Summary
Denna artikel beskriver i detalj en metod baserad på Silvernanopartiklar för ameliorating biliär atresi syndrom i en experimentell biliär atresi musmodell. En solid förståelse av reagens förberedelseprocessen och neonatal mus injektionsteknik hjälper bekanta forskare med den metod som används i neonatal mus modell studier.
Abstract
Biliär atresi (BA) är en allvarlig typ av kolangit med hög dödlighet hos barn som etiologi är fortfarande inte helt klarlagt. Virusinfektioner kan vara en möjlig orsak. Den typiska djura modell som används för att studera BA etableras genom att vaccinera en neonatal mus med en Rhesusapa rotavirus. Silvernanopartiklar har visat att utöva antibakteriella och antivirala effekter; deras funktion i BA musmodell utvärderas i denna studie. I BA djurförsök, de metoder som används för att förbättra symtomen på BA möss för närvarande allmänt symtomatisk behandling som ges via mat eller andra droger. Syftet med denna studie är att demonstrera en ny metod för ameliorating BA syndrom hos möss av intraperitoneal injektion av Silvernanopartiklar och ge detaljerade metoder för att förbereda silver nanopartiklar gel formulering. Denna metod är enkel och allmänt tillämpliga och kan användas till forskning mekanismen av BA, liksom i kliniska behandlingar. Baserat på BA musmodell, när möss uppvisar gulsot, injiceras beredda silver nanopartiklar gelen intraperitonealt på ytan av lägre levern. Överlevnad status observeras och biokemiska indikatorer och levern histopatologi undersöks. Denna metod tillåter en mer intuitiv förståelse av både inrättandet av BA modell och nya BA behandlingar.
Introduction
BA är en form av kolestas som kännetecknas av ihållande gulsot och har hög dödlighet i avsaknad av levertransplantation. Virusinfektioner är nära kopplad till patogenesen av BA. Den cytomegalovirus, reovirus och rotavirus har alla föreslagits som patogener i BA1,2,3. Under nyföddhetsperioden, omogna immunsystemets svar på en virusinfektion resulterar i immun dysreglering mot extra- och intrahepatisk gallgångarna, vilket leder till biliär epitelial cell apoptos, infiltration av inflammatoriska celler i portalen område, intrahepatisk och extrahepatiska gallgången obstruktion, och slutligen leverfibros4,5,6.
Den vanligaste djurmodell för BA studier innebär inympning av en neonatal mus med den rhesus rotavirus (RRV). Musen vanligtvis utvecklar gulsot efter 5-6 dagar, visar en låg kroppsvikt och acholic avföring. Rollen av immunsvaret i sjukdomsprocessen är kritisk, särskilt för natural killer (NK) celler; utarmning av dessa celler med anti-NKG2D antikropp minskar avsevärt BA-inducerad skada7. Dessutom andra celler, inklusive CD4+ T-celler, CD8+ T celler, dendritiska celler och regulatoriska T-celler, har alla visat att spela roller i sjukdom8,9,10,11. Alla data tyder den oumbärliga karaktären immunförsvaret under BA.
Silvernanopartiklar (AgNPs) har visat sig ha positiva effekter mot vissa smittsamma sjukdomar, inklusive bakterieinfektioner12 och virusinfektioner13,14,15. Men än dermatologiska användning, har några studier använt AgNPs i en klinisk behandling, främst på grund av deras potentiella giftighet. Forskare har i djurförsök, allmänt studerat effekten av AgNPs administreras via muntliga16 eller intravenös metoder17. Dock har inga andra forskare studerat effekten av AgNPs administreras via som en intraperitoneal (IP) injektion i neonatal musen experiment, som är en enkel och snabb metod leder till en mer direkt effekt på levern och gallgångarna medan att minska toxicitet för andra system, såsom immunsystemet. AgNPs har visats påverka NK cell aktivitet18; Därför testade vi de terapeutiska effekterna av AgNPs administreras via i.p.-injektion i BA musmodell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur experimentella protokoll har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén för Sun Yat-Sen University laboratorium djur Center (#IACUC-DB-16-0602).
1. upprätta biliär atresi musmodell
- Upprätthålla gravid BALB/c-möss i ett specifikt patogenfria miljö under en 12 h mörk/ljus cykel vid 25 ° C, med tillgång till Ånghärdad chow ad libitum.
- För att förbereda RRV stammen MMU 18006, förstärker viruset i MA104 celler och mäta de virala titrarna av en plakett assay19.
Obs: MA104 celler odlas i Dulbeccos modifierade örnens medium (DMEM) med 10% fetalt bovint serum (FBS) i en inkubator med en fuktad atmosfär som innehåller 5% CO2. Förstärkning stegen beskrivs kortfattat nedan.- Infektera MA104 celler (1,5 x 107) i en 150 cm2 kultur kolv med trypsin-aktiverat RRV [1,5 x 106 plaque-forming enheter (PFU)] i 30 mL serumfritt medium. Inkubera de infektera cellerna i 3 dagar i en fuktad inkubator vid 37 ° C med 5% CO2.
- Lysera de infektera cellerna i kolven, kultur av tre frysning-och-tining cykler, med 20 min i-80 ° C frys för varje frysa fas och, sedan, upptining cellerna tillbaka till rumstemperatur; cell-associerade virus partikeln kommer att släppa in supernatanten. Sedan samla in och överföra cell lysate och kultur supernatanten till en 15 mL koniska rör.
- Ta bort stora cellulära skräp från den lysate låg hastighet centrifugering (x 300 g vid 4 ° C för 3 min). Över sedan supernatanten innehållande viruset (ca 6 mL) till en ny 15 mL koniska rör för djurförsök.
Obs: RRV är sedan redo att vara titrerade, aliquoted, och lagrade eller används för ytterligare rundor av förstärkning. Långvarig exponering för rumstemperatur minskar den virusinfektion kapaciteten; viruset ska placeras på is och lagras vid-80 ° C eller i flytande kväve.
- Belastning av RRV i en små volymer (1 mL) insulin spruta med en 29 G nål för neonatal mus injektion.
Obs: De tjocka nålarna av volymetriska sprutor lätt leda till drogen läckage. - Inom 24 timmar efter födseln, administrera till varje nyfödda 20 µL av 1,2 x 105 PFU/mL RRV via i.p. rutten; Använd samma volym av saltlösning som kontroll.
Obs: Sprutan används i detta experiment är en 1 mL spruta av insulin. Infekterade möss som inte matades av sina mödrar dog inom de första 2 dagarna på grund av andra skäl ingick inte i analysen. - Noggrant alla neonatala möss och väga dem dagligen. Vanligtvis på den sjätte dagen efter RRV inympningen, gulsot visas på öronen och naken hud, avföringen blir Lerfärgad och pälsen blir fet, att föreslå inrättandet av den BA-modellen. Kontrollera för dessa symtom.
Obs: BA kan bekräftas genom en levervävnad avsnitt undersökning med H & E och immunhistokemisk anger. BA möss är sedan redo för AgNP behandling.
Varning: Det protokoll som presenteras är för användning med samtida djurs och människors RV stammar, som måste hanteras på biosäkerhetsnivå 2 (BSL-2) villkor.
2. silver nanopartiklar syntes
- Förbereda och karaktärisera AgNPs som tidigare beskrivits12,20.
Obs: Detaljerna förbereder och karaktärisera AgNPs har beskrivits i publikationerna av C. M. Che's team vid Institutionen för kemi, University of Hong Kong12,20. Den slutliga koncentrationen av lösningen var 1 mM. Den genomsnittliga diametern av AgNPs var 10 nm (sträcker sig 5 till 15 nm) och bekräftas av elektronmikroskopi.
3. beredning av Silver nanopartiklar kollagen blandningen
Obs: AgNP kollagen blandningen bereds och karakteriseras som tidigare beskrivits21 och lagras vid 4 ° C. Alla procedurer måste utföras på is.
- Lägg först till 490 µL för kollagen beredning, typ I-kollagen (4 mg/mL) i en 1,5 mL rör och placera den på isen.
- Tillsätt 100 µL fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS, 10 x) till kollagen och blanda det med en pipett.
- För att förbereda 1 L 10 x PBS-bufferten, kombinera 80 g NaCl, 2 g av KCl och 35,8 g av Na2HPO4. 12H2O till 2,4 g KH2PO4 och store bufferten vid rumstemperatur.
- Lägg sedan till 10 µL av NaOH (0,2 M) till ovanstående lösning.
- För att förbereda 0.2 M NaOH, tillsätt 8 g NaOH pulver till 1 L destillerat vatten.
- Slutligen tillsätt 400 µL AgNPs (1 mM) i kollagen och blanda dem med en pipett.
Obs: Lägg till AgNPs senast för en jämn blandning. AgNP kollagen blandningen ska förvaras vid 4 ° C; Annars kan stelnar det lätt i rumstemperatur.
4. mus injektion metod
- Administrera de infekterade neonatala möss i RRV behandlade gruppen med en i.p.-injektion med 50 µL AgNP kollagen blandningen efter utseendemässigt av gulsot; utföra en andra injektion 3 d senare.
Obs: Mössen i kontrollgruppen RRV (infekterade kontroll) ges samma volym av saltlösning, och mössen i gruppen normal kontroll ges inte någon behandling. - I början av injektionen, tryck på musens benet med ringfingret snett över det högra låret och införa nålen sakta i 15° vinkel (figur 1). När du når ytan på den nedre kanten av levern (figur 2), ca 0,5 cm i kan injicera AgNP kollagen blandningen. Dra sedan ut injektionsnålen långsamt.
Obs: Var noga med att inte införa någon luft i sprutan som då neonatal musen kan dödas. Hos neonatala möss, magen och mjälten är i vänstra delen av buken, och magen är full av mjölk. Om injektionen ges från denna sida, kunde nålen enkelt ange antingen magen, orsakar mjölk att flöda in i bukhålan eller mjälte, orsakar blödning.
FÖRSIKTIGHET: Uppmärksamma nålen att förebygga skador finger, och se till att ersätta nålskyddet, ta bort nålen och placera den i en behållare. - Efter alla injektionerna, hålla mössen ur sina burar för 10 min att tillåta AgNP kollagen blandningen till gel och förhindra att mamman slickar injektionsstället. Tillbaka möss till sina burar.
- Observera och registrera de fysiska utseenden av alla möss dagligen, inklusive gulsot och kroppsvikt, samt överlevnaden.
5. blod prov samling
Obs: Blodprov på ca 120 µL samlas genom att sätta nålen i hjärtat. Efter centrifugering är serumet insamlade (ungefärligt 70 µL) för leverfunktionen testning. Metoden blod insamling är som följer.
- Söva möss den nionde och 12: e dagen efter RRV inympningen (vilket är 3 dagar efter AgNP behandling) med 0,5-2,5% sevofluran.
- Immobilisera lemmar musen och sterilisera övre och nedre buken med 75% alkohol.
- Exponera membranet genom att skära musen hud, muskler och bukhinnan längs mittlinjen till xiphoid med sax; Använd en steril bomullspinne ta bort magtarmkanalen för att helt avslöja diafragma muskeln.
- Stick in nålen (med en 1 mL lossas insulinspruta) i vänster kammare i hjärtat och långsamt dra tillbaka sprutkolven för att erhålla den maximala blodvolymen. Överför sedan blodet till en 1,5 mL tub.
- Låt röret stå i 30 min i rumstemperatur och centrifugera det för 5 min vid 400 x g. Sedan med överföring pipett, samla in och spara serumet för vidare användning.
Obs: Undvik skada membranen, som membranen brister lätt leda till pneumothorax, död och blodkoagulation, vilket hindrar blodet provsamlingen.
6. biokemisk Parameter upptäckt
- Använd serumet som samlats in i steg 5,5 för en biokemisk parameter upptäckt.
- Använda en automatiserad biokemiska analysatorn för att upptäcka följande biokemiska parametrar: alaninaminotransferas (ALAT), aspartataminotransferas (ASAT), alkaliska fosfataser (ALP), totalt protein (TP), albumin (ALB), globulin (GLO), totalt bilirubin (TBIL), direkt bilirubin (DBIL), indirekt bilirubin (IBIL) och totala gallsyror (TBA).
7. extrahepatiska Cholangiography att iaktta de extrahepatiska gallvägar Patency
Obs: Utföra hela processen under en dissektion Mikroskop.
- Helt avslöja levern, gallblåsan och extrahepatiska gallgångarna med en bomullspinne.
- Observera och fotografera utseendet på levern och gallgångarna i dissektion Mikroskop.
- Använd oftalmologiska pincett till att försiktigt hålla botten av gallblåsan.
- Ladda en 1 mL spruta med lösning av metylenblått (0,05 wt.% i H2O). Långsamt in sprutans nål i gallblåsan hålighet; sedan förstå nålen med oftalmologiska tången, och långsamt ingjuta 10 – 20 µL av metylenblått.
- Observera i Mikroskop om den blå färgen passerar genom extrahepatiska gallgångarna till jejunum och fotografera.
8. insamling av färsk lever prover för Hematoxylin och Eosin färgning
- Fixa fräsch musen levern vävnader över natten i 10% formalin.
- Sedan bädda in fast levern vävnader i paraffin och avsnitt dem.
- Dewax avsnitten, rehydrera dem med en etanol-serien (som 100%, 95%, 80% och 70% etanol i destillerat vatten, var och en för 5 min), fläcken avsnitten vävnad med hematoxylin, utsätta dem för en 1% saltsyra alkohol differentiering och slutligen fläcken den sektioner med eosin.
- Slutligen, Observera den histopatologisk undersökning av levern i 40 X Mikroskop.
9. immunhistokemisk färgning av Hematoxylin och Eosin-färgade vävnadssnitt
- Efter dewaxing och återfuktande avsnitten, utföra en antigen-hämtning genom dränka avsnitten i Tris-EDTA buffert (10 mM Tris base, 1 mM EDTA-lösning, pH 9,0) och värma dem i mikrovågsugn för 10 min vid 95 ° C.
- Ta bort endogena peroxidas genom att utsätta vävnaden avsnitten för 10 min till en 3% väteperoxid-lösning.
- Behandla avsnitten med 5% get serum, blockera ospecifik bindning.
- Lägg till primära antikroppar kanin-mus NKG2D (1: 100) i avsnitten, och inkubera dem över natten vid 4 ° C.
- Inkubera i avsnitt med lämpliga sekundära antikroppar (HRP-märkt polymer anti-kanin system) under 30 minuter vid rumstemperatur.
- Visualisera de immunhistokemisk färgning med 3, 3'-Diaminobenzidin (DAB) som kromogen.
- Iaktta avsnitten i 40 X Mikroskop, inhämta bilder och fortsätta att analysera dem som önskat.
10. flöde flödescytometrisk analys
- Försiktigt finhacka levern vävnad, passera den genom en sil med 70 µm i cellen och centrifugera det 2 x 270 x g vid 4 ° C under 4 minuter.
- Återsuspendera cellpelleten i RPMI 1640 medium och analysera den genom två färger immunofluorescens med monoklonala antikroppar.
- Utföra cellulära fenotypning med specifika cellytan märkpennor, inklusive fluorescein isotiocyanat - och fykoerytrin-konjugerad göra anti-NKp46 på (NK lymfocyter; 1:1, 000) och anti-CD4 T-celler subtyp, 1:1, 000, med en flödescytometer och analysera data med flödescytometri data mjukvara Flödesanalys.
- Välj cellpopulationer enligt framåt/side scatter, gate enligt isotypen kontrollerna att redogöra för alla bakgrunden fluorescens och underställas en sekundär analys av fluorescens signalerna från enskilda antikroppar data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Baserat på etablerade BA musmodell, infekterade neonatala möss administrerades en i.p.-injektion av beredda AgNP kollagen blandningen 2 x efter uppvisar gulsot. Mus överlevnad kontrollerades för dagliga och leverfunktionen testning, lever patologi och flödescytometri utfördes. Jämfört med obehandlad kontroll BA möss, AgNP-behandlade möss visade minskad gulsot och vidhöll sin normala kroppsvikt (figur 3). Nivåerna av bilirubin metabolism och levertransaminaser sjunkit till normal styrning värden, vilket tyder på att AgNPs kraftigt förbättrat leverfunktionsvärden (tabell 1). Extrahepatisk cholangiography (figur 4) med metylenblått färgning bekräftade den gallgången patency efter AgNP behandling. H & E färgning (figur 5) visade en infiltration av signifikant minskade inflammatoriska celler i området för nedsatt portal i möss som behandlats med AgNPs, jämfört med kontroll möss. Flöde flödescytometri resultaten visade betydligt mindre NK-celler i levern efter de AgNP behandlingarna (både på dagar 9 och 12) än i RRV möss (figur 6). Immunhistokemisk färgning avslöjade ett avsevärt reducerat uttryck för NK cell markören NKG2D (figur 7) i portalen triaden av AgNP-behandlade möss, jämfört med RRV möss.
Figur 1: inledande spruta penetration position. Den röda streckade linjen visar linjen som är parallell till buken av P6 neonatal musen; den gula pilen anger den nål punkten; den röda pilen anger nål vinkeln. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: nålen når ytan på den nedre kanten av levern. Den gula streckade linjen visar den nedre kanten av en mus lever; den röda pilen visar nålen position under injektionen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: effekt av AgNPs på BA syndrom i en experimentell BA musmodell. (A) denna panel visar utseendet på neonatala möss på dag 9 och 12 efter en injektion med RRV ensam och 3 dagar och 6 dagar efter en injektion med AgNPs (RRV + AgNPs). (B) i denna panel visas vikten på möss i varje grupp olika tidpunkter; på x-axeln anger antalet dagar efter musen föddes och y-axeln anger den-faldig förändringen i kroppsvikt. P < 0,01 med Student's t-test jämförde RRV + AgNp grupp till gruppen RRV kontroll; n = 16 i kontrollgruppen, n = 18 i RRV gruppen och n = 17 i RRV + AgNP grupp. (C), denna panel visar en överlevnadsfrekvens på möss i varje grupp. Denna siffra har ändrats från Zhang et al. 18. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: extrahepatiska cholangiography. Ett kontrastmedel användes att upptäcka patency av extrahepatiska gallgångarna och ta bilder. Den blå streckade linjen anger riktningen för de extrahepatiska gallvägar; den röda pilen anger en förträngning av gallgången; den svarta pilen anger BA. Skalstapeln = 1 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5: H & E färgning. Levern vävnader av möss i varje grupp på dag 9 och 12 var samlat, fast, sektioneras och färgad med H & E. förkortningar: PV = portvenen, BD = gallgången. Skalstapeln = 50 µm. Denna siffra har ändrats från Zhang et al. 18. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 6: andel av NK-celler i levern vävnad. (A) lever från möss var bearbetas till cellsuspensioner dagar 9 och 12, och andelen av NK-celler upptäcktes av flödescytometri. (B) denna panel visar procentsats av NK-celler (NKp46+CD4+) i varje grupp vid olika tidpunkter efter den AgNP injektionen. Y-axeln anger den-faldig förändringen i procentandelen av NK-celler, som beräknades i förhållande till procentsatserna för kontrollgruppen på dag 9 och dag 12.* *P < 0,01 och *P < 0,05, med Student's t-test jämföra den RRV + AgNp grupp till RRV kontrollgruppen, n = 10 i varje grupp. Denna siffra har ändrats från Zhang et al. 18. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 7: immunhistokemisk färgning för NK cell markören NKG2D i området portal i möss i varje behandlingsgrupp. Uttrycket av NK cell markören NKG2D i området portal i möss i varje behandlingsgrupp upptäcktes genom immunhistokemisk färgning. Långa pilarna anger gallgångarna; kort pilarna anger NK-celler. Förkortningar: PV: portvenen, BD: gallgången. Sscale bar = 50 µm. Denna siffra har ändrats från Zhang et al. 18. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Tabell 1: kliniska laboratorieundersökningar av levern funktionen-relaterade molekyl serumnivåer. Perifert blod användes för att mäta leverfunktionsvärden i möss i varje grupp. ALT: alaninaminotransferas, AST: aspartataminotransferas, ALP: alkaliskt fosfatas, TP: totalt protein, ALB: albumin, GLO: globulin, TBIL: totalbilirubin, DBIL: direkt bilirubin, IBIL: indirekt bilirubin och TBA = totala gallsyror. P < 0,05 och **P < 0,01, med Student's t-test för varje kohort som jämfört RRV ensam grupp, n = 10 i varje grupp. Alla biokemiska indikator data visas som den medelvärde ± SD. Alla möss i de tre grupperna var 12 dagar gamla. Den här tabellen har ändrats från Zhang et al. 18. vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AgNPs uppvisar potent solskyddskrämen antibakteriella egenskaper och en stark genomtränglighet22. Dessutom används de för att producera en rad antibakteriella läkemedel23. AgNPs kan dock ta lång tid att rensa när de ackumuleras i organ, och denna envishet kan leda till toxiska effekter24,25. En tidigare studie undersökte akut toxicitet och genotoxicitet AgNPs efter en enda intravenös injektion i en råtta experiment, och resultaten visade att AgNPs kan orsaka akut lever- och njurskador. AgNPs ackumuleras i de viktigaste immunsystem organ, inklusive bräss och mjälte17. Behandlingen med AgNPs förbättras i denna musmodell BA, BA syndrom, som våra data tyder medieras delvis av NK cell hämning. De långsiktiga effekterna av AgNPs kräver dock ytterligare en undersökning, att bedöma den potentiella toxiciteten till mus utveckling och immunreglering.
När det gäller metoden, några ytterligare anteckningar för en lyckad operation är följande: (i) att förbereda AgNP kollagen blandningen måste utföras på is eftersom, vid rumstemperatur, AgNP kollagen blandningen blir snabbt en halvfast gel, som kan inte användas för injektioner. Efter beredning, ska AgNP kollagen blandningen förvaras vid 4 ° C. (ii) endast 1 mL insulinsprutor bör användas på grund av den små diametern, vilket reducerar läckage av injicerade drogen. (iii) tidigare studier har granskat effekten av AgNPs administreras oralt16 eller via intravenös injektion17. I våra djurförsök är experimentell ämnena neonatala möss; Således, intravenös injektion är nästan omöjligt, och vi använde en i.p.-injektion. Injektion av AgNPs förbättrades symtomen på BA i möss. (iv) i början av injektionen, är de nedre extremiteterna av musen fasta hand vill att musen flyttas. Denna metod säkerställer att rätt mängd av läkemedlet injiceras i bukhålan utan läckage och garanterar ytterligare effekten av experimentet. (v) hos neonatala möss, magen och mjälten är i vänstra delen av buken, och magen är full av mjölk. För att injicera AgNP blandningen till ytan på den nedre kanten av levern, infogas nålen uppifrån högra låret av musen. Om nålen sätts in från vänster sida, kan det lätt punktera antingen magen, orsakar mjölk att flöda in i bukhålan eller mjälte, orsakar blödning. (vi) eftersom den buk-väggen hos neonatala möss är tunn, kan drog läckage förhindras genom diagonalt framåt nålen i 15° vinkel nära den buk-väggen att nå den nedre kanten av levern.
Vi har observerat uppmuntrande effekten av AgNPs i denna RRV-inducerad mus BA modell. Tillsammans med tidigare studier som använde AgNPs i behandlingar av olika virusinfektioner och sjukdomar, antyder dessa AgNP data möjligheten i vivo ansökan i anti virus infektioner. Begränsning av dessa experiment är att farmakokinetiken för AgNPs inte är helt tydligt som på grund av bristande mätmetoder för den AgNPs, vilket försvårar kontroll av AgNP doser. Ytterligare studier behövs också för intracellulära målet för den AgNPs, som hjälper oss att förstå mekanismen och minska biverkningar i framtida sjukdom behandlingar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
De AgNPs används här var en gåva från C. M. Che i Institutionen för kemi, University of Hong Kong. Detta arbete finansierades av den nationella naturvetenskap Foundation i Kina (nr. 81600399) och vetenskap och teknik projekt i Guangzhou (No.201707010014).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/c mouse | Guangdong Medical Experimental Animal Center | SYXK2017-0174 | Animal experiment |
| Rhesus rotavirus (RRV) | ATCC | ATCC VR-1739 | Establish biliary atresia mouse model |
| MA104 cells | ATCC | ATCC CRL-2378.1 | For laboratory use only |
| DMEM | Thermo Fisher | 10569010 | Mammalian Cell Culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10099141 | Mammalian Cell Culture |
| collagen Type I | CORNING | 354236 | For research use only |
| PBS buffer | OXOID | BR0014G | For washing |
| NaOH | Sigma | 1310-73-2 | Adjust the PH value |
| AgNP | Antibacterial Note: The AgNps was a gift from Prof CM Che. in the Department of Chemistry, the University of Hong Kong. |
||
| Insulin syringe with integrated needle | BD | 9161635S | For medical use |
| 15 mL Centrifuge Tube | Corning | 430791 | For laboratory use only |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | GEB | CT0200-B-N | For laboratory use only |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE-Ci | For laboratory use |
| Dissecting/Intravital microscope | Nikon | SMZ 1000 | For laboratory use |
| anti-Mouse NKp46 FITC | eBioscience | 11-3351 | For research use only |
| anti-Mouse CD4 PE-Cyanine5 | eBioscience | 15-0041 | For research use only |
| Monoclonal Mouse Anti-Human CD4 | DAKO | 20001673 | For research use only |
| anti-NKG2D | RD | MAB1547 | For research use only |
| BD FACSCanto Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Canto Plus | For laboratory use only |
References
- Szavay, P. O., Leonhardt, J., Czechschmidt, G., Petersen, C. The role of reovirus type 3 infection in an established murine model for biliary atresia. European Journal of Pediatric Surgery. 12 (04), 248-250 (2002).
- Coots, A., et al. Rotavirus infection of human cholangiocytes parallels the murine model of biliary atresia. Journal of Surgical Research. 177 (2), 275-281 (2012).
- Shanmugam, N. P., Jayanthi, V. Biliary atresia with cytomegalovirus. Indian Pediatrics. 49 (2), 157 (2012).
- Mack, C. L., Feldman, A. G., Sokol, R. J. Clues to the Etiology of Bile Duct Injuryin Biliary Atresia. Seminars in Liver Disease. 32, 307-316 (2012).
- Muraji, T., Suskind, D. L., Irie, N. Biliary atresia: a new immunological insight into etiopathogenesis. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 3 (6), 599-606 (2009).
- Sokol, R. J., Mack, C. Etiopathogenesis of Biliary Artesia. Seminars in Liver Disease. 21, 517-524 (2001).
- Shivakumar, P., Sabla, G. E., Whitington, P., Chougnet, C. A., Bezerra, J. A. Neonatal NK cells target the mouse duct epithelium via Nkg2d and drive tissue-specific injury in experimental biliary atresia. Journal of Clinical Investigation. 119 (8), 2281-2290 (2009).
- Mack, C. L., et al. Oligoclonal expansions of CD4+ and CD8+ T-cells in the target organ of patients with biliary atresia. Gastroenterology. 133 (1), 278-287 (2007).
- Shivakumar, P., et al. Effector Role of Neonatal Hepatic CD8 + Lymphocytes in Epithelial Injury and Autoimmunity in Experimental Biliary Atresia. Gastroenterology. 133 (1), 268-277 (2007).
- Saxena, V., et al. Dendritic Cells Regulate Natural Killer Cell Activation and Epithelial Injury in Experimental Biliary Atresia. Science Translational Medicine. 3 (102), 102ra194 (2011).
- Miethke, A. G., et al. Post-natal paucity of regulatory T cells and control of NK cell activation in experimental biliary atresia. Journal of Hepatology. 52 (5), 718-726 (2010).
- Tian, J., et al. Topical delivery of silver nanoparticles promotes wound healing. ChemMedChem. 2 (1), 129-136 (2010).
- Lu, L., et al. Silver nanoparticles inhibit hepatitis B virus replication. Antiviral Therapy. 13 (2), 253-262 (2008).
- Xiang, D., et al. Inhibition of A/Human/Hubei/3/2005 (H3N2) influenza virus infection by silver nanoparticles in vitro and in vivo. International Journal of Nanomedicine. 8 (Issue 1), 4103-4114 (2013).
- Elechiguerra, J. L., et al. Interaction of silver nanoparticles with HIV-1. Journal of Nanobiotechnology. 3 (1), 1-10 (2005).
- Nallanthighal, S., et al. Differential effects of silver nanoparticles on DNA damage and DNA repair gene expression in Ogg1-deficient and wild type mice. Nanotoxicology. 11 (8), 1-16 (2017).
- Wen, H., et al. Acute toxicity and genotoxicity of silver nanoparticle in rats. PLoS One. 12 (9), e0185554 (2017).
- Zhang, R., et al. Silver nanoparticle treatment ameliorates biliary atresia syndrome in rhesus rotavirus inoculated mice. Nanomedicine. 13 (3), 1041-1050 (2017).
- Arnold, M., Patton, J. T., McDonald, S. M. Culturing, Storage, and Quantification of Rotaviruses. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 15 Unit 15C.13 (2009).
- Liu, X., et al. Silver nanoparticles mediate differential responses in keratinocytes and fibroblasts during skin wound healing. ChemMedChem. 5 (3), 468-475 (2010).
- Zhang, R., et al. Silver nanoparticles promote osteogenesis of mesenchymal stem cells and improve bone fracture healing in osteogenesis mechanism mouse model. Nanomedicine. 11 (8), 1949-1959 (2015).
- Wu, J., Hou, S., Ren, D., Mather, P. T. Antimicrobial properties of nanostructured hydrogel webs containing silver. Biomacromolecules. 10 (9), 2686-2693 (2009).
- Xu, L. Genotoxicity and molecular response of silver nanoparticle (NP)-based hydrogel. Journal of Nanobiotechnology. 10 (1), 16 (2012).
- Dobrzyńska, M. M., et al. Genotoxicity of silver and titanium dioxide nanoparticles in bone marrow cells of rats in vivo. Toxicology. 315 (1), 86-91 (2014).
- Mohamed, H. R. H. Estimation of TiO 2 nanoparticle-induced genotoxicity persistence and possible chronic gastritis-induction in mice. Food & Chemical Toxicology. 83 (9), 76-83 (2015).
