Summary
מאמר זה מתאר בפירוט שיטה המבוססת על סילבר חלקיקים עבור ameliorating בהכנת בכיס המרה תסמונת במודל עכבר ניסיוני בהכנת בכיס המרה. הבנה עמוקה של תהליך הכנה ריאגנט ואת טכניקת ההזרקה neonatal העכבר יסייע להכיר חוקרים השיטה שבה נעשה שימוש במחקרים דגם העכבר neonatal.
Abstract
בהכנת בכיס המרה (BA) הוא סוג חמור של דרכי המרה עם תמותה גבוהה אצל ילדים אשר האטיולוגיה עדיין לא לגמרי מובן. זיהומים נגיפיים יכול להיות אחת הסיבות האפשריות. המודל בעלי חיים אופייני בשימוש ללמוד תואר ראשון נקבע לפי מזריקים עם בנגיף רזוס העכבר neonatal. סילבר חלקיקים הוכחו להפעיל אפקטים אנטי-בקטריאליים וויראליים; תפקידם במודל עכבר BA מוערך במחקר זה. כיום, בניסויים על בעלי חיים BA, האמצעים שננקטו כדי לשפר את הסימפטומים של BA עכברים הם טיפולים בדרך כלל סימפטומטי ניתן דרך מזון או תרופות אחרות. מטרת מחקר זה היא להפגין שיטה חדשה עבור ameliorating BA תסמונת בעכברים על ידי הזרקה בקרום הבטן של סילבר חלקיקים מספקים נתונים היסטוריים שיטות להכנת ננו-חלקיק כסף ניסוח ג'ל. שיטה זו פשוט וקל החלים נרחב והוא יכול לשמש כדי לחקור את המנגנון של בואנוס איירס, כמו גם טיפולים קליניים. בהתבסס על המודל העכבר BA, כאשר העכברים התערוכה צהבת, הג'ל ננו-חלקיק כסף מוכן מוזרק intraperitoneally אל פני השטח של הכבד נמוכה יותר. הוא ציין את מצב הישרדות, אינדיקטורים הביוכימי, histopathology כבד נבדקים. שיטה זו מאפשרת הבנה אינטואיטיבית יותר של שניהם על הקמת דגם BA וטיפולים חדשניים BA.
Introduction
BA היא צורה של לחסימת מרה תוך כבדית מאופיין צהבת מתמשכת וכוללת תמותה גבוהה בהיעדרו של השתלת כבד. זיהומים נגיפיים קשורים קשר הדוק בפתוגנזה של בואנוס איירס. Cytomegalovirus, reovirus ו בנגיף כל שהוצעו פתוגנים BA1,2,3. במהלך תקופת neonatal, התגובה של המערכת החיסונית לא בשלה זיהום ויראלי תוצאות dysregulation מחוסן נגד צינורות המרה נוספת - ו intrahepatic, המוביל אפופטוזיס בכיס המרה תא אפיתל, חדירה לתא דלקתי בפורטל אזור, חסימת צינור המרה intrahepatic ו extrahepatic, ולבסוף, פיברוזיס בכבד-4,-5,-6.
המודל בעלי חיים הנפוצים ללימודי תואר ראשון מערב את חיסון של עכבר neonatal עם בנגיף רזוס (RRV). העכבר בדרך כלל מתפתחת צהבת אחרי 5-6 ימים, מציג משקל גוף נמוך ושרפרפים acholic. תפקידו של התגובה החיסונית של תהליך המחלה הוא קריטי, במיוחד עבור הרוצח הטבעיים (NK) תאים; דלדול של תאים אלה עם נוגדן anti-NKG2D מקטינה באופן משמעותי את הנזק BA-induced7. יתר על כן, לשני תאים, כולל CD4+ T תאים, התאים CD8+ T תאים תאים דנדריטים, תאי T רגולטוריים, כל הוכחו ממלאים תפקידים10,119,8,המחלה. כל הנתונים מראים הטבע הכרחית של המערכת החיסונית במהלך תואר ראשון.
סילבר חלקיקים (AgNPs) הוכחו להיות השפעות מועיל נגד מחלות זיהומיות מסוימות, כולל זיהומים חיידקיים12 וזיהומים וירליים13,14,15. עם זאת, מלבד השימוש דרמטולוגיים, מחקרים מעטים השתמשו AgNPs בטיפול קליני, בעיקר בגלל רעילות פוטנציאלית שלהם. בניסויים על בעלי חיים, החוקרים למדו בדרך כלל את היעילות של AgNPs ניתנת דרך הפה16 או שיטות תוך ורידי17. עם זאת, אין חוקרים אחרים למדו את היעילות של AgNPs מנוהל באמצעות זריקה בקרום הבטן (i.p.) neonatal עכבר ניסויים, מה שיטה פשוטה ומהירה שמוביל השפעה ישירה יותר על הכבד ועל צינורות המרה בזמן הפחתת רעילותם למערכות אחרות, כגון מערכת החיסון. AgNPs הוכחו להשפיע על פעילות תאי NK18; לכן, בדקנו את ההשפעות הטיפוליות של AgNPs מנוהל באמצעות הזרקת i.p. במודל עכבר BA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הפרוטוקולים ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה של סון יאט-סן מעבדה חיה המרכז האוניברסיטאי (#IACUC-DB-16-0602).
1. יצירת המודל העכבר בהכנת בכיס המרה
- לשמור על עכברים BALB/c בהריון סביבה נטולת פתוגן מסוים תחת מחזור כהה/אור 12 שעות ב- 25 ° C, עם גישה צ'או בלוק ad libitum.
- כדי להכין את המתח RRV יחידת ניהול זיכרון 18006, להגביר את הוירוס בתאים MA104 ולמדוד את titers ויראלי מאת assay לוח19.
הערה: MA104 תאים מתורבתים במדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) עם 10% עוברית שור סרום (FBS) בתוך אינקובטור עם אווירה humidified המכילה 5% CO2. השלבים הגברה מתוארים בקצרה להלן.- להדביק תאים MA104 (1.5 x 107) בבקבוקון תרבות2 150 ס"מ עם מופעל טריפסין RRV [1.5 x 106 ויוצרים רובד יחידות (PFU)] ב30 מ"ל של מדיום ללא סרום. דגירה התאים הנגועים במשך 3 ימים ב- חממה humidified ב 37 ° C עם 5% CO2.
- Lyse התאים הנגועים הבקבוקון התרבות על ידי שלושה מחזורים ההקפאה-הפשרה, עם 20 דקות במקפיא-80 ° C עבור הקפאת כל שלב ובחזרה, ואז מפשיר את התאים בטמפרטורת החדר; החלקיק וירוס תא-הקשורים תשחרר לתוך תגובת שיקוע. לאחר מכן, לאסוף ולהעביר את התא lysate והתרבות supernatant לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל.
- הסרת לכלוך הסלולר גדול מ- lysate על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה (300 x g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות). לאחר מכן, להעביר את תגובת שיקוע המכילים את הנגיף (כ- 6 מ"ל) לתוך צינור חרוטי 15 mL החדש לניסויים בבעלי חיים.
הערה: RRV זה אז מוכנים להיות titered, aliquoted, ו מאוחסנת או משמש סיבובים נוספים של הגברה. חשיפה ארוכת טווח לטמפרטורת החדר תפחית את קיבולת זיהום ויראלי; הנגיף צריך ניתן להציב על קרח ו המאוחסן ב- 80 ° C או בחנקן נוזלי.
- טען RRV לתוך אינסולין בנפח מצומצם (1 מ"ל) מזרק עם מחט ג'י 29 עבור הזריקה העכבר neonatal.
הערה: המחטים בעובי של מזרקים הנפחי בקלות להוביל בריחת סמים. - בתוך 24 שעות של לידה, לנהל את כל µL neonate 20 של 1.2 x 105 PFU/mL RRV דרך המסלול i.p.; השתמש באותו אמצעי אחסון של תמיסת מלח של הפקד.
הערה: המזרק השתמשו בניסוי זה הוא מזרק אינסולין 1 מ"ל. עכברים נגועים לא מוזנים על ידי אימותיהם מתו בתוך הימים הראשונים 2 מסיבות אחרות לא נכללו בניתוח. - להתבונן מקרוב כל העכברים neonatal, לשקול אותם מדי יום. בדרך כלל, ביום השישי לאחר חיסון RRV, צהבת מופיע על אוזניים, עור חשוף, השרפרף הופך בצבע חימר, ואת הפרווה הופך שומני, רומז על הקמת דגם BA; בדוק אם יש סימפטומים אלו.
הערה: BA יכול להיות מאושרות על ידי בדיקה של מקטע רקמת הכבד עם H & E והצגתן immunohistochemical. העכברים BA מוכנים ואז לטיפול AgNP.
התראה: פרוטוקול שהוצג הוא לשימוש עם עכשווית חיה ואנושית RV זנים, אשר חייבים להיות מטופלים בתנאים אבטחה ברמה 2 (BSL-2).
2. כסף סינתזה ננו-חלקיק
- להכין ולאפיין את AgNPs כפי שתואר לעיל12,20.
הערה: הפרטים של הכנת ואפיון של AgNPs תוארו בפרסומים על ידי הצוות של צ'ה סי מ- במחלקה לכימיה, אוניברסיטת הונג קונג12,20. הריכוז הסופי של הפתרון היה 1 מ מ. הקוטר אכזרי של AgNPs בת 10 ננומטר (החל 5-15 ננומטר) אושרה על-ידי מיקרוסקופ אלקטרונים.
3. הכנת התערובת כסף קולגן ננו-חלקיק
הערה: התערובת קולגן AgNP מוכן, מאופיין כפי שתואר קודם לכן21 ומאוחסנים ב 4 º C. כל ההליכים חייב להתבצע על קרח.
- ראשית, לשם הכנת קולגן, להוסיף µL 490 של מסוג קולגן (4 מ"ג/מ"ל) לרכבת התחתית 1.5 mL ומניחים אותו על קרח.
- להוסיף 100 µL של באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS, 10 x) הקולגן ומערבבים אותו עם פיפטה.
- להכנת 1 ליטר של 10 x PBS מאגר, לשלב 80 גר' של NaCl, g 2 של אשלגן כלורי ו- g 35.8 נה2HPO4. 12 שעות2O ל- 2.4 g2פו ח'4 , חנות המאגר בטמפרטורת החדר.
- לאחר מכן, להוסיף 10 µL של NaOH (0.2 מ') הפתרון שלעיל.
- כדי להכין 0.2 M NaOH, להוסיף 8 גרם של אבקת NaOH 1 ליטר של מים מזוקקים.
- לבסוף להוסיף 400 µL של AgNPs (1 מ מ) הקולגן, לערבב אותם עם פיפטה.
הערה: להוסיף את AgNPs אחרונה מיקס אפילו. התערובת קולגן AgNP צריך להיות מאוחסן ב 4 ° C; אחרת, זה בקלות עפור בטמפרטורת החדר.
4. העכבר הזרקת שיטה
- לנהל את העכברים neonatal נגוע בקבוצה RRV שטופלו עם זריקה i.p. של 50 µL של התערובת קולגן AgNP לאחר הופעת צהבת; לבצע השני זריקה בתלת-ממד מאוחר יותר.
הערה: העכברים קבוצת הבקרה (בקרת נגוע) RRV ניתנות באותו אמצעי אחסון של תמיסת מלח, העכברים בקבוצת הביקורת נורמלי לא מקבלים כל טיפול. - בהתחלה של הזריקה, הקש על הרגל של העכבר עם הקמיצה בעקיפין על ירך רגל ימין, להציג את המחט לאט בזווית של 15° (איור 1). כשמגיעים השטח של הקצה התחתון של הכבד (איור 2), כ- 0.5 ס מ ב, להזריק את התערובת קולגן AgNP; . ואז, מסירים את המחט לאט.
אם כך, הערה: היזהרו שלא להציג את כל האוויר לתוך המזרק כמו העכבר neonatal עלולים להיהרג. בעכברים neonatal, הבטן וה טחול הן בבטן השמאלית, הקיבה הוא מלא חלב. אם הזריקה ניתנת מהצד הזה, המחט יכלו להיכנס בקלות גם הקיבה, גורם החלב לזרום לתוך חלל הבטן, או הטחול, גרימת דימום.
התראה: לב המחט כדי למנוע פציעות אצבע, הקפד להחליף את מכסה המחט, הסר את המחט, ולמקם אותו במיכל החדים. - אחרי כל הזריקות, לשמור על העכברים מהכלובים שלהם למשך 10 דקות לאפשר את התערובת קולגן AgNP ג'ל, ולמנוע את האמא מליקוק ההזרקה. לאחר מכן, להחזיר את העכברים לכלובים.
- לצפות ולהקליט המראה הפיזי של כל העכברים מדי יום, כולל צהבת, משקל הגוף, כמו גם שיעור ההישרדות.
5. דם לטעום אוסף
הערה: דגימות הדם של µL כ-120 נאספים על ידי החדרת המחט לתוך הלב. לאחר צנטריפוגה, הסרום הוא שנאספו (כ 70 µL) לבדיקת תפקודי כבד. שיטת איסוף דם היא כדלקמן.
- עזים ומתנגד העכברים ביום התשיעי וה-12 לאחר חיסון RRV (אשר 3 ימים לאחר הטיפול AgNP) באמצעות 0.5-2.5% sevoflurane.
- לשתק את הגפיים של העכבר ולחטא את הבטן העליונים והתחתונים עם 75% אלכוהול.
- לחשוף את הסרעפת על ידי חיתוך העכבר עור, שריר, צפק לאורך הקו האמצעי כדי מצאתי עם מספריים; השתמש ספוגית כותנה סטרילי כדי להסיר את מערכת העיכול לחשוף באופן מלא את שריר הסרעפת.
- הכנס את המחט (עם מזרק אינסולין לפרוק 1 מ"ל) לתוך החדר השמאלי של הלב, לאט לאט למשוך בחזרה על הבוכנה מזרק כדי להשיג את נפח הדם המרבי. לאחר מכן, העבר את הדם צינור 1.5 מ.
- לאפשר את הצינור לעמוד למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, centrifuge זה עבור 5 דקות ב 400 x g. לאחר מכן, באמצעות פיפטה העברה, לאסוף ולשמור את הנסיוב לשימוש נוסף.
הערה: למנוע נזק הסרעפת, כמו דיאפרגמה פגמים בקלות להוביל חזה אוויר, מוות, קרישת דם, ובכך מונע את האוסף דגימת דם.
6. איתור פרמטרים ביוכימיים
- השתמש את הנסיוב שנאספו בשלב 5.5 עבור זיהוי פרמטרים ביוכימיים.
- השתמש של מנתח הביוכימי אוטומטית כדי לזהות את הפרמטרים הביוכימי הבאים: אלנין aminotransferase (ALT), aminotransferase אספרטט (AST), אלקליין פוספטאז (ALP), הכוללת חלבון (TP), אלבומין (ALB), גלובולין (GLO), הכולל בילירובין (TBIL), בילירובין ישיר (DBIL), בילירובין עקיף (IBIL) ו חומצות מרה הכולל (יפורסם בהמשך).
7. extrahepatic Cholangiography להתבונן Patency צינור המרה Extrahepatic
הערה: בצע את התהליך כולו תחת מיקרוסקופ לנתיחה.
- מלא לחשוף את הכבד, כיס המרה, extrahepatic צינורות המרה באמצעות מקלון צמר גפן.
- להתבונן ולצלם את המראה של הכבד, צינורות המרה תחת מיקרוסקופ לנתיחה.
- להשתמש מלקחיים אופטלמולוגיות לאחוז בעדינות את החלק התחתון של כיס המרה.
- לטעון מזרק 1 מ"ל עם פתרון מתילן כחול (0.05 wt.% H2O). לאט לאט את המחט מזרק לתוך חלל כיס המרה; לאחר מכן, תופסים את המחט עם המלקחיים אופטלמולוגיות, לאט להשרות 10 – 20 µL של מתילן כחול.
- להתבונן במיקרוסקופ אם הצבע הכחול עובר צינורות המרה extrahepatic מעי צם, לצלם.
8. אוסף של דוגמאות כבד טרי Hematoxylin ו אאוזין מכתים
- את העכבר טרי רקמות כבד בן לילה בפורמלין 10%.
- לאחר מכן, להטביע את רקמות הכבד קבוע פרפין, סעיף אותם.
- Dewax הסעיפים נתרענן אותם עם סדרות אתנול (כגון אתנול 100%, 95%, 80% ו- 70% במים מזוקקים, כל אחד למשך 5 דקות), כתם הסעיפים רקמות עם hematoxylin, מעמיד אותם בפני חומצת מלח 1% אלכוהול הבחנה, בסופו של דבר, מכתים סעיפים עם אאוזין.
- לבסוף, לבחון את histopathology של הכבד תחת מיקרוסקופ X 40.
9. נוגדן של Hematoxylin ואת מקטעי רקמה צבעונית-אאוזין
- לאחר dewaxing rehydrating הסעיפים, לבצע אחזור של אנטיגן על-ידי השוקע הסעיפים במאגר טריס-EDTA (בסיס טריס 10 מ מ, פתרון EDTA 1 מ"מ; pH 9.0) וחימום אותם במיקרוגל למשך 10 דקות ב 95 ° C.
- הסר peroxidase אנדוגני ע י חשיפת הסעיפים רקמות 10 דקות לפתרון חמצן 3%.
- פנקו את הסעיפים עם סרום עיזים 5%, כדי לחסום את הכריכה לא ספציפית.
- הוספת נוגדנים העיקרי ארנב-העכבר NKG2D (1: 100) על המקטעים, דגירה אותם בן לילה ב 4 º C.
- דגירה הסעיפים עם נוגדנים משניים המתאים (פולימר התווית על-ידי HRP ארנב נגד המערכת) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- דמיינו את נוגדן באמצעות 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) כמו chromogen.
- להתבונן הסעיפים תחת מיקרוסקופ X 40, לרכוש תמונות ולהמשיך לנתח אותם כרצונכם.
10. זרימה Cytometric ניתוח
- בעדינות מינצ רקמת הכבד, להעביר את זה דרך מסננת תא מיקרומטר 70 ו centrifuge זה 2 x-x 270 גרם ב- 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות.
- Resuspend בגדר תא RPMI 1640 בינוני ולנתח אותם על-ידי immunofluorescence שני צבעים באמצעות נוגדנים חד-שבטיים.
- לבצע phenotyping הסלולר באמצעות סמנים תא-פני ספציפיים, כולל fluorescein isothiocyanate - ו phycoerythrin-מצומדת אנטי-NKp46 (NK לימפוציטים; 1:1, 000) ו anti-CD4 (סוג של תא T; 1:1, 000), עם cytometer זרימה ולנתח את הנתונים עם תוכנת ניתוח של נתונים cytometry זרימה.
- בחר תא אוכלוסיות על-פי העבר לצד פיזור, השער בהתאם isotype בקרת חשבון עבור כל זריחה רקע והנושא את הנתונים כדי ניתוח משני המבוסס על האותות זריחה של נוגדנים בודדים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בהתבסס על המודל העכבר BA הוקמה, העכברים neonatal נגוע נוהלו זריקה i.p. של התערובת קולגן AgNP מוכן 2 x לאחר שהציגה צהבת. העכבר הישרדות היה ייבדק יומית, בוצעו בדיקות תפקודי כבד, כבד, מחלות cytometry זרימה. בהשוואה לעכברים BA שליטה ללא טיפול, העכברים שטופלו AgNP הראה צהבת מופחתת ומתוחזק משקל גוף נורמלי שלהם (איור 3). רמות בילירובין חילוף החומרים, transaminase הכבד ירד לערכים בקרה נורמלית, רומז כי AgNPs לשפר באופן משמעותי את תפקוד הכבד (טבלה 1). Extrahepatic cholangiography (איור 4) עם מתילן כחול מכתים אישר patency צינור המרה לאחר הטיפול AgNP. צביעת המטוקסילין (איור 5) הראה חדירה של תאים דלקתיים ירד משמעותית באזור פורטל כבדית של עכברים שטופלו AgNPs, בהשוואה לעכברים שליטה. התוצאות cytometry זרימה הראו באופן משמעותי פחות תאי NK כבדי לאחר AgNP הטיפולים (שניהם בימים 9 ו-12) מאשר בעכברים RRV (איור 6). נוגדן המתגלה ביטוי משמעותי מופחתת של סמן התא NK NKG2D (איור 7) שילוש הפורטל של העכברים שטופלו AgNP, לעומת העכברים RRV.
איור 1: מיקום החדירה הראשונית מזרק. קו מקווקו אדום מציין את קו מקביל בבטן של העכבר neonatal P6; החץ הצהוב מצביע על נקודת המחט; החץ האדום מציין את הזווית המחט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: מחט להגיע השטח של הקצה התחתון של הכבד. קו מקווקו צהוב מצביע על הקצה התחתון של העכבר כבד; החץ האדום מציין את מיקום המחט במהלך ההזרקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: השפעת AgNPs על תסמונת BA במודל עכבר ניסיוני BA- (א) לוח זה מראה את המראה של עכברים neonatal בימים 9 ו-12 לאחר זריקה עם RRV לבד ו 3 ימים ו 6 ימים לאחר זריקה עם AgNPs (RRV + AgNPs). (B) לוח זה מראה את המשקל של העכברים בכל קבוצה בנקודות זמן שונות; ה- x-ציר מציין את מספר ימים אחרי העכבר נולד y-ציר מציין הקיפול-שינוי משקל הגוף. P < 0.01 עם הסטודנט t-מבחן משווה את RRV + AgNp לקבוצת קבוצת הביקורת RRV; n = 16 בקבוצת הביקורת, n = 18 RRV קבוצה ולאחר n = 17 RRV + AgNP קבוצה. (ג) לוח זה מראה את שיעור ההישרדות של העכברים בכל קבוצה. איור זה שונה מג'אנג. et al. 18. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: Extrahepatic cholangiography. סוכן ניגודיות שימש כדי לזהות patency של צינורות המרה extrahepatic כדי ללכוד תמונות. הקו הכחול המקווקו מציין את כיוון extrahepatic המרה; החץ האדום מציין היצרות של צינור המרה; החץ השחור מציין BA. סרגל קנה מידה = 1 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: צביעת המטוקסילין - רקמות הכבד של העכברים בכל קבוצה בימים 9 ו-12 היו נאספים, קבוע, למחלקה, מוכתם H & א קיצורים: PV = וריד שער הכבד, BD = צינור המרה. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. איור זה שונה מג'אנג. et al. 18. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: אחוז NK תאי רקמת הכבד. (א) הכבדים של עכברים עובדו לתוך התא המתלים בימים 9 ו-12, ואת חלקם של תאי NK אותרה על ידי cytometry זרימה. (B) לוח זה מציג את האחוז של תאי NK (NKp46+CD4+) בכל קבוצה בנקודות זמן שונות לאחר הזריקה AgNP. Y-ציר מציין הקיפול-השינוי באחוזים של תאי NK, אשר מחושב ביחס האחוזים של קבוצת הביקורת וביום יום 9 יום 12. * *P < 0.01 ו *P < 0.05, עם הסטודנט t-מבחן משווה RRV + AgNp לקבץ לקבוצה שליטה RRV, n = 10 בכל קבוצה. איור זה שונה מג'אנג. et al. 18. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7: נוגדן עבור סמן התא NK NKG2D באזור הפורטל של העכברים בכל קבוצה הטיפול. הביטוי של סמן התא NK NKG2D באזור הפורטל של העכברים בכל קבוצה טיפול זוהה על ידי נוגדן. החצים ארוך לציין צינורות המרה; החיצים קצר מצביעים על תאי NK. קיצורים: PV: וריד שער הכבד, BD: צינור המרה. Sscale בר = 50 מיקרומטר. איור זה שונה מג'אנג. et al. 18. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
טבלה 1: המעבדה הקלינית בחינה של מולקולה הקשורות תפקוד הכבד סרום רמות. דם היקפיים שימש כדי למדוד את תפקודי כבד בעכברים בכל קבוצה. ALT: אלנין aminotransferase, AST: אספרטט aminotransferase, ALP: phosphatase אלקליין, TP: חלבון, ALB סה ' כ: אלבומין, גלו: גלובולין, TBIL: בילירובין הכולל, DBIL: בילירובין ישיר, IBIL: בילירובין עקיף, יפורסם = סה כ חומצות מרה. P < 0.05 ו * *P < 0.01, עם הסטודנט t-test עבור כל קוהורטה בהשוואה RRV הקבוצה לבד, n = 10 בכל קבוצה. כל מחוון הביוכימי הנתונים מוצגים זאת אומרת ± SD. עכברים כל שלוש הקבוצות היו בן 12 ימים. טבלה זו שונתה מג'אנג. et al. 18. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AgNPs שהפגינו אנטיבקטריאליות חזקות נגד בקטריה, חדירות חזקות22; בנוסף, הם משמשים כדי לייצר מגוון של מוצרים רפואיים אנטי בקטריאלי23. עם זאת, AgNPs יכול לקחת זמן רב כדי לנקות פעם הם נצברים באיברים, התמדה זה עלול להוביל ההשפעות הרעילות24,25. מחקר קודם בחן את רעילות חריפה ואת genotoxicity של AgNPs לאחר זריקה בודדת עירוי בניסוי עכברוש, התוצאות הראו כי AgNPs יכולים לגרום נזק לכליות וכבד חריפה. AgNPs שהצטברו באיברים העיקריים של מערכת החיסון, כולל בלוטת התימוס, טחול17. במודל BA זה העכבר, הטיפול עם AgNPs יושבחו תסמונת BA, אשר נתונים שלנו מציע חלקית מתווך על ידי עיכוב תאי NK. עם זאת, ההשפעות ארוכות הטווח של AgNPs לדרוש חקירה נוספת, כדי להעריך את רעילות פוטנציאלית על פיתוח העכבר, ויסות מערכת החיסון.
מבחינת השיטה, כמה הערות נוספות עבור ניתוח מוצלח הם כדלקמן: (א) תהליך הכנת התערובת קולגן AgNP צריך להתבצע על קרח, כי בטמפרטורת החדר, התערובת קולגן AgNP יהפוך במהירות ג'ל מוצק למחצה, אשר אין אפשרות להשתמש לזריקות. לאחר ההכנה, התערובת קולגן AgNP צריך להיות מאוחסן ב 4 º C. (ii) רק 1 מ"ל אינסולין מזרקים אמור לשמש בגלל קוטר קטן, אשר מפחית את בריחת של הסם מוזרק. (iii) הקודם מחקרים בחנו באופן כללי השפעת AgNPs אוראלית16 או באמצעות הזרקה תוך ורידי17. בניסויים על בעלי חיים שלנו, הנושאים ניסיוני הם עכברים neonatal; לפיכך, הזרקה תוך ורידי הוא כמעט בלתי אפשרי, השתמשנו זריקה i.p.. ההזרקה של AgNPs לשפר את הסימפטומים של BA בעכברים. (iv) בהתחלה של הזריקה, הגפיים התחתונות של העכבר קבועים ידנית כדי למנוע את העכבר זז. שיטה זו מבטיחה כמות הסם מוזרק לתוך חלל הבטן ללא דליפה כלשהי נוספת מבטיחה את היעילות של הניסוי. (v) בעכברים neonatal, הבטן וה טחול הן בבטן השמאלית, הקיבה הוא מלא חלב. כדי להזריק את התערובת AgNP אל פני השטח של הקצה התחתון של הכבד, המחט מוחדרת מעל ירך רגל ימין של העכבר. אם המחט מוחדרת מצד שמאל, זה יכול בקלות מנקב גם את הקיבה, גורם החלב לזרום לתוך חלל הבטן, או הטחול, גרימת דימום. (vi) כי לקיר הבטן בעכברים neonatal הוא דק, ניתן למנוע את זליגת סמים על ידי באלכסון קידום המחט בזווית של 15° ' קרוב לקיר הבטן כדי להגיע אל הקצה התחתון של הכבד.
הבחנו השפעת מעודד AgNPs הזה עכבר RRV-induced דגם BA. יחד עם מחקרים קודמים בשימוש AgNPs הטיפולים של זיהומים וירוס שונות ומחלות, נתונים אלה AgNP מציע את האפשרות של יישום ויוו אנטי וירוס זיהומים. המגבלה של ניסויים אלה היא כי פרמקוקינטיקה של AgNPs אינה לגמרי ברורה כפי עקב מחסור של שיטות מדידה AgNPs, מה שהופך את השליטה במינונים AgNP קשה. מחקר נוסף נחוץ גם עבור היעד תאיים של AgNPs, אשר יעזרו לנו להבין את המנגנון ולצמצם את תופעות הלוואי בטיפולים המחלה בעתיד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
AgNPs המשמש כאן היו מתנה צ'ה מ ג במחלקה לכימיה, אוניברסיטת הונג קונג. עבודה זו מומן על ידי את נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (מספר 81600399) ואת מדע וטכנולוגיה פרוייקט של גואנגזו (No.201707010014).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/c mouse | Guangdong Medical Experimental Animal Center | SYXK2017-0174 | Animal experiment |
| Rhesus rotavirus (RRV) | ATCC | ATCC VR-1739 | Establish biliary atresia mouse model |
| MA104 cells | ATCC | ATCC CRL-2378.1 | For laboratory use only |
| DMEM | Thermo Fisher | 10569010 | Mammalian Cell Culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10099141 | Mammalian Cell Culture |
| collagen Type I | CORNING | 354236 | For research use only |
| PBS buffer | OXOID | BR0014G | For washing |
| NaOH | Sigma | 1310-73-2 | Adjust the PH value |
| AgNP | Antibacterial Note: The AgNps was a gift from Prof CM Che. in the Department of Chemistry, the University of Hong Kong. |
||
| Insulin syringe with integrated needle | BD | 9161635S | For medical use |
| 15 mL Centrifuge Tube | Corning | 430791 | For laboratory use only |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | GEB | CT0200-B-N | For laboratory use only |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE-Ci | For laboratory use |
| Dissecting/Intravital microscope | Nikon | SMZ 1000 | For laboratory use |
| anti-Mouse NKp46 FITC | eBioscience | 11-3351 | For research use only |
| anti-Mouse CD4 PE-Cyanine5 | eBioscience | 15-0041 | For research use only |
| Monoclonal Mouse Anti-Human CD4 | DAKO | 20001673 | For research use only |
| anti-NKG2D | RD | MAB1547 | For research use only |
| BD FACSCanto Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Canto Plus | For laboratory use only |
References
- Szavay, P. O., Leonhardt, J., Czechschmidt, G., Petersen, C. The role of reovirus type 3 infection in an established murine model for biliary atresia. European Journal of Pediatric Surgery. 12 (04), 248-250 (2002).
- Coots, A., et al. Rotavirus infection of human cholangiocytes parallels the murine model of biliary atresia. Journal of Surgical Research. 177 (2), 275-281 (2012).
- Shanmugam, N. P., Jayanthi, V. Biliary atresia with cytomegalovirus. Indian Pediatrics. 49 (2), 157 (2012).
- Mack, C. L., Feldman, A. G., Sokol, R. J. Clues to the Etiology of Bile Duct Injuryin Biliary Atresia. Seminars in Liver Disease. 32, 307-316 (2012).
- Muraji, T., Suskind, D. L., Irie, N. Biliary atresia: a new immunological insight into etiopathogenesis. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 3 (6), 599-606 (2009).
- Sokol, R. J., Mack, C. Etiopathogenesis of Biliary Artesia. Seminars in Liver Disease. 21, 517-524 (2001).
- Shivakumar, P., Sabla, G. E., Whitington, P., Chougnet, C. A., Bezerra, J. A. Neonatal NK cells target the mouse duct epithelium via Nkg2d and drive tissue-specific injury in experimental biliary atresia. Journal of Clinical Investigation. 119 (8), 2281-2290 (2009).
- Mack, C. L., et al. Oligoclonal expansions of CD4+ and CD8+ T-cells in the target organ of patients with biliary atresia. Gastroenterology. 133 (1), 278-287 (2007).
- Shivakumar, P., et al. Effector Role of Neonatal Hepatic CD8 + Lymphocytes in Epithelial Injury and Autoimmunity in Experimental Biliary Atresia. Gastroenterology. 133 (1), 268-277 (2007).
- Saxena, V., et al. Dendritic Cells Regulate Natural Killer Cell Activation and Epithelial Injury in Experimental Biliary Atresia. Science Translational Medicine. 3 (102), 102ra194 (2011).
- Miethke, A. G., et al. Post-natal paucity of regulatory T cells and control of NK cell activation in experimental biliary atresia. Journal of Hepatology. 52 (5), 718-726 (2010).
- Tian, J., et al. Topical delivery of silver nanoparticles promotes wound healing. ChemMedChem. 2 (1), 129-136 (2010).
- Lu, L., et al. Silver nanoparticles inhibit hepatitis B virus replication. Antiviral Therapy. 13 (2), 253-262 (2008).
- Xiang, D., et al. Inhibition of A/Human/Hubei/3/2005 (H3N2) influenza virus infection by silver nanoparticles in vitro and in vivo. International Journal of Nanomedicine. 8 (Issue 1), 4103-4114 (2013).
- Elechiguerra, J. L., et al. Interaction of silver nanoparticles with HIV-1. Journal of Nanobiotechnology. 3 (1), 1-10 (2005).
- Nallanthighal, S., et al. Differential effects of silver nanoparticles on DNA damage and DNA repair gene expression in Ogg1-deficient and wild type mice. Nanotoxicology. 11 (8), 1-16 (2017).
- Wen, H., et al. Acute toxicity and genotoxicity of silver nanoparticle in rats. PLoS One. 12 (9), e0185554 (2017).
- Zhang, R., et al. Silver nanoparticle treatment ameliorates biliary atresia syndrome in rhesus rotavirus inoculated mice. Nanomedicine. 13 (3), 1041-1050 (2017).
- Arnold, M., Patton, J. T., McDonald, S. M. Culturing, Storage, and Quantification of Rotaviruses. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 15 Unit 15C.13 (2009).
- Liu, X., et al. Silver nanoparticles mediate differential responses in keratinocytes and fibroblasts during skin wound healing. ChemMedChem. 5 (3), 468-475 (2010).
- Zhang, R., et al. Silver nanoparticles promote osteogenesis of mesenchymal stem cells and improve bone fracture healing in osteogenesis mechanism mouse model. Nanomedicine. 11 (8), 1949-1959 (2015).
- Wu, J., Hou, S., Ren, D., Mather, P. T. Antimicrobial properties of nanostructured hydrogel webs containing silver. Biomacromolecules. 10 (9), 2686-2693 (2009).
- Xu, L. Genotoxicity and molecular response of silver nanoparticle (NP)-based hydrogel. Journal of Nanobiotechnology. 10 (1), 16 (2012).
- Dobrzyńska, M. M., et al. Genotoxicity of silver and titanium dioxide nanoparticles in bone marrow cells of rats in vivo. Toxicology. 315 (1), 86-91 (2014).
- Mohamed, H. R. H. Estimation of TiO 2 nanoparticle-induced genotoxicity persistence and possible chronic gastritis-induction in mice. Food & Chemical Toxicology. 83 (9), 76-83 (2015).
