Summary
توضح هذه المقالة بالتفصيل أسلوب يقوم على جسيمات نانوية فضية لتخفيف المتلازمة الكبدية الصفراوية في طراز ماوس الكبدية الصفراوية تجريبية. سوف يساعد فهم راسخ لعملية إعداد كاشف وتقنية حقن الفأر الولدان تعريف الباحثين بالطريقة التي استخدمت في دراسات نموذجية الماوس الأطفال حديثي الولادة.
Abstract
الكبدية الصفراوية (BA) هو نوع شديد من التهاب الأوعية الصفراوية مع ارتفاع معدل الوفيات في الأطفال منها المسببات: هو لا تزال غير مفهومة تماما. الالتهابات الفيروسية قد يكون أحد الأسباب المحتملة. يحدد نموذج الحيوان النموذجية المستخدمة لدراسة درجة البكالوريوس تطعيم ماوس حديثي الولادة مع فيروس روتا الريسوسي. جسيمات فضة نانوية قد ثبت أن ممارسة تأثيرات مضادة للجراثيم والمضادة للفيروسات؛ يتم تقييم وظيفتها في طراز الماوس با في هذه الدراسة. حاليا، في التجارب على الحيوانات با، الأساليب المستخدمة لتحسين أعراض الفئران با الأعراض عموما علاجات تعطي عن طريق الأغذية أو الأدوية الأخرى. الهدف من هذه الدراسة هو إظهار أسلوب جديد لتخفيف متلازمة با في الفئران بحقن داخل جسيمات فضة نانوية وتوفير طرق مفصلة لإعداد صياغة جل نانوحبيبات الفضة. هذه الطريقة بسيطة وقابلة للتطبيق على نطاق واسع ويمكن استخدامها لإجراء بحوث إليه مكتبة الإسكندرية، وكذلك في العلاج السريري. استناداً إلى نموذج الماوس با، عند الفئران يحمل اليرقان، هلام نانوحبيبات الفضة استعداد يتم حقن إينترابيريتونيلي على سطح الكبد أقل. لوحظ في حالة البقاء على قيد الحياة، وهي دراسة المؤشرات البيوكيميائية والتشريح المرضى الكبد. يسمح هذا الأسلوب فهم أكثر بديهية لكلا إنشاء نموذج با ورواية با العلاج.
Introduction
با شكل من ركود صفراوي تتسم باستمرار اليرقان وارتفاع معدل الوفيات في غياب زرع الكبد. الالتهابات الفيروسية ترتبط ارتباطاً وثيقا بالآلية المرضية لمكتبة الإسكندرية. الفيروس المضخم للخلايا، ريوفيروس، وفيروس روتا جميعا قد اقترحت كممرضات في مكتبة الإسكندرية1،،من23. خلال فترة الوليد، استجابة النظام المناعي غير ناضجة لالتهاب فيروسي يؤدي إلى التقلبات محصنة ضد القنوات الصفراوية إضافية-وأحيانا، مما يؤدي إلى استموات الخلايا الظهارية الصفراوية، تسلل الخلايا الملتهبة في المدخل المنطقة، وانسداد القناة الصفراوية أحياناً واكستراهيباتيك، وأخيراً، تليف الكبد4،،من56.
نموذج الحيوان استخداماً للدراسات با ينطوي على تلقيح ماوس الوليد بفيروس الروتا الريسوسي (RRV). عادة ما تضع الماوس اليرقان بعد 5-6 أيام، عرض على وزن جسم منخفض والبراز أتشوليك. ويتمثل دور الاستجابة المناعية في عملية المرض الحرجة، خاصة بالنسبة للخلايا (ناغورني كاراباخ) القاتل الطبيعية؛ استنفاد هذه الخلايا مع الأجسام المضادة NKG2D يقلل كثيرا من الأضرار التي يسببها با7. وعلاوة على ذلك، الخلايا الأخرى، بما في ذلك خلايا CD4+ تي خلايا CD8+ تي الخلايا والخلايا الجذعية والخلايا التائية التنظيمية، الجميع تبين أن تلعب أدواراً في المرض8،9،،من1011. كافة البيانات تشير إلى طبيعة الجهاز المناعي أثناء با لا غنى عنه.
جسيمات فضة نانوية (أجنبس) أثبتت أن تكون لها آثار مفيدة ضد بعض الأمراض المعدية، بما في ذلك12 من الإصابات البكتيرية والالتهابات الفيروسية13،،من1415. بيد عدا استخدام الأمراض الجلدية، ودراسات قليلة استخدمت أجنبس في علاج السريري، معظمهم بسبب سميتها المحتملة. في التجارب على الحيوانات، وقد درس الباحثون عموما فعالية أجنبس تدار عن طريق الفم16 أو17من طرق الحقن الوريدي. ومع ذلك، لا باحثين آخرين درسوا فعالية أجنبس تدار عن طريق حقنه داخل (القائمة) في الماوس الولدان والتجارب، الذي هو طريقة بسيطة وسريعة تؤدي إلى تأثير مباشر أكثر في الكبد والقناة الصفراوية أثناء تقليل السمية إلى أنظمة أخرى مثل نظام المناعة. أجنبس قد ثبت أن تؤثر على نشاط الخلية ناغورني كاراباخ18؛ ولذلك، نحن اختبار الآثار العلاجية من أجنبس تدار عن طريق الحقن القائمة في نموذج الماوس با.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع البروتوكولات التجريبية الحيوانية أقرتها لجنة استخدام صن يأت-صن الجامعة مختبر الحيوان مركز (#إياكوك-DB-16-0602) ورعاية الحيوان المؤسسية.
1-إنشاء نموذج الماوس الكبدية الصفراوية
- الحفاظ على الحوامل بالب/ج الفئران في بيئة خالية من مسببات الأمراض محددة ضمن دورة الظلام/ضوء ح 12 عند 25 درجة مئوية، مع إمكانية الوصول إلى تشو يعقم libitum الإعلانية.
- إعداد سلالة RRV MMU 18006 وتضخيم الفيروس في الخلايا MA104 وقياس التتر الفيروسية ب مقايسة البلاك19.
ملاحظة: الخلايا MA104 تستزرع في المتوسطة تعديل النسر دولبيكو (دميم) مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) في حاضنة مع جو هوميديفيد التي تحتوي على 5% CO2. فيما يلي بإيجاز الخطوات التضخيم.- تصيب الخلايا MA104 (1.5 × 107) في قارورة ثقافة2 سم 150 مع تنشيط التربسين RRV [1.5 × 106 وحدات تشكيل اللوحة (بفو)] في 30 مل متوسط خالية من المصل. احتضان الخلايا المصابة لمدة 3 أيام في حاضنة هوميديفيد عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
- الخلايا المصابة في قارورة الثقافة بثلاث دورات التجميد والذوبان، مع 20 دقيقة في ثلاجة-80 درجة مئوية لتجميد كل مرحلة، وذوبان الخلايا، ثم مرة أخرى إلى درجة حرارة الغرفة؛ سوف تطلق الجسيمات الفيروسات المرتبطة بالخلية في المادة طافية. ثم جمع ونقل الخلية ليستي والثقافة طافية في أنبوب مخروطي 15 مل.
- إزالة الحطام الخلوية الكبيرة من بالطرد المركزي ذات سرعة منخفضة (300 x ز عند 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق). ثم قم بنقل المادة طافية المحتوية على الفيروس (حوالي 6 مل) في أنبوب 15 مل مخروطية الشكل جديد للتجارب على الحيوانات.
ملاحظة: RRV ثم مستعدة لأن تكون تيتيريد أو الكوتيد، والمخزنة أو المستخدمة لجولات إضافية من التضخيم. التعرض الطويل الأمد لدرجة حرارة الغرفة وسوف تقلل من قدرة العدوى الفيروسية؛ ينبغي أن توضع على الجليد الفيروس والمخزنة في-80 درجة مئوية أو في نيتروجين سائل.
- تحميل RRV إلى الأنسولين صغيرة حجم (1 مل) المحاقن بإبرة ز 29 لحقن الفأر حديثي الولادة.
ملاحظة: سميكة الإبر من المحاقن الحجمي يؤدي بسهولة إلى تسرب المخدرات. - خلال 24 ساعة ولادة، إدارة لكل ميليلتر الوليد 20 من 1.2 × 105 RRV بفو/مل عبر مسار القائمة؛ استخدم نفس الحجم من المياه المالحة كعنصر التحكم.
ملاحظة: المحاقن المستخدمة في هذه التجربة حقنه الأنسولين 1 مل. الفئران المصابة غذيت لا عن طريق أمهاتهم توفي خلال أول يومين بسبب أسباب أخرى لم تدرج في التحليل. - ملاحظة جميع الفئران حديثي الولادة عن كثب وتزن لهم يوميا. عادة، في اليوم السادس بعد التلقيح RRV، يظهر اليرقان على الأذنين والجلد العارية، يصبح البراز من الصلصال الملون، والفراء يصبح الزيتية، مما يوحي بإنشاء نموذج مكتبة الإسكندرية؛ التحقق من وجود هذه الأعراض.
ملاحظة: يمكن تأكيد با بإجراء فحص أنسجة كبد مقطع مع ح & ه وتفيد المناعي. ثم مستعدون الفئران با لعلاج عنب.
تنبيه: البروتوكول قدم للاستخدام مع المعاصرة الإنسان والحيوان RV السلالات، التي يجب أن تعالج ضمن شروط السلامة البيولوجية المستوى 2 (BSL-2).
2-الفضة نانوحبيبات التوليف
- إعداد وتوصيف أجنبس كما هو موضح سابقا12،20.
ملاحظة: تفاصيل الإعداد وتميز في أجنبس وقد وصف في منشورات فريق جيم م تشي في قسم الكيمياء، جامعة هونج كونج12،20. وكان تركيز الحل النهائي 1 مم. قطر يعني أجنبس كان 10 نانومتر (تتراوح بين 5 إلى 15 نانومتر) وأكدت بالميكروسكوب الإلكتروني.
3-إعداد خليط الفضة نانوحبيبات الكولاجين
ملاحظة: إعداد مزيج الكولاجين في عنب وتتسم كما تم وصفه سابقا21 وتخزينها في 4 درجات مئوية. يجب إجراء كافة الإجراءات على الجليد.
- أولاً، من أجل إعداد الكولاجين، إضافة 490 ميليلتر من النوع الأول من الكولاجين (4 مغ/مل) لأنبوب 1.5 مل ووضعه على الجليد.
- إضافة 100 ميليلتر من الفوسفات مخزنة المالحة (برنامج تلفزيوني، 10 x) إلى الكولاجين ومزجها مع ماصة.
- لتحضير 1 لتر x 10 برنامج تلفزيوني المخزن المؤقت، الجمع بين 80 جرام من كلوريد الصوديوم وز 2 من بوكل ز 35.8 Na2هبو4. 12 ح2س إلى 2.4 ز خ2ص4 ومخزن المخزن المؤقت في درجة حرارة الغرفة.
- ثم إضافة 10 ميليلتر من هيدروكسيد الصوديوم (0.2 M) إلى الحل أعلاه.
- لإعداد 0.2 M هيدروكسيد الصوديوم، إضافة 8 غم مسحوق هيدروكسيد الصوديوم إلى 1 لتر ماء المقطر.
- وأخيراً، إضافة 400 ميليلتر من أجنبس (1 مم) إلى الكولاجين ومزجها مع ماصة.
ملاحظة: إضافة أجنبس آخر لخلط حتى. يجب أن يتم تخزين المخلوط الكولاجين عنب عند 4 درجة مئوية؛ وبخلاف ذلك، فإنه بسهولة يتصلب في درجة حرارة الغرفة.
4-أسلوب الحقن الماوس
- إدارة الفئران حديثي الولادة المصابين في المجموعة RRV تعامل مع حقن القائمة من 50 ميليلتر في عنب خليط الكولاجين بعد ظهور اليرقان؛ إجراء حقن ثانية د 3 في وقت لاحق.
ملاحظة: يتم إعطاء الفئران في المجموعة (مراقبة المصابة) RRV التحكم نفس الحجم من المحلول الملحي، والفئران في مجموعة التحكم العادية لا تعطي أي علاج. - في بداية الحقن، اضغط الساق الماوس مع الإصبع خاتم منحرف على الفخذ الأيمن، وإدخال الإبرة ببطء بزاوية 15 درجة (الشكل 1). عند الوصول إلى سطح الحافة السفلية للكبد (الشكل 2)، حوالي 0.5 سم في، حقن مزيج الكولاجين في عنب؛ وبعد ذلك، سحب الإبرة ببطء.
ملاحظة: ينبغي الحرص على عدم إدخال أي الهواء في المحاقن ك، ثم، قد يكون قتل الماوس الأطفال حديثي الولادة. في الفئران حديثي الولادة، المعدة والطحال في البطن الأيسر، وبطنه مليء بالحليب. إذا الحقن تدار من هذا الجانب، يمكن بسهولة إدخال الإبرة أما المعدة، مما تسبب في اللبن في التدفق إلى تجويف البطن، أو الطحال، مما تسبب في نزيف.
تنبيه: الاهتمام بالإبرة لمنع أي إصابات الأصابع، وتأكد من استبدال الغطاء إبرة وإزالة الإبرة، ووضعه في حاوية الأدوات الحادة. - بعد جميع الحقن، الحفاظ على الفئران من اقفاصها لمدة 10 دقيقة للسماح الخليط الكولاجين عنب لجل ومنع الأم من لعق مكان الحقن. ثم العودة الفئران إلى اقفاصها.
- مراقبة وتسجيل المظاهر المادية لجميع الفئران يوميا، بما في ذلك اليرقان ووزن الجسم، فضلا عن أن معدل البقاء على قيد الحياة.
5-الدم عينة جمع
ملاحظة: يتم جمع عينات دم من حوالي 120 ميليلتر بإدخال الإبرة في القلب. بعد الطرد المركزي، هو المصل المجمعة (ميليلتر حوالي 70) لاختبار وظيفة الكبد. طريقة جمع الدم كما يلي.
- تخدير الفئران في اليوم التاسع والثاني عشر بعد التلقيح RRV (و 3 أيام بعد العلاج عنب) باستخدام 0.5-2.5 ٪ سيفوفلوراني.
- شل أطرافه الماوس وتعقيم البطن العلوي والسفلي مع 75 ٪ من الكحول.
- كشف الحجاب الحاجز عن طريق قطع الماوس الجلد والعضلات والصفاق على طول خط الوسط الرهابه مع مقص؛ استخدم مسحه القطن معقم لإزالة الجهاز الهضمي لفضح تماما في عضلة الحجاب الحاجز.
- إدراج الإبرة (مع حقنه الأنسولين تفريغ 1 مل) في البطين الأيسر للقلب وبطء سحب المكبس حقنه للحصول على حجم الدم كحد أقصى. ثم قم بنقل الدم إلى أنبوب 1.5 مل.
- يسمح الأنبوب إلى الوقوف لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة والطرد المركزي أنه لمدة 5 دقائق في 400 x غ. ثم، باستخدام ماصة نقل، جمع وحفظ المصل لاستخدامها مرة أخرى.
ملاحظة: تجنب إتلاف الحاجز، كالحجاب الحاجز العيوب يؤدي بسهولة إلى استرواح الصدر، والموت، وتخثر الدم، مما يحول دون جمع عينة الدم.
6-اكتشاف المعلمة الكيمياء الحيوية
- استخدام مصل الدم التي تم جمعها في الخطوة 5، 5 للكشف عن معلمة الكيمياء الحيوية.
- استخدام محلل بيوكيميائية الآلي الكشف عن المعلمات البيوكيميائية التالية: aminotransferase ألانين (البديل)، أمينوترانسفيراسي اسبارتاتي (أست)، الفوسفاتيز القلوية (حزب العمال الأسترالي)، البروتين الكلي (TP)، الزلال (القلب)، الجلوبيولين (GLO)، ومجموع البيليروبين (تبيل)، البيليروبين المباشر (دبيل)، البيليروبين غير المباشر (أبل)، وإجمالي الأحماض الصفراوية (يعلن عنها لاحقاً).
7-اكستراهيباتيك تشولانجيوجرافي لمراقبة سالكيه القناة الصفراوية اكستراهيباتيك
ملاحظة: تنفيذ العملية بأكملها تحت مجهر تشريح.
- كشف تماما في الكبد، والمرارة والقنوات الصفراوية extrahepatic مع مسحه القطن.
- مراقبة وتصوير مظهر الكبد والقناة الصفراوية تحت مجهر تشريح.
- استخدام الملقط العيون بلطف عقد الجزء السفلي من المرارة.
- تحميل 1 مل حقنه بمحلول أزرق الميثيلين (wt.% 0.05 في ح2س). أدخل إبرة حقنه ببطء في تجويف المرارة؛ ثم أمسك الإبرة مع الملقط العيون، ويبث ببطء 10 – 20 ميليلتر من الميثيلين الأزرق.
- مراقبة تحت مجهر ما إذا كان اللون الأزرق يمر عبر الصفراوية اكستراهيباتيك إلى الصائم وأخذ صورة فوتوغرافية.
8-جمع عينات الكبد الطازج توضع وتلطيخ ويوزين
- إصلاح الماوس جديدة أنسجة الكبد بين عشية وضحاها في الفورمالين 10%.
- ثم تضمين أنسجة الكبد الثابتة في البارافين وقسم منهم.
- دو المقاطع، ترطيب لهم مع سلسلة إيثانول (مثل الإيثانول 100%، 95%، 80%، و 70% في الماء المقطر، كل منهما لمدة 5 دقائق)، ووصمة عار أقسام الأنسجة مع توضع، وإخضاعها لتفريق الكحول حمض الهيدروكلوريك 1%، وأخيراً، وصمة عار مقاطع مع ويوزين.
- وأخيراً، نلاحظ الأنسجة الكبد تحت مجهر X 40.
9-المناعي تلطيخ الأنسجة الملطخة ثم قسمي وتوضع
- بعد ديواكسينج وريهيدراتينج المقاطع، القيام استرجاع مستضد غمر المقاطع في تريس يدتا المخزن المؤقت (قاعدة تريس 10 ملم، والحل يدتا 1 مم؛ pH 9.0) وتدفئة لهم في فرن ميكروويف لمدة 10 دقائق عند 95 درجة مئوية.
- إزالة البيروكسيديز الذاتية بفضح مقاطع الأنسجة لمدة 10 دقيقة لحل بيروكسيد الهيدروجين 3%.
- علاج المقاطع مع مصل الماعز 5%، لمنع الربط غير محدد.
- إضافة الأجسام المضادة الأولية أرنب-ماوس NKG2D (1: 100) للفروع، واحتضان هذه بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- احتضان الفروع مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة (المسمى HRP البوليمر أرنب المناهضة النظام) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- تصور المناعي تلطيخ استخدام 3، 3 '--ديامينوبينزيديني (DAB) تشروموجين.
- مراقبة الأقسام تحت مجهر X 40، والحصول على الصور، والشروع في تحليل هذه كما هو مطلوب.
10-تدفق سيتوميتريك التحليل
- بلطف فرم نسيج الكبد، يمر عبر مصفاة خلية 70 ميكرومتر، والطرد المركزي هو 2 x في x 270 ز عند 4 درجة مئوية لمدة 4 دقائق.
- ريسوسبيند بيليه خلية في المتوسط RPMI 1640 ونحللها باللونين الفلورة استخدام الأجسام المضادة.
- أداء فينوتيبينج الخلوية باستخدام علامات سطح الخلية المحددة، بما في ذلك fluorescein isothiocyanate و phycoerythrin مترافق مكافحة--NKp46 (لمفاوية ناغورني كاراباخ؛ 1:1، 000) ومكافحة-CD4 (تي خلية نوع فرعي؛ 1:1، 000)، مع سيتوميتير تدفق البيانات وتحليلها مع التدفق الخلوي برامج تحليل البيانات.
- حدد الخلية السكان وفقا للأمام/الجانب مبعثر، البوابة وفقا لضوابط ايستب للأسفار أي خلفية، وإخضاع البيانات لتحليل ثانوي استناداً إلى إشارات الأسفار من الأجسام المضادة للأفراد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
استناداً إلى نموذج الماوس با الراسخة، كانت تدار من الفئران حديثي الولادة المصابين حقنه القائمة في عنب استعداد خليط الكولاجين 2 x بعد العارضة اليرقان. تم التحقق من بقاء الماوس يوميا، وأجريت اختبارات وظائف الكبد وأمراض الكبد، والتدفق الخلوي. مقارنة بالفئران غير المعالجة التحكم با، أظهرت انخفاض اليرقان الفئران المعالجة عنب والحفاظ على وزن الجسم العادي (الشكل 3). مستويات استقلاب البيليروبين و transaminase كبدي انخفض إلى قيم عنصر تحكم عادي، مما يوحي بأن أجنبس تحسنت وظيفة الكبد (الجدول 1). وأكد تشولانجيوجرافي اكستراهيباتيك (الشكل 4) مع صبغة أزرق الميثيلين سالكيه القناة الصفراوية بعد العلاج عنب. ح & ه تلطيخ (الشكل 5) أظهر تسلل خلية تحريضية انخفضت إلى حد كبير في منطقة المدخل الكبدية للفئران تعامل مع أجنبس، مقارنة بالفئران التحكم. وأظهرت نتائج الخلوي تدفق الخلايا ناغورني كاراباخ أقل بشكل ملحوظ في الكبد بعد العلاجات عنب (سواء في أيام 9 و 12) من الفئران RRV (الشكل 6). المناعي تلطيخ كشفت عن تعبير إلى حد كبير انخفاض علامة الخلية ناغورني كاراباخ NKG2D (الشكل 7) في ثالوث المدخل من الفئران المعالجة عنب، مقارنة بالفئران RRV.
رقم 1: الأولى حقنه اختراق الموقف. خط منقط أحمر يشير إلى الخط الموازي في البطن من الماوس P6 الأطفال حديثي الولادة؛ السهم الأصفر يشير إلى نقطة إبرة؛ يشير السهم الأحمر إلى زاوية الإبرة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: إبرة الوصول إلى سطح الحافة السفلية للكبد. خط منقط الأصفر يشير إلى الحافة السفلي لكبد الفأر؛ السهم الأحمر يشير إلى موضع الإبرة أثناء الحقن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: تأثير أجنبس على متلازمة با في نموذج تجريبي لماوس با- (أ) هذا الفريق يظهر مظهر الفئران حديثي الولادة في أيام 9 و 12 بعد حقنه مع RRV وحدها وأيام 3 و 6 أيام بعد حقنه مع أجنبس (RRV + أجنبس). (ب) هذا الفريق يوضح وزن الفئران في كل مجموعة في نقاط زمنية مختلفة؛ العاشر-المحور يشير إلى عدد الأيام بعد ولدت الماوس و y-المحور يشير إلى إضعاف-التغيير في وزن الجسم. ف < 0.01 مع الطالب t-اختبار مقارنة RRV + عنب المجموعة إلى مجموعة مراقبة RRV؛ n = 16 في مجموعة مراقبة، n = 18 في المجموعة RRV و ن = 17 في عنب + RRV المجموعة. (ج) هذا الفريق معدل البقاء على قيد الحياة من الفئران في كل مجموعة. وقد تم تعديل هذا الرقم من تشانغ et al. 18- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: تشولانجيوجرافي اكستراهيباتيك- وكان يستخدم عامل تباين للكشف عن سالكيه الصفراوية اكستراهيباتيك والتقاط الصور. خط منقط أزرق يشير إلى اتجاه القناة الصفراوية اكستراهيباتيك؛ يشير السهم الأحمر إلى تضييق القناة الصفراوية المشتركة؛ السهم الأسود يشير إلى مكتبة الإسكندرية. مقياس بار = 1 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: ح & ه تلطيخ. أنسجة الكبد من الفئران في كل مجموعة في أيام 9 و 12 تم جمعها وثابت ومقطوع وملطخة H & هاء المختصرات: PV = الوريد البابي، دينار بحريني = القناة الصفراوية. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من تشانغ et al. 18- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: نسبة مئوية من ناغورني كاراباخ الخلايا في نسيج الكبد. (أ) جهزت في كبد الفئران في تعليق خلية في أيام 9 و 12، وتم الكشف عن نسبة الخلايا ناغورني كاراباخ بالتدفق الخلوي. (ب) هذا الفريق ويبين النسبة المئوية للخلايا ناغورني كاراباخ (NKp46+CD4+) في كل مجموعة في نقاط زمنية مختلفة بعد حقن عنب. Y-المحور يشير إلى إضعاف-التغير في النسبة المئوية للخلايا ناغورني كاراباخ، التي تم حسابها مقارنة بالنسب المئوية للسيطرة على المجموعة في يوم 9 ويوم 12.* *P < 0.01 و *ف < 0.05، مع الطالب t-اختبار مقارنة RRV + أجنب المجموعة إلى مجموعة مراقبة RRV، n = 10 في كل مجموعة. وقد تم تعديل هذا الرقم من تشانغ et al. 18- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 7: المناعي تلطيخ لعلامة الخلية ناغورني كاراباخ NKG2D في منطقة المدخل من الفئران في كل مجموعة العلاج. تم الكشف عن التعبير عن علامة الخلية ناغورني كاراباخ NKG2D في منطقة المدخل من الفئران في كل مجموعة العلاج تلطيخ المناعي. وتشير الأسهم طويلة إلى الصفراوية؛ الأسهم قصيرة تشير إلى الخلايا ناغورني-كاراباخ. المختصرات: PV: الوريد البابي، دينار بحريني: القناة الصفراوية. بار سكالي = 50 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من تشانغ et al. 18- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الجدول 1: فحص المختبرات السريرية من مستويات المصل جزيء المتصلة بوظيفة الكبد. تم استخدام الدم المحيطي لقياس وظيفة الكبد في الفئران في كل مجموعة. ALT: ألانين aminotransferase، AST: اسبارتاتي aminotransferase، الب: الفوسفاتيز القلوية، TP: مجموع البروتين، القلب: الزلال، GLO: الجلوبيولين، تبيل: مجموع البيليروبين، دبل: البيليروبين المباشر، أبل: البيليروبين غير المباشر، والقابلات التقليديات = مجموع الأحماض الصفراوية. ف < 0.05 و * *ف < 0.01، مع الطالب t-اختبار لكل فوج مقارنة بالمجموعة وحدها، RRV ن = 10 في كل مجموعة. يتم عرض كافة بيانات المؤشرات البيوكيميائية يعني ± التنمية المستدامة. وكانت جميع الفئران في المجموعات الثلاث القديمة 12 يوما. وقد تم تعديل هذا الجدول من تشانغ et al. 18- اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أجنبس يحمل خصائص مضادة للجراثيم واسعة الطيف قوية ونفاذيه قوية22؛ بالإضافة إلى ذلك، يتم استخدامها لإنتاج مجموعة من المنتجات المضادة للبكتيريا الطبية23. ومع ذلك، أجنبس يمكن أن يستغرق وقتاً طويلاً لمسح مرة واحدة أنها تتراكم في الأعضاء، واستمرار هذه قد تؤدي إلى تأثيرات سامة24،25. دراسة سابقة درست السمية الحادة وسمية جينية من أجنبس بعد حقنه واحدة رابعا في تجربة الفئران، وأظهرت النتائج أن أجنبس يمكن أن يسبب تلف الكلي والكبد الحاد. أجنبس المتراكمة في أجهزة النظام المناعي الرئيسية، بما في ذلك الغدة الصعترية و الطحال17. في هذا النموذج با الماوس، تحسن المعاملة مع أجنبس متلازمة با، الذي تشير البيانات المتوفرة لدينا هو جزئيا بوساطة من تثبيط الخلية ناغورني-كاراباخ. بيد أن الآثار الطويلة الأجل أجنبس تتطلب إجراء تحقيقات إضافية، لتقييم السمية المحتملة لوضع الماوس والتنظيم المناعي.
من حيث الأسلوب، بعض الملاحظات الإضافية لعملية جراحية ناجحة كما يلي: (ط) عملية إعداد مزيج الكولاجين في عنب يجب أن تنفذ على الجليد لأنه، في درجة حرارة الغرفة، سوف تصبح مزيج الكولاجين في عنب بسرعة هلام شبه صلبة، التي لا يمكن استخدامه للحقن. بعد الإعداد، يجب تخزين خليط الكولاجين في عنب في 4 درجات مئوية. (ثانيا) ينبغي أن تستخدم 1 مل الأنسولين المحاقن فقط بسبب قطرها صغير، مما يقلل من تسرب المخدرات الحقن. عموما بحثت الدراسات السابقة (ثالثا) أثر أجنبس فموياً16 أو عن طريق الحقن الوريدي17. لدينا تجارب على الحيوانات، هي مواضيع تجريبية الفئران حديثي الولادة؛ وهكذا، الحقن الوريدي يكاد يكون من المستحيل، واستخدمنا حقنه القائمة. حقن أجنبس تحسن أعراض با في الفئران. (رابعا) في بداية الحقن، يتم إصلاحها السفلية للماوس باليد للحيلولة دون تحريك الماوس. يضمن لك هذا الأسلوب أن الحق في كمية المخدرات يحقن تجويف البطن دون أي تسرب، وكذلك الضمانات نجاعة التجربة. (v) في الفئران حديثي الولادة، المعدة والطحال في البطن الأيسر، وامتلاء المعدة من الحليب. لحقن الخليط عنب إلى سطح الحافة السفلية للكبد، يتم إدراج الإبرة من فوق الفخذ الأيمن للماوس. إذا تم إدخال الإبرة من الجانب الأيسر، فإنه يمكن بسهولة ثقب أما المعدة، مما تسبب في اللبن في التدفق إلى تجويف البطن، أو الطحال، مما تسبب في النزيف. (سادسا) نظراً لأن جدار البطن في الفئران حديثي الولادة رقيقة، ويمكن منع تسرب المخدرات بالنهوض بشكل قطري الإبرة بزاوية 15 درجة قريبة من جدار البطن للوصول إلى الحافة السفلية للكبد.
وقد لاحظنا أثر أجنبس في هذا الفأر المستحثة RRV النموذجي با مشجعة. جنبا إلى جنب مع الدراسات السابقة التي تستخدم أجنبس في علاج الإصابات متفاوتة بالفيروسات والأمراض، هذه البيانات في عنب توحي بإمكانية التطبيق في فيفو في الإصابات بالفيروسات. الحد من هذه التجارب هو أن الدوائية أجنبس ليست واضحة تماما، نظراً لعدم وجود طرق القياس أجنبس، مما يجعل من الصعب التحكم في عنب جرعات. أيضا الحاجة إلى مزيد من الدراسة المستهدفة داخل الخلايا من أجنبس، التي سوف تساعدنا على فهم الآلية والحد من الآثار الجانبية في علاج الأمراض مستقبلا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وكانت أجنبس المستخدمة هنا هدية من جيم تشي م. في قسم الكيمياء، جامعة هونغ كونغ. تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية (رقم 81600399) والعلوم والتكنولوجيا المشروع من قوانغتشو (No.201707010014).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/c mouse | Guangdong Medical Experimental Animal Center | SYXK2017-0174 | Animal experiment |
| Rhesus rotavirus (RRV) | ATCC | ATCC VR-1739 | Establish biliary atresia mouse model |
| MA104 cells | ATCC | ATCC CRL-2378.1 | For laboratory use only |
| DMEM | Thermo Fisher | 10569010 | Mammalian Cell Culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10099141 | Mammalian Cell Culture |
| collagen Type I | CORNING | 354236 | For research use only |
| PBS buffer | OXOID | BR0014G | For washing |
| NaOH | Sigma | 1310-73-2 | Adjust the PH value |
| AgNP | Antibacterial Note: The AgNps was a gift from Prof CM Che. in the Department of Chemistry, the University of Hong Kong. |
||
| Insulin syringe with integrated needle | BD | 9161635S | For medical use |
| 15 mL Centrifuge Tube | Corning | 430791 | For laboratory use only |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | GEB | CT0200-B-N | For laboratory use only |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE-Ci | For laboratory use |
| Dissecting/Intravital microscope | Nikon | SMZ 1000 | For laboratory use |
| anti-Mouse NKp46 FITC | eBioscience | 11-3351 | For research use only |
| anti-Mouse CD4 PE-Cyanine5 | eBioscience | 15-0041 | For research use only |
| Monoclonal Mouse Anti-Human CD4 | DAKO | 20001673 | For research use only |
| anti-NKG2D | RD | MAB1547 | For research use only |
| BD FACSCanto Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Canto Plus | For laboratory use only |
References
- Szavay, P. O., Leonhardt, J., Czechschmidt, G., Petersen, C. The role of reovirus type 3 infection in an established murine model for biliary atresia. European Journal of Pediatric Surgery. 12 (04), 248-250 (2002).
- Coots, A., et al. Rotavirus infection of human cholangiocytes parallels the murine model of biliary atresia. Journal of Surgical Research. 177 (2), 275-281 (2012).
- Shanmugam, N. P., Jayanthi, V. Biliary atresia with cytomegalovirus. Indian Pediatrics. 49 (2), 157 (2012).
- Mack, C. L., Feldman, A. G., Sokol, R. J. Clues to the Etiology of Bile Duct Injuryin Biliary Atresia. Seminars in Liver Disease. 32, 307-316 (2012).
- Muraji, T., Suskind, D. L., Irie, N. Biliary atresia: a new immunological insight into etiopathogenesis. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 3 (6), 599-606 (2009).
- Sokol, R. J., Mack, C. Etiopathogenesis of Biliary Artesia. Seminars in Liver Disease. 21, 517-524 (2001).
- Shivakumar, P., Sabla, G. E., Whitington, P., Chougnet, C. A., Bezerra, J. A. Neonatal NK cells target the mouse duct epithelium via Nkg2d and drive tissue-specific injury in experimental biliary atresia. Journal of Clinical Investigation. 119 (8), 2281-2290 (2009).
- Mack, C. L., et al. Oligoclonal expansions of CD4+ and CD8+ T-cells in the target organ of patients with biliary atresia. Gastroenterology. 133 (1), 278-287 (2007).
- Shivakumar, P., et al. Effector Role of Neonatal Hepatic CD8 + Lymphocytes in Epithelial Injury and Autoimmunity in Experimental Biliary Atresia. Gastroenterology. 133 (1), 268-277 (2007).
- Saxena, V., et al. Dendritic Cells Regulate Natural Killer Cell Activation and Epithelial Injury in Experimental Biliary Atresia. Science Translational Medicine. 3 (102), 102ra194 (2011).
- Miethke, A. G., et al. Post-natal paucity of regulatory T cells and control of NK cell activation in experimental biliary atresia. Journal of Hepatology. 52 (5), 718-726 (2010).
- Tian, J., et al. Topical delivery of silver nanoparticles promotes wound healing. ChemMedChem. 2 (1), 129-136 (2010).
- Lu, L., et al. Silver nanoparticles inhibit hepatitis B virus replication. Antiviral Therapy. 13 (2), 253-262 (2008).
- Xiang, D., et al. Inhibition of A/Human/Hubei/3/2005 (H3N2) influenza virus infection by silver nanoparticles in vitro and in vivo. International Journal of Nanomedicine. 8 (Issue 1), 4103-4114 (2013).
- Elechiguerra, J. L., et al. Interaction of silver nanoparticles with HIV-1. Journal of Nanobiotechnology. 3 (1), 1-10 (2005).
- Nallanthighal, S., et al. Differential effects of silver nanoparticles on DNA damage and DNA repair gene expression in Ogg1-deficient and wild type mice. Nanotoxicology. 11 (8), 1-16 (2017).
- Wen, H., et al. Acute toxicity and genotoxicity of silver nanoparticle in rats. PLoS One. 12 (9), e0185554 (2017).
- Zhang, R., et al. Silver nanoparticle treatment ameliorates biliary atresia syndrome in rhesus rotavirus inoculated mice. Nanomedicine. 13 (3), 1041-1050 (2017).
- Arnold, M., Patton, J. T., McDonald, S. M. Culturing, Storage, and Quantification of Rotaviruses. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 15 Unit 15C.13 (2009).
- Liu, X., et al. Silver nanoparticles mediate differential responses in keratinocytes and fibroblasts during skin wound healing. ChemMedChem. 5 (3), 468-475 (2010).
- Zhang, R., et al. Silver nanoparticles promote osteogenesis of mesenchymal stem cells and improve bone fracture healing in osteogenesis mechanism mouse model. Nanomedicine. 11 (8), 1949-1959 (2015).
- Wu, J., Hou, S., Ren, D., Mather, P. T. Antimicrobial properties of nanostructured hydrogel webs containing silver. Biomacromolecules. 10 (9), 2686-2693 (2009).
- Xu, L. Genotoxicity and molecular response of silver nanoparticle (NP)-based hydrogel. Journal of Nanobiotechnology. 10 (1), 16 (2012).
- Dobrzyńska, M. M., et al. Genotoxicity of silver and titanium dioxide nanoparticles in bone marrow cells of rats in vivo. Toxicology. 315 (1), 86-91 (2014).
- Mohamed, H. R. H. Estimation of TiO 2 nanoparticle-induced genotoxicity persistence and possible chronic gastritis-induction in mice. Food & Chemical Toxicology. 83 (9), 76-83 (2015).
