Summary
この資料では、銀ナノ粒子実験的胆道閉鎖症マウスモデルにおける胆道閉鎖症症候群を改善するための手法について詳しく説明します。試薬の準備プロセスおよび新生仔マウス注入の技術をしっかりと理解は、新生児マウス モデル研究で用いられた方法と研究者を理解に役立ちます。
Abstract
胆道閉鎖症 (BA) は、病因はまだ完全に理解するの子供の高い死亡率と胆管炎の重症型です。ウイルス感染症は、原因の 1 つかもしれません。BA の勉強に使用する典型的な動物モデルを確立するには、アカゲザルのロタウイルスを新生児マウスに接種します。抗菌・抗ウイルス効果を発揮する銀ナノ粒子が示されています。BA マウス モデルでの機能は、この研究で評価されます。現在、BA 動物実験で BA マウスの症状を改善する方法について、一般的に症状の治療を経由で食物や他の薬物を与え。本研究の目的は、銀ナノ粒子の腹腔内投与によるマウスの BA 症候群を改善するための新しい方法を示すため、銀ナノ粒子ゲル製剤を準備するための詳細な方法を提供します。この方法は簡単で、広く適用できると ba, だけでなく、臨床治療のメカニズムの研究に使用することができます。BA マウス モデルに基づいて、マウスが黄疸を示す場合、準備された銀ナノ粒子ゲルは低い肝臓の表面に腹腔内に注入されます。生存状態を観察し、生化学的指標と肝の病理組織を検討しました。このメソッドは、BA モデルと新しい BA 治療法成立のより直感的に理解できます。
Introduction
BA は胆汁うっ滞、永続的な黄疸が特徴の形態であり、高い死亡率は、肝移植の不在。ウイルス感染が BA の病態と密接に関連します。サイトメガロ ウイルスやレオウイルス、ロタウイルスは BA1,2,3の病原体としてすべて提案されています。新生児期には、ウイルス感染に未熟な免疫システムの反応の結果余分な - と肝内胆管、胆管上皮細胞のアポトーシス、ポータルで炎症性細胞浸潤につながるに対して免疫不全領域、肝内および肝外胆管閉塞、そして最後に、肝線維症4,5,6。
BA 研究の一般的に使用される動物モデルには、アカゲザルのロタウイルス (RRV) 新生仔マウスの接種が含まれます。マウスは通常、低体重と灰白色便を示す後 5-6 日、黄疸を開発しています。病気の過程における免疫応答の役割は重要、特にナチュラル キラー (NK) 細胞;アンチ NKG2D 抗体とこれらの細胞の枯渇は、BA ダメージ7を大きく軽減されます。さらに、他のセル、CD4 を含む+ T 細胞、CD8+ T 細胞、樹状細胞、T 細胞、すべて示されている疾患8,9,10,11の役割を果たします。すべてのデータは、BA の過程で免疫システムの不可欠な性質をお勧めします。
銀ナノ粒子 (AgNPs) は、12細菌感染症とウイルス感染症13,14,15を含むいくつかの感染症に対して有益な効果があると実証されています。ただし、皮膚の使用率以外いくつかの研究使用している AgNPs 臨床治療の潜在的な毒性が主な原因。動物実験で研究者は一般に口腔を介してAgNPs 投与16または静脈内投与方法17の有効性を調査しました。しかし、ない他の研究者は AgNPs 投与による新生仔マウスにおける腹腔注入実験、簡易迅速法は、肝臓の中の胆管のより直接的な影響につながる効果を研究しています。免疫システムなど、他システムへの毒性を減らします。NK 細胞活性18; に影響を与える AgNPs が示されています。したがって、我々 は BA マウス モデルで i. p. 注入を介してAgNPs 投与の治療効果をテストしました。
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Protocol
すべての動物実験的プロトコルは、機関の動物の世話、太陽 Yat Sen 大学実験動物センター (#IACUC-DB-16-0602) の利用委員会によって承認されています。
1 胆道閉鎖症のマウスモデルの確立
- オートクレーブ チョウ広告自由にアクセスできる、25 ° C で 12 h ダーク/ライト サイクル下特定病原体フリーの環境で妊娠中の BALB/c マウスを維持します。
- RRV 株 MMU 18006 を準備するには、MA104 細胞でウイルスを増幅し、プラーク法19ウイルス抗体価を測定します。
注: MA104 細胞培養されるダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) で 10% 牛胎児血清 (FBS) インキュベーター内で 5% CO2を含む加湿雰囲気。増幅の手順を簡単に紹介いたします。- MA104 細胞に感染する (1.5 x 107) 無血清培地 30 mL のトリプシン活性化 RRV [1.5 x 106プラーク形成単位 (PFU)] と 150 cm2培養フラスコで。5% CO2と 37 ° C で加湿のインキュベーターで 3 日間の感染細胞を孵化させなさい。
- 各固定相、室温; に戻して細胞を融解し、-80 ° C のフリーザーで 20 分で、3 つの凍結-融解サイクルによって培養用フラスコに感染した細胞を溶解させます。細胞のウイルス粒子は、培養上清を発売いたします。収集し、15 mL の円錐管に細胞ライセートや培養上清を転送します。
- 低速遠心分離 (300 x gで 3 分のための 4 ° C) によってライセートから大規模な細胞の残骸を削除します。その後、動物実験のための新しい 15 mL の円錐管にウイルス (約 6 mL) を含む上清を転送します。
注: RRV は胃と検体、または増幅の追加ラウンドのために使用される格納される準備ができているし。部屋の温度への長期露出はウイルス感染能力を減らすウイルスは、氷の上に配置、-80 ° c または液体窒素中で保存されている必要があります。
- 負荷は少量 (1 mL) インスリンに RRV の新生児マウス注射用 29 G 注射針と注射器します。
注: 体積注射器の太い針は簡単に薬物の漏洩に します。 - 出生 24 時間以内 105 Pfu/ml RRV経由でi. p. ルート x 1.2 の各新生児 20 μ L に管理します。コントロールとして生理食塩水と同じボリュームを使用します。
注: この実験で使用されるシリンジが 1 mL インスリン注射器です。他の理由により最初の 2 日以内に死亡した母親によって与えられたいない感染したマウスでは、分析に含まれていません。 - すべての新生児マウスを密接に観察し、毎日それらの重量を量る。通常、RRV の接種後六日目、耳と裸の皮膚に黄疸が表示されます便粘土色になり毛皮になります油性、BA モデルの確立を示唆これらの症状を確認します。
注: BA は、H & E と免疫組織化学を示すと肝組織のセクション検査で確認できます。BA マウスは AgNP 治療のため準備ができているし。
注意: 提示されたプロトコルは、現代的な動物と人間の RV 株、バイオ セーフティ レベル 2 (BSL-2) 条件下で処理する必要があります使用します。
2. 銀のナノ粒子合成
- 準備し、前述の12,20AgNPs を特徴付けます。
注: 準備と、AgNPs の特性の詳細は香港大学12,20化学科の c. m. チェ チームが出版物に記載されています。ソリューションの最終濃度 1 mM であった。AgNPs の平均の直径は 10 nm (5、15 に至るまで nm)、電子顕微鏡による確認します。
3. 銀ナノ粒子コラーゲン混合物の調製
注: AgNP コラーゲン混合物を準備し、前述の21 4 ° C で格納される特徴すべての手順は、氷で実行する必要があります。
- まず、コラーゲンの準備のための 490 μ L を追加 I 型コラーゲン (4 mg/mL) 1.5 mL チューブに、氷の上に置きます。
- コラーゲンにリン酸緩衝食塩水 (PBS, 10 x) の 100 μ L を追加し、ピペットとミックスします。
- 10 x PBS バッファーの 1 L を準備するには、結合 80 g の NaCl、KCl の 2 g および Na2HPO4.の 35.8 g12 H2O 瀬2PO4とストア室温でバッファーの 2.4 g に。
- その後、上記の解決策に水酸化ナトリウム (0.2 M) の 10 μ L を追加します。
- 0.2 M NaOH を準備するには、蒸留水 1 L に水酸化ナトリウム粉末 8 g を追加します。
- 最後に、コラーゲンを AgNPs (1 mM) の 400 μ L を追加し、ピペットでそれらをミックスします。
注: も混合の最後、AgNPs を追加します。4 ° C で保存する AgNP コラーゲン混合物それ以外の場合、それは簡単に室温で固化します。
4. マウス注入法
- 黄疸の出現の後 AgNP コラーゲン混合物の 50 μ L の i. p. 注入で RRV 群で感染した新生児マウスを管理します。第 2 注入 3 d 後を実行します。
注: コントロール RRV (感染制御) グループのマウスは、生理食塩水と同じボリュームを与えられているし、正常対照群のマウスは、任意の治療を与えられていません。 - 注射の初めに、右太腿の上斜めリング指でマウスの足を押すし、15 ° の角度 (図 1) でゆっくりと針を紹介します。約 0.5 cm (図 2)、肝臓の下側の面に達したら、注入 AgNP コラーゲン混合物;その後、ゆっくりと針を撤回します。
注: する、注射器に空気を導入しないように注意し、新生仔マウスが殺されるかもしれない。新生仔マウスの左腹部、胃、脾臓と胃は牛乳でいっぱい。こちら側から注入が管理されている場合針をどちらか胃の腹腔内や出血を引き起こす、脾臓に流れ込むミルクを原因と簡単に入力。
注意: 任意の指のけがを防ぐため、針のキャップを交換し、針を削除、シャープス コンテナーに配置を確認するため針に注意してください。 - すべての注射後 10 分 AgNP コラーゲン混合ゲルと母が注射部位をなめるを防ぐためにできるようにケージのマウスを維持します。その後、マウスをケージに戻ります。
- 観察し、黄疸や体重、生存率など毎日、すべてのマウスの物理的な外観を記録します。
5. 血液検体の採取
注: 約 120 μ L の血液サンプルは、中心に針を挿入することによって収集されます。遠心分離後、血清は収集 (約 70 μ L) 肝機能をテストするためです。血の収集方法は次のとおりです。
- (ある AgNP 治療後 3 日) RRV 接種後第 9 そして第 12 日目のマウスを麻酔使用 0.5 2.5% セボフルラン。
- マウスの手足を固定し、75% のアルコールで下腹部を滅菌します。
- ハサミでは; に、剣にマウスを皮膚、筋肉や正中線に沿って腹膜切断して横隔膜を公開します。滅菌綿棒を使って横隔膜筋を完全に公開する消化管を外します。
- (1 mL アンロード インスリン注射器) の心臓の左心室に針を挿入し、最大血液量を取得するシリンジのプランジャーをゆっくり引き戻します。その後、血を 1.5 mL チューブに転送します。
- 室温で 30 分放置し、400 × gで 5 分間遠心管を許可します。転送ピペットを使用すると、収集し、さらに使用するため血清を保存します。
注: は、欠陥は、簡単に気胸、死、および血液凝固、血サンプルのコレクションを防ぐにつながるダイヤフラムとして、横隔膜の損傷を防ぐ。
6. 生化学的パラメーターの検出
- 生化学的パラメーターの検出のステップ 5.5 で収集した血清を使用します。
- 自動生化学分析装置を使用して、次の生化学的パラメーターを検出: アラニントランスアミナーゼ (ALT)、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ (AST)、アルカリ性ホスファターゼ (ALP)、総蛋白 (TP)、アルブミン (ALB)、グロブリン (グロ)、総ビリルビン (TBIL)(DBIL) 直接ビリルビン、間接ビリルビン (IBIL)、および総胆汁酸 (TBA)。
7. 肝外胆道胆管の開存性を観察するには
注: は、解剖顕微鏡の下で全体のプロセスを実行します。
- 肝臓、胆嚢、肝外胆管綿棒で完全に公開します。
- 観察して肝臓と胆管解剖顕微鏡で外観の写真します。
- 眼科用鉗子を使用して、胆嚢の底部を軽く押さえします。
- メチレン ブルー溶液 (0.05 wt.% H2O を 1 mL 注射器をロードします。胆嚢空洞に注射針をゆっくりと挿入します。眼科ピンセットで針を把握し、メチレン ブルーの 10-20 μ L をゆっくりと注入します。
- 青い色は空腸に肝外胆管に通過するかどうかを顕微鏡下で観察し、写真を撮る。
8. ヘマトキシリン ・ エオシン染色の新鮮な肝臓サンプル集
- 新鮮なマウス肝組織一晩で修正 10% ホルマリン。
- パラフィンで固定肝組織を埋め込むし、それらをセクションします。
- セクションを dewax、エタノール シリーズ (各 5 分間蒸留水で 100%、95%、80%、70% エタノール) などで水分補給をして、組織切片ヘマトキシリンで染色、1% 塩酸アルコール分化にそれらを服従、最後に、ステイン、エオシンのセクション。
- 最後に、40 X 顕微鏡下で肝臓の病理組織像を観察します。
9. ヘマトキシリンとエオシン染色組織切片の染色
- 脱脂とセクションを復元することの後トリス EDTA バッファー (10 mM Tris ベース、1 mM EDTA 溶液; pH 9.0) でセクションを水没、95 ° C で 10 分間電子レンジで加熱して抗原検索を実行します。
- 3% 過酸化水素溶液に 10 分間ティッシュ セクションを公開することによって、内因性ペルオキシダーゼを削除します。
- 5% のヤギ血清、非特異的結合をブロックするとセクションを扱います。
- 一次抗体ウサギ マウス NKG2D 追加 (1: 100)、セクションに、4 ° C でそれらを一晩インキュベート
- セクションに適切な二次抗体 (高分子の HRP 標識抗家兎システム) 室温で 30 分間インキュベートします。
- 3, 3'-ジアミノベンジジン (軽打) として発色を用いた免疫組織染色を視覚化します。
- 40 倍の顕微鏡の下でセクションを観察、画像を取得、必要に応じてそれらを分析に進みます。
10. フローサイトメトリーによる解析
- 優しく肝組織をミンチ、70 μ m の細胞ストレーナを通過、それを遠心分離機 270 x gで 4 分の 4 ° C で 2 倍。
- RPMI 1640 培地で細胞ペレットを再懸濁します、モノクローナル抗体を用いた 2 色蛍光抗体法によって分析します。
- フルオレセイン共役イソチオ シアン酸とフィコエ リスリン アンチ-NKp46 (NK リンパ球; 1:1, 000) を含む、特定の細胞表面マーカーを使用して細胞の表現型解析を実行し、抗 cd4 抗体 (T 細胞サブタイプ; 1:1, 000)、流れの cytometer でデータを分析流れ cytometry データ解析ソフトウェア。
- 前方/側面分散、アイソタイプ コントロールを任意の背景の蛍光性を考慮して個々 の抗体の蛍光信号に基づき二次分析対象データによるとゲートによるとセル人口を選択します。
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Representative Results
確立された BA マウス モデルに基づいて、感染した新生児マウス投与準備 AgNP コラーゲン混合物 2 の i. p. 注入後黄疸を示す x。マウスの生存率は毎日、チェック、肝機能検査、肝臓の病理とフローサイトメトリーを行った。無処理 BA マウスと比較して、AgNP 投与マウスは減らされた黄疸を示し、通常の体重 (図 3) を維持します。ビリルビン代謝と肝トランスアミナーゼのレベルは、AgNPs が肝機能 (表 1) を大幅に改善を示唆している、通常のコントロール値に落ちた。メチレン ブルー染色、肝外胆管 (図 4) は、AgNP 治療後胆管の開存を確認しました。コントロール マウスと比較して、AgNPs を投与したマウスの肝門脈域の大幅減少は炎症性細胞浸潤を示した H & E 染色 (図 5)。流れの cytometry の結果は、AgNP 治療後 (9, 12 日に両方) より RRV マウス (図 6) で肝臓で大幅に少ない NK 細胞を示した。免疫組織化学染色 RRV マウスに比べて AgNP 処理マウスのポータル トライアドの NK 細胞のマーカー NKG2D (図 7) の大幅に減らされた式を明らかにしました。
図 1: 初期注射器貫通位置。赤の点線を示します P6 新生児マウスの腹部に平行な線黄色の矢印の針;赤い矢印は、針の角度を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 針肝下縁の表面に到達します。黄色の点線を示します。 マウスの肝臓の下縁赤い矢印は、注入時に針の位置を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: BA マウスの実験モデルで BA 症候群に及ぼす AgNPs.(A) このパネルは、単独でと 3 日と 6 日 AgNPs (RRV + AgNPs) で注射後 RRV で注射後 9, 12 日に新生仔マウスの外観を示します。(B) このパネルは異なる時間ポイントで各グループのマウスの重さを示すx-軸を示します、マウスが生まれた後の日数とy-軸は体重のフォールドの変更を示します。P < スチューデントのtと 0.01-RRV + AgNp 比較テスト RRV コントロール グループにグループn = nコントロール群 16 RRV グループ、およびnの 18 を = = RRV + AgNP 17 グループ。(C) このパネルでは、各グループのマウスの生存率を示しています。この図は、張らから変更されています。18.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 肝外胆管。造影剤は、肝外胆管の開通性を検出し、画像をキャプチャする使用されました。青の点線は、肝外胆管の方向を示します赤の矢印は、胆管の狭窄黒い矢印は、BA を示します。スケール バー = 1 mm.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: H & E 染色します。9, 12 日に各グループのマウスの肝組織された収集、固定、断面、および H & e. の略語で染色: PV = 門脈, BD 胆管を =。スケールバー = 50 μ m。この図は、張らから変更されています。18.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 肝組織における細胞の NK の割合。(A) マウスの肝臓が 9 と 12 日に細胞懸濁液に処理され、NK 細胞の割合は、フローサイトメトリーで検出されました。(B) このパネルは、NK 細胞の割合を示します (NKp46+CD4+) AgNP 注射後の異なる時点で各グループで。Y-軸は 9 日と日 12.* *P < 0.01 に対照群の割合を基準にして計算された NK 細胞の割合でフォールドの変更を示します、*P < 0.05 で、スチューデントのt-テストを比較すること、RRV + AgNp グループ RRV 対照群n = 各グループの 10。この図は、張らから変更されています。18.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: 免疫組織化学的染色各治療群のマウスのポータル エリアに NK 細胞のマーカー NKG2D 。各治療群のマウスのポータル エリアに NK 細胞のマーカー NKG2D 発現は免疫組織化学染色によって検出されました。長い矢印を示す胆管;短い矢印は、NK 細胞を示しています。略語: PV: 門脈、BD: 胆管。Sscale バー = 50 μ m。この図は、張らから変更されています。18.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
表 1: 肝機能関連分子の血清レベルの臨床検査します。末梢血は、各グループのマウスにおける肝の機能を測定するために使用されました。ALT: アラニンアミノトランスフェラーゼ、AST: アスパラギン酸アミノ基転移酵素、ALP: TP アルカリホスファターゼ: 総蛋白、ALB: アルブミン、グロ: グロブリン、TBIL: 総ビリルビン、DBIL: 直接ビリルビン、IBIL: 間接ビリルビンと未定総胆汁酸を =。P < 0.05 と * *P < 0.01、学生のt-RRV 単独でグループnと比較して各コホート試験 = 各グループの 10。平均 ± SD. として生化学的指標のすべてのデータが表示されます。3 つのグループにすべてのマウスが 12 日古い。このテーブルは、張らから変更されています。18.ファイルのダウンロードは、こちらをご覧ください。
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Discussion
AgNPs 展示強力な広域スペクトル抗菌特性と強力な透磁率22;さらに、抗菌医薬品23の範囲を生成する使用されます。しかし、AgNPs では、臓器内に蓄積し、毒性24,25につながる可能性がありますこの永続性をクリアに長い時間がかかります。以前研究ラット実験で単回静脈内投与後の急性毒性および遺伝毒性 AgNPs の検討し、その結果、AgNPs が急性の肝臓と腎臓の損傷を引き起こす可能性があります。AgNPs は、胸腺と脾臓17を含む主要な免疫器官に蓄積します。このマウス BA モデルの AgNPs による治療は NK 細胞抑制作用によって部分的に仲介されるが示唆 BA 症候群を改善しました。ただし、AgNPs の長期的な影響には、マウスの開発と免疫調節への潜在的な毒性を評価するために、更なる調査が必要があります。
法、手術の成功のいくつかの追加のノートの通りです: (i) AgNP コラーゲン混合物を準備するプロセス遂行されなければならない氷のため、室温、AgNP コラーゲン混合物は急速になる半固形のゲルを注射用は使用できません。4 ° C で保存する AgNP コラーゲン混合調製後(1 mL インスリンは注射器 ii) のみは小径注入薬剤の漏れを低減するために使わなければなりません。(iii) これまでの研究を検討している一般に AgNPs の効果は16または経由での静脈注射の17を経口投与します。動物実験では、実験の被験者が新生児マウス;したがって、静脈注射はほとんど不可能である、i. p. 注射を使いました。AgNPs の注入マウスで BA の症状の改善。(iv) 注入の初めに、マウスの下肢は、マウスが移動するを防ぐために手で固定されます。このメソッドは、適切な量の薬が、ヌケモレなく腹腔内に注入し、さらに実験の有効性を保証します。(v) 新生児マウス左腹部、胃、脾臓と胃は牛乳でいっぱい。肝臓の下側の面に AgNP 混合物を注入するには、針を挿入し、マウスの右の腿の上から。左側から針を挿入する場合簡単にいずれか胃の腹腔内や出血を引き起こす、脾臓に流れ込むミルクを引き起こすを穴をあける可能性がありますそれ。(vi) 新生仔マウスの腹部の壁が薄いので、肝臓の下縁に到達する腹部の壁に近くの 15 ° の角度で針を斜めに進めることによって薬剤の漏れを防止できます。
我々 はこの RRV 誘発マウス BA モデルで AgNPs の促進効果を観察しました。先行研究ではさまざまなウイルス感染症や病気の治療に AgNPs を使用するとこれら AgNP データは、アンチ ウイルスの感染症での体内の応用の可能性を示唆しています。これらの実験の制限は、AgNPs の薬物動態が AgNP 投与量のコントロールは困難 AgNPs の測定方法の不足のため、完全に明確ではないことです。さらなる研究は、メカニズムを理解し、将来の疾患治療の副作用を減らす助けになる AgNPs の細胞内ターゲットのも必要です。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
ここで使用される AgNPs は、香港大学化学科の c. m. チェからの贈り物でした。この作品は、中国の国家自然科学基金 (第 81600399) と科学技術広州プロジェクト (No.201707010014) によって賄われていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/c mouse | Guangdong Medical Experimental Animal Center | SYXK2017-0174 | Animal experiment |
| Rhesus rotavirus (RRV) | ATCC | ATCC VR-1739 | Establish biliary atresia mouse model |
| MA104 cells | ATCC | ATCC CRL-2378.1 | For laboratory use only |
| DMEM | Thermo Fisher | 10569010 | Mammalian Cell Culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10099141 | Mammalian Cell Culture |
| collagen Type I | CORNING | 354236 | For research use only |
| PBS buffer | OXOID | BR0014G | For washing |
| NaOH | Sigma | 1310-73-2 | Adjust the PH value |
| AgNP | Antibacterial Note: The AgNps was a gift from Prof CM Che. in the Department of Chemistry, the University of Hong Kong. |
||
| Insulin syringe with integrated needle | BD | 9161635S | For medical use |
| 15 mL Centrifuge Tube | Corning | 430791 | For laboratory use only |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | GEB | CT0200-B-N | For laboratory use only |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE-Ci | For laboratory use |
| Dissecting/Intravital microscope | Nikon | SMZ 1000 | For laboratory use |
| anti-Mouse NKp46 FITC | eBioscience | 11-3351 | For research use only |
| anti-Mouse CD4 PE-Cyanine5 | eBioscience | 15-0041 | For research use only |
| Monoclonal Mouse Anti-Human CD4 | DAKO | 20001673 | For research use only |
| anti-NKG2D | RD | MAB1547 | For research use only |
| BD FACSCanto Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Canto Plus | For laboratory use only |
References
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