Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

En høj overførselshastighed Calcium-flux Assay at studere NMDA-receptorer med følsomhed over for glycin/D-Serin og glutamat

Published: July 10, 2018 doi: 10.3791/58160

Summary

Målet med denne protokol er at lette undersøgelsen af NMDA-receptorer (NMDAR) på en større skala og giver mulighed for undersøgelse af modulerende virkningerne af små molekyler og deres terapeutiske anvendelsesmuligheder.

Abstract

N-methyl-D-aspartat (NMDA) receptorer (NMDAR) er klassificeret som ionotropic glutamat receptorer og spiller en kritisk rolle i indlæring og hukommelse. NMDAR fejl, udtrykt som enten over - eller under - activity forårsaget af mutationer, ændrede udtrykket, menneskehandel eller lokalisering, kan bidrage til mange sygdomme, især i det centrale nervesystem. Derfor er forstå den receptor biologi samt lette opdagelsen af forbindelser og små molekyler afgørende i igangværende bestræbelser på at bekæmpe neurologiske sygdomme. Nuværende metoder til at studere receptoren har begrænsninger herunder lav overførselshastighed, høje omkostninger og manglende evne til at studere dets funktionelle evner på grund af den nødvendige tilstedeværelse af kanal blokkere at forhindre NMDAR-medieret excitotoxicity. Derudover de eksisterende assay systemer er følsomme over for stimulation af glutamat kun og manglende følsomhed over for stimulation af glycin, de andre Co ligand på NMDAR. Her præsenterer vi den første plade-baseret analyse med høj overførselshastighed magt til at studere en NMDA-receptor med følsomhed over for både Co ligander, glutamat og D-Serin/glycin. Denne tilgang giver mulighed for undersøgelse af forskellige NMDAR subunit kompositioner og tillader funktionelle studier af receptor i glycin - og/eller glutamat-følsomme tilstande. Metoden kræver desuden ikke tilstedeværelsen af hæmmere under målingerne. Effekten af positive og negative allosteriske modulatorer kan registreres med denne analyse og den kendte Farmakologi af NMDAR er blevet replikeret i vores system. Denne teknik overvinder begrænsningerne af eksisterende metoder og er omkostningseffektivt. Vi mener, at denne nye teknik vil fremskynde opdagelsen af terapier for NMDAR-medieret patologier.

Introduction

Med de nuværende fremskridt i medicin, er levealder steget betydeligt; men så har forekomsten af aldersbetingede sygdomme. Sygdomme i centralnervesystemet (CNS) som skizofreni, amyotrofisk lateral sklerose (ALS), Alzheimers sygdom og Parkinsons sygdom, blandt andre, er ingen undtagelse og har blevet fremskrevet til at stige i det næste årti1, 2 , 3. fejlfunktion af ionotropic glutamat receptorer kendt som N-methyl-D-aspartat receptorer (NMDAR) har været forbundet med Alzheimers sygdom, skizofreni, traumatisk hjerneskade, slagtilfælde, diabetes og glaukom blandt andre, som garanterer de nødt til at undersøge deres biologi for udviklingen af effektive, Sygdomsmodificerende behandlinger4,5,6,7.

NMDARs er sammensat af fire monomerer eller underenheder4,8,9. Den strukturelle sammensætning af NMDAR viser udviklingsmæssige og regional variation inden for hjernen7,10. NMDARs er involveret i synaptisk plasticitet, kognition og generation af rytmer for vejrtrækning og bevægelse11,12,13. Som en spænding-gated kanal, det er stort set ikke-ledende på hvile membran potentiale (-70 mV) og blokeres af magnesium til at forhindre yderligere gennemtrængning af ioner. Kanalen er aktiveret ved at binde to ligander, glutamat og glycin/D-Serin, og en samtidig depolarisering på synaptic membranen medieret af AMPA-receptorer, et andet underklasse af ionotropic glutamat receptorer. Depolarisering fjerner magnesium blokering af NMDAR, at tilstrømningen af kationer, især calcium14,15,16. Selvom aktivering af NMDAR er afgørende for celle overlevelse, kan overdreven aktivering føre til celle død17,18,19 gennem excitotoxicity. Dette, ud over den komplekse karakter af receptoren, gør det udfordrende for at udføre undersøgelser nødvendige for at udvikle effektive behandlinger.

Forskellige metoder er blevet udviklet for at studere NMDAR. Hver enkelt har dog ledsager forbehold. For eksempel, er en meget udbredt teknik et fluorescens-baseret analyse, der måler NMDAR-medieret ændringer i intracellulære calcium i en stabil cellelinie under kontrol af en tetracyklin-inducerbar promotor (Tet-On)20. Men i dette system, supramaximal koncentrationer af ligander, der er nødvendige, og kravet om at NMDAR hæmmere er til stede under målingen gør det næsten umuligt at opdage aktivitet af konkurrencedygtige antagonist. I andre tilsvarende systemer forårsager udtryk for den funktionelle receptor toksicitet, der kræver kanal blokkere såsom ketamin21,22 at bevare cellekulturer. Disse kanal blokkere sidde kernen i receptoren og er svære at vaske ud, især i en plade-baseret format, så de forstyrrer funktionelle studier af receptor. I elektrofysiologiske målinger såsom patch fastspænding, der er begrænset overførselshastighed og store undersøgelser er meget dyre23. Trods er de ovennævnte systemer ufølsom over for glycin stimulation; dermed, at studere glycin-afhængig aktivitet af NMDAR bliver en udfordring.

Her, beskrive vi en ny tilgang til at studere NMDAR, der overvinder de omtalte begrænsninger. Vores teknik udnytter baculovirus ekspressionssystem udtrykke receptor på funktionelle niveauer med et optimalt forhold for underenheder i så lidt som 16 timer. Desuden brug af baculovirus giver mulighed for en simpel og kombinatorisk tilgang, som giver en bred karakterisering af de særskilte rekombinante NMDAR undertyper. I modsætning til andre assays kræver denne protokol ikke kanal blokkere på grund af brugen af svage antagonister. Metodens stærkeste fordel er, at efter udvaskning af de svage antagonist, receptoren er følsomme over for graduering af de enkelte glycin - og glutamat-bindingssteder ud over dobbelt graduering af både glycin/D-Serin og glutamat ligand-bindende websteder. Analysen indeholder kendte Farmakologi af NMDAR receptoren og virkningerne af dens kendte positive og negative modulatorer. Endelig, generation af denne i vitro cellulære assay overvinder den cellulære toksicitet forårsaget af overdreven calcium tilstrømning og giver mulighed for funktionelle studier af receptor i en høj overførselshastighed mode, som kan fremskynde opdagelser af NMDAR modulatorer i sygdomstilstande.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse af celler

Bemærk: Denne protokol, herunder data generation, bruger HEK293 celler transduced med en baculovirus kodning NR1 og NR2A celler.

  1. Frø bør antallet af HEK293 celler og tilføje virussen NR1 og/eller NR2A på de relevante endelige koncentrationer (1,00 µL). For en 384-godt plade, bruge 10.000 celler/brønd i en endelige mængden af 30 µL.
  2. Alternativt, frø HEK293-NR1-NR2A celler på den relevante celle nummer og volumen (for en 384-godt plade, brug 10.000 celler/brønd i en endelige mængden af 30 µL). Tilføje tetracyclin i en koncentration på 2 µg/mL til at fremkalde NR2A udtryk og tilføje beskyttelse sammensatte (100 µM MDL105, 519 eller 5 µM CGP07066724).
  3. Bemærk: Baculovirus kodning NR1 og NR2 bør have en omtrentlig titer mellem 5 x 109 - 10 x 109 smitsomme enhed pr. milliliter24.

2. måling af NMDA-receptor aktivitet

  1. Forberede en 384-godt plade med HEK293 celler transduced med NR1/NR2 eller HEK293-NR1-NR2A celler i overværelse af enten beskyttende sammensatte. Brug en klar bund, sort ramme, poly-D-lysin belagt plade.
    Bemærk: Beskyttelse med 100 µM MDL105, 519 bruges til at tildele følsomhed over for glycin, mens 5 µM CGP070667 bruges til at tildele følsomhed over for glutamat.
  2. Inkuber plade på 37 ° C og 5% CO2 i 16 timer (natten over).
  3. Fjerne pladen fra rugemaskinen og forsigtigt kassér celle medier af aftagende flipping pladen over en kompatibel bioaffald container. Forsigtigt trykke pladen på en papir håndklæde at rengøre mediet off kanter af pladen og dræn enhver resterende medier.
  4. Forberede calcium6-farvning af solubilizing et hætteglas med calcium6 farvestof (1 plade størrelse) i 10 mL af inkubation buffer (HBSS pH 7,5, 20 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 1 mM probenecid). Inkuber pladen i 2 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
  5. Fjern pladen fra rugemaskinen og lad cellerne justeres til stuetemperatur i 10 minutter.
  6. Forsigtigt hældes ud calcium6-farvestof som beskrevet i trin 2.3 og tilføje 30 µL af analysebuffer (HBSS pH 7,5, 20 mM HEPES, 1,8 mM CaCl2, 1 mM probenecid).
  7. Gentag trin 2.6 to gange til et samlet beløb af 3 vasker. Forlade 30 µL af analysebuffer på celler efter den sidste vask.
  8. Lad cellerne hvile i 5 minutter ved stuetemperatur.
  9. Forberede ligand pladen ved at gøre en 4-fold bestand af 400 µM glycin og 400 µM glutamat (endelig koncentration på 100 µM; optimal koncentration af ligander skal fastlægges som beskrevet nedenfor). Overfør mindst 25 µL af ligand lager i en V-bund 384-godt plade.
  10. Indlæse den ligand og celle plader i FDSS (funktionelle stof Screening System).
  11. Måle baseline fluorescens (Fo) i celle-pladen i 30 sekunder. Overfør 10 µL af ligand bestanden i celle pladen med FDSS udlevering funktion og måle calcium flux ved optagelse calcium6-dye fluorescens i 5 minutter.
  12. Beregn maksimal fluorescens-forholdet ved at dividere den maksimal fluorescens fremstillet ved baseline fluorescens (Fmax/fo).

3. optimering af NMDAR udtryk niveauer

  1. For at bestemme den optimale mængde af baculovirus at bruge, udføre en titrering af både NR1 og NR2A virus. Forberede en 384-godt plade med HEK293 celler (anbefaling af 10.000 celler/brønd, 30 µL af medier) og omfatte beskyttelse forbindelser som beskrevet i trin 2.1.
  2. Tilføje varierende mængder af virussen NR1 i forskellige rækker i pladen (for eksempel: tilføje 0 µL, 2 µL, 1 µL, 0,5 µL, 0,25 µL i rækker A-E henholdsvis). Tilføje dubletter for data nøjagtighed.
  3. Tilføje varierende mængder af NR2A virus i forskellige kolonner i pladen (for eksempel: tilføje 0 µL, 2 µL, 1 µL, 0,5 µL, 0,25 µL i rækker A-E henholdsvis). Tilføje dubletter for data nøjagtighed.
  4. Inkuber plade på 37 ° C og 5% CO2 i 16 timer (natten over).
  5. Bestemme optimal ratio og mængden af NR1 og NR2A virus ved at udføre en calcium flux måling på FDSS (se ovenfor).

4. ligand titrering

  1. Forberede cellerne, som beskrevet i trin 2.3.
  2. Tilberedes fortyndinger af hvert ligand i overværelse af mætte koncentrationer (100 µM) af de andre ligand som en 4-fold stamopløsning. For eksempel: for en 10 µM endelige test-koncentration af glycin, forberede en 40 µM stamopløsning af glycin herunder 400 µM glutamat.
  3. Fortsætte med FDSS måling som beskrevet i trin 2.11.

5. sammensatte test

  1. Forberede cellerne, som beskrevet i trin 1.
  2. Forberede ligand pladen med en 5-fold bestand af endelige ligand koncentration i analysebuffer.
  3. Forberede forbindelser plade med ønskede slutkoncentration af forbindelser i analysebuffer 4-fold bestanden. En sammensat slutkoncentration på 10 µM i analysebuffer, forberede en 40 µM stamopløsning.
    1. Holde koncentrationen af dimethylsulfoxid (DMSO) konstant på tværs af alle prøver ved at forberede en pre fortynding af sammensatte i DMSO før yderligere fortynding i analysebuffer.
    2. En dosis-respons af stoffet i den endelige analyse spænder mellem 3 og 30 µM, forberede en pre fortynding af sammensatte i DMSO spænder fra 1 til 10 mM. Fortyndes i analysebuffer til 4-fold stock koncentrationen. Den endelige koncentration af DMSO bør ikke overstige 0,5%.
      Bemærk: Det anbefales at teste hver prøve i tre.
  4. Indlæse ligand, sammensatte og celle plade i FDSS.
  5. Måle baseline fluorescens i 30 sekunder.
  6. Tilsæt 10 µL af sammensatte lager og måle fluorescens i 5 minutter.
  7. Tilsæt 10 µL af ligand lager og måle fluorescens i 5 minutter.
  8. Bestemme integralet af fluorescens-forhold ved at beregne arealet under kurven for de fluorescerende nøgletal i løbet af de sidste 5 minutter af målingen.
    Bemærk: Alternativt, maksimal forholdet mellem fluorescens efter ligand tilsætning kan bruges til analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Før testning virkningerne af små molekyler, fastlægger en optimal udtryk niveauer af NMDARs samt optimal ligand koncentrationer. Som beskrevet, HEK293 celler var seedet på 10.000 celler pr. brønd i en 384-godt plade, i overværelse af 5 µM transduced CGP060667, derefter med varierende mængder af NR1 og NR2A virus. Efter inkubering natten, ligand-induceret calcium flux blev målt (figur 1). Resultaterne af disse eksperimenter afslører bedste mængden og forholdet af virus skal bruges til hver enkelt underenhed (figur 1, gul boks).

Når den optimale mængde og forholdet til transduktion med NR1 og NR2A var bestemt, blev en ligand titrering udført for at bestemme den optimale ligand koncentration for aktivering af NMDARs. For at opnå dette, et af co ligander blev tilføjet i varierende koncentrationer på faste, mætte koncentrationer af de andre Co ligand (figur 2A-2B). Lignende resultater blev opnået for andre subunit kombinationer af NMDAR NR1/NR2B og NR1/NR2D (figur 2 c), viser analysens anvendelighed til andre NMDAR familiemedlemmer24. Efter bestemmelse af optimal udtryk niveauer og ligand koncentrationer, kan man fortsætte med test virkningerne af NMDAR-modulatorer i analysen.

Overensstemmelse med publicerede rapporter, denne første plade-baseret analyse at studere NMDARs med følsomhed over for både glycin og glutamat i stor skala gengiver data på de kendte egenskaber af NMDAR14,25,26. Her bruger vi aktiviteten i to forbindelser, [(R)-[(S)-1-(4-bromophenyl)-ethylamino]-(2,3-dioxo-1,2,3,4-tetrahydroquinoxalin-5-yl)-methyl]-phosphonic syre (NVP-AAM077), en glutamat site antagonist, og [7-chlor-4-hydroxy-3-(3-phenoxy) phenyl-2 (H) quinolon] (L701, 324), en glycin site antagonist, at eksemplificere forudsigelsesresultaterne assay27,28 (figur 3). Endelig blev hver sammensatte testet på EC80 af de respektive naturlige ligand på bindingssted. Reduktion af ligand koncentrationen forventes at øge styrken af antagonister, mens det forventes at have nogen effekt på styrken af ikke-kompetitive inhibitorer eller pore-blokkere.

Figure 1
Figur 1: titrering af NR1 og NR2A subunits. Forskellige mængder af virus, der indkode NMDAR subunits NR1 og NR2A blev titreret til at bestemme det beløb, der er nødvendige for optimal funktionelle aktivitet af receptor. Forholdet 1:1 (v/v) NR1:NR2A blev observeret som den optimale forhold med 1 µL af hver (gul boks). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Ligand titrering. A. i en fast koncentration af glycin (100 µM), varierende glutamat koncentrationer blev titreret og calcium flux blev indspillet. Fejllinjer udgør standardafvigelse. B. glutamat forblev i en koncentration på 100 µM og var titreres mod forskellige koncentrationer af D-Serin og glycin, og calcium flux blev målt. Der var ingen signifikant forskel mellem calcium flux i glycin og i D-serin. Fejllinjer udgør standardafvigelse. C. celler transduced med NR1 og NR2D baculovirus blev stimuleret med enten 100 µM glutamat og varierende koncentrationer af D-Serin eller 100 µM D-Serin og varierende koncentrationer af glutamat og calcium flux blev målt. Fejllinjer udgør standardafvigelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: kendetegner aktivitet af ligand bindende site antagonist. Ved hjælp af de forudbestemte optimal ligand og subunit udtryk, virkningerne af en glutamat-bindingssted antagonist, NVP-AAM077 og en glycin-bindende site antagonist, L701, var 324 præget af calcium flux assay for NR1/NR2A på den angivne koncentrationer. En koncentration svarende til EC80 af glycin eller glutamat i nærværelse af den mætte koncentration (100 µM) af de andre ligand var brugte efter tilsætning af NVP-AAM077 og L701, 324, henholdsvis. Fejllinjer udgør standardafvigelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette assay succes afhænger i høj grad sundhed HEK celler anvendes. Celler gennemgår eksponentiel vækst og med lav passage nummer bør anvendes. Denne analyse indebærer mange overførsler og tilføjelser af løsninger, så ved hjælp af forsigtighed vil sikre højere præcision i sine resultater. Koncentrationer af forbindelser og alle andre reagenser skal krydscheckes også at minimere fejl. Når du udskifter celle medier med analysebuffer til calcium flux assay, skal pladen vippes forsigtigt så at cellerne ikke frigøre. Endelig øger brugen af poly-D-lysin overtrukne plader i denne protokol udlæg i cellerne på pladen.

Der kan være forskelle i NMDAR udtryk og mængden af virus til subunit udtryk afhængigt af passage antal og egnethed af HEK293 cellerne i forbindelse med transduktion. Også, baculovirus har en kort holdbarhed, som strækker sig fra seks måneder til et år. Derfor, kvaliteten af virus er en vigtig parameter for denne analyse. En standard immunofluorescens assay kan bruges til at registrere og bekræfte udtryk niveauer og lokalisering af NMDAR enhederne før yderligere eksperimenter24. Andre cellelinjer kan bruges til at studere NMDA-receptor benytter denne protokol. Dog, tolerance og udtryk for NMDARs ved hjælp af baculovirus skal bekræftes, før du fortsætter med protokollen; ellers kan der opstå uventede resultater. Derudover er forbindelser såsom topoisomerase II hæmmere blevet rapporteret at øge effekten af baculovirus udtryk29. Disse alternativer kan være testet og optimeret efter brugerens præferencer.

Undersøgelse af biologiske processer i en anderledes end de oprindelige celletype celletype rejser spørgsmål inden for det videnskabelige samfund. En begrænsning af denne analyse er brugen af nyre cellelinjer (HEK 293) som et modelsystem til at studere ionotropic glutamat receptor, NMDAR. HEK celler blev brugt på grund af deres depolariseret membran potentiale ligner depolariseret neuroner. Derudover er ligheden mellem NMDARs i hjernen og i vores model bekræftet af vores supplerende undersøgelser. Aktiviteten af positive allosteriske modulatorer såsom GNE-8324, negative modulatorer såsom ifenprodil og kanal blokkere såsom ketamin, samt spænding afhængighed af NMDAR, blev alt bekræftet i vores model22,23 ,24. Også, vores evne til at justere mængden af virus for underenheder NR1 og NR2A sikrer optimal funktionelle udtryk niveauer.

På grund af lav effektivitet og høje omkostninger og minimal succes resultatet, karakterisering af enkelte receptorer og deres unikke farmakologi føres for øjeblikket i lav-overførselshastighed manuel patch-clamp assays22,23. På den anden side excitotoxicity er stadig en stor hindring når ved hjælp af stabilt transfekteret celler, fordi overekspression af funktionelle NMDARs er skadelige for celler som følge af ligander (glutamat og glycin/D-Serin), der frigives til media18. Som en stærkere alternativ bruger vores analyse baculovirus-medieret udtryk af funktionelle NMDARs, som overvinder excitotoxicity og giver hurtige, titrerbare udtryk af receptorer. I stedet for at være begrænset af den klæbrige karakter af kanal blokkere, tager dette assay også fordel af antagonister af svage ligand-bindingssteder. Disse antagonister konkurrere med endogene ligander i medierne og beskytte ligand-bindingssteder. Derfor, efter udvaskning af antagonister, følsomhed over for eksogent tilføjet ligander af glutamat- og glycin/D-Serin-bindingssteder er genoprettet.

Denne analyse, kombineret med de seneste fremskridt inden for molekylær biologi som CRISPR, vil hjælpe mål og karakterisere romanen regulatorer af NMDAR udtryk og funktion. Samtidigt, vil denne analyse hjælpe med at identificere små molekyler, der kan direkte eller indirekte modulere NMDAR aktivitet uden at generere stabile cellelinjer, hvilket giver kompatibilitet med genetiske- og lille molekyle-baserede skærme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter og intet at videregive.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke studentereksamen lærde Program posthus og Novartis institutter for biomedicinsk forskning som helhed til finansiering af denne undersøgelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEK-293 ATCC CRL-1573
Human NMDA (NR1/NR2A) Receptor Cell Line ChanTest Corporation CT6120
pFastBac Dual Expression Vector ThermoFisher Scientific 10712-024
Corning 384-well Clear Flat Bottom Microplate Corning Life Sciences 3844
FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit Molecular Devices R8192
Glycine Sigma-Aldrich G7126
Glutamate Sigma-Aldrich 49621
D-serine Sigma-Aldrich S4250
L701,324 Tocris 907
HEPES Buffer Boston Bio Product BB-103
Magnesium Chloride Solution Sigma-Aldrich 63069
Calcium Chloride VWR E506
HBSS ThermoFisher Scientific 14025-092
Probenecid ThermoFisher Scientific P36400
DMEM/F-12, GlutaMAX media ThermoFisher Scientific 10565018
MDL105,519 NIBR Synthesized in house
NVP-AAM077 NIBR Synthesized in house
CGP070667 NIBR Synthesized in house

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Farrall, A. J., Wardlaw, J. M. Blood-brain barrier: ageing and microvascular disease--systematic review and meta-analysis. Neurobiology of Aging. 30 (3), 337-352 (2009).
  2. Walhovd, K. B., Fjell, A. M., Espeseth, T. Cognitive decline and brain pathology in aging--need for a dimensional, lifespan and systems vulnerability view. Scandinavian Journal of Psychology. 55 (3), 244-254 (2014).
  3. Wittchen, H. U., et al. The size and burden of mental disorders and other disorders of the brain in Europe 2010. European Neuropsychopharmacology. 21 (9), 655-679 (2011).
  4. Traynelis, S. F., et al. Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function. Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).
  5. Mony, L., Kew, J. N., Gunthorpe, M. J., Paoletti, P. Allosteric modulators of NR2B-containing NMDA receptors: molecular mechanisms and therapeutic potential. British Journal of Pharmacology. 157 (8), 1301-1317 (2009).
  6. Lau, C. G., Zukin, R. S. NMDA receptor trafficking in synaptic plasticity and neuropsychiatric disorders. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 413-426 (2007).
  7. Zhou, Q., Sheng, M. NMDA receptors in nervous system diseases. Neuropharmacology. 74, 69-75 (2013).
  8. Paoletti, P., Bellone, C., Zhou, Q. NMDA receptor subunit diversity: impact on receptor properties, synaptic plasticity and disease. Nature Reviews Neuroscience. 14, 383 (2013).
  9. Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. Diversity in NMDA receptor composition: many regulators, many consequences. Neuroscientist. 19 (1), 62-75 (2013).
  10. Neyton, J., Paoletti, P. Relating NMDA receptor function to receptor subunit composition: limitations of the pharmacological approach. Journal of Neuroscience. 26 (5), 1331-1333 (2006).
  11. Hunt, D. L., Castillo, P. E. Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 496-508 (2012).
  12. Huganir, R. L., Nicoll, R. A. AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years. Neuron. 80 (3), 704-717 (2013).
  13. Shimomura, H., et al. Glycine plays a crucial role as a co-agonist of NMDA receptors in the neuronal circuit generating body movements in rat fetuses. Neuroscience Research. 97, 13-19 (2015).
  14. Tajima, N., et al. Activation of NMDA receptors and the mechanism of inhibition by ifenprodil. Nature. 534 (7605), 63-68 (2016).
  15. Mayer, M. L., Westbrook, G. L., Guthrie, P. B. Voltage-dependent block by Mg2+ of NMDA responses in spinal cord neurones. Nature. 309 (5965), 261-263 (1984).
  16. Zhu, S., et al. Mechanism of NMDA Receptor Inhibition and Activation. Cell. 165 (3), 704-714 (2016).
  17. Yildiz-Unal, A., Korulu, S., Karabay, A. Neuroprotective strategies against calpain-mediated neurodegeneration. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 11, 297-310 (2015).
  18. Gascon, S., Sobrado, M., Roda, J. M., Rodriguez-Pena, A., Diaz-Guerra, M. Excitotoxicity and focal cerebral ischemia induce truncation of the NR2A and NR2B subunits of the NMDA receptor and cleavage of the scaffolding protein PSD-95. Molecular Psychiatry. 13 (1), 99-114 (2008).
  19. Uttara, B., Singh, A. V., Zamboni, P., Mahajan, R. T. Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options. Current Neuropharmacology. 7 (1), 65-74 (2009).
  20. Hansen, K. B., et al. Implementation of a fluorescence-based screening assay identifies histamine H3 receptor antagonists clobenpropit and iodophenpropit as subunit-selective N-methyl-D-aspartate receptor antagonists. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 333 (3), 650-662 (2010).
  21. Bettini, E., et al. Identification and characterization of novel NMDA receptor antagonists selective for NR2A- over NR2B-containing receptors. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335 (3), 636-644 (2010).
  22. Feuerbach, D., Loetscher, E., Neurdin, S., Koller, M. Comparative pharmacology of the human NMDA-receptor subtypes R1-2A, R1-2B, R1-2C and R1-2D using an inducible expression system. European Journal of Pharmacology. 637 (1-3), 46-54 (2010).
  23. Hansen, K. B., Brauner-Osborne, H., Egebjerg, J. Pharmacological characterization of ligands at recombinant NMDA receptor subtypes by electrophysiological recordings and intracellular calcium measurements. Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 11 (4), 304-315 (2008).
  24. Guo, H., et al. A NMDA-receptor calcium influx assay sensitive to stimulation by glutamate and glycine/D-serine. Scientific Reports. 7 (1), 11608 (2017).
  25. Hackos, D. H., et al. Positive Allosteric Modulators of GluN2A-Containing NMDARs with Distinct Modes of Action and Impacts on Circuit Function. Neuron. 89 (5), 983-999 (2016).
  26. Romero-Hernandez, A., Furukawa, H. Novel Mode of Antagonist Binding in NMDA Receptors Revealed by the Crystal Structure of the GluN1-GluN2A Ligand-Binding Domain Complexed to NVP-AAM077. Molecular Pharmacology. 92 (1), 22-29 (2017).
  27. Auberson, Y. P., et al. 5-Phosphonomethylquinoxalinediones as competitive NMDA receptor antagonists with a preference for the human 1A/2A, rather than 1A/2B receptor composition. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 12 (7), 1099-1102 (2002).
  28. Danysz, W., Parsons, C. G. Glycine and N-methyl-D-aspartate receptors: physiological significance and possible therapeutic applications. Pharmacological Reviews. 50 (4), 597-664 (1998).
  29. Liu, M. K., et al. Topoisomerase II Inhibitors Can Enhance Baculovirus-Mediated Gene Expression in Mammalian Cells through the DNA Damage Response. International Journal of Molecular Science. 17 (6), (2016).

Tags

Neurovidenskab sag 137 NMDAR calcium-flux excitotoxicity cellernes levedygtighed antagonister glycin/D-Serin glutamat modulatorer
En høj overførselshastighed Calcium-flux Assay at studere NMDA-receptorer med følsomhed over for glycin/D-Serin og glutamat
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yeboah, F., Guo, H., Bill, A. AMore

Yeboah, F., Guo, H., Bill, A. A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate. J. Vis. Exp. (137), e58160, doi:10.3791/58160 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter