Summary
Dit artikel beschrijft in detail een methode gebaseerd op zilveren nanodeeltjes voor verbetering van biliaire atresie syndroom in een experimentele biliaire atresie muismodel. Een solide begrip van het voorbereidingsproces reagens en de injectietechniek neonatale muis zal helpen onderzoekers vertrouwd met de methode gebruikt bij neonatale muis model studies.
Abstract
Biliaire atresie (BA) is een ernstige vorm van Acute cholangitis met hoge mortaliteit bij kinderen waarvan de etiologie is nog steeds niet volledig begrepen. Virale infecties kunnen een mogelijke oorzaak zijn. De typische diermodel gebruikt voor het bestuderen van BA is opgericht door het enten van een neonatale muis met een rhesus-rotavirus. Zilveren nanodeeltjes hebben aangetoond dat de antibacteriële en antivirale werking; hun functie in de BA-muismodel wordt geëvalueerd in deze studie. Momenteel zijn de methoden die worden gebruikt ter verbetering van de symptomen van BA muizen in BA dierproeven, meestal symptomatische behandelingen gegeven via voedsel of andere drugs. Het doel van deze studie is om aan te tonen van een nieuwe methode voor de verbetering van BA syndroom in muizen door de intraperitoneale injectie van zilveren nanodeeltjes en om te voorzien in gedetailleerde methoden voor het voorbereiden van de zilveren nanoparticle gel formulering. Deze methode is eenvoudig en breed inzetbaar en kan worden gebruikt voor het onderzoek van het mechanisme van BA, evenals in klinische behandelingen. Gebaseerd op het model van de muis BA, wanneer de muizen geelzucht vertonen, wordt de bereid zilveren nanoparticle gel geïnjecteerd intraperitoneally op het oppervlak van de lagere lever. De status van de overleving is waargenomen, en biochemische indicatoren en lever histopathologisch onderzoek worden onderzocht. Met deze methode kunt een meer intuïtieve inzicht van zowel de inrichting van de BA-model en de roman BA behandelingen.
Introduction
BA is een vorm van cholestase gekenmerkt door aanhoudende geelzucht en heeft hoge mortaliteit bij gebrek aan lever transplantatie. Virale infecties zijn nauw verbonden met de pathogenese van BA. Het cytomegalovirus, reovirus en rotavirus hebben al gesuggereerd als pathogenen in BA1,2,3. In de neonatale periode, de reactie van de onrijpe immuunsysteem op een virale infectie resulteert in immuun disregulatie tegen extra- en Intrahepatische galwegen, wat leidt tot biliaire epitheliale cellen apoptosis, inflammatoire cel infiltratie in de portal gebied, Intrahepatische en extrahepatic gal duct obstructie, en ten slotte leverfibrose4,5,6.
De gebruikte diermodel voor BA studies betreft het enten van een neonatale muis met de rhesus rotavirus (RVV). De muis ontwikkelt meestal geelzucht na 5-6 dagen, met een laag lichaamsgewicht en acholic ontlasting. De rol van de immuunrespons bij het ziekteproces is kritisch zijn, vooral voor natural killer (NK) cellen; de uitputting van deze cellen met anti-NKG2D antistof vermindert sterk schade BA-geïnduceerde7. Bovendien andere cellen, met inbegrip van CD4+ T cellen, CD8+ T cellen, dendritische cellen en regulatoire T-cellen, al is aangetoond dat ze spelen een rol in de ziekte8,9,10,11. Alle gegevens suggereren de onmisbare aard van het immuunsysteem in de loop van BA.
Zilveren nanodeeltjes (AgNPs) hebben aangetoond dat hebben gunstige effecten tegen sommige besmettelijke ziekten, waaronder bacteriële infecties12 en virale infecties13,14,15. Echter dan dermatologische gebruik, hebben weinig studies gebruikt AgNPs in een klinische behandeling, vooral vanwege hun mogelijke toxiciteit. In dierproeven, hebben onderzoekers in het algemeen de werkzaamheid van AgNPs toegediend via mondelinge16 of intraveneuze methoden17bestudeerd. Echter hebben geen andere onderzoekers onderzocht de doeltreffendheid van de AgNPs toegediend via een injectie intraperitoneaal (i.p.) in neonatale muis experimenten, die een eenvoudige en snelle methode leidt tot een meer direct effect op de lever en galwegen terwijl vermindering van de toxiciteit voor andere systemen, zoals het immuunsysteem. AgNPs is gebleken dat bij NK cel activiteit18; dus we getest de therapeutische effecten van AgNPs toegediend via i.p. injectie in de BA-muismodel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke experimentele protocollen zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik van het Comité van de zon Yat-Sen University Laboratory Animal Center (#IACUC-DB-16-0602).
1. vaststelling van de muismodel biliaire atresie
- Zwangere BALB/c muizen in een specifieke pathogenen vrije omgeving onder een 12u donker/licht cyclus bij 25 ° C, met toegang tot gesteriliseerde met autoclaaf chow ad libitumhandhaven.
- Ter voorbereiding van de RVV-stam MMU 18006, versterken van het virus in de cellen van de MA104 en de virale titers meten door een plaque assay19.
Opmerking: MA104 cellen worden gekweekt in Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) met 10% foetale runderserum (FBS) in een broedmachine met een bevochtigde sfeer met 5% CO2. De versterking stappen worden hieronder kort geschetst.- MA104 cellen infecteren (1,5 x 107) in een maatkolf van 150 cm-2 -cultuur met trypsine-geactiveerde RVV [1.5 x 106 plaque-vormende eenheden (PFU)] in 30 mL serumvrij voedingsbodem. Incubeer de geïnfecteerde cellen voor 3 dagen in een bevochtigde incubator bij 37 ° C met 5% CO2.
- Lyse van de geïnfecteerde cellen in de kolf van cultuur door drie cycli bevriezen en ontdooien, met 20 min in een vriezer-80 ° C voor elk bevriezen fase en, vervolgens, ontdooien van de cellen terug naar kamertemperatuur; de cel-associated virus deeltje zal vrijgeven in het supernatant. Vervolgens verzamelen en breng de cel lysate en supernatant van cultuur in een conische tube van 15 mL.
- Verwijder grote cellulaire puin uit de lysate door lage snelheid centrifugeren (300 x g bij 4 ° C gedurende 3 minuten). Pipetteer vervolgens het supernatant met het virus (ongeveer 6 mL) in een nieuwe conische tube van 15 mL voor dierproeven.
Opmerking: De RVV is vervolgens klaar om te worden titered, aliquoted, en opgeslagen of gebruikt voor extra rondes voor amplificatie. Langdurige blootstelling aan kamertemperatuur zal het verminderen van de capaciteit van de virale infectie; het virus moet worden geplaatst op ijs en opgeslagen bij-80 ° C of in vloeibare stikstof.
- Belasting de RVV in een kleine-volume (1 mL) insuline syringe met een 29 G naald voor de neonatale muis injectie.
Opmerking: De dikke naalden van volumetrische spuiten gemakkelijk leiden tot lekkage van de drug. - Binnen de 24 uur van geboorte, toedienen aan elke pasgeborene 20 µL van 1.2 x 105 PFU/mL RVV via de i.p. route; Gebruik hetzelfde volume zoutoplossing als het besturingselement.
Opmerking: De spuit gebruikt in dit experiment is een insuline spuit van 1 mL. Geïnfecteerde muizen die niet waren gevoed door hun moeder stierf in de eerste 2 dagen als gevolg van andere redenen werden niet opgenomen in de analyse. - Alle neonatale muizen nauw observeren en dagelijks wegen. Typisch, op de zesde dag na inoculatie van de RVV, geelzucht verschijnt op de oren en de blote huid, de ontlasting wordt klei-gekleurde en de vacht olieachtig, suggereren de oprichting van de BA-model; Controleer of deze symptomen.
Opmerking: BA kan worden bevestigd door een onderzoek van de sectie leverweefsel met H & E en met vermelding van immunohistochemical. De BA-muizen zijn dan klaar voor de behandeling van AgNP.
Let op: Het protocol gepresenteerd is voor gebruik met hedendaagse dierlijke en menselijke RV stammen, die moet worden behandeld onder voorwaarden Biosafety Level 2 (BSL-2).
2. Zilveren Nanoparticle synthese
- Bereiden en de AgNPs als eerder beschreven12,20te karakteriseren.
Opmerking: De details van de voorbereiding en karakteriseren van het AgNPs zijn beschreven in de publicaties door C. M. Che van team van de afdeling scheikunde, de Universiteit van Hongkong12,20. De uiteindelijke concentratie van de oplossing was 1 mM. De gemiddelde diameter van de AgNPs was 10 nm (variërend van 5 tot 15 nm) en bevestigd door elektronenmicroscopie.
3. bereiding van het zilveren Nanoparticle collageen mengsel
Opmerking: Het AgNP collageen mengsel is voorbereid en gekarakteriseerd als eerder21 beschreven en bij 4 ° C. opgeslagen Alle procedures moeten worden uitgevoerd op het ijs.
- Eerst, voor de vervaardiging van collageen, voeg 490 µL van type I collageen (4 mg/mL) tot een 1,5 mL koker en plaats deze op het ijs.
- Voeg 100 µL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, 10 x) om de collageen en meng het met een pipet.
- Combineren om te bereiden 1 L voor 10 x PBS buffer, 80 g NaCl, KCl 2 g en 35.8 g nb2HPO4. 12H2O met 2.4 g KH2PO4 en winkel de buffer bij kamertemperatuur.
- Dan, voeg 10 µL van NaOH (0,2 M) aan de bovenstaande oplossing.
- Toevoegen om te bereiden 0,2 M NaOH, 8 g NaOH poeder tot 1 L gedestilleerd water.
- Ten slotte Voeg 400 µL van AgNPs (1 mM) aan het collageen en meng ze met een pipet.
Opmerking: Voeg het AgNPs laatst voor een zelfs mengen. Het mengsel van de collageen AgNP moet worden bewaard bij 4 ° C; anders, het gemakkelijk stolt bij kamertemperatuur.
4. muis injectie methode
- Beheren van de geïnfecteerde pasgeborenen muizen in de behandelde groep van het RVV met een injectie i.p. 50 µL van het mengsel van de collageen AgNP na het verschijnen van geelzucht; een tweede injectie 3 d later uitvoeren
Opmerking: De muizen in de controlegroep RVV (geïnfecteerde control) krijgen hetzelfde volume van zout, en de muizen in de normale controlegroep krijgen niet iedere behandeling. - Aan het begin van de injectie, druk op het been van de muis met de ringvinger schuin over de rechter dij, en voeren de naald langzaam in een hoek van 15° (Figuur 1). Bij het bereiken van het oppervlak van de onderrand van de lever (Figuur 2), ongeveer 0,5 cm in, injecteren de AgNP collageen mengsel; Vervolgens trekken de naald langzaam.
Opmerking: Wees voorzichtig niet om alle lucht in de spuit als, dan, de neonatale muis kan worden gedood. In neonatale muizen, de maag en milt zijn in de linker buik, en de maag is vol van melk. Als de injectie wordt toegediend aan deze zijde, kon de naald eenvoudig invoeren of de maag, waardoor melk stromen naar de buikholte of de milt, waardoor het bloeden.
Let op: Let op de naald ter voorkoming van eventuele verwondingen van de vinger, en zorg ervoor dat u de dop van de naald vervangen, verwijderen van de naald en plaatst u deze in een container slijpsel. - Na de injecties, de muizen buiten hun kooien voor 10 min te laat het AgNP collageen mengsel gel en om te voorkomen dat de moeder het likken van de injectieplaats te houden. Vervolgens terug de muizen naar hun kooien.
- Observeren en registreren van de fysieke verschijningsvormen van alle muizen per dag, met inbegrip van geelzucht en lichaamsgewicht, evenals de overlevingskans.
5. bloed monster collectie
Opmerking: Bloedmonsters van ongeveer 120 µL worden verzameld door het invoegen van de naald in het hart. Na het centrifugeren is het serum verzameld (ongeveer 70 µL) voor het testen van de leverfunctie. De bloed collectie methode is als volgt.
- Anesthetize van de muizen op de 9e en 12e dag na de RVV-inoculatie (dus 3 dagen na de behandeling van AgNP) met behulp van 0.5-2.5% Sevofluraan.
- Immobiliseren de ledematen van de muis en steriliseren van de bovenste en onderste buik met 75% alcohol.
- Het middenrif bloot door het snijden van de muis huid, spier en buikvlies langs de middellijn aan de xiphoid met een schaar; een steriel katoenen doekje te verwijderen van het maag-darmkanaal om volledig bloot het middenrif spieren te gebruiken.
- Plaats de naald (met een gelost insuline spuit van 1 mL) in het linkerventrikel van het hart en de zuiger van de spuit om te verkrijgen van het volume van de maximale bloed langzaam terugtrekken. Vervolgens overbrengen in het bloed een 1,5 mL-buis.
- Het toestaan van de buis te staan gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en het gedurende 5 min op 400 x gcentrifugeren. Vervolgens met behulp van een pipet overdracht, verzamelen en opslaan van het serum voor verder gebruik.
Opmerking: Te voorkomen beschadiging van het middenrif, als diafragma defecten gemakkelijk tot een pneumothorax, dood en bloedstolling leiden, waardoor het bloed sample collectie.
6. biochemische Parameter detectie
- Gebruik het serum verzameld in stap 5.5 voor de detectie van een biochemische parameter.
- Een geautomatiseerde biochemische analyzer gebruiken voor het detecteren van de volgende biochemische parameters: alanineaminotransferase (ALT), aspartaataminotransferase (AST), alkalische fosfatase (ALP), totaal eiwit (TP), albumine (ALB), globuline (GLO), totaal bilirubine (TBIL), direct bilirubine (DBIL), indirecte bilirubine (IBIL) en totale galzuren (TBA).
7. extrahepatic Cholangiography te observeren de Extrahepatic gal buis bij
Opmerking: Het hele proces onder een Microscoop dissectie uitvoeren
- Volledig bloot de lever, de galblaas en de extrahepatic van de galwegen met een wattenstaafje.
- Observeren en fotograferen van de verschijning van de lever en galwegen onder een Microscoop dissectie.
- Ophthalmic pincet gebruiken om voorzichtig de onderkant van de galblaas.
- Het laden van een injectiespuit 1 mL met methyleenblauwoplossing (0,05 wt.% in H2O). De naald van de spuit langzaam invoegen in de holte van de galblaas; vervolgens, grijpen de naald met de oogheelkundige pincet en langzaam de infusie van 10 – 20 µL van methyleenblauw.
- Observeren onder een microscoop of de blauwe kleur aan de extrahepatic galwegen aan het jejunum passeert en neem een foto.
8. verzamelen van verse lever monsters voor haematoxyline en eosine-kleuring
- Corrigeer de verse muis lever weefsels 's nachts in 10% formaline.
- Vervolgens het vaste lever weefsel inbedden in paraffine en deel ze.
- De secties dewax, ze hydrateren met een reeks van ethanol (zoals 100%, 95%, 80% en 70% ethanol in gedistilleerd water, elk gedurende 5 minuten), vlek de weefselsecties met haematoxyline, onderwerpen aan een 1%-zoutzuur alcohol-differentiatie en ten slotte vlek de secties met eosine.
- Ten slotte acht het histopathologisch onderzoek van de lever onder een Microscoop X 40.
9. immunohistochemische kleuring van de haematoxyline en eosine gebeitste weefselsecties
- Voer na het Wasuitsmeltovens en vochtinbrengende de secties, een antigeen-ophalen door de secties in Tris-EDTA-buffer (10 mM Tris base, 1 mM EDTA-oplossing; pH 9.0) dompelen en verwarming ze in een magnetron voor 10 min bij 95 ° C.
- Endogene peroxidase verwijderen door de weefselsecties gedurende 10 minuten tot een 3% waterstof peroxide oplossing bloot te leggen.
- Behandelen van de secties met 5% geit serum, niet-specifieke binding blokkeren.
- Toevoegen van primaire antilichamen konijn-muis NKG2D (1:100) naar de secties, en na een hen nacht bebroeden bij 4 ° C.
- Incubeer de secties met de passende secundaire antilichamen (HRP-geëtiketteerden polymeer anti-konijn systeem) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Visualiseer de immunohistochemische kleuring met behulp van 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) als chromogeen.
- Observeren van de secties onder een Microscoop X 40, te verwerven van beelden, en gaan ze analyseren zoals gewenst.
10. flow cytometrische analyse
- Zachtjes het leverweefsel gehakt, het passeren door een zeef van de cel 70 µm en Centrifugeer het 2 x bij 270 x g bij 4 ° C voor 4 min.
- Resuspendeer de pellet cel in RPMI 1640 medium en analyseren met twee kleuren immunofluorescentie met monoklonale antilichamen.
- Uitvoeren van cellulaire fenotypering met behulp van specifieke celoppervlak markers, met inbegrip van fluoresceïne isothiocyanaat - en phycoerythrin-geconjugeerde anti-NKp46 (NK lymfocyten; 1:1, 000) en anti-CD4 (T-cel subtype; 1:1, 000), met een cytometer van de stroom en analyseren van gegevens met stroom cytometry data analysesoftware.
- Selecteer cel populaties volgens vooruit/kant scatter, gate volgens de isotype besturingselementen naar de rekening voor elke achtergrond fluorescentie, en de gegevens onderworpen aan een secundaire analyse op basis van de signalen van de fluorescentie van individuele antilichamen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Op basis van de gevestigde muismodel van BA, de geïnfecteerde pasgeborenen muizen werden toegediend een i.p. injectie van het bereide AgNP collageen mengsel 2 x na het tentoonstellen van geelzucht. Muis overleven dagelijks werd gecontroleerd en leverfunctie testen, lever pathologie en stroom cytometry werden uitgevoerd. In vergelijking met de onbehandelde BA muizen, de AgNP behandelde muizen toonde verminderde geelzucht en onderhouden van hun normale lichaamsgewicht (Figuur 3). De hoeveelheid bilirubine metabolisme en hepatische transaminase gedaald tot normale controlewaarden, wat suggereert dat de AgNPs sterk verbeterd de leverfunctie (tabel 1). Extrahepatic cholangiography (Figuur 4) met methyleenblauw kleuring bevestigde de gal duct bij na de AgNP behandeling. H & E kleuring (Figuur 5) bleek een aanzienlijk verminderde inflammatoire cel infiltratie in de hepatische portal-gebied van muizen behandeld met AgNPs, in vergelijking met de controle-muizen. De stroom cytometry resultaten toonde aanzienlijk minder NK-cellen in de lever na de AgNP behandelingen (beide op dagen 9 en 12) dan in de RVV-muizen (Figuur 6). Immunohistochemische kleuring een aanzienlijk verminderde expressie van de NK-cel markering NKG2D (Figuur 7) geopenbaard in de portal triade van de AgNP behandelde muizen, vergeleken met de RVV-muizen.
Figuur 1: eerste spuit penetratie positie. De rode stippellijn geeft aan de lijn evenwijdig aan de buik van de P6 neonatale muis; de gele pijl geeft aan de naaldpunt; de rode pijl geeft de hoek van de naald. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: naald bereiken van het oppervlak van de onderrand van de lever. De gele stippellijn geeft aan de onderrand van de lever van een muis; de rode pijl geeft de positie van de naald tijdens de injectie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Effect van AgNPs op BA syndroom in een experimentele BA muismodel. (A) dit paneel toont de verschijning van neonatale muizen op dagen 9 en 12 na een injectie met RVV alleen en 3 dagen en 6 dagen na een injectie met AgNPs (RRV + AgNPs). (B) dit paneel toont het gewicht van de muizen in elke groep op verschillende tijdstippen; de x-as geeft aan hoeveel dagen nadat de muis werd geboren en de y-as geeft de fold-verandering in lichaamsgewicht. P < 0.01 met de Student t-test vergelijken de RVV + AgNp groep de RVV controlegroep; n = 16 in de controlegroep, n = 18 in de RVV-groep, en n = 17 in de RVV + AgNP groep. (C) dit paneel toont de overlevingskansen van de muizen in elke groep. Dit cijfer is gewijzigd van Zhang et al. 18. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Extrahepatic cholangiography. Een contrast-agent werd gebruikt om te ontdekken de bij van de extrahepatic galwegen en om beelden te vangen. De blauwe stippellijn geeft de richting van de extrahepatic gal koker; de rode pijl geeft een vernauwing van de Galgang; de zwarte pijl geeft BA. Schaal bar = 1 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: H & E kleuring. Lever weefsels van de muizen in elke groep op dagen 9 en 12 werden verzameld, vaste, gesegmenteerd en gekleurd met H & E. afkortingen: PV = portal vein, BD = gal buis. Schaal bar = 50 µm. Dit cijfer is gewijzigd van Zhang et al. 18. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: Percentage van NK cellen in het leverweefsel. (A) de lever van muizen werden verwerkt in cel schorsingen op dagen 9 en 12, en het aandeel van NK-cellen werd ontdekt door stroom cytometry. (B) dit paneel toont het percentage van NK-cellen (NKp46+CD4+) in elke groep op verschillende tijdstippen na de injectie van de AgNP. De y-as geeft de fold-verandering in het percentage van NK-cellen, die was berekend ten opzichte van de percentages van de controlegroep op dag 9 en dag 12.* *P < 0.01 en *P < 0,05, met de Student t-test vergelijken de RVV + AgNp groep de RVV controlegroep, n = 10 in elke groep. Dit cijfer is gewijzigd van Zhang et al. 18. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7: immunohistochemische kleuring voor de NK-cel markering NKG2D in het gebied van de portal van de muizen in alle behandelde groepen. De expressie van de NK-cel markering NKG2D in het gebied van de portal van de muizen in elke behandelde groep werd ontdekt door immunohistochemische kleuring. De lange pijlen geven de galwegen; de korte pijlen geven aan NK-cellen. Afkortingen: PV: portal vein, BD: Gal buis. Sscale bar = 50 µm. Dit cijfer is gewijzigd van Zhang et al. 18. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Tabel 1: klinisch laboratoriumonderzoek van de lever functie-gerelateerde molecuul serum niveaus. Perifeer bloed werd gebruikt voor het meten van de leverfunctie bij de muizen in elke groep. ALT: alanineaminotransferase, AST: aspartaataminotransferase, ALP: alkalische fosfatase, TP: total eiwit, ALB: albumine, GLO: globuline, TBIL: totaal bilirubine, DBIL: direct bilirubine, IBIL: indirecte bilirubine, en TBA = totale galzuren. P < 0,05 en **P < 0,01, met de Student t-test voor elk cohort ten opzichte van de RVV alleen groep, n = 10 in elke groep. Alle biochemische indicator gegevens worden weergegeven als de gemiddelde ± SD. Alle muizen in de drie groepen waren 12 dagen oud. Deze tabel is gewijzigd van Zhang et al. 18. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AgNPs Exposeren krachtige breed-spectrum antibacteriële eigenschappen en een sterke permeabiliteit22; Daarnaast worden ze gebruikt voor de productie van een scala van antibacteriële geneesmiddelen23. Echter kan AgNPs lang duren om te wissen zodra ze in organen accumuleren, en deze volharding tot toxische effecten24,25 leiden kan. Een eerdere studie onderzocht de acute toxiciteit en genotoxiciteit van AgNPs na een enkele i.v. injectie in een rat-experiment, en de resultaten toonden aan dat AgNPs leiden acute lever en nierschade tot kan. AgNPs opgebouwd in de belangrijkste immuunsysteem organen, met inbegrip van de zwezerik en de milt17. De behandeling met AgNPs verbeterd in dit model muis BA BA syndroom, die onze gegevens suggereren is gedeeltelijk gemedieerd door NK cel remming. De langetermijneffecten van AgNPs vereisen echter een verder onderzoek, om te beoordelen van de mogelijke toxiciteit tot de ontwikkeling van de muis en de immuunregulatie.
In termen van de methode, opmerkingen voor een succesvolle operatie zijn als volgt: (i) het proces ter voorbereiding van het AgNP collageen mengsel moet worden uitgevoerd op ijs omdat, bij kamertemperatuur, de AgNP collageen mengsel zal snel uitgegroeid tot een semi-solide gel, die kan niet worden gebruikt voor injecties. Na de voorbereiding, moet het mengsel van de collageen AgNP worden bewaard bij 4 ° C. (ii) uitsluitend 1 mL insuline spuiten moeten worden gebruikt vanwege de kleine diameter, waardoor de lekkage van de geïnjecteerde drugs. (iii) vorige studies hebben over het algemeen onderzocht het effect van AgNPs oraal toegediend16 of via intraveneuze injectie17. In onze dierproeven zijn de experimentele onderwerpen neonatale muizen; Dus, intraveneuze injectie is bijna onmogelijk, en gebruikten we een i.p. injectie. De injectie van AgNPs verbeterd de symptomen van BA in de muizen. (iv) aan het begin van de injectie, worden de onderste ledematen van de muis opgelost met de hand om te voorkomen dat de muis verplaatsen. Deze methode zorgt ervoor dat het juiste bedrag van de drug wordt geïnjecteerd in de buikholte zonder lekkages en verder de werkzaamheid van het experiment garandeert. (v) in neonatale muizen, de maag en milt zijn in de linker buik, en de maag is vol van melk. Om te injecteren van het AgNP mengsel op het oppervlak van de onderrand van de lever, wordt de naald ingevoegd boven de rechter dij van de muis. Als de naald wordt ingevoegd vanaf de linkerkant, kan het gemakkelijk of de maag, waardoor melk stromen naar de buikholte of de milt, waardoor het bloeden doorprikken. (vi) omdat de buikwand in neonatale muizen dun is, kan drug lekkage worden voorkomen door de naald onder een hoek van 15° dichtbij de buikwand tot de onderrand van de lever diagonaal vooruit te gaan.
Wij hebben geconstateerd dat het positief effect van de AgNPs in deze muis van RVV-geïnduceerde BA model. Samen met eerdere studies waarmee AgNPs in de behandelingen van verschillende virusinfecties en ziekten, suggereren deze gegevens AgNP de mogelijkheid van een in vivo toepassing anti-virus infecties. De beperking van deze experimenten is dat de farmacokinetiek van AgNPs is niet helemaal duidelijk als gebrek aan meetmethoden voor de AgNPs, die de controle van AgNP doseringen moeilijk maakt. Verder onderzoek is ook nodig voor het intracellulaire doel van de AgNPs, die ons helpen zal te begrijpen van het mechanisme en de bijwerkingen in de toekomst ziekte behandelingen te verminderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De AgNPs die hier gebruikt waren een geschenk van C. M. Che in het departement chemie, de Universiteit van Hongkong. Dit werk werd gefinancierd door het National Natural Science Foundation of China (nr. 81600399) en de wetenschap en de technologie Project van Guangzhou (No.201707010014).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/c mouse | Guangdong Medical Experimental Animal Center | SYXK2017-0174 | Animal experiment |
| Rhesus rotavirus (RRV) | ATCC | ATCC VR-1739 | Establish biliary atresia mouse model |
| MA104 cells | ATCC | ATCC CRL-2378.1 | For laboratory use only |
| DMEM | Thermo Fisher | 10569010 | Mammalian Cell Culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10099141 | Mammalian Cell Culture |
| collagen Type I | CORNING | 354236 | For research use only |
| PBS buffer | OXOID | BR0014G | For washing |
| NaOH | Sigma | 1310-73-2 | Adjust the PH value |
| AgNP | Antibacterial Note: The AgNps was a gift from Prof CM Che. in the Department of Chemistry, the University of Hong Kong. |
||
| Insulin syringe with integrated needle | BD | 9161635S | For medical use |
| 15 mL Centrifuge Tube | Corning | 430791 | For laboratory use only |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | GEB | CT0200-B-N | For laboratory use only |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE-Ci | For laboratory use |
| Dissecting/Intravital microscope | Nikon | SMZ 1000 | For laboratory use |
| anti-Mouse NKp46 FITC | eBioscience | 11-3351 | For research use only |
| anti-Mouse CD4 PE-Cyanine5 | eBioscience | 15-0041 | For research use only |
| Monoclonal Mouse Anti-Human CD4 | DAKO | 20001673 | For research use only |
| anti-NKG2D | RD | MAB1547 | For research use only |
| BD FACSCanto Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Canto Plus | For laboratory use only |
References
- Szavay, P. O., Leonhardt, J., Czechschmidt, G., Petersen, C. The role of reovirus type 3 infection in an established murine model for biliary atresia. European Journal of Pediatric Surgery. 12 (04), 248-250 (2002).
- Coots, A., et al. Rotavirus infection of human cholangiocytes parallels the murine model of biliary atresia. Journal of Surgical Research. 177 (2), 275-281 (2012).
- Shanmugam, N. P., Jayanthi, V. Biliary atresia with cytomegalovirus. Indian Pediatrics. 49 (2), 157 (2012).
- Mack, C. L., Feldman, A. G., Sokol, R. J. Clues to the Etiology of Bile Duct Injuryin Biliary Atresia. Seminars in Liver Disease. 32, 307-316 (2012).
- Muraji, T., Suskind, D. L., Irie, N. Biliary atresia: a new immunological insight into etiopathogenesis. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 3 (6), 599-606 (2009).
- Sokol, R. J., Mack, C. Etiopathogenesis of Biliary Artesia. Seminars in Liver Disease. 21, 517-524 (2001).
- Shivakumar, P., Sabla, G. E., Whitington, P., Chougnet, C. A., Bezerra, J. A. Neonatal NK cells target the mouse duct epithelium via Nkg2d and drive tissue-specific injury in experimental biliary atresia. Journal of Clinical Investigation. 119 (8), 2281-2290 (2009).
- Mack, C. L., et al. Oligoclonal expansions of CD4+ and CD8+ T-cells in the target organ of patients with biliary atresia. Gastroenterology. 133 (1), 278-287 (2007).
- Shivakumar, P., et al. Effector Role of Neonatal Hepatic CD8 + Lymphocytes in Epithelial Injury and Autoimmunity in Experimental Biliary Atresia. Gastroenterology. 133 (1), 268-277 (2007).
- Saxena, V., et al. Dendritic Cells Regulate Natural Killer Cell Activation and Epithelial Injury in Experimental Biliary Atresia. Science Translational Medicine. 3 (102), 102ra194 (2011).
- Miethke, A. G., et al. Post-natal paucity of regulatory T cells and control of NK cell activation in experimental biliary atresia. Journal of Hepatology. 52 (5), 718-726 (2010).
- Tian, J., et al. Topical delivery of silver nanoparticles promotes wound healing. ChemMedChem. 2 (1), 129-136 (2010).
- Lu, L., et al. Silver nanoparticles inhibit hepatitis B virus replication. Antiviral Therapy. 13 (2), 253-262 (2008).
- Xiang, D., et al. Inhibition of A/Human/Hubei/3/2005 (H3N2) influenza virus infection by silver nanoparticles in vitro and in vivo. International Journal of Nanomedicine. 8 (Issue 1), 4103-4114 (2013).
- Elechiguerra, J. L., et al. Interaction of silver nanoparticles with HIV-1. Journal of Nanobiotechnology. 3 (1), 1-10 (2005).
- Nallanthighal, S., et al. Differential effects of silver nanoparticles on DNA damage and DNA repair gene expression in Ogg1-deficient and wild type mice. Nanotoxicology. 11 (8), 1-16 (2017).
- Wen, H., et al. Acute toxicity and genotoxicity of silver nanoparticle in rats. PLoS One. 12 (9), e0185554 (2017).
- Zhang, R., et al. Silver nanoparticle treatment ameliorates biliary atresia syndrome in rhesus rotavirus inoculated mice. Nanomedicine. 13 (3), 1041-1050 (2017).
- Arnold, M., Patton, J. T., McDonald, S. M. Culturing, Storage, and Quantification of Rotaviruses. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 15 Unit 15C.13 (2009).
- Liu, X., et al. Silver nanoparticles mediate differential responses in keratinocytes and fibroblasts during skin wound healing. ChemMedChem. 5 (3), 468-475 (2010).
- Zhang, R., et al. Silver nanoparticles promote osteogenesis of mesenchymal stem cells and improve bone fracture healing in osteogenesis mechanism mouse model. Nanomedicine. 11 (8), 1949-1959 (2015).
- Wu, J., Hou, S., Ren, D., Mather, P. T. Antimicrobial properties of nanostructured hydrogel webs containing silver. Biomacromolecules. 10 (9), 2686-2693 (2009).
- Xu, L. Genotoxicity and molecular response of silver nanoparticle (NP)-based hydrogel. Journal of Nanobiotechnology. 10 (1), 16 (2012).
- Dobrzyńska, M. M., et al. Genotoxicity of silver and titanium dioxide nanoparticles in bone marrow cells of rats in vivo. Toxicology. 315 (1), 86-91 (2014).
- Mohamed, H. R. H. Estimation of TiO 2 nanoparticle-induced genotoxicity persistence and possible chronic gastritis-induction in mice. Food & Chemical Toxicology. 83 (9), 76-83 (2015).
