Summary
Bu makalede ayrıntılı olarak safra atrezi sendromu bir deneysel safra atrezi fare modeli ameliorating Nano Gümüş tanecikleri dayalı bir yöntem açıklanır. Reaktif hazırlık süreci ve neonatal fare enjeksiyon tekniği katı bir anlayış yenidoğan fare modeli çalışmalarda kullanılan yöntemi ile araştırmacılar tanıtmak yardımcı olacaktır.
Abstract
Safra atrezi (BA) kolanjit hangi etiyolojisi hala tam anlaşılmaktadır çocuklarda yüksek mortalite ile şiddetli bir türüdür. Viral enfeksiyonlar bir olası neden olabilir. BA eğitim için kullanılan tipik hayvan modeli yenidoğan bir fare ile bir al yanaklı Rotavirüs aşı tarafından kuruldu. Gümüş nano tanecikleri antibakteriyel ve antiviral efektleri uygulamak gösterilmiştir; BA fare modeli kendi işlevleriyle Bu çalışmada değerlendirilir. Şu anda, BA hayvan deneylerinde, genellikle semptomatik tedaviler yiyecek yolu ile veya diğer ilaçlar verilen BA fareler belirtileri geliştirmek için kullanılan yöntemleri vardır. Bu çalışmada gümüş nano tanecikleri mayi enjeksiyonu ile BA sendromu farelerde ameliorating için yeni bir yöntem göstermek için ve gümüş nanopartikül jel formülasyonu hazırlama detaylı yöntemleri sağlamak amaçtır. Bu yöntem basit ve yaygın olarak uygulanabilir ve mekanizma ba, hem de klinik tedaviler araştırma için kullanılabilir. Fareler sarılık sergilemek ne zaman BA fare modeline bağlı olarak, hazırlanan gümüş nanopartikül jel intraperitoneally alt karaciğer yüzeye enjekte edilir. Hayatta kalma durumu görülmektedir ve biyokimyasal göstergelerin ve karaciğer histopatoloji incelenir. Bu yöntem her iki kurulması BA modeli ve Roman BA tedaviler daha sezgisel bir anlayış sağlar.
Introduction
BA tarafından kalıcı sarılık ile karakterize Histiositoz şeklidir ve karaciğer nakli yokluğunda yüksek ölüm oranı vardır. Viral enfeksiyonlar BA patogenezi ile yakından ilişkilidir. Sitomegalovirüs, reovirus ve Rotavirüs tüm patojenler BA1,2,3olarak önerilmiştir. Yenidoğan döneminde ilave ve intrahepatic safra kanalları, safra epitel hücre apoptosis, inflamatuar hücre infiltrasyon Portal önde gelen karşı bağışıklık bozukluk olgunlaşmamış bağışıklık sistemi yanıt viral bir enfeksiyon olarak sonuçlanır alan, intrahepatic ve extrahepatic safra kanalı tıkanıklığı ve son olarak, karaciğer fibrozis4,5,6.
BA eğitimi için yaygın olarak kullanılan hayvan modeli bir yenidoğan fare al yanaklı Rotavirüs (RRV) ile aşı içerir. Fare genellikle 5-6 gün sonra düşük vücut ağırlığı ve acholic dışkı gösterilen sarılık gelişir. Hastalık süreci Bağışıklık yanıtında rolü özellikle doğal öldürücü (NK) hücreleri için önemlidir; Bu hücreler ile anti-NKG2D antikor tükenmesi BA indüklenen zarar7büyük ölçüde azaltır. Ayrıca, diğer dahil olmak üzere CD4 hücreleri+ T hücreleri CD8+ T hücreleri, dendritik hücreler ve düzenleyici T hücreleri, tüm gösterilmiştir içinde hastalık8,9,10,11rolleri oynamak için. Tüm verileri BA sırasında bağışıklık sisteminin vazgeçilmez doğa göstermektedir.
Gümüş nano tanecikleri (AgNPs) bakteriyel enfeksiyonlar12 ve viral enfeksiyonlar13,14,15de dahil olmak üzere bazı bulaşıcı hastalıklara karşı faydalı etkileri olduğu gösterilmiştir. Ancak, dermatolojik kullanım dışında kaç çalışmalar AgNPs bir klinik tedavi çoğunlukla nedeniyle onların potansiyel toksisitesi kullandık. Hayvan deneylerinde, araştırmacılar genellikle yönetilen AgNPs yolu ile sözlü16 veya intravenöz yöntemleri17etkinliğini inceledik. Ancak, diğer araştırmacılar AgNPs yönetilen yolu ile mayi (IP) iğne yenidoğan Mouse deneyler, hangi basit ve hızlı bir yöntem karaciğer ve safra kanalları ise daha doğrudan bir etkiye yol açmaktadır etkinliğini inceledik bağışıklık sistemi gibi diğer sistemlere toksisite azaltılması. AgNPs NK hücre etkinlik18etkiler gösterilmiştir; Bu nedenle, BA fare modelinde ı.p. enjeksiyon yolu ile yönetilen AgNPs tedavi edici etkileri test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneysel protokoller kurumsal hayvan bakım ve Sun Yat-Sen üniversite laboratuvar hayvan Merkezi (#IACUC-DB-16-0602) kullanım Komitesi tarafından onaylanmış olması.
1. safra atrezi fare modeli oluşturma
- Hamile BALB/c fareler bir ortamda özel patojen-Alerjik bir 12 h karanlık/ışık siklet autoclaved chow ad libitumulaşabilen 25 ° c altında korumak.
- RRV zorlanma MMU 18006 hazırlamak için bir plak tahlil19tarafından viral titreleri ölçmek ve virüs MA104 hücrelerdeki yükseltmek.
Not: MA104 hücre Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal Orta (DMEM) ile % 10 fetal Sığır serum (FBS) bir kuluçka %5 CO2içeren bir oksijen atmosfere sahip kültürlü. Amplifikasyon adımları aşağıda kısaca açıklanmaktadır.- MA104 hücreleri enfekte (1.5 x 107) tripsin harekete geçirmek RRV [1.5 x 106 plak oluşturan birim (PFU)] 30 ml serum-Alerjik orta ile 150 cm2 kültür şişesi içinde. Enfekte hücreleri oksijen kuluçka %5 CO237 ° C'de 3 gün kuluçkaya.
- Her aşama donma ve o hücreleri çözdürme zamanlar, oda sıcaklığında için 20 dk-80 ° C dondurucu ile üç donma-çözülme devir tarafından kültür şişeye enfekte hücrelerde koşullar; hücre ilişkili virüs parçacık süpernatant yayınlayacak. Daha sonra toplamak ve hücre lysate ve kültür süpernatant 15 mL konik tüp içine aktarmak.
- Büyük hücresel enkaz lysate düşük hızda Santrifüjü (300 x g 3 dk 4 ° C'de) çıkarın. Ardından, virüs (yaklaşık 6 mL) içeren süpernatant hayvan deneyleri için yeni 15 mL konik tüp içine aktarın.
Not: RRV sonra titered, bölünmemeli ve saklı veya kullanılan ek mermi ile amplifikasyon için hazırdır. Oda sıcaklığında uzun vadeli maruz viral enfeksiyon kapasitesini azaltır; virüs buz üzerinde yerleştirilir ve-80 ° C'de veya sıvı azot içinde saklanan.
- RRV küçük hacimli (1 mL) insülin içine şırınga yenidoğan fare enjeksiyon için 29 G iğne ile yük.
Not: Hacimsel şırıngaların kalın iğne kolayca uyuşturucu sızıntısı için yol. - Doğum 24 h içinde her kardiyolojik 20 µL 1.2 x 105 PFU/mL RRV üzerinden IP rota için yönetmek; aynı birim salin denetimi olarak kullanın.
Not: Bu deneyde kullanılan şırınga 1 mL insülin şırınga var. Diğer nedenlerden dolayı ilk 2 gün içinde öldü anneleri tarafından beslendi değil enfekte fareler Analize dahil değildi. - Tüm yenidoğan fareler yakından gözlemlemek ve onları her gün tartmak. Genellikle, RRV aşı sonra altıncı gününde, sarılık kulakları ve çıplak deri üzerinde görünür dışkı kil renginde olur, ve kürk BA modelinin kurulması düşündüren yağlı olur; Bu belirtiler için kontrol edin.
Not: BA bir karaciğer dokusu bölümü muayene ile H & E ve immunohistokimyasal belirten tarafından onaylanabilir. BA fareler sonra AgNP tedavisi için hazırsınız demektir.
Dikkat: Seviye 2 (BSL-2) koşullar altında ele alınması gerekir çağdaş hayvan ve insan RV suşları sunulan Protokolü içindir.
2. gümüş nanoparçacık sentezi
- Hazırlamak ve yukarıda açıklanan12,20AgNPs karakterize.
Not: hazırlama ve AgNPs karakterize ayrıntılarını yayınlarda Kimya Bölümü, Hong Kong Üniversitesi12,20C. M. Che'nin ekibi tarafından tarif edilmistir. Çözüm son konsantrasyonu 1 mM olduğunu. AgNPs ortalama çapı 10 yapıldı nm (5-15 arasında değişen nm) ve elektron mikroskobu tarafından onaylandı.
3. gümüş nanopartikül kollajen karışımı hazırlanması
Not: AgNP kollajen karışım hazırlanır ve daha önce açıklanan21 ve 4 ° C'de depolanan gibi karakterize Tüm yordamları buza gerçekleştirilmelidir.
- İlk olarak, kollajen hazırlanırken, 490 µL ekleyin tip ı kollajen (4 mg/mL) 1,5 mL tüp ve buz üzerinde yerleştirin.
- Fosfat tamponlu tuz (PBS, 10 x) 100 µL için kollajen ve bir pipet ile karıştırın.
- 1 L 10 x PBS arabelleği hazırlamak için NaCl, 80 g, 2 g KCl ve 35.8 g Na2HPO4. birleştirmek 12H2O 2.4 g KH2PO4 , mağaza oda sıcaklığında arabellek için.
- O zaman, 10 µL NaOH (0.2 M) Yukarıdaki ekleyin.
- 0.2 M NaOH hazırlamak için 1 litre saf su 8 g NaOH tozu ekleyin.
- Son olarak, 400 µL AgNPs (1 mM), kollajen için ve onları bir pipet ile karıştırın.
Not: AgNPs son bir bile karıştırma için ekleyin. AgNP kollajen karışımı 4 ° C'de muhafaza edilmelidir; Aksi takdirde, oda sıcaklığında kolayca katılaşır.
4. fare enjeksiyon yöntemi
- AgNP kollajen karışımı 50 µL ı.p. enjeksiyonu ile tedavi RRV grup virüs bulaşmış yenidoğan farelerde sarılık görünümünü sonra yönetmek; ikinci bir enjeksiyon 3 d daha sonra gerçekleştirin.
Not: Kontrol RRV (enfekte denetimi) grubu farelerde aynı birim salin verilir ve normal kontrol grubu farelerde herhangi bir tedavi verilmez. - Enjeksiyon başında fare bacak yüzük parmağı ile eğik sağ uyluk üzerinde tuşuna basıp iğneyi yavaşça 15 ° açıyla (Şekil 1) tanıtmak. Karaciğerde (resim 2), yaklaşık 0.5 cm alt kenarına yüzeyine ulaşan üzerine AgNP kollajen karışımı enjekte; o zaman, iğneyi yavaşça geri alıyorum.
Not: herhangi bir hava içine şırınga tanıtmak değil dikkatli olun, sonra yenidoğan fareyi öldürdüm. Yenidoğan farelerde mide ve dalak sol karın ve mide sütle dolu. Enjeksiyon bu taraftan yönetilir, iğne ya da mide, karın boşluğu veya kanama neden dalak akışı için süt neden kolayca girebilirsiniz.
Dikkat: iğne iğne kapağı değiştirin, iğneyi çıkarmak ve bir "Sharps" kapsayıcısına getirin emin olun ve herhangi bir parmak yaralanmaları önlemek için dikkat. - Sonra tüm enjeksiyon, fareler AgNP kollajen karışımı jel ve enjeksiyon yeri yalamaktan annesi önlemek için izin vermek 10 min için kafeslerinden tutun. O zaman, fareler için onların kafes dönmek.
- İşlevlerini izlemek ve kaydetmek tüm fareler günlük, sarılık ve vücut ağırlığı gibi hayatta kalma oranı da dahil olmak üzere fiziksel görünüşü.
5. kan toplama örnek
Not: Kalbine iğne ekleyerek yaklaşık 120 µL kan örnekleri toplanır. Santrifüjü sonra serum (karaciğer fonksiyon testleri için toplanan yaklaşık 70 µL) olduğunu. Kan toplama yöntemi aşağıdaki gibidir.
- Dokuzuncu ve 12 gün (3 gün sonra AgNP tedavi olan) RRV aşı sonra farelerin anestezi 0,5-2,5 kullanarak % sevoflurane.
- Fare ekstremitelerin hareketsiz ve üst ve alt karın % 75 alkolle sterilize.
- Diyafram fare deri, kas ve orta çizgi boyunca karın zarını xiphoid makasla keserek ortaya çıkarmak; Steril Pamuklu çubukla tam diyafram kas ortaya çıkarmak için gastrointestinal sistem kaldırmak için kullanın.
- İğne (1 mL boş insülin şırıngayla) kalbin sol ventrikül yerleştirin ve yavaş yavaş en fazla kan hacmi elde etmek için şırınga pistonu geri çekin. Ardından kan 1,5 mL tüp aktarın.
- Tüp, oda sıcaklığında 30 dakika durup 400 x gde 5 dk santrifüj kapasitesi sağlar. Ardından, bir transfer pipet kullanarak, toplamak ve serum daha fazla kullanmak için kaydedin.
Not: diyafram diyafram kusurlar kolayca pnömotoraks, ölüm ve kan pıhtılaşması, böylece kan örnek koleksiyon önleme yol olarak zarar vermemek.
6. biyokimyasal parametrelerin algılanması
- Adım 5.5 biyokimyasal parametrelerin algılanması için toplanan serum kullanın.
- Otomatik bir biyokimyasal analyzer aşağıdaki biyokimyasal parametreleri algılamak için kullanır: alanin aminotransferaz (ALT), aspartat aminotransferaz (AST), alkalen fosfataz (ALP), toplam protein (TP), albümin (ALB), globulin (GLO), toplam bilirubin (TBIL), direkt bilirubin (DBIL), dolaylı bilirubin (IBIL) ve toplam safra asitlerinin (TBA).
7. extrahepatic Cholangiography Extrahepatic safra kanalını A_ılabilinirse gözlemlemek için
Not: bir diseksiyon mikroskop altında tüm süreci gerçekleştirmek.
- Tam olarak karaciğer, safra kesesi ve extrahepatic safra kanalları ile bir pamuklu çubukla ortaya çıkarmak.
- Gözlemlemek ve karaciğer ve safra kanalları diseksiyon mikroskop altında görünümünü fotoğraf.
- Oftalmik forseps yavaşça safra kesesi dibinde tutmak için kullanın.
- 1 mL şırınga ile metilen mavisi çözüm (0,05 wt.% H2O) yükleyin. Yavaş yavaş şırınga iğne safra kesesi boşluğa yerleştirmek; sonra iğne ile oftalmik forseps kavramak ve yavaş yavaş 10-20 µL metilen mavisi süzülür.
- Mikroskop altında mavi renk değişir için extrahepatic safra kanalları geçer olup olmadığını gözlemlemek ve fotoğraf çekmek.
8. Hematoksilen ve eozin boyama için taze karaciğer örnekleri topluluğu
- Taze fare karaciğer doku gecede % 10 formalin içinde düzeltmek.
- Ardından, sabit belgili tanımlık karaciğer doku parafin içinde katıştırabilir ve onları bölüm.
- Bölümleri dewax, onları bir etanol serisi (örneğin % 100, % 95, % 80 ve % 70 etanol distile su, her 5 min için) ile rehydrate, doku bölümleri hematoksilen ile leke, onları % 1 hidroklorik asit alkol farklılaşma tabi ve son olarak, leke eozin bölümlerle.
- Son olarak, 40 X mikroskopla karaciğer histopatoloji gözlemlemek.
9. immunohistokimyasal Hematoksilen ve eozin lekeli doku bölümleri boyama
- Mum eritme ve bölümleri nemlendirilmesi sonra Tris-EDTA arabellek (10 mM Tris Bankası, 1 mM EDTA çözüm; pH 9.0) bölümlerinde batış ve onları 95 ° C'de 10 dakika için bir mikrodalga ısıtma tarafından bir antijen alma gerçekleştirmek
- Endojen peroksidaz %3 hidrojen peroksit çözüm için 10 min için doku bölümler açarak kaldırın.
- Bölümleri nonspesifik bağlama engellemek için % 5 keçi serum ile tedavi.
- Birincil antikorlar tavşan-fare NKG2D Ekle (1: 100) bölümlerine ve onları gecede 4 ° C'de kuluçkaya
- Oda sıcaklığında 30 dk için uygun ikincil antikorlar (HRP etiketli polimer Anti-tavşan sistemi) bölümlerle kuluçkaya.
- İmmunohistokimyasal boyama 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) Kromojen olarak kullanarak görselleştirmek.
- 40 X mikroskopla bölümleri gözlemlemek, görüntüleri ve istediğiniz şekilde çözümlemek için devam edin.
10. akış sitometrik çözümlemesi
- Yavaşça karaciğer dokusu kıyma, bir 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla geçmek ve bu santrifüj kapasitesi 2 x 270 x g 4 dk 4 ° C'de de.
- Hücre Pelet RPMI 1640 ortamda resuspend ve monoklonal antikorları kullanarak iki renkli ayirt tarafından analiz.
- Hücresel fenotipleme floresein isothiocyanate ve phycoerythrin Birleşik anti-NKp46 (NK lenfositler; 1:1, 000) dahil olmak üzere belirli hücre yüzeyine işaretçileri kullanarak gerçekleştirmek ve anti-CD4 (T-hücre alt türü; 1:1, 000), bir akış sitometresi ile ve verileri analiz Akış Sitometresi veri analiz yazılımı ile.
- Hücre popülasyonlarının ileri/yan dağılım, kapı izotip denetimlerin herhangi bir arka plan floresan için hesap ve verileri ikincil bir analiz bireysel antikorlar gelen floresan sinyallerini dayalı tabi göre göre seçin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kurulan BA fare modelini temel alan, virüslü yenidoğan fareler idare ı.p. enjeksiyonu hazırlanan AgNP kollajen karışım 2 x sonra sarılık sergilenmesi. Fare hayatta kalmak için günlük kontrol edildi ve karaciğer fonksiyon testleri, karaciğer patolojisi ve akış sitometresi yapıldı. Tedavi edilmeyen denetim BA fareler için karşılaştırıldığında, AgNP tedavi fareler azaltılmış sarılık gösterdi ve kendi normal vücut ağırlığı (Şekil 3) saklanır. Bilirubin metabolizması ve karaciğer transaminaz düzeyleri AgNPs büyük ölçüde karaciğer fonksiyon (Tablo 1) geliştirilmiş düşündüren normal denetim değerleri için düştü. Metilen mavisi boyama ile extrahepatic cholangiography (Şekil 4) AgNP tedavi sonrası safra kanalını a_ılabilinirse doğruladı. H & E (Şekil 5) boyama önemli ölçüde azalmıştır iltihabi hücre infiltrasyonu ile AgNPs kontrol fareler için karşılaştırıldığında, tedavi farelerin karaciğer portal alanı gösterdi. Akış Sitometresi sonuçları önemli ölçüde daha az NK hücreleri AgNP tedaviler sonra (hem gün 9 ve 12) RRV farelerde (Şekil 6) içinde karaciğerleri gösterdi. İmmunohistokimyasal boyama portal Triad'ın AgNP tedavi farelerin NK hücre işaretçisi NKG2D (Şekil 7) önemli ölçüde azaltılmış bir ifade ortaya RRV fareler için karşılaştırıldı.
Şekil 1: ilk şırınga penetrasyon pozisyon. Kırmızı noktalı çizgi P6 yenidoğan fare karın için paralel çizgi gösterir; sarı ok iğne noktasını gösterir; kırmızı ok iğne açı belirtir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: karaciğer alt kenarına yüzeye iğne. Sarı noktalı çizgi fare karaciğer alt kenarına gösterir; kırmızı ok enjeksiyon sırasında iğne konumu gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 3: bir deneme BA fare modeli sendromunda BA AgNPs etkisi. (A) Bu panel yenidoğan fareler görünümünü üzerinde gösterir 9 ve 12 gün sonra iğne ile RRV yalnız ve 3 gün ve 6 gün sonra bir enjeksiyon AgNPs (RRV + AgNPs) ile. (B) Bu panel farklı zaman noktalarda her grupta fareler ağırlığını gösterir; x-eksen gösterir fare doğduktan sonra gün sayısı ve y-ekseni vücut ağırlığı kat değişikliği gösterir. P < 0,01 ile öğrenci t-test karşılaştırma RRV + AgNp grup RRV kontrol grubuna; n = n kontrol grubunda 16 RRV grup ve n 18 = 17 RRV + AgNP = grubu. (C) Bu panel, her grupta fareler survival oranı gösterir. Bu şekil Zhang ve ark. değiştirildi 18. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Extrahepatic cholangiography. Bir kontrast ajan olarak extrahepatic safra kanallarının a_ılabilinirse algılamak ve esir alma imge için kullanıldı. Mavi noktalı çizgi extrahepatic safra kanalını yönünü gösterir; kırmızı ok bir ortak safra kanalını daralma gösterir; siyah ok BA gösterir. Ölçek çubuğu 1 mm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: H & E boyama. Her grup gün 9 ve 12 farelerin karaciğer doku toplanmış, sabit, kesitli ve H & E. kısaltmalar ile lekeli: PV portal ven, BD = safra kanalını =. Ölçek çubuğu 50 µm =. Bu şekil Zhang ve ark. değiştirildi 18. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: yüzde NK hücreleri karaciğer dokusunda. (A)fare karaciğer hücre süspansiyonlar 9 ve 12 gün işlendi ve NK hücreleri oranı akış sitometresi tarafından tespit edildi. (B) Bu panel NK hücreleri yüzdesini gösterir (NKp46+CD4+) AgNP enjeksiyon sonra farklı zaman noktalarda her grupta. Y-eksen kontrol grubunda yüzde göre 9. gün ve gün 12.* *P 0,01 < hesaplanmıştır NK hücreleri, yüzdesi olarak kat değişiklik gösterir ve *P < 0,05, öğrencinin tile-karşılaştırma testi RRV + AgNp grup RRV kontrol Grup, n = 10 her grup. Bu şekil Zhang ve ark. değiştirildi 18. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7: immunohistokimyasal her tedavi grubu farelerde portal alanı içinde NK hücre işaretçisi NKG2D için boyama. Her tedavi grubu farelerde portal alanı NK hücre işaretçisi NKG2D ifade immunohistokimyasal boyama tarafından tespit edildi. Uzun oklar, safra kanalları gösterir; kısa oklar NK hücreleri gösterir. Kısaltmalar: PV: portal ven, BD: safra kanalını. Sscale bar = 50 µm. Bu şekil Zhang ve ark. değiştirildi 18. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Tablo 1: klinik laboratuvar muayene karaciğer fonksiyonu ile ilgili molekül düzeylerinin. Periferik kan her grupta farelerde karaciğer fonksiyon ölçmek için kullanıldı. ALT: alanin aminotransferaz, AST: aspartat aminotransferaz, ALP: alkalen fosfataz, TP: Toplam protein, ALB: albümin, GLO: globulin, TBIL: Toplam bilirubin, DBIL: direkt bilirubin, IBIL: dolaylı bilirubin ve TBA toplam safra asitlerinin =. P < 0,05 ve **P < 0,01, bir öğrenci t-test için RRV yalnız grup n karşılaştırıldığında her kohort için = 10 her grup. Tüm biyokimyasal göstergesi verileri ortalama ± SD görüntülenir Bütün fareler üç grupta 12 günlüktün. Bu tablo Zhang ve ark. değiştirildi 18. bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AgNPs güçlü geniş spektrumlu antibakteriyel özellikleri ve güçlü geçirgenliği22sergi; Ayrıca, bunlar antibakteriyel Medikal Ürünler23bir dizi üretmek için kullanılır. Ancak, AgNPs bir kez onlar organlarda birikir ve bu sebat toksik etkileri24,25için neden olabilir temizlemek için uzun bir zaman alabilir. Bir önceki çalışmada akut toksisite ve AgNPs genotoxicity tek damardan enjeksiyon bir fare deneyinde sonra muayene ve AgNPs akut karaciğer ve böbrek hasarına neden olabilecek sonuçlar gösterdi. AgNPs timus ve dalak17de dahil olmak üzere ana bağışıklık sistemi organlarında birikmiş. Bu fare BA modelde, bizim veri kısmen NK hücre inhibisyon tarafından aracılık ettiği öneririz BA sendromu AgNPs tedaviyle iyileştirmiştir. Ancak, AgNPs uzun vadeli etkileri bağışıklık düzenlenmesi ve fare geliştirme için potansiyel toksisitesi değerlendirmek için daha fazla bir araştırma gerektirir.
Yöntemi açısından başarılı bir ameliyat için bazı ek notlar şunlardır: oda sıcaklığında AgNP kollajen karışımı hızlı bir şekilde yarı katı jel haline gelecektir çünkü (ı) AgNP kollajen karışım hazırlama süreci buza yapılmalıdır ki enjeksiyon için kullanılamaz. Hazırlık sonra AgNP kollajen karışımı 4 ° C'de muhafaza edilmelidir (ii) sadece 1 mL insülin şırınga enjekte ilaç kaçağı azaltan küçük çaplı nedeniyle kullanılmalıdır. (III) önceki çalışmalar genel olarak incelendiğinde AgNPs etkisini sözlü16 ya da yolu ile İntravenöz enjeksiyon17yönetilen. Bizim hayvan deneylerinde deneysel konularda yenidoğan fareler vardır; Böylece, intravenöz enjeksiyon neredeyse mümkün değildir ve biz bir ı.p. enjeksiyon kullanılır. AgNPs enjeksiyon BA belirtileri farelerde geliştirilmiş. (iv) enjeksiyon başında alt ekstremite fare fareyi hareket etmesini önlemek için el ile sabitlenir. Bu yöntem doğru miktarda ilaç olmadan herhangi bir karın boşluğu içine enjekte edilir ve daha fazla deneme etkinliğini garanti sağlar. (v) farelerde neonatal, mide ve dalak sol karın ve mide sütle dolu. Karaciğer alt kenarına yüzeyine AgNP karışımı enjekte iğne fareyi sağ uyluk yukarıda eklenir. İğne sol taraftan eklediyseniz, kolayca ya da mide, karın boşluğu veya kanama neden dalak akışı için süt neden delik. (vi) yenidoğan farelerde karın duvarı ince olduğu için uyuşturucu sızıntısı çapraz iğne karaciğer alt kenarına ulaşmak için karın duvarına yakın 15 ° açıyla ilerleyen önlenebilir.
Bu RRV kaynaklı Mouse BA modeli AgNPs cesaret verici etkisini gözlemledim. AgNPs değişen virüs enfeksiyonları ve hastalıklar tedavilerde kullanılan önceki çalışmaları ile birlikte, bu AgNP verileri bir anti-virüs enfeksiyonları in vivo uygulamada olasılığını göstermektedir. Bu deneyler AgNPs farmakokinetik olarak ölçüm yöntemleri AgNP dozlarda kontrolünü zorlaştırır AgNPs için eksikliği nedeniyle tamamen açık değildir kısıtlamasıdır. Daha fazla çalışma mekanizmasını anlamak ve gelecekteki hastalığı tedavi içinde yan etkileri azaltmak için bize yardımcı olacaktır AgNPs hücre içi hedefi için de gereklidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Burada kullanılan AgNPs C. M. Che Hong Kong Üniversitesi Kimya bölümü üzerinden bir hediyeydi. Bu eser Ulusal Doğa Bilimleri Foundation of China (No. 81600399) ve bilim ve teknoloji proje Guangzhou (No.201707010014) tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/c mouse | Guangdong Medical Experimental Animal Center | SYXK2017-0174 | Animal experiment |
| Rhesus rotavirus (RRV) | ATCC | ATCC VR-1739 | Establish biliary atresia mouse model |
| MA104 cells | ATCC | ATCC CRL-2378.1 | For laboratory use only |
| DMEM | Thermo Fisher | 10569010 | Mammalian Cell Culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10099141 | Mammalian Cell Culture |
| collagen Type I | CORNING | 354236 | For research use only |
| PBS buffer | OXOID | BR0014G | For washing |
| NaOH | Sigma | 1310-73-2 | Adjust the PH value |
| AgNP | Antibacterial Note: The AgNps was a gift from Prof CM Che. in the Department of Chemistry, the University of Hong Kong. |
||
| Insulin syringe with integrated needle | BD | 9161635S | For medical use |
| 15 mL Centrifuge Tube | Corning | 430791 | For laboratory use only |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | GEB | CT0200-B-N | For laboratory use only |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE-Ci | For laboratory use |
| Dissecting/Intravital microscope | Nikon | SMZ 1000 | For laboratory use |
| anti-Mouse NKp46 FITC | eBioscience | 11-3351 | For research use only |
| anti-Mouse CD4 PE-Cyanine5 | eBioscience | 15-0041 | For research use only |
| Monoclonal Mouse Anti-Human CD4 | DAKO | 20001673 | For research use only |
| anti-NKG2D | RD | MAB1547 | For research use only |
| BD FACSCanto Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Canto Plus | For laboratory use only |
References
- Szavay, P. O., Leonhardt, J., Czechschmidt, G., Petersen, C. The role of reovirus type 3 infection in an established murine model for biliary atresia. European Journal of Pediatric Surgery. 12 (04), 248-250 (2002).
- Coots, A., et al. Rotavirus infection of human cholangiocytes parallels the murine model of biliary atresia. Journal of Surgical Research. 177 (2), 275-281 (2012).
- Shanmugam, N. P., Jayanthi, V. Biliary atresia with cytomegalovirus. Indian Pediatrics. 49 (2), 157 (2012).
- Mack, C. L., Feldman, A. G., Sokol, R. J. Clues to the Etiology of Bile Duct Injuryin Biliary Atresia. Seminars in Liver Disease. 32, 307-316 (2012).
- Muraji, T., Suskind, D. L., Irie, N. Biliary atresia: a new immunological insight into etiopathogenesis. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 3 (6), 599-606 (2009).
- Sokol, R. J., Mack, C. Etiopathogenesis of Biliary Artesia. Seminars in Liver Disease. 21, 517-524 (2001).
- Shivakumar, P., Sabla, G. E., Whitington, P., Chougnet, C. A., Bezerra, J. A. Neonatal NK cells target the mouse duct epithelium via Nkg2d and drive tissue-specific injury in experimental biliary atresia. Journal of Clinical Investigation. 119 (8), 2281-2290 (2009).
- Mack, C. L., et al. Oligoclonal expansions of CD4+ and CD8+ T-cells in the target organ of patients with biliary atresia. Gastroenterology. 133 (1), 278-287 (2007).
- Shivakumar, P., et al. Effector Role of Neonatal Hepatic CD8 + Lymphocytes in Epithelial Injury and Autoimmunity in Experimental Biliary Atresia. Gastroenterology. 133 (1), 268-277 (2007).
- Saxena, V., et al. Dendritic Cells Regulate Natural Killer Cell Activation and Epithelial Injury in Experimental Biliary Atresia. Science Translational Medicine. 3 (102), 102ra194 (2011).
- Miethke, A. G., et al. Post-natal paucity of regulatory T cells and control of NK cell activation in experimental biliary atresia. Journal of Hepatology. 52 (5), 718-726 (2010).
- Tian, J., et al. Topical delivery of silver nanoparticles promotes wound healing. ChemMedChem. 2 (1), 129-136 (2010).
- Lu, L., et al. Silver nanoparticles inhibit hepatitis B virus replication. Antiviral Therapy. 13 (2), 253-262 (2008).
- Xiang, D., et al. Inhibition of A/Human/Hubei/3/2005 (H3N2) influenza virus infection by silver nanoparticles in vitro and in vivo. International Journal of Nanomedicine. 8 (Issue 1), 4103-4114 (2013).
- Elechiguerra, J. L., et al. Interaction of silver nanoparticles with HIV-1. Journal of Nanobiotechnology. 3 (1), 1-10 (2005).
- Nallanthighal, S., et al. Differential effects of silver nanoparticles on DNA damage and DNA repair gene expression in Ogg1-deficient and wild type mice. Nanotoxicology. 11 (8), 1-16 (2017).
- Wen, H., et al. Acute toxicity and genotoxicity of silver nanoparticle in rats. PLoS One. 12 (9), e0185554 (2017).
- Zhang, R., et al. Silver nanoparticle treatment ameliorates biliary atresia syndrome in rhesus rotavirus inoculated mice. Nanomedicine. 13 (3), 1041-1050 (2017).
- Arnold, M., Patton, J. T., McDonald, S. M. Culturing, Storage, and Quantification of Rotaviruses. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 15 Unit 15C.13 (2009).
- Liu, X., et al. Silver nanoparticles mediate differential responses in keratinocytes and fibroblasts during skin wound healing. ChemMedChem. 5 (3), 468-475 (2010).
- Zhang, R., et al. Silver nanoparticles promote osteogenesis of mesenchymal stem cells and improve bone fracture healing in osteogenesis mechanism mouse model. Nanomedicine. 11 (8), 1949-1959 (2015).
- Wu, J., Hou, S., Ren, D., Mather, P. T. Antimicrobial properties of nanostructured hydrogel webs containing silver. Biomacromolecules. 10 (9), 2686-2693 (2009).
- Xu, L. Genotoxicity and molecular response of silver nanoparticle (NP)-based hydrogel. Journal of Nanobiotechnology. 10 (1), 16 (2012).
- Dobrzyńska, M. M., et al. Genotoxicity of silver and titanium dioxide nanoparticles in bone marrow cells of rats in vivo. Toxicology. 315 (1), 86-91 (2014).
- Mohamed, H. R. H. Estimation of TiO 2 nanoparticle-induced genotoxicity persistence and possible chronic gastritis-induction in mice. Food & Chemical Toxicology. 83 (9), 76-83 (2015).
