत धीरे से इनपुट दबाव वाल्व खुला । तभी उत्पादन दबाव वाल्व बंद ।
नोट: यह इतना है कि बल के उत्पादन 4 किलो धीरे से प्रत्येक झिल्ली वेफर के रूप में तुरन्त करने के लिए लागू किया जाता है, जो वेफर्स टूट सकता है । - AMF स्विच फ्लिप पर इलाज चक्र शुरू करने के लिए । संपीड़न और 1 तालिकामें सूचीबद्ध एक रैंप तापमान चक्र के 4 किलो (16 केपीए) के तहत वेफर इलाज ।
| चरण | तापमान (° c) | अवधि (min) |
| 1 | 20 | 20 |
| 2 | ३५ | 10 |
| 3 | ४५ | 10 |
| 4 | ५० | ६० |
| 5 | ६० | १२० |
| 6 | 20 | पकड़ |
तालिका 1-झिल्ली इलाज की स्थिति
- इनपुट दबाव वाल्व बंद करो और हवा सिलेंडरों से दबाव जारी करने के लिए उत्पादन दबाव वाल्व खुला ।
- ट्रे निकालें और उंहें लामिना फ्लो हूड के लिए ले आओ ।
- ध्यान से textured पाली कार्बोनेट छील और ध्यान से PDMS स्पेसर हटा दें ।
नोट: यह एक अलग कोने से छीलने शुरू होता है अगर यह होता है, यह भी बंद पॉलीस वाहक छील नहीं करता है यह सुनिश्चित करने के लिए PDMS स्पेसर देखो ।- के माध्यम से छेद के साथ क्षेत्रों के लिए पाली कार्बोनेट वाहक के माध्यम से PDMS झिल्ली का निरीक्षण और के माध्यम से छेद क्षेत्र की रूपरेखा का पता लगाने और झिल्ली में किसी भी छेद या दोषों को चिह्नित करने के लिए एक मार्कर का उपयोग करें ।
- वेफर हैंडलिंग संदंश का उपयोग करना, ट्रे से वेफर्स को ढीला करना ।
- पेट्री डिश में वेफर और जगह से प्रत्येक झिल्ली को हटा दें ।
नोट: PDMS झिल्ली झिल्ली वेफर से de-मोल्ड होगा और पाली कार्बोनेट समर्थन करने के लिए पालन किया जाएगा । यदि PDMS पाली कार्बोनेट वाहक से अलग शुरू होता है, एक दूसरे क्षेत्र से छील । - कमरे के तापमान पर एक सकारात्मक दबाव कैबिनेट में पेट्री व्यंजन में झिल्ली और वेफर्स की दुकान ।
5. शीर्ष विधानसभा और तैयारी
- मैट टेप का इस्तेमाल करने से PDMS की झिल्ली साफ हो जाती है साथ ही मलबे को हटाने के लिए पेट्री डिश का दुष्परिणाम भी होता है ।
- मलबे को हटाने के लिए प्रत्येक शीर्ष घटक के सुविधा पक्ष को अच्छी तरह से टेप करें ।
- PDMS झिल्ली के साथ पेट्री डिश में शीर्ष चैनल हिस्सा ("शीर्ष") सुविधा की ओर रखें ।
नोट: ध्यान रखें कि कुछ झिल्ली प्रयोग करने योग्य क्षेत्र के आकार के आधार पर एक या दो शीर्ष भागों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । प्रत्येक शीर्ष भाग के मुख्य चैनल झिल्ली के चिह्नित क्षेत्र के भीतर फिट होना चाहिए । - प्लाज्मा मशीन में पेट्री व्यंजन लोड ।
- प्लाज्मा का इलाज झिल्ली और ४५ एस के लिए 20 डब्ल्यू में शीर्ष, O2 गैस ०.८० mbar पर ।
- बांडिंग चक्र समाप्त हो गया है एक बार, व्यंजन को हटाने और झिल्ली के शीर्ष पर नीचे सक्रिय भागों सुविधा की ओर रखना और हिस्सा पूरी तरह से कोई बुलबुले के साथ झिल्ली के साथ फाड़ा हुआ है सुनिश्चित करते हैं ।
- ६० डिग्री सेल्सियस ओवन में जगह भागों के लिए कम से 2 एच के लिए ऐनी ।
- एक स्केलपेल का उपयोग करना, के आसपास की परिधि के चारों ओर का पता लगाने के बंधुआ शीर्ष-झिल्ली विधानसभा से अलग करने के लिए पाली कार्बोनेट वाहक ।
नोट: वाहक में कटौती न करें । - एक बार भाग का पता लगाया है, पाली कार्बोनेट से विधानसभा छील । PDMS झिल्ली कि शीर्ष करने के लिए बंधुआ है वाहक से छील चाहिए ।
- तेज इत्तला दे दी संदंश का प्रयोग, नीचे चैनल का उपयोग है कि बंदरगाहों से झिल्ली को हटा दें, और एक stereoscope के तहत संदंश के साथ किसी भी मलबे या धूल हटा दें ।
नोट: पहुंच पोर्ट को कवर झिल्ली के किसी भी भाग मत छोड़ो ।
6. चिप विधानसभा
- सुविधा ओर ऊपर, प्लाज्मा इलाज विधानसभाओं नीचे कदम ५.५ में शर्तों का उपयोग घटकों के साथ ।
- एक औंधा माइक्रोस्कोप के तहत, नीचे आधा करने के लिए माइक्रोस्कोप स्लाइड के साथ शीर्ष विधानसभा संरेखित करें ।
- ६० डिग्री सेल्सियस ओवन में प्लेस के लिए कम से 2 ज ।
- चिप गुणवत्ता नियंत्रण निरीक्षण
नोट: मुख्य बंदरगाहों और चिप के चैनल के लिए करीब ध्यान देना । आँख से विफलता मोड के लिए और भी माइक्रोस्कोप के नीचे की जाँच करें ।- जांच करने के लिए कि चिप पूरी तरह से बंधुआ है, चिप के प्रत्येक कोने पर हल्के से रस्साकशी भागों को फाड़ने के लिए जांच करने के लिए ।
- एक शिकन या डूबती हुई झिल्ली के लिए जांच करने के लिए चिप के चैनल को देखो, जो एक लहरदार पैटर्न या चैनल में एक प्रकाश झुकाव के रूप में दिखाई देगा ।
- मुख्य चैनल में मलबे के लिए निरीक्षण करने के लिए एक खुर्दबीन निरीक्षण करते हैं ।
नोट: गैर महत्वपूर्ण क्षेत्रों में मलबे, जैसे निर्वात चैनल स्वीकार्य है । - उल्टे माइक्रोस्कोप पर अभी भी चिप के साथ, फाड़ना के लिए मुख्य चैनल और निर्वात चैनलों का निरीक्षण किया.
नोट: गैर महत्वपूर्ण क्षेत्रों में फाड़ना (उदाहरण के लिए, चिप के किनारे) स्वीकार्य है । - जांच करें कि मुख्य चैनल 50-60 µm (1-2 झिल्ली pores) के भीतर गठबंधन कर रहे हैं ।
नोट: यह महत्वपूर्ण है कि चैनलों निर्वात चैनलों के साथ अतिव्यापी नहीं कर रहे हैं । - जांच करें कि मुख्य चैनलों और प्रवेश और आउटलेट चैनलों के बीच झिल्ली किसी भी स्पष्ट छेद के बिना बरकरार है ।
नोट: झिल्ली में छेद किसी भी चैनल के बाहर एक टपका हुआ चिप या कोशिका विकास के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।
- कमरे के तापमान पर एक सकारात्मक दबाव कैबिनेट में पेट्री व्यंजन में चिप्स की दुकान ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल PDMS अंग चिप्स के स्केलेबल निर्माण का वर्णन करता है । इन उपकरणों के एक लोचदार छिद्रित झिल्ली पर दो अलग perfused ऊतक प्रकार की संस्कृति को सक्षम (चित्रा 1) । PDMS चैनल 3 डी मुद्रित molds, जो नए डिजाइनों के प्रोटोटाइप (चित्रा 2a और b बी) में बढ़ौतरी का उपयोग कर डाली हैं । शीर्ष चैनल molds में एक अनुरूप टुकड़े पाल बांधने की रस्सी के खिलाफ संपीड़न के तहत सांचे में ढालना बंदरगाहों (चित्रा 2c) के साथ घटकों का उत्पादन कर रहे हैं, जबकि नीचे चैनल घटकों ट्रे में डाली और माइक्रोस्कोप स्लाइड समर्थन (चित्रा 2d) पर संभाल रहे हैं । इस निर्माण दृष्टिकोण एक ही कदम है, जो समय बचाता है, reproducibility और ट्रेसिंग में सुधार, और बंदरगाह छिद्रण और कई काटने चरणों द्वारा उत्पन्न मलबे को कम कर देता है में भागों की बहु पैमाने पर पैटर्न को जोड़ती है । छिद्रित झिल्ली अंग चिप के समारोह के लिए महत्वपूर्ण हैं, और निर्माण दृष्टिकोण अनुरूप मोटाई और सतह खत्म (चित्रा 3) की झिल्ली में नमूनों सिलिकॉन वेफर्स परिणामों के खिलाफ कास्टिंग पर आधारित है । कार्बोनेट वाहक के माध्यम से हैंडलिंग बड़ा बैच उत्पादन और भंडारण के लिए अनुमति देता है ।
इकट्ठे अंग चिप (चित्रा 4) एक ऑप्टिकली पारदर्शी पैकेज में दो छिड़काव चैनल के होते हैं । अतिव्यापी क्षेत्र में, एक छिद्रित PDMS झिल्ली चयापचयों, प्रोटीन, चिकित्सकीय, रोगजनकों, और दोहराऊंगा अंग चिप समारोह के लिए कोशिकाओं के ऊतक ऊतक बातचीत में सक्षम बनाता है, जबकि दोनों ओर दो समानांतर चैनल यांत्रिक प्रदान करने के लिए उपयोग किया जाता है चक्रीय वैक्यूम actuation का उपयोग कर तनाव । PDMS झिल्ली biomimetically के porosity चयापचयों के प्रवाह का समर्थन करता है, विकास कारकों, और यहां तक कि कोशिकाओं के बीच vasculature और अंग पैरेन्काइमा (चित्रा 5) । स्पष्ट पारगम्यता (पीअनुप्रयोग, मुख्यमंत्री/एस झिल्ली के) के साथ और Caco2 आंत कोशिकाओं के बिना आउटलेट चैनलों में डाई एकाग्रता का उपयोग कर निर्धारित किया गया था । आंत चिप सेल परतों पारगम्यता के लिए एक काफी वृद्धि की बाधा प्रदान करते हैं । अंग चिप समानांतर निर्वात चैनलों का उपयोग मात्रात्मक और reproducibly झिल्ली को चक्रीय तनाव लोड हो रहा है और इसलिए प्रसंस्कृत ऊतकों (चित्रा 6) को लागू किया जा सकता है । इस चक्रीय तनाव मीडिया छिड़काव के साथ संयुक्त सेलुलर भेदभाव का समर्थन करता है बेहतर vivo अंग फिजियोलॉजी में नकल, जैसे आंत चिप में विल्ली के गठन के रूप में ।
चित्रा 2 : 3 डी मुद्रित molds के साथ चैनल निर्माण । अंग चिप भागों उच्च संकल्प 3 डी मुद्रित molds (ए और बी) है, जो अधिक से अधिक डिजाइन बहुमुखी प्रतिभा और पारंपरिक नरम लिथोग्राफी से प्रोटोटाइप के लिए अनुमति देता है के खिलाफ डाली जाती हैं । शीर्ष चैनल भागों (सी) समाप्त भागों में छिद्रण बंदरगाहों के लिए की जरूरत को नष्ट संपीड़न के तहत ठीक हो रहे हैं । प्रत्येक तपसिल कास्टिंग एक सिंगल कट के साथ singulated है । नीचे चैनल भागों (घ) कांच स्लाइड पर रखा के लिए उपयोग और इमेजिंग की आसानी की सुविधा है । स्केल सलाखों के सभी छवियों में लगभग 1 सेमी हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3 : छिद्रित PDMS झिल्ली डरिए नमूनों सिलिकॉन वेफर्स का उपयोग कर डाली है । (क) 7 µm व्यास, ५० µm लंबा micropillars का प्रतिपादन एक सिलिकॉन वेफर में डरिए का उपयोग कर धंसा । (ख) PDMS संपीड़न के 4 किलो के तहत इस सरणी पर ठीक हो जाता है (16 केपीए) 7 µm व्यास की एक सरणी के साथ एक ५० µm मोटी झिल्ली बनाने के लिए हालांकि छेद षट्कोण ४० µm के अलावा अंतरिक्ष । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4 : एक इकट्ठे PDMS अंग चिप की तस्वीर । लाल डाई parenchymal कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया बड़ा शिखर चैनल भरता है, जबकि नीले रंग आमतौर पर संवहनी endothelium के लिए इस्तेमाल किया बेसल चैनल पर प्रकाश डाला गया. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 5 : निष्क्रिय अनुरेखक झरना नीले रंग की पारगम्यता सूक्ष्मदर्शी PDMS झिल्ली के माध्यम से. झरना नीले हयद्रज़ीदे डाई मध्यम में अंग चिप और perfused के शीर्ष चैनल में लोड किया गया था ६० µ एल एच में झिल्ली भर में डाई के प्रवाह को मापने के लिए नीचे के माध्यम से युक्त चैनल में । खाली चिप्स शिखर चैनल और मानव संवहनी endothelial कोशिकाओं में Caco2-BBe1 कोशिकाओं के साथ आंत चिप्स की तुलना में थे (HUVEC) बेसल चैनल में 6 दिनों के लिए संस्कृति । त्रुटि पट्टियां माध्य की मानक त्रुटि इंगित करती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 6 : झिल्ली तनाव वैक्यूम पक्ष चैनलों का उपयोग कर के आवेदन । साजिश एक लागू निर्वात दबाव के जवाब में झिल्ली की रैखिक तनाव मॉडुलन को इंगित करता है । चक्रीय uniaxial तनाव समरूप पक्ष चैनलों के लिए लागू निर्वात का उपयोग अंग चिप की संस्कृति क्षेत्र के लिए समान रूप से लागू किया जाता है । तनाव हर-वैक्यूम दबाव में 10 केपीए परिवर्तन (आर2 = ०.९९२) के लिए लगभग 1% तनाव में वैक्यूम दबाव कम करने के साथ रैखिक सहसंबंधी । त्रुटि पट्टियां माध्य के मानक विचलन का संकेत देती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
पूरक सामग्री: कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
निर्माण प्रक्रिया PDMS शीर्ष और नीचे अंग चिप शरीर micromolded छिद्र PDMS झिल्ली के साथ युग्मित घटकों पैटर्न के लिए उच्च संकल्प 3 डी मुद्रित molds पर निर्भर करता है । इस महत्वपूर्ण दृष्टिकोण में तेजी से संक्रमण के साथ संयुक्त प्रोटोटाइप का निर्माण और टूलींग के प्रतिस्थापन के आसानी के कारण चुना गया था । शीर्ष घटक मोल्ड कास्टिंग कदम के दौरान निर्धारित ऊर्ध्वाधर प्रोफाइल के साथ सटीक स्थानों में पैटर्न बंदरगाहों के लिए डिजाइन किए हैं । यह न केवल में शामिल श्रम से बचने का उपयोग बंदरगाहों छिद्रण लेकिन यह भी कार्यस्थल में मलबे को कम कर देता है, reproducible बंदरगाह संरेखण इंटरफ़ेस manifolds या उपकरण के लिए सक्षम बनाता है, और फिट और डाला की सील पर नियंत्रण के साथ भागों का उत्पादन टयूबिंग या द्रव और वायवीय कनेक्शन के लिए पिन । मोल्ड्स एक संपीड़न जिग में एक दूसरे के शीर्ष पर खड़ी कर रहे हैं, संगत टुकड़े चादरें द्वारा अलग करने के लिए बंदरगाहों के छेद कास्टिंग के माध्यम से सुविधा । एक एकल जिग में एकाधिक भागों स्टैक कर रहा है, किसी एकल उपयोगकर्ता एक ही चरण में पोर्ट के साथ पूर्ण घटकों की बड़ी मात्रा कास्ट कर सकते हैं । सामग्री चयन और विनिर्माण विधि मोल्ड्स के लिए आवश्यक सुविधा का समाधान प्रदान करने के लिए महत्वपूर्ण हैं, कम सतह असहजता, और डिवाइस विधानसभा और बाद में इमेजिंग अनुप्रयोगों के लिए सपाटता के उच्च डिग्री. Stereolithography इन आवश्यकताओं को पूरा कर सकते हैं, हालांकि उच्च विक्षेपन तापमान के साथ सामग्री (> ८० ° c) और PDMS इलाज के साथ संगतता उपलब्ध बहुलक रेंज को कम । कांच से भरे रेजिन सहित विभिन्न व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रेजिन, इन मानदंडों को पूरा ।
लोचदार छिद्रित PDMS झिल्ली यकीनन एक अंग चिप का सबसे अनूठा और महत्वपूर्ण घटक है, जबकि सबसे परिसर के निर्माण के लिए जा रहा है । एक गहरी प्रतिक्रियाशील आयन नक़्क़ाशी (डरिए) एक विक्रेता को आउटसोर्स प्रक्रिया microfabricate ५० x ५० mm खंभों की षट्कोण arrays के लिए प्रयोग किया जाता है (7 µm व्यास, ४० µm अलावा, ५० µm लंबा, सी4एफ8 लेपित) कि पैटर्न के लिए उपयोग किया जाता है PDMS झिल्ली में pores । स्तंभ arrays की गुणवत्ता मजबूत झिल्ली कास्टिंग को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है । विशेष रूप से, स्तंभों चिकनी ऊर्ध्वाधर प्रोफाइल के साथ तंग सहिष्णुता के लिए धंसा किया जाना चाहिए के लिए कटौती या अत्यधिक sidewall किसी न किसी कि मोल्ड विफलता के लिए नेतृत्व कर सकते है से बचने के लिए । देखभाल के लिए धंसा क्षेत्र के तल पर "घास" से बचने के लिए लिया जाना चाहिए, जो झिल्ली को प्रभावित कर सकते है और कोशिका लगाव । सफल माध्यम से झिल्ली निर्माण-होल patterning और डिवाइस एकीकरण प्रोटोकॉल के एकल सबसे जटिल अनुभाग है । गंभीर, प्रत्येक वेफर पर PDMS के ०.०९ मिलीलीटर रखने और यह प्रसार करने के लिए पर्याप्त समय की अनुमति के माध्यम से अधूरा छेद ढलाई से बचने के लिए आवश्यक है । ठीक से प्लाज्मा का इलाज कर रहा है पाली कार्बोनेट का समर्थन के लिए झिल्ली का मजबूत समर्थन को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है और wrinkling या खींच के बिना कदम संबंधों को ढालना । समर्थन नाजुक सिलिकॉन वेफर से कास्ट झिल्ली को ढालना का एक मजबूत साधन प्रदान करता है ।
compression प्रत्येक वेफर के लिए लागू लोड भी वर्दी के माध्यम से छेद निर्माण के लिए आवश्यक है । पहले के प्रयासों का उपयोग भार बाधा झिल्ली उत्पादन और गैर वर्दी बल वितरण के कारण गरीब पैदावार के परिणामस्वरूप । उत्पादन अड़चन को दूर करने के लिए, हम पहले से प्रकाशित झिल्ली निर्माण प्रोटोकॉल18 अनुकूलित और प्रक्रिया parallelize करने के लिए एक स्वचालित झिल्ली किर (AMF) का निर्माण किया । AMF 24 वायवीय पिस्टन के होते है एक प्रोग्राम गर्म थाली पर समर्थित एक क्रमादेशित PDMS इलाज प्रक्रिया में नियंत्रित संपीड़न बल प्रदान करने के लिए । एक पाली कार्बोनेट समर्थन फिल्म uncureed पर रखा गया है और फिर समान रूप से संकुचित AMF के वायवीय पिस्टन का उपयोग करते हुए PDMS polymerize गर्म किया जा रहा है । गंभीर, क्रमिक इलाज प्रक्रिया अधिकतम तापमान के लिए एक कदम से उच्च गुणवत्ता झिल्ली में प्रोटोकॉल परिणामों में वर्णित है, जहां इलाज प्रक्रिया के दौरान बुलबुला विकास से उत्पंन पंख पैटर्न देखा गया । जबकि वैकल्पिक, AMF काफी क्या एक ओवन में वजन का उपयोग कर संभव है परे प्रवाह बढ़ जाती है ।
परिणामी अंग चिप्स समस्या निवारण दो स्तरों पर जगह लेता है: निर्माण की प्रक्रिया के दौरान और अंग चिप संस्कृति के दौरान. हम गुणवत्ता आश्वासन (क्यूए) के माध्यम से कलाकारों की झिल्ली में छेद गठन है कि बहुत उत्पादन की प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए एक दृश्य विधि विकसित की है, जबकि गुणवत्ता और इकट्ठे अंग चिप्स की विश्वसनीयता में सुधार । इस गुणवत्ता आश्वासन विधि प्रक्रिया समस्या निवारण के लिए अनुमति देता है, और हम प्रक्रिया की स्थिति का रिकॉर्ड रखने की सिफारिश को ट्रैकिंग निर्माण समस्याओं है कि सेल संस्कृति के दौरान हो सकता है सक्षम करें । अंग चिप संस्कृति के दौरान, निष्क्रिय अनुरेखक रंजक निर्माण प्रक्रिया और सेल संस्कृति चरणों का निवारण करने के लिए बाधा समारोह को मापने का सरलतम तरीका है. लूसिफ़ेर पीला ऐतिहासिक रूप से अपने छोटे आणविक द्रव्यमान और जन्मजात प्रतिदीप्ति के कारण इस्तेमाल किया गया है, लेकिन झरना नीला एक संकरा उत्सर्जन स्पेक्ट्रम है कि कम बहाव परख के साथ हस्तक्षेप की संभावना है के साथ इसी तरह की संपत्ति प्रदान करता है । बड़े अणुओं, जैसे पाली-ethyleneglycol (खूंटी)-या dextran-संयुग्मित fluorophores बड़े होते हैं और फलस्वरूप कम पारगम्यता समग्र और कम संवेदनशीलता में परिणाम. स्पष्ट पारगम्यता (पीअनुप्रयोग, cm/अनुरेखक रंजक के अंगों या ऊतकों की बाधा समारोह गुण निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता (चित्रा 4). निम्नलिखित समीकरण के लिए खुराक चैनल और प्राप्त चैनल के बीच पीअनुप्रयोग की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और Transwell अध्ययन के लिए मुख्य रूप से इस्तेमाल समीकरणों से व्युत्पंन है19,20 और अनुरेखक डाई नुकसान के लिए सही PDMS में दो उत्पादन प्रवाह की तुलना और बहिर्वाह पर बड़े पैमाने पर संतुलन मांयताओं पर भरोसा नहीं द्वारा अवशोषण की वजह से ।
Vr समय टीके बाद प्राप्त चैनल प्रवाह के एमएल में मात्रा है; Vd समय टीके बाद खुराक चैनल प्रवाह की मिलीलीटर में मात्रा है; एक के माध्यम से झिल्ली का क्षेत्र है-होल क्षेत्र में मुख्यमंत्री2 (०.१६७ cm2 इस डिवाइस के लिए); t सेकंड में प्रवाह संग्रह का समय है; सीआर प्राप्त चैनल प्रवाह में अनुरेखक डाई की एकाग्रता में मापा परिवर्तन है; सीडी खुराक चैनल प्रवाह में अनुरेखक डाई की मापी एकाग्रता है. इस समीकरण के लिए मुख्य मांयताओं के लिए मांय शामिल हैं: 1) संभल अनुरेखक डाई समय पर एकाग्रता खुराक, 2) सीआर की एकाग्रता सीडीकी तुलना में छोटी है, और 3) प्रणाली की पारगम्यता समान रूप से वितरित किया जाता है संस्कृति क्षेत्र के पार । हालांकि इस समीकरण स्थैतिक सिस्टम के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, देखभाल की जांच करने के लिए कि मांयताओं सच पकड़ लिया जाना चाहिए । ट्रांस-उपकला विद्युत प्रतिरोध (तीळ) सहित बिजली के तरीके, आमतौर पर Transwell अध्ययन में कार्यांवित कर रहे है और हाल ही में तत्काल और सतत बाधा समारोह माप के लिए PDMS अंग चिप्स में शामिल किया गया है के रूप में अच्छी तरह से21 ,22.
इस प्रोटोकॉल की सीमाएं PDMS की लोच के साथ ही मैनुअल कास्टिंग और विधानसभा प्रक्रिया है कि उत्पादन दर सीमित शामिल हैं । PDMS यांत्रिक तनाव actuation की आवश्यकता अंग चिप्स के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है कि एक बहुमुखी बहुलक है, लेकिन इसकी लोच उत्पादन में बाधा कर सकते हैं. पार्ट्स विकृति और झिल्ली के बिना संभाल मुश्किल हेरफेर के लिए फिल्मों के समर्थन की आवश्यकता हो सकती है । नतीजतन, अंग चिप उत्पादन के स्वचालन सीमित किया जा सकता है । थर्माप्लास्टिक पॉलिमर के लिए इस्तेमाल किया गर्म उभार या इंजेक्शन मोल्डिंग के विपरीत कास्टिंग प्रक्रिया, बैच आधारित है और इसलिए भी सीमा का प्रवाह है ।
अंग चिप्स में सक्षम इन विट्रो मानव अंग के अध्ययन-और vivo में शरीर स्तर के कार्यों के संवहनी चैनलों के माध्यम से एक आम माध्यम perfusing द्वारा. शारीरिक ऊतक-ऊतक इंटरफेस, संवहनी और parenchymal डिब्बों, यांत्रिक संकेतों, और द्रव कतरनी और परिवहन के बीच अणुओं के प्रवाह का पुनर्गठन करके, इन उपकरणों histodifferentiation को बढ़ावा देने और recapitulating में सक्षम हैं विवो मेंसामान्य और रोगग्रस्त दोनों अंगों के समान कार्य. दो डिब्बों में ऊतकों और तरल पदार्थ की compartmentalization vivo कार्यों में उनकी नकल करते हैं, और अंग चिप अध्ययन समय के लिए उत्तरदायी हैं-हल pharmacokinetic प्रयोग और मॉडलिंग के साथ ही इन विट्रो में-vivo में 9 एक्सट्रपलेशन,10 कि मुश्किल या असंभव है एकल चैनल सांसदों में14,15,16। microchannel संरचनाओं अंय अनुप्रयोगों के लिए leveraged किया जा सकता है, मानव छोटे airway उपकला में द्वि-दिशा श्वास के साथ गतिशील तंबाकू धुआं जोखिम की जांच सहित फेफड़ों के नुकसान23के उपंयास के प्रभाव को विकसित करने के लिए । planar झिल्ली और उपकरणों की उच्च ऑप्टिकल स्पष्टता के परिभाषित पदों उंहें विशिष्ट छवि आधारित विश्लेषण और एंबेडेड सेंसर के एकीकरण के लिए अनुकूल बनाते हैं । एकीकृत निर्वात चैनलों और elastomeric सामग्री द्वारा सक्षम यांत्रिक उत्तेजना Transwell प्रणालियों में संभव नहीं कार्यक्षमताओं प्रदान करता है । हम प्रदर्शन किया है कि यांत्रिक तनाव vivo में कुछ के recapitulation के लिए आवश्यक है शारीरिक कार्यों, फेफड़े4में nanoparticle अवशोषण सहित, फुफ्फुसीय शोफ3 और परिपक्व के भेदभाव आईपीएस-व्युत्पंन glomerular podocytes8।
इस प्रोटोकॉल के भविष्य के अनुप्रयोगों के विभिंन संवेदन विधियों कि दवाओं, विषाक्त पदार्थों, या विकिरण जैसे उत्तेजनाओं के लिए अंग चिप प्रतिक्रिया के वास्तविक समय readouts प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता के एकीकरण शामिल हो सकते हैं । यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल गैर-PDMS सामग्रियों को विभिन्न ऑप्टिकल, यांत्रिक और रासायनिक गुणों, biodegradable सामग्रियों सहित, के साथ विस्तारित किया जा सकता है. यहां प्रस्तुत अंग चिप प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं उपकरणों है कि स्वस्थ और pathophysiologic ऊतकों और अंगों, जो चिकित्सीय विकास के लिए leveraged किया जा सकता है की microenvironment पर नियंत्रण के एक उच्च डिग्री प्रदान करने के लिए सक्षम बनाना चाहिए, सहित लक्ष्य खोज, विषाक्तता और pharmacokinetic आकलन, साथ ही व्यक्तिगत चिकित्सा के लिए.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
D.E.I. एक संस्थापक है और अनुकरण में इक्विटी रखती है, Inc, और अपने वैज्ञानिक सलाहकार बोर्ड कुर्सियों । जेपी वर्तमान में अनुकरण के एक कर्मचारी है, inc R.N., Y.C., जेपी, और D.E.I. बौद्धिक संपदा है कि अनुकरण करने के लिए लाइसेंस प्राप्त किया गया है पर अंवेषकों हैं, inc
Acknowledgments
हम फोटोग्राफी और वीडियोग्राफी और एम. Ingram, जे गुयेन, डी. एक प्रकार का वृक्ष के साथ मदद के लिए एम रूसो और एस Kroll धंयवाद, और एन वेन प्रारंभिक निर्माण प्रोटोकॉल विकास के लिए योगदान के लिए । इस शोध को Wyss संस्थान द्वारा हार्वर्ड विश्वविद्यालय में जैविक रूप से प्रेरित इंजीनियरिंग के लिए प्रायोजित किया गया था और रक्षा उन्नत अनुसंधान परियोजनाएं सहकारी समझौतों के तहत एजेंसी #W911NF-12-2-0036 और #W911NF -16-C-००५०, और एफडीए अनुदान # HHSF223201310079C, NIH अनुदान #R01-EB020004 और #UG3-HL141797-01, और बिल और मेलिंडा गेट्स फाउंडेशन अनुदान #OPP1163237 और #OPP1173198 देई । विचारों और इस दस्तावेज़ में समाहित निष्कर्ष लेखकों के है और सरकारी नीतियों का प्रतिनिधित्व करने के रूप में व्याख्या नहीं की जानी चाहिए, या तो व्यक्त या निहित, रक्षा उंनत अनुसंधान परियोजनाओं एजेंसी, खाद्य और औषधि प्रशासन, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, या अमेरिकी सरकार ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Personal Protective Equipment | |||
| Hairnet | VWR | 89107-770 | |
| Tyvek lab coat | VWR | 13450-506 | |
| Extended cuff gloves | VWR | 89521-898 | |
| Equipment | |||
| Cutting mat | VWR | 102096-430 | |
| Tile cutter | McMaster-Carr | 26765A31 | |
| Mold-in-place (MIP) top molds | Protolabs, Inc. | custom | printed in Prototherm 12120 |
| Mold-in-place (MIP) bottom molds | Protolabs, Inc. | custom | printed in Prototherm 12121 |
| Duckbill curved forceps | VWR | 63041-864 | |
| Sharp tipped forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
| Metal spatula | VWR | 82027-528 | |
| Deep reactive ion etch (DRIE) pillar array wafers | Sensera, Inc. | custom | Four 50 x 50 mm pillar arrays per wafer; pillars 7 um wide, 50 um tall, spaced hexagonally 40 um apart |
| Textured polycarbonate .01” thick | McMaster-Carr | 85585K33 | cut to 45 mm square |
| PDMS blocks (40 x 40 x 5 mm) | n/a | custom | |
| Laminar flow hood | Germfree | BVBI | cast in-house |
| Air gun | |||
| 60°C level oven | |||
| Vacuum desiccator | |||
| Mass balance | accuracy to 0.1 g | ||
| Plasma machine | Diener | Nano | oxygen plasma capability is critical |
| Supplies | |||
| Sylgard 184 poly (dimethylsiloxane) (PDMS) base/curing agent kit | Ellsworth Adhesives | 4019862 | |
| Mixing cup | Ensure adequate ventilation when handling prepolymer due to low levels of ethylbenzene | ||
| 1 mL syringe | VWR | 10099-395 | |
| Cleanroom wipes | VWR | TWTX1080 | |
| 25 x 75 mm glass microscope slides | VWR | 48311-703 | |
| Packing tape | VWR | 500043-724 | |
| Scotch tape | VWR | 500026-873 | |
| Die-cut Polyurethane (PU) strips | Atlantic Gasket, Inc. | custom: AGWI2X3 | 1/8” thick; 60 Durometer Black Polyurethane; 2” x 3” |
| Polycarbonate film .005” thick | McMaster-Carr | 85585K102 | |
| 100 x 100 x 15 mm square gridded petri dishes | VWR | 60872-480 | |
| Aluminum foil | |||
| Optional Equipment | |||
| Thinky PDMS Mixer | Thinky | ARE-310 | |
| Mold-in place (MIP) jig | in-house | screw clamp compression jig | |
| Automated membrane fabricator (AMF) | in-house | pneumatic compression piston array with programmable heater |
References
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Benam, K. H., et al. Engineered In vitro Disease Models. Annual Review of Pathology Mechanisms of Disease. 10 (1), 195-262 (2015).
- Huh, D., et al. A Human Disease Model of Drug Toxicity-Induced Pulmonary Edema in a Lung-on-a-Chip Microdevice. Science Translational Medicine. 4 (159), 159ra147 (2012).
- Huh, D., et al. Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab on a Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).
- Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integrative Biology. 5 (9), 1130-1140 (2013).
- Kim, H. J., Li, H., Collins, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), E7-E15 (2016).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1 (5), s41551-017-0069–017 (2017).
- Somayaji, M. R., Das, D., Przekwas, A. Computational approaches for modeling and analysis of human-on-chip systems for drug testing and characterization. Drug Discovery Today. 21 (12), 1859-1862 (2016).
- Prantil-Baun, R., et al. Physiologically Based Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis Enabled by Microfluidically Linked Organs-on-Chips. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 58 (1), 37-64 (2018).
- Mahler, G. J., Esch, M. B., Stokol, T., Hickman, J. J., Shuler, M. L. Body-on-a-chip systems for animal-free toxicity testing. Alternatives to laboratory animals: ATLA. 44 (5), 469-478 (2016).
- Miller, P. G., Shuler, M. L. Design and demonstration of a pumpless 14 compartment microphysiological system. Biotechnology and Bioengineering. 113 (10), 2213-2227 (2016).
- Coppeta, J. R., et al. A portable and reconfigurable multi-organ platform for drug development with onboard microfluidic flow control. Lab Chip. 17 (1), 134-144 (2016).
- Wikswo, J. P., et al. Scaling and systems biology for integrating multiple organs-on-a-chip. Lab on a Chip. 13 (18), 3496-3511 (2013).
- Sung, J. H., et al. Using PBPK guided "Body-on-a-Chip" Systems to Predict Mammalian Response to Drug and Chemical Exposure. Experimental biology and medicine (Maywood, N.J.). 239 (9), 1225-1239 (2014).
- Stokes, C., Cirit, M., Lauffenburger, D. Physiome-on-a-Chip: The Challenge of "Scaling" in Design, Operation, and Translation of Microphysiological Systems. CPT: Pharmacometrics & Systems Pharmacology. 4 (10), 559-562 (2015).
- Shirure, V. S., George, S. C. Design considerations to minimize the impact of drug absorption in polymer-based organ-on-a-chip platforms. Lab Chip. , (2017).
- Huh, D., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nature Protocols. 8 (11), 2135-2157 (2013).
- Tran, T. T., et al. Exact kinetic analysis of passive transport across a polarized confluent MDCK cell monolayer modeled as a single barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 93 (8), 2108-2123 (2004).
- Henry, O. Y. F., et al. Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function. Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).
- Maoz, B. M., et al. Organs-on-Chips with combined multi-electrode array and transepithelial electrical resistance measurement capabilities. Lab on a Chip. 17 (13), 2294-2302 (2017).
- Benam, K. H., et al. Matched-Comparative Modeling of Normal and Diseased Human Airway Responses Using a Microengineered Breathing Lung Chip. Cell Systems. 3 (5), 456-466 (2016).
Tags
इंजीनियरिंग अंक १४० अंग-पर-a-चिप microphysiological प्रणाली microfluidic microfabrication PDMS छिद्रित झिल्ली microchannel चक्रीय तनाव छिड़कावErratum
Formal Correction: Erratum: Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips
Posted by JoVE Editors on 05/08/2019.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips. The Representative Results, Discussion, and References sections have been updated.
In the Representative Results section, the legend for Figure 5 has been updated from:
Figure 5: Permeability of inert tracer Cascade Blue through the microporous PDMS membrane. Cascade Blue hydrazide dye in medium was loaded into the top channel of the Organ Chip and perfused at 60 µL/h to measure the flux of the dye across the membrane into the bottom channel containing medium. Empty chips were compared to Gut Chips with Caco2-BBe1 cells in the apical channel and human vascular endothelial cells (HUVEC) in the basal channel cultured for 6 days. Error bars indicate standard error of the mean.
to:
Figure 5: Permeability of inert tracer Cascade Blue through the microporous PDMS membrane. Cascade Blue hydrazide dye in medium was loaded into the top channel of the Organ Chip and perfused at 60 µl/h to measure the flux of the dye across the membrane into the bottom channel containing medium. Empty chips were compared to Gut Chips with Caco2-BBe1 cells in the apical channel and human vascular endothelial cells (HUVEC) in the basal channel cultured for 6 days. The apparent permeability (Papp, cm/s) of the microporous PDMS membrane was determined using the dye concentration in the outlet channels. The gut chip cell layers provide a significantly increased barrier to permeability. Error bars indicate standard error of the mean.
In the Discussion section, the fourth paragraph has been updated from:
Troubleshooting the resulting Organ Chips takes place at two levels: during the fabrication process and during Organ Chip culture. We have developed a visual method for quality assurance (QA) of through-hole formation in the cast membranes that greatly accelerates the production process while improving the quality and reliability of assembled Organ Chips. This QA method allows for process troubleshooting, and we recommend keeping a record of process conditions to enable tracking fabrication problems that may occur during cell culture. During Organ Chip culture, inert tracer dyes are the simplest method of measuring barrier function to troubleshoot the fabrication process and cell culture steps. Lucifer Yellow has been used historically due to its small molecular mass and innate fluorescence, but Cascade Blue offers similar properties with a narrower emission spectrum that is less likely to interfere with downstream assays. Larger molecules, such as poly-ethyleneglycol (PEG)- or dextran-conjugated fluorophores are larger and consequently result in lower permeability overall and lower sensitivity. The apparent permeability (Papp, cm/s) of tracer dyes can be used to determine barrier function properties of organs or tissues (Figure 4). The following equation can be used to calculate Papp between the dosing channel and receiving channel and is derived from equations used primarily for Transwell studies19,20 and corrects for tracer dye loss caused by absorption into PDMS by comparing the two output flows and not relying on mass balance assumptions at the outflow.
to:
Troubleshooting the resulting Organ Chips takes place at two levels: during the fabrication process and during Organ Chip culture. We have developed a visual method for quality assurance (QA) of through-hole formation in the cast membranes that greatly accelerates the production process while improving the quality and reliability of assembled Organ Chips. This QA method allows for process troubleshooting, and we recommend keeping a record of process conditions to enable tracking fabrication problems that may occur during cell culture. During Organ Chip culture, inert tracer dyes are the simplest method of measuring barrier function to troubleshoot the fabrication process and cell culture steps. Lucifer Yellow has been used historically due to its small molecular mass and innate fluorescence, but Cascade Blue offers similar properties with a narrower emission spectrum that is less likely to interfere with downstream assays. Larger molecules, such as poly-ethyleneglycol (PEG)- or dextran-conjugated fluorophores are larger and consequently result in lower permeability overall and lower sensitivity. The apparent permeability (Papp, cm/s) of tracer dyes can be used to determine barrier function properties of organs or tissues (Figure 5). The following equation derived by Tran, et al.19 can be used to calculate Papp between the dosing channel and receiving channel, which partially corrects for tracer dye loss caused by absorption into PDMS by averaging the two output flows and not relying on mass balance assumptions at the outflow.
The References section has been updated from:
- Blaser, D.W. Determination of drug absorption parameters in Caco-2 cell monolayers with a mathematical model encompassing passive diffusion, carrier-mediated efflux, non-specific binding and phase II metabolism. at <http://edoc.unibas.ch/655/1/DissB_7998.pdf> (2007).
- Hubatsch, I., Ragnarsson, E.G.E., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nature Protocols. 2 (9), 2111-2119 (2007).
- Henry, O.Y.F. et al. Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function. Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).
- Maoz, B.M. et al. Organs-on-Chips with combined multi-electrode array and transepithelial electrical resistance measurement capabilities. Lab on a Chip. 17 (13), 2294-2302 (2017).
- Benam, K.H. et al. Matched-Comparative Modeling of Normal and Diseased Human Airway Responses Using a Microengineered Breathing Lung Chip. Cell Systems. 3 (5), 456-466.e4 (2016).
to:
- Tran, T.T. et al. Exact kinetic analysis of passive transport across a polarized confluent MDCK cell monolayer modeled as a single barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 93 (8), 2108–2123 (2004).
- Henry, O.Y.F. et al. Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function. Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).
- Maoz, B.M. et al. Organs-on-Chips with combined multi-electrode array and transepithelial electrical resistance measurement capabilities. Lab on a Chip. 17 (13), 2294-2302 (2017).
- Benam, K.H. et al. Matched-Comparative Modeling of Normal and Diseased Human Airway Responses Using a Microengineered Breathing Lung Chip. Cell Systems. 3 (5), 456-466.e4 (2016).
