Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Skalbar tillverkning av töjbart, Dual Channel, ultrakalla orgel Chips

Published: October 20, 2018 doi: 10.3791/58151
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Här presenterar vi ett protokoll som beskriver tillverkning av töjbart, dual channel, orgel chip mikroflödessystem cell kultur enheter för går igenom orgel-nivå funktionalitet in vitro.

Abstract

Ett betydande antal blyföreningar misslyckas i farmaceutiska rörledningen eftersom djurstudier misslyckas ofta med att förutsäga kliniska Svaren hos patienter. Mänskliga Organ-på-ett-Chip (orgel Chip) mikroflödessystem cell kultur enheter, vilket ger en experimentell in vitro- plattform för att utvärdera effekt, toxicitet och farmakokinetiska (PK) profiler hos människor, kan vara bättre prediktorer för terapeutisk effekt och säkerhet i kliniken jämfört med djurstudier. Dessa enheter kan användas för att modellera funktionen av praktiskt taget alla organ typ och fluidically kan kopplas via gemensamma endotel-fodrade mikrokanaler att utföra in vitro- studier på humanfysiologi orgel- och hela kroppen-nivå utan att behöva genomföra experiment på människor. Dessa Organ marker består av två perfunderade mikroflödessystem kanaler åtskilda av en genomsläpplig elastomeriska membran med organ-specifika parenkymal celler på ena sidan och mikrovaskulära endotel å andra sidan, som kan sträckas cykliskt att tillhandahålla organ-specifika mekaniska signaler (t.ex. andas rörelser i lungan). Detta protokoll Detaljer tillverkning av flexibla, dual channel, orgel marker genom gjutning av delar med hjälp av 3D tryckta formar, möjliggör kombinationen av flera gjutning och efterbehandling steg. Porösa poly (dimetyl siloxan) (PDMS) membran är gjutna med mikrometer storlek genomgångshål använda silicon pelaren matriser under komprimering. Tillverkning och montering av orgel Chips innebär utrustning och åtgärder som kan genomföras utanför en traditionell renrum. Detta protokoll ger forskare med tillgång till Organ Chip teknik för in vitro- orgel - och kropp-nivå studier i läkemedelsutveckling, säkerhet och effekt, samt mekanistiska studier av grundläggande biologiska processer.

Introduction

Här beskriver vi tillverkning av dubbla kanaler, simblåsa Organ-på-ett-Chip (orgel Chip) mikroflödessystem kultur enheter använder en skalbar protokoll som är mottaglig för användning av forskargrupper som saknar tillgång till renrum och traditionella mjuka litografi verktyg. Dessa enheter har utvecklats för att sammanfatta människans organ-nivå funktioner för förståelse normal och sjukdom fysiologi, samt drog Svaren in vitro-1,2. Avgörande för att iscensätta denna funktionalitet är två perfunderade mikroflödessystem kanaler åtskilda av ett halvgenomträngligt membran (figur 1). Denna konstruktion möjliggör rekreation av vävnad-vävnad gränssnitten mellan minst två typer av vävnader, vanligtvis orgel parenkymal celler på ena sidan av porösa membranet och vaskulära endotel å den andra, samt deras exponering för vätskeflöde. Dessutom, eftersom elastomeriska polymeren, poly (dimetyl siloxan) (PDMS), används för att tillverka Organ Chip kroppen och membran komponenter, cykliska mekaniska belastningen kan tillämpas på hela konstruerad vävnad-vävnad gränssnitt via elastiskt membran för att efterlikna den naturliga fysiska närmiljön av levande organ, såsom andning rörelser i lungan och peristaltik i tarmen.

Figure 1
Figur 1: Organ Chip tvärsnitt. Orgel marker består av två kanaler åtskilda av ett poröst, elastiskt membran som kan dirigeras med celler på båda sidor. Övre kanal tvärsnitt är 1 mm bred x 1 mm hög, botten kanal cross sektioner är 1 mm bred x 0,2 mm hög och vakuum kanaler i båda och nedre delar är 0,3 mm bred, 0,5 mm höga och radavstånd 0,3 mm från fluidic kanaler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Dessa töjbart, dual channel, orgel marker har använts för att demonstrera effekten av andas rörelse på nanopartiklar absorption i lunga och läkemedelsinducerad lungödem3,4. effekter av peristaltiska rörelser på differentiering5 och bakteriell överväxt i tarmen5,6,7; och påverkan av cykliska deformationer på grund av pulsering av hjärtat på differentiering och mognad av glomerulär podocytes i njuren8. Dessutom, dessa två-lumen enheter som innehåller en endotel-fodrade vaskulär kanal åtskilda av en extracellulär matrix (ECM)-belagda membran från parenkymal celler inom en separat tillgänglig kanal är väl lämpade för karakterisering av drogen PK parametrar och ny läkemedelsutveckling, som har begränsats i enda perfusion kanal system. Dessutom flera Organ marker kan kopplas ihop via sin vaskulära kanaler att effektivt skapa en mänsklig kropp-på-chips, som kunde erbjuda en attraktiv människa in vitro- plattform för therapeutics utveckling9, 10. Till skillnad från mest mikro-fysiologiska system (MPS)11,12,13innehåller orgel marker två mikroflödessystem kanaler avgränsade med ett poröst membran som underlättar vaskulär-parenkymal interaktioner till sammanfatta i vivo organfunktion. Detta förenklar inte bara sammankoppling av olika organ grupp av startas ett vanligt medium genom vaskulära kanaler, men uppdelning i vävnad och kroppsvätskor härmar i vivo funktioner och stöder farmakokinetiska experiment och modellering samt i vitro-i vivo extrapolering9,10 , det är svårt eller omöjligt i enda kanal MPS14,15,16. Populariteten av PDMS i ultrakalla enheter har lett till utvecklingen av verktyg att övervinna materialets inneboende förmåga att absorbera små molekyler10,17. Det stora antalet marker som krävs för att stödja biologiska studier där användningen av antimikrobiella agens och PDMS-absorberande föreningar göra återanvända orgel marker svårt nödvändiggör dock en skalbar tillverkningsprocess även för små forskargrupper. Protokollet beskrivs här presenterar en metod för enheten tillverkning lämplig för användning i akademiska laboratorier, inklusive de som saknar tillgång till renrum och mjuk litografi. Detta protokoll syftar till att bredda tillgången till orgel marker av en rad forskare som försöker använda de töjbara, dubbla kanaler enheterna för att utforska grundläggande biologiska processer samt translationell terapeutisk utveckling.

Att utnyttja bästa praxis från mikrotillverkning fält tillsammans med design för tillverkning, utvecklades en robust metod för fabricera Organ Chip enheter i stora mängder med hög reproducerbarhet och avkastning. Det fabrication-protokollet som beskrivs här ger en skalbar metod för Organ Chip produktion. Vi beskriver användningen av en valfri mögel-in-Place jigg (MiP; designdetaljer i Kompletterande material) tillsammans med polyuretan packning remsor att aktivera upptrappningen av gjutning PDMS komponenter. Den blanka sidan av polyuretan remsor producera optiskt smidig PDMS delar medan den strukturerade sidan underlättar demolding. Vi beskriver också användningen av en valfri automatiserad membran Fabricator (AMF) som erbjuder enhetlig komprimering av membran wafer formar härdning för att fabricera upp till 24 membran per batch. Designen är i stort sett tillämpliga för studier av organ som består av vävnader som uppleva mekaniska påfrestningar och perfusion, och dessa marker kan produceras med låg chip-till-chip variabilitet i kvantiteter som krävs för att uppfylla behoven hos små och stora forskargrupper både. Arbetsflödet är mottagliga för en batch eller monteringslinje format och lätt kompatibel med kvalitet bedömning protokoll för kontroll av produktionsprocesser, personalutbildning och lyhörd felsökning. Vi hoppas att detta protokoll kommer att expandera åtkomst till funktionerna i dubbla kanaler, töjbart, orgel marker för grundläggande och translationell forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. allmänna beredning

  1. För att undvika skräp, rena arbetsområdet använder förpackningstejpen och torka av området med en renrum torka och isopropylalkohol.
  2. För alla åtgärder som kräver PDMS, blanda PDMS i förhållandet 10:1 (10 g av cross linking agent, 100 g av elastomer bas). Blanda för hand eller med en kommersiellt tillgänglig mixer. Använda en planetarisk centrifugal mixer här: blanda i 2 minuter vid 2000 rpm och avgasning av PDMS i 2 minuter vid 2200 rpm.
  3. Ren all formar med air gun att blåsa ut skräp före användning.
    Varning: Använd inte metal pincett för att avlägsna skräp eftersom det kan skada ytan på formarna.

2. top kanal förberedelse

  1. Torka den blanka sidan av varje polyuretan med etanol och renrum våtservetter. Kontrollera att alla återstående etanol torkas från polyuretan ytan.
  2. Placera den blanka sidan av polyuretan över den öppna sidan av MiP mögel att skapa en tätning på den öppna sidan av mögel, lämnar endast en brunn-gillar öppning överst i formen för hälla PDMS.
    Obs: Kontrollera att varje mögel täcks ordentligt av polyuretan bit eller PDMS kommer att läcka från mögel under hälla.
  3. Placera de mögel och polyuretan församlingarna i en MiP jigg, med den strukturerade sidan mot slutet av MiP jiggen. Fortsätta att göra detta tills alla formar har placerats i jiggen.
  4. Dra åt jiggen MiP genom att vrida handtaget med hjälp av en skiftnyckel tills jiggen avståndet är 25 mm i bredd.
  5. Göra en båt av aluminiumfolie som omger MiP jiggen för att förhindra överskott PDMS läcker på ytor.
  6. Häll PDMS i var och en av formarna bra tills full.
    Obs: Varje chip topp komponent kräver ca 3 mL PDMS.
  7. När hela jiggen är fylld, placera jiggen in i vakuum exsickator. Dra vakuum vid-80 kPa för 1 h att degas PDMS.
  8. Efter 1 h, ta bort jiggen MiP från exsickatorn och placera i 60 ° C ugn i minst 4 h att bota PDMS.
  9. Demontera MiP jiggen med hjälp av en skiftnyckel, lossa jiggen genom att vrida handtaget moturs. När formar är fri från komprimering, ta bort mögel från jiggen.
  10. Avlägsna polyuretan remsor från varje mögel och kassera.
  11. Noggrant de mögel PDMS delar från deras formar och lägga dem funktionen sida uppåt.
  12. Rada upp bladet av kakel skrapa på slutet fliken notch och skära bort ändarna till singulate övre komponenterna.
  13. Kontrollera delar för någon av felmoder som följande och kassera eventuella otillfredsställande delar: repor i huvudkanalen, stora skräp ovanför kanal, stora bubblor, deformerade vakuum kanaler.
  14. Lagra färdiga delar i fyrkantiga petriskålar inom tryck positivt skåp vid rumstemperatur.

3. nedre kanal förberedelse

  1. Häll ca 10,5 g PDMS i formarna tills PDMS når toppen av Hålrummet.
    1. Inspektera botten kanal mögel för PDMS härdat till botten av mögel.
    2. Om den är smutsig, skrapa gamla PDMS från botten av mögel eftersom en ojämn yta på undersidan av mögel kan orsaka ojämn tjocklek av de sista delarna.
      Obs: för små < 2 cm2 områden som är avtäckt, luften pistol kan användas mycket försiktigt att flytta PDMS över utrymmet.
  2. Placera formarna i vakuum exsickator för 1 h.
  3. Efter 1 h, flytta formarna till en nivå 60 ° C ugn för > 4 h.
  4. Placera mögel på tabellen i LAF. Lossa PDMS från ena kanten av mögel.
  5. Grepp ett hörn och dra försiktigt tillbaka PDMS från mögel ytan.
  6. När helt bort, låg på ytan med arbete, så att kanalfunktioner ansikte upp.
  7. Skär delar längs ytterkanterna med kakel fräsar, placera kakel knivbladet i spårat PDMS som i steg 2.12.
  8. Låg delar funktionen sidan på band att ta bort eventuellt skräp.
  9. Ta bort en del från förpackningstejpen. Dra den lösa änden av delen över bilden. Den lösa änden kommer laminat med glas.
    Obs: Det är avgörande för att undvika sträcker sig delen medan det fastställande av. Om bubblan är fångade mellan del och glas, försiktigt lyfta delen med tången och åter lägga.
  10. Utföra kvalitetskontroll inspektion av delar. Kontrollera delar för eventuella fellägen och kassera eventuella otillfredsställande delar, inklusive de som innehåller repor i den viktigaste kanalen, stora skräp, stora bubblor eller deformerade vakuum kanaler.
  11. Täcka funktioner med tejp.
  12. Lagra delar i ett positivt tryck skåp vid rumstemperatur.

4. PDMS membran förberedelse

  1. Kontrollera att wafers är PDMS på baksidan.
  2. Placera varje membran wafer i utsedda skåror i AMF magasinen.
  3. Använd 1 mL-sprutan för att placera 0,09 mL PDMS på mitten av varje membran wafer post matris. Låt PDMS sitta i minst 5 min att tillåta PDMS att sprida över hela inlägg av membran rånet.
    Obs: Fortsätt inte till nästa steg förrän minst 75% av post matrisen är täckt av PDMS. Kvaliteten på membran förbättrar ju längre PDMS är tillåtet att transportera in inlägget regionen så längre väntetider i det här steget är att föredra.
  4. Plasma behandla polykarbonat remsan på 20 W för 45 s, O2 gas vid 0.80 mbar i en plasma-maskin.
  5. Ta bort bladet polykarbonat från plasma maskinen och använd sax för att klippa polykarbonatskivor i 45 x 45 mm rutor.
    Obs: Minimera kontakt med plasma behandlade ytan för att förhindra damm fastnar polykarbonat.
  6. Lägg försiktigt den plasma som behandlade sidan av polykarbonat rutor på den flytande PDMS centrerad på membran rånet. Se till att polykarbonat och PDMS i kontakt.
    Obs: Undvik luftfickor mellan polykarbonat och PDMS.
  7. Placera den färdigskurna PDMS spacer på mitten av torget i polykarbonat.
  8. Placera bladet färdigskurna strukturerad polykarbonat på PDMS blocket att hålla församlingen från bindning till komprimering plattan.
  9. Infoga facket så att Magasin 3 är i ryggen, fack 2 är i mitten och fack1 är i fronten. Fack 1 har en skåra för justering.
  10. Öppna utdata tryck ventilen och mycket långsamt öppna ingående tryck ventilen. Stäng bara sedan utgång tryck ventilen.
    Obs: Detta är så att utdata 4 kg kraft gradvis tillämpas på varje membran wafer i motsats till direkt, som kan bryta wafers.
  11. Dra i AMF spaken till ON börja bota cykeln. Bota wafer under 4 kg (16 kPa) komprimering och en ramp temperaturcykel som anges i tabell 1.
Steg Temperatur (° C) Längd (min)
1 20 20
2 35 10
3 45 10
4 50 60
5 60 120
6 20 Håll

Tabell 1 - membran bota tillstånd

  1. Stäng ingående tryck ventilen och öppna den utdata ventilen för att släppa på trycket från luftbehållarna.
  2. Ta bort magasinen och föra dem till LAF.
  3. Dra försiktigt av strukturerad polykarbonat och ta försiktigt bort PDMS mellanlägget.
    Obs: Titta på PDMS mellanlägget så det inte också lossnar polykarbonat transportören, om detta inträffar start peeling från ett olika hörn.
    1. Inspektera PDMS membranet genom polykarbonat transportören för områden med genomgående hål och använda en markör för att spåra konturerna av området hålmontering och markera eventuella hål eller defekter i membranen.
    2. Använda wafer hantering pincett, lossa wafers från facket.
    3. Ta bort varje membran från rånet och placera i petriskål.
      Obs: PDMS membranet kommer de mögel från membran rånet och kommer att följas polykarbonat bakningen. Om PDMS börjar lossa från polykarbonat transportören, skal från en annan region.
    4. Förvaras membranen och rån i petriskålar i ett positivt tryck skåp vid rumstemperatur.

5. top församling och förberedelse

  1. Med Matt tejp, ren PDMS membran samt insidan av petriskål att avlägsna skräp.
  2. Grundligt tejpa den funktion sidan av varje topp komponent att ta bort skräp.
  3. Placera top kanal del (”top”) funktionen sida upp i petriskål med PDMS membran.
    Obs: Tänk på att vissa membran kan användas för en eller två övre delar beroende på storlek av den tillgängliga arean. De viktigaste kanalerna för varje övre delen bör passa inom det markerade området av membranet.
  4. Fyll i petriskålar i plasma maskinen.
  5. Plasma behandla membranet och topp 20 W för 45 s, O2 gas vid 0.80 mbar.
  6. När de limning cyklerna är klar, ta bort rätter och fastställa de aktivera delarna funktionen sida ovanpå membranet och säkerställa del är fullt laminerad med membran med inga bubblor.
  7. Placera delarna i 60 ° C ugn för minst 2 h att glödga.
  8. Med en skalpell, spåra runt omkretsen av bundna upp till separata topp-membran montering från polykarbonat transportören.
    Obs: Skär inte transportören.
  9. När delen spåras, skala församlingen från polykarbonat. PDMS membran som är bundna till toppen bör skala från transportören.
  10. Använda skarpa lutad pincett, bort membranet från de portar som tillgång till botten-kanalen och ta bort skräp och damm med pincett under ett stereoskop.
    Obs: Lämna inte någon del av membranet som täcker tillgång till hamnen.

6. chip montering

  1. Funktionen sida upp, plasma behandla sammansättningar med botten komponenter med villkoren i steg 5,5.
  2. Under en inverterade Mikroskop, justera den övre församlingen med objektglas till botten hälften.
  3. Placera i 60 ° C ugn för minst 2 h.
  4. Chip kvalitetskontroll inspektion
    Obs: Betala nära uppmärksamhet till de viktigaste hamnarna och kanal för chip. Kontrollera för felmoder av ögat och även under mikroskopet.
    1. För att kontrollera att chipet är limmade helt, bogserbåt lätt på varje hörn av chip att kontrollera för formförändras delar.
    2. Titta på kanalen av chip till check för ett skrynkligt eller slapp membran, som visas som ett vågigt mönster eller en ljus nedböjning i kanalen.
    3. Utföra en Mikroskop inspektion att inspektera för skräp i huvudkanalen.
      Obs: Skräp i icke-kritiska områden, såsom vakuum kanalerna är acceptabelt.
    4. Med chip fortfarande på inverterade mikroskopet, inspektera huvudkanal och vakuum kanaler för delaminering.
      Obs: Delaminering i icke-kritiska områden (t.ex. i utkanten av chip) är acceptabelt.
    5. Kontrollera att de viktigaste kanalerna är justerade till inom 50-60 µm (1-2 membran porer).
      Obs: Det är avgörande att kanalerna inte överlappar med vakuum kanaler.
    6. Kontrollera att membranet mellan de främsta kanalerna och de in- och utlopp kanalerna är intakt utan några uppenbara hål.
      Obs: Något hål i membranet kan leda till en läckande chip eller celltillväxt utanför kanalerna.
  5. Store marker i petriskålar i ett positivt tryck skåp vid rumstemperatur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det protokoll som presenteras här beskriver skalbara tillverkning av PDMS orgel marker. Dessa enheter möjliggöra kultur av två distinkta perfunderade vävnadstyper på ett elastiskt porösa membran (figur 1). PDMS kanalerna är gjutna med 3D tryckta formar, som accelererar prototyper av nya konstruktioner (figur 2A och 2B). Översta kanaler gjuts i formar under komprimering mot en kompatibel polyuretan packning att producera komponenter med gjuten portar (figur 2 c) medan botten kanal komponenter är gjutna i magasinen och hanteras på objektglas bakningen (figur 2D). Denna tillverkning strategi kombinerar flerskalig mallning av delar i ett enda steg, som sparar tid, förbättrar reproducerbarhet och spårbarhet och minskar skräp som genereras av port stansning och flera styckning steg. De porösa membran är avgörande för funktionen av orgel Chip, och metoden fabrication baserat på gjutning mot mönstrade kiselskivor resultaten i membran av konsekvent tjocklek och ytjämnhet (figur 3). Hantering via polykarbonat bärare tillåter större tillverkningsserier och lagring.

Färdigmonterad orgel Chip (figur 4) består av två perfusion kanaler i optiskt transparent förpackning. I regionen överlappande möjliggör ett poröst membran PDMS vävnad-vävnad interaktion av metaboliter, proteiner, therapeutics, patogener och celler att recapitulate chip organfunktion medan två parallella kanaler på vardera sidan används för att ge mekanisk stam med cyklisk vakuum aktivering. Porositeten av PDMS membran biomimetically stöder flödet av metaboliter, tillväxtfaktorer och även celler mellan vaskulatur och orgel parenkymet (figur 5). Membranet uppenbara permeabilitet (Papp, cm/s) bestämdes med hjälp av färgämne koncentrationen i utlopp kanaler med och utan Caco2 gut celler. De gut chip cellagren ger en avsevärt ökad barriär till permeabilitet. Orgel chipet kan aktiveras med de parallella vakuum kanalerna att kvantitativt och reproducibly använda cyklisk belastning lastning till membranet och därför odlade vävnader (figur 6). Denna cykliska stam kombinerat med media perfusion stöder celldifferentiering för att bättre efterlikna i vivo orgel fysiologi, såsom bildandet av villi i tarmen Chip.

Figure 2
Figur 2 : Kanal fabrication med 3D tryckta formar. Orgel chip delar är gjutna mot högupplösta 3D tryckta formar (A och B), vilket möjliggör större design mångsidighet och prototyping än traditionella mjuka litografi. Övre kanalen delar (C) botas under komprimering vilket eliminerar behovet av stansning hamnar i de färdiga delarna. Varje tre exemplar gjutning är singulated med ett enda snitt. Nedre kanalen delar (D) placeras på objektglas att underlätta användarvänlighet och imaging. Skala barer är ca 1 cm i alla bilder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Porösa PDMS membranet är gjuten med DRIE mönstrad kiselskivor. (A) rendering av 7 µm diameter, 50 µm lång micropillars etsad med DRIE in en silicon wafer. (B) PDMS härdas på denna matris under 4 kg av komprimering (16 kPa) för att skapa ett 50 µm tjocka membran med en rad 7 µm diameter om hål fördelade hexagonally 40 µm apart. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Fotografi av en monterade PDMS Organ Chip. Rött färgämne fyller den största apikal kanal som används för parenkymal celler medan det blå färgämnet belyser den basala kanal används vanligtvis för vaskulära endotel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Permeabilitet av inert tracer Cascade blå genom mikroporös PDMS membranet. Cascade blå maleinhydrazid färgämne i medium lästes in i top kanal av orgel Chip och perfusion vid 60 µL/h att mäta flödet av färgämnet över membranet i botten kanalen som innehåller medium. Tomma chips jämfördes Gut Chips med Caco2-BBe1 celler i apikal kanal och mänskliga vaskulära endotelceller (HUVEC) i basal kanalen odlade i 6 dagar. Felstaplar visar standardavvikelsen för medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 : Tillämpning av membran stam med vakuumsidan channels. Handlingen visar linjär stam modulering av membran som svar på en tillämpad vakuumtryck. Cyklisk enaxiella stam tillämpas enhetligt till regionen kultur av orgel Chip med tillämpad dammsugare till parallella sida kanaler. Stammen korrelerar linjärt med minskande vakuumtryck på cirka 1% stam för varje-10 kPa förändring i vakuum (R2 = 0.992). Felstaplar visar standardavvikelsen för medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande material: Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tillverkningsprocessen är beroende av högupplösta 3D tryckta formar till mönster PDMS övre och nedre Organ Chip kropp komponenterna tillsammans med micromolded porösa PDMS membran. Detta kritiskt förhållningssätt valdes på grund av användarvänlighet prototyping kombinerat med snabb övergång till skalas upp tillverkning och byte av verktyg. Översta komponenten formarna är utformade för att mönstret hamnar i exakta platser med definierade vertikala profiler under gjutning steg. Detta inte bara undviker arbetskraft som är inblandade i manuellt stansning tillgång portar men också minskar skräp på arbetsplatsen, möjliggör reproducerbara port justering gränssnitt grenrör eller instrumentering, och producerar delar med kontroll över passform och försegling av infogas slangar eller stift för fluidic och pneumatiska anslutningar. Formarna staplas ovanpå varandra i en komprimering jigg, åtskilda av kompatibla polyuretan ark för att underlätta hålmontering gjutning av portar. Genom att stapla flera delar i en enda jigg, kan en enskild användare casta stora mängder komponenter komplett med hamnar i ett enda steg. Val av material och tillverkning metod för formarna är kritiska att tillhandahålla den nödvändiga funktionen upplösning, låg ytråhet och hög grad av planhet för enheten montering och efterföljande bildhanteringsprogram. Stereolitografi kan uppfylla dessa krav, även material med hög nedböjning temperaturer (> 80 ° C) och kompatibilitet med PDMS bota minska intervallet tillgänglig polymer. Olika kommersiellt tillgängliga hartser, inklusive glas-fyllda hartser, uppfyller dessa kriterier.

Elastisk porösa PDMS membranet är utan tvekan den mest unika och kritiska komponenten i en orgel-Chip samtidigt vara de mest komplexa att fabricera. En djupt reactive ion etsningar (DRIE) processen ut på entreprenad till en leverantör används för att microfabricate 50 x 50 mm sexkantiga matriser av pelarna (7 µm diameter, 40 µm apart, 50 µm lång, C4F8 belagd) som används för att mönstret porerna i membranet som PDMS. Kvaliteten på de pelare arrayer är avgörande för att uppnå robust membran gjutning. I synnerhet måste pelarna vara etsad att snäva toleranser med smidig vertikala profiler att undvika underskär eller överdriven sidovägg ojämnheter som kan leda till mögel misslyckande. Försiktighet bör iakttas att undvika ”bete” längst ned på den etsade regionen, som kan påverka membran demolding och cell fastsättning. Membran tillverkning med framgångsrik integration för hålmontering mallning och enhet är den enda mest komplexa delen av protokollet. Kritiskt, är utsläppande 0,09 mL PDMS på varje wafer och tillåta tillräcklig tid för att sprida viktigt att undvika ofullständig hålmontering gjutning. Ordentligt är plasma behandling av polykarbonat bakningen skyldiga att uppnå robust uppbackning av membranet för demolding och limning steg utan att skrynkla eller stretching. Stöd tillhandahåller en robust demolding cast membranet från bräckliga kisel rånet.

Tryckkraft lasten tillämpas på varje wafer är också viktigt för enhetlig hålmontering fabrication. Tidigare insatser med vikter hindrade membran produktion och resulterade i dålig avkastning på grund av icke-enhetlig force distribution. För att övervinna produktionen flaskhalsen, vi optimerat den tidigare publicerade membran tillverkning protokoll18 och byggde en automatiserad membran Fabricator (AMF) för att parallellisera processen. AMF består av 24 pneumatiska kolvar stöds över en programmerbar värmeplatta att tillhandahålla kontrollerade tryckkraft i hela en programmerad PDMS bota processen. En polykarbonat bakningen filmen placeras på den ohärdade PDMS och sedan komprimerats jämnt med pneumatiska kolvar AMF medan värms för att polymerisera PDMS. Kritiskt, den gradvisa härdning processen beskrivs i protokollet resulterar i högre kvalitet membran än ett enda steg till den högsta temperaturen, där ludd mönster följd bubbla utveckling under härdning processen observerades. Medan valfritt, ökar AMF genomströmningen betydligt utöver vad som är möjligt med vikter i ugn.

Felsökning resulterande orgel marker sker på två nivåer: under tillverkningsprocessen och Organ Chip kultur. Vi har utvecklat en visuell metod för kvalitetssäkring (QA) för hålmontering bildning i cast membran som kraftigt påskyndar produktionen medan förbättra kvaliteten och tillförlitligheten hos monterade orgel Chips. QA metoden möjliggör felsökning av processen, och vi rekommenderar att hålla ett register över process villkor att aktivera spårning fabrication problem som kan uppstå under cellodling. Under Organ Chip kultur är inert tracer färgämnen den enklaste metoden att mäta barriär-funktion för att felsöka tillverkningsprocessen och cell kultur steg. Lucifer gul har använts historiskt tack vare dess små molekylärt samlas och medfödda fluorescens, men Cascade blå erbjuder liknande egenskaper med en smalare emissionsspektrum som är mindre sannolikt att störa efterföljande analyser. Större molekyler, såsom poly-etylenglykol (PEG)- eller dextran-konjugerad fluorophores är större och därmed resultera i lägre permeabilitet övergripande och lägre känslighet. Tracer färgämnen uppenbara permeabilitet (Papp, cm/s) kan användas för att avgöra funktionen barriäregenskaper organ eller vävnader (figur 4). Följande ekvation kan användas för att beräkna Papp mellan den dosering kanalen och mottagande kanalen och härleds från ekvationer används främst för Transwell studier19,20 och korrigerar för tracer dye förlust orsakas av absorptionen i PDMS genom att jämföra de två utflöden och inte förlitar sig på massbalans antaganden på utflödet.

Equation 1

VR är volymen i mL efter kanal utflödet efter tiden t; VD är volymen i mL dosering kanal avloppsvattnets efter tiden t; A är området i membran hålmontering regionen i cm2 (0.167 cm2 för denna enhet). t är tiden för spillvatten samling i sekunder; CR är uppmätta förändringar i koncentrationen av spårämne färgämnet i mottagande kanal utflödet; CD är den uppmätta koncentrationen av spårämne färgämnet i dosering kanal utflödet. Viktiga antaganden för denna ekvation att gälla inkluderar: (1) stadig tracer färga dosering koncentration över tid t, 2) koncentrationen av Cr är liten jämfört med Cdoch 3) genomträngligheten av systemet är jämnt fördelade hela regionen kultur. Även om denna ekvation kan användas för statiska system, var noga att kontrollera att antagandena håller sant. Elektriska metoder, inklusive trans-epitelial elektriskt motstånd (TEER) genomförs vanligen i Transwell studier och nyligen har införlivats i PDMS orgel marker för omedelbar och kontinuerlig barriär funktion mätningar samt21 ,22.

Begränsningar i detta protokoll är elasticiteten i PDMS samt den manuella processen för gjutning och montering som begränsar produktion priser. PDMS är en mångsidig polymer som är väl lämpad för orgel marker som kräver mekaniska belastningen aktivering, men dess elasticitet kan hindra produktionen. Delar kan vara svårt att hantera utan deformation och membran kräver säkerhetskopiera filmer för manipulation. Som ett resultat, kan automatisering av Organ Chip produktion begränsas. Gjutprocessen, till skillnad från varmpressning eller formsprutning används för termoplastiska polymerer, är batch-baserade och därför också begränsar genomströmning.

Orgel Chips aktivera in vitro- studier av mänskliga organ - och kropp-nivå funktioner i vivo genom startas ett vanligt medium genom vaskulära kanaler. Genom beredning av fysiologiska vävnad-vävnad gränssnitt, flux molekyler mellan vaskulär och parenkymal fack, mekaniska ledtrådar, och fluidic skjuvning och transport, dessa enheter främja histodifferentiation och klarar av att går igenom in-vivo-gillar funktionerna i både normal och sjuka organ. Uppdelning i vävnad och kroppsvätskor i två fack härmar deras in-vivo -funktioner och Organ Chip studier är mottagliga för tid-löst farmakokinetiska experiment och modellering samt i vitro-i vivo extrapolering9,10 som är svårt eller omöjligt i enda kanal MPS14,15,16. Microchannel strukturer kan utnyttjas för andra program, inklusive undersöka effekterna av exponeringen för dynamisk tobaksrök med dubbelriktad andas i mänskliga liten luftvägsreaktivitet epitel att utveckla nya biomarkörer lung skada23. Planar membranen definierade positioner och hög optisk klarhet enheter gör dem unikt lämpad för image-baserad analys och integrering av inbyggda sensorer. Mekanisk stimulering aktiveras med integrerat vakuum kanaler och elastomermaterial ger funktioner inte möjligt i Transwell system. Vi har visat att mekanisk stam är avgörande för rekapitulation av vissa i vivo fysiologiska funktioner, inklusive nanopartiklar absorption i lungan4, lungödem3 och differentiering av mogen iPS-derived glomerulär podocytes8.

Framtida tillämpningar av detta protokoll kan omfatta integrering av olika fjärranalys modaliteter som kan användas för att ge realtid avläsning av Organ Chip svar på stimuli såsom droger, gifter eller strålning. Det protokoll som presenteras här skulle kunna utvidgas till icke-PDMS material med olika optiska, mekaniska och kemiska egenskaper, inklusive biologiskt nedbrytbart material. Protokollet Organ Chip presenteras här bör göra det möjligt för forskare att fabricera enheter som erbjuder en hög grad av kontroll över närmiljön av friska och patofysiologiska vävnader och organ, vilket kan utnyttjas för terapeutisk utveckling, inklusive rikta upptäckten, toxicitet och farmakokinetiska bedömningar, samt när det gäller personlig medicin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

D.E.I. är en av grundarna och innehar kapital i emulera, Inc., och stolar dess vetenskapliga rådgivande styrelse. J.P. är för närvarande anställd på emulera, Inc. R.N., YC, J.P., och D.E.I. är uppfinnare på immateriella rättigheter som har licensierats till emulera, Inc.

Acknowledgments

Vi tackar M. Rousseau och S. Kroll för hjälp med fotografering och videography och M. Ingram, J. Nguyen, D. Shea och N. Wen för bidrag till inledande tillverkning protokoll utveckling. Denna forskning sponsrades av Wyss Institutet för biologiskt inspirerade Engineering vid Harvard University och den Defense Advanced Research Projects Agency under kooperativa avtal nr W911NF-12-2-0036 och #W911NF-16-C-0050, och FDA beviljar # HHSF223201310079C, NIH grants #R01-EB020004 och #UG3-HL141797-01 och Bill och Melinda Gates stiftelse beviljar #OPP1163237 och #OPP1173198 DEI. De åsikter och slutsatser som finns i detta dokument är författarnas och bör inte tolkas som representerar den officiella politiken, antingen uttryckliga eller underförstådda, av Defense Advanced Research Projects Agency, Food and Drug Administration, den National Institutes of Health, eller den amerikanska regeringen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Personal Protective Equipment
Hairnet VWR 89107-770
Tyvek lab coat VWR 13450-506
Extended cuff gloves VWR 89521-898
Equipment
Cutting mat VWR 102096-430
Tile cutter McMaster-Carr 26765A31
Mold-in-place (MIP) top molds Protolabs, Inc. custom printed in Prototherm 12120
Mold-in-place (MIP) bottom molds Protolabs, Inc. custom printed in Prototherm 12121
Duckbill curved forceps VWR 63041-864
Sharp tipped forceps Electron Microscopy Sciences 72700-D
Metal spatula VWR  82027-528
Deep reactive ion etch (DRIE)  pillar array wafers Sensera, Inc. custom Four 50 x 50 mm pillar arrays per wafer; pillars 7 um wide, 50 um tall, spaced hexagonally 40 um apart
Textured polycarbonate .01” thick McMaster-Carr 85585K33 cut to 45 mm square
PDMS blocks (40 x 40 x 5 mm) n/a custom
Laminar flow hood Germfree BVBI cast in-house
Air gun
60°C level oven
Vacuum desiccator
Mass balance accuracy to 0.1 g
Plasma machine Diener Nano oxygen plasma capability is critical
Supplies
Sylgard 184 poly (dimethylsiloxane) (PDMS) base/curing agent kit Ellsworth Adhesives  4019862
Mixing cup Ensure adequate ventilation when handling prepolymer due to low levels of ethylbenzene
1 mL syringe VWR 10099-395
Cleanroom wipes VWR TWTX1080
25 x 75 mm glass microscope slides VWR 48311-703
Packing tape VWR 500043-724
Scotch tape VWR 500026-873
Die-cut Polyurethane (PU) strips Atlantic Gasket, Inc. custom: AGWI2X3  1/8” thick; 60 Durometer Black Polyurethane; 2” x 3”
Polycarbonate film .005” thick McMaster-Carr 85585K102
100 x 100 x 15 mm square gridded petri dishes VWR 60872-480
 Aluminum foil
Optional Equipment
Thinky PDMS Mixer Thinky ARE-310
Mold-in place (MIP) jig in-house screw clamp compression jig
Automated membrane fabricator (AMF) in-house pneumatic compression piston array with programmable heater

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
  2. Benam, K. H., et al. Engineered In vitro Disease Models. Annual Review of Pathology Mechanisms of Disease. 10 (1), 195-262 (2015).
  3. Huh, D., et al. A Human Disease Model of Drug Toxicity-Induced Pulmonary Edema in a Lung-on-a-Chip Microdevice. Science Translational Medicine. 4 (159), 159ra147 (2012).
  4. Huh, D., et al. Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  5. Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab on a Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).
  6. Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integrative Biology. 5 (9), 1130-1140 (2013).
  7. Kim, H. J., Li, H., Collins, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), E7-E15 (2016).
  8. Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1 (5), s41551-017-0069–017 (2017).
  9. Somayaji, M. R., Das, D., Przekwas, A. Computational approaches for modeling and analysis of human-on-chip systems for drug testing and characterization. Drug Discovery Today. 21 (12), 1859-1862 (2016).
  10. Prantil-Baun, R., et al. Physiologically Based Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis Enabled by Microfluidically Linked Organs-on-Chips. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 58 (1), 37-64 (2018).
  11. Mahler, G. J., Esch, M. B., Stokol, T., Hickman, J. J., Shuler, M. L. Body-on-a-chip systems for animal-free toxicity testing. Alternatives to laboratory animals: ATLA. 44 (5), 469-478 (2016).
  12. Miller, P. G., Shuler, M. L. Design and demonstration of a pumpless 14 compartment microphysiological system. Biotechnology and Bioengineering. 113 (10), 2213-2227 (2016).
  13. Coppeta, J. R., et al. A portable and reconfigurable multi-organ platform for drug development with onboard microfluidic flow control. Lab Chip. 17 (1), 134-144 (2016).
  14. Wikswo, J. P., et al. Scaling and systems biology for integrating multiple organs-on-a-chip. Lab on a Chip. 13 (18), 3496-3511 (2013).
  15. Sung, J. H., et al. Using PBPK guided "Body-on-a-Chip" Systems to Predict Mammalian Response to Drug and Chemical Exposure. Experimental biology and medicine (Maywood, N.J.). 239 (9), 1225-1239 (2014).
  16. Stokes, C., Cirit, M., Lauffenburger, D. Physiome-on-a-Chip: The Challenge of "Scaling" in Design, Operation, and Translation of Microphysiological Systems. CPT: Pharmacometrics & Systems Pharmacology. 4 (10), 559-562 (2015).
  17. Shirure, V. S., George, S. C. Design considerations to minimize the impact of drug absorption in polymer-based organ-on-a-chip platforms. Lab Chip. , (2017).
  18. Huh, D., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nature Protocols. 8 (11), 2135-2157 (2013).
  19. Tran, T. T., et al. Exact kinetic analysis of passive transport across a polarized confluent MDCK cell monolayer modeled as a single barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 93 (8), 2108-2123 (2004).
  20. Henry, O. Y. F., et al. Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function. Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).
  21. Maoz, B. M., et al. Organs-on-Chips with combined multi-electrode array and transepithelial electrical resistance measurement capabilities. Lab on a Chip. 17 (13), 2294-2302 (2017).
  22. Benam, K. H., et al. Matched-Comparative Modeling of Normal and Diseased Human Airway Responses Using a Microengineered Breathing Lung Chip. Cell Systems. 3 (5), 456-466 (2016).

Tags

Bioteknik fråga 140 Organ-på-ett-chip microphysiological system ultrakalla mikrofabrikation PDMS porösa membran microchannel cykliska stam perfusion

Erratum

Formal Correction: Erratum: Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips
Posted by JoVE Editors on 05/08/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips.  The Representative Results, Discussion, and References sections have been updated.

In the Representative Results section, the legend for Figure 5 has been updated from:

Figure 5: Permeability of inert tracer Cascade Blue through the microporous PDMS membrane. Cascade Blue hydrazide dye in medium was loaded into the top channel of the Organ Chip and perfused at 60 µL/h to measure the flux of the dye across the membrane into the bottom channel containing medium. Empty chips were compared to Gut Chips with Caco2-BBe1 cells in the apical channel and human vascular endothelial cells (HUVEC) in the basal channel cultured for 6 days. Error bars indicate standard error of the mean.

to:

Figure 5: Permeability of inert tracer Cascade Blue through the microporous PDMS membrane. Cascade Blue hydrazide dye in medium was loaded into the top channel of the Organ Chip and perfused at 60 µl/h to measure the flux of the dye across the membrane into the bottom channel containing medium. Empty chips were compared to Gut Chips with Caco2-BBe1 cells in the apical channel and human vascular endothelial cells (HUVEC) in the basal channel cultured for 6 days. The apparent permeability (Papp, cm/s) of the microporous PDMS membrane was determined using the dye concentration in the outlet channels. The gut chip cell layers provide a significantly increased barrier to permeability. Error bars indicate standard error of the mean. 

In the Discussion section, the fourth paragraph has been updated from:

Troubleshooting the resulting Organ Chips takes place at two levels: during the fabrication process and during Organ Chip culture. We have developed a visual method for quality assurance (QA) of through-hole formation in the cast membranes that greatly accelerates the production process while improving the quality and reliability of assembled Organ Chips. This QA method allows for process troubleshooting, and we recommend keeping a record of process conditions to enable tracking fabrication problems that may occur during cell culture. During Organ Chip culture, inert tracer dyes are the simplest method of measuring barrier function to troubleshoot the fabrication process and cell culture steps. Lucifer Yellow has been used historically due to its small molecular mass and innate fluorescence, but Cascade Blue offers similar properties with a narrower emission spectrum that is less likely to interfere with downstream assays. Larger molecules, such as poly-ethyleneglycol (PEG)- or dextran-conjugated fluorophores are larger and consequently result in lower permeability overall and lower sensitivity. The apparent permeability (Papp, cm/s) of tracer dyes can be used to determine barrier function properties of organs or tissues (Figure 4). The following equation can be used to calculate Papp between the dosing channel and receiving channel and is derived from equations used primarily for Transwell studies19,20 and corrects for tracer dye loss caused by absorption into PDMS by comparing the two output flows and not relying on mass balance assumptions at the outflow.

Equation 1

to:

Troubleshooting the resulting Organ Chips takes place at two levels: during the fabrication process and during Organ Chip culture. We have developed a visual method for quality assurance (QA) of through-hole formation in the cast membranes that greatly accelerates the production process while improving the quality and reliability of assembled Organ Chips. This QA method allows for process troubleshooting, and we recommend keeping a record of process conditions to enable tracking fabrication problems that may occur during cell culture. During Organ Chip culture, inert tracer dyes are the simplest method of measuring barrier function to troubleshoot the fabrication process and cell culture steps. Lucifer Yellow has been used historically due to its small molecular mass and innate fluorescence, but Cascade Blue offers similar properties with a narrower emission spectrum that is less likely to interfere with downstream assays. Larger molecules, such as poly-ethyleneglycol (PEG)- or dextran-conjugated fluorophores are larger and consequently result in lower permeability overall and lower sensitivity. The apparent permeability (Papp, cm/s) of tracer dyes can be used to determine barrier function properties of organs or tissues (Figure 5). The following equation derived by Tran, et al.19 can be used to calculate Papp between the dosing channel and receiving channel, which partially corrects for tracer dye loss caused by absorption into PDMS by averaging the two output flows and not relying on mass balance assumptions at the outflow.

Equation 1

The References section has been updated from:

  1. Blaser, D.W. Determination of drug absorption parameters in Caco-2 cell monolayers with a mathematical model encompassing passive diffusion, carrier-mediated efflux, non-specific binding and phase II metabolism. at <http://edoc.unibas.ch/655/1/DissB_7998.pdf> (2007).
  2. Hubatsch, I., Ragnarsson, E.G.E., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nature Protocols. 2 (9), 2111-2119 (2007).
  3. Henry, O.Y.F. et al. Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function. Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).
  4. Maoz, B.M. et al. Organs-on-Chips with combined multi-electrode array and transepithelial electrical resistance measurement capabilities. Lab on a Chip. 17 (13), 2294-2302 (2017).
  5. Benam, K.H. et al. Matched-Comparative Modeling of Normal and Diseased Human Airway Responses Using a Microengineered Breathing Lung Chip. Cell Systems. 3 (5), 456-466.e4 (2016).

to:

  1. Tran, T.T. et al. Exact kinetic analysis of passive transport across a polarized confluent MDCK cell monolayer modeled as a single barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 93 (8), 2108–2123 (2004).
  2. Henry, O.Y.F. et al. Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function. Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).
  3. Maoz, B.M. et al. Organs-on-Chips with combined multi-electrode array and transepithelial electrical resistance measurement capabilities. Lab on a Chip. 17 (13), 2294-2302 (2017).
  4. Benam, K.H. et al. Matched-Comparative Modeling of Normal and Diseased Human Airway Responses Using a Microengineered Breathing Lung Chip. Cell Systems. 3 (5), 456-466.e4 (2016).
Skalbar tillverkning av töjbart, Dual Channel, ultrakalla orgel Chips
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Novak, R., Didier, M., Calamari, E., More

Novak, R., Didier, M., Calamari, E., Ng, C. F., Choe, Y., Clauson, S. L., Nestor, B. A., Puerta, J., Fleming, R., Firoozinezhad, S. J., Ingber, D. E. Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips. J. Vis. Exp. (140), e58151, doi:10.3791/58151 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter