Summary
Het doel van dit protocol is te vergemakkelijken van de studie van NMDA-receptoren (NMDAR) op een grotere schaal en het onderzoek van f effecten van kleine moleculen en hun therapeutische toepassingen.
Abstract
N-methyl-D-aspartaat (NMDA) receptoren (NMDAR) worden geclassificeerd als ionotropic glutamaat receptoren en hebben belangrijke rol bij het leren en geheugen. NMDAR storing, uitgedrukt als ofwel over - of onder - activity veroorzaakt door mutaties, veranderde expressie, mensenhandel of lokalisatie, kan bijdragen aan vele ziekten, met name in het centrale zenuwstelsel. Begrip van de receptor biologie, alsmede het vergemakkelijken van de ontdekking van stoffen en kleine moleculen is daarom van cruciaal belang in voortdurende inspanningen ter bestrijding van neurologische aandoeningen. Huidige aanpak aan het bestuderen van de receptor hebben beperkingen waaronder lage doorvoersnelheid, hoge kosten en het onvermogen om te bestuderen zijn functionele capaciteiten als gevolg van de noodzakelijke aanwezigheid van kanaal blokkers om te voorkomen dat NMDAR-gemedieerde excitotoxicity. Bovendien, de bestaande assay-systemen zijn gevoelig voor stimulatie door glutamaat slechts en gebrek aan gevoeligheid voor stimulatie door glycine, de andere co ligand van de NMDAR. Hier presenteren wij de eerste plaat gebaseerde bepaling met hoge gegevensdoorvoer macht te bestuderen van een NMDA-receptor met gevoeligheid voor zowel mede-liganden, glutamaat en D-serine/glycine. Deze benadering kunt de studie van de verschillende NMDAR subeenheid composities en functionele studies van de receptor in glycine - en/of glutamaat-gevoelige modi. De methode hoeft bovendien niet de aanwezigheid van remmers tijdens de metingen. De effecten van positieve en negatieve allosteric modulatoren met deze test kunnen worden gedetecteerd en de bekende farmacologie van NMDAR is gerepliceerd in ons systeem. Deze techniek overwint de beperkingen van bestaande methoden en rendabel. Wij zijn van mening dat deze nieuwe techniek zal het versnellen van de ontdekking van therapieën voor NMDAR-gemedieerde aandoeningen.
Introduction
Met huidige vooruitgang in de geneeskunde toegenomen levensverwachting aanzienlijk; Zo heeft echter de prevalentie van leeftijd gerelateerde ziekten. Ziekten van het centrale zenuwstelsel (CNS) zoals schizofrenie, Amyotrofische laterale sclerose (ALS), de ziekte van Alzheimer en Parkinson's disease, onder anderen, zijn geen uitzondering en hebben naar zijn verwachting toenemen in de komende tien jaar1, 2 , 3. de storing van ionotropic glutamaat receptoren bekend als N-methyl-D-aspartaat receptoren (NMDAR) is gekoppeld aan de ziekte van Alzheimer, schizofrenie, traumatisch hersenletsel, beroerte, diabetes en glaucoom o.a. die garandeert de moeten hun biologie voor de ontwikkeling van effectieve, ziekte-wijzigen therapieën4,5,6,7te bestuderen.
NMDARs bestaan uit vier monomeren of subeenheden4,8,-9. De structurele samenstelling van de NMDAR toont ontwikkelings- en regionale variabiliteit binnen de hersenen7,10. NMDARs zijn betrokken bij de Synaptische plasticiteit, cognitie en de generatie van ritmes voor ademhaling en motoriek11,12,13. Als een spanning-gated kanaal, het is grotendeels niet-geleidend op rusten membraanpotentiaal (-70 mV) en wordt geblokkeerd door magnesium om te voorkomen dat verdere permeatie van ionen. Het kanaal wordt geactiveerd door de binding van twee liganden, glutamaat en glycine/D-serine en een gelijktijdige depolarisatie op de synaptische membraan gemedieerd door AMPA receptoren, een subklasse van ionotropic glutamaat receptoren. De depolarisatie verwijdert de magnesium-blokkering van de NMDAR, zodat de toestroom van kationen, met name calcium14,15,16. Hoewel de activering van het NMDAR essentieel voor de overleving van de cel is, kan buitensporige activering leiden tot cel dood17,18,19 tot en met excitotoxicity. Dit, maakt naast het complexe karakter van de receptoren, het uitdagend om onderzoek te verrichten nodig voor het ontwikkelen van effectieve therapieën.
Verschillende methoden hebben ontwikkeld om te bestuderen van de NMDAR. Echter, ieder heeft begeleidende waarschuwingen. Bijvoorbeeld, is een veel gebruikte techniek een fluorescentie-gebaseerde test die NMDAR-gemedieerde veranderingen in intracellulair calcium in een stabiele cellijn onder de controle van een tetracycline-afleidbare promotor (Tet-On)20 meet. In dit systeem maakt de supramaximal concentraties van liganden die nodig zijn en de eis dat NMDAR-remmers aanwezig tijdens de meting zijn het echter bijna onmogelijk op te sporen van de activiteit van de concurrerende antagonist. De expressie van de functionele receptor veroorzaakt in andere soortgelijke systemen, toxiciteit, kanaal-blokkers zoals ketamine21,22 te behouden van de celculturen vereisen. Deze kanaal blokkers zitten de kern van de receptor en zijn moeilijk te wassen, met name in een plaat gebaseerde indeling, zodat ze met functionele studies van de receptor interfereren. Ten slotte, in elektrofysiologische metingen zoals patch klemmen, er is beperkte doorvoer en grootschalig onderzoek zijn erg duur23. Ondanks zijn de bovengenoemde systemen ongevoelig voor glycine stimulatie; Vandaar, studeren glycine-afhankelijke activiteit van de NMDAR wordt een uitdaging.
Hier beschrijven we een nieuwe benadering voor de studie van NMDAR dat de besproken beperkingen overwint. Onze techniek speelt in op het systeem van de expressie baculovirus wil de receptor op functionele niveaus met een optimale verhouding van de subeenheden in zo weinig als 16 uur. Anderzijds zorgt het gebruik van baculovirus voor een eenvoudige en combinatorische aanpak, waarmee een globale karakterisering van de verschillende subtypen voor recombinante NMDAR. In tegenstelling tot andere testen vereist dit protocol geen kanaal blokkers vanwege het gebruik van zwakke antagonisten. De sterkste voordeel van de methode is dat na wassen van de zwakke antagonist, de receptor is gevoelig voor modulatie van de individuele glycine - en glutamaat-bandplaatsen naast dual modulatie van zowel glutamaat als glycine/D-serine ligand-bindende sites. De assay recapituleert bekende farmacologie van de NMDAR receptor en de gevolgen van haar bekende positieve en negatieve modulatoren. Ten slotte, deze cellulaire assay in vitro generatie overwint de cellulaire toxiciteit veroorzaakt door buitensporige calcium toestroom en zorgt voor functionele studies van de receptor in een high-throughput mode, die ontdekkingen van NMDAR modulatoren versnellen kan in ziekte staten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van cellen
Opmerking: Dit protocol, met inbegrip van gegevens generatie, maakt gebruik van HEK293 cellen getransduceerde met een baculovirus codering NR1 en NR2A cellen.
- Zaad van het juiste aantal HEK293 cellen en voeg de NR1 en/of NR2A virus aan de juiste eindconcentraties (elke 1.00 µL). Gebruik voor een 384-well plaat, cellen per putje op 10.000 in een eindvolume van 30 µL.
- U kunt ook zaad HEK293-NR1-NR2A cellen op de gewenste cel nummer en het volume (voor een 384-well plaat, gebruik 10.000 cellen per putje in een eindvolume van 30 µL). Toevoegen van tetracycline bij een concentratie van 2 µg/mL induceren NR2A expressie en het toevoegen van de samengestelde bescherming (100 µM MDL105, 519 of 5 µM CGP07066724).
- Opmerking: De baculovirus codering NR1 en NR2 moet hebben een geschatte titer tussen 5 x 109 - 10 x 109 besmettelijke eenheid per milliliter24.
2. meting van de NMDA-receptor activiteit
- Bereiden een 384-well-plate met HEK293 cellen met NR1/NR2 of HEK293-NR1-NR2A cellen in aanwezigheid van beide beschermende samengestelde getransduceerde. Gebruik een duidelijk bodem, zwart frame, poly-D-lysine beklede plaat.
Opmerking: Bescherming met 100 µM MDL105, 519 wordt gebruikt voor het verlenen van gevoeligheid voor glycine, terwijl 5 µM CGP070667 wordt gebruikt voor het verlenen van gevoeligheid voor glutamaat. - Incubeer de plaat bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 16 uur ('s nachts).
- Verwijderen de plaat uit de incubator en zachtjes de cel media negeren door het vertragen van het wegknippen van de plaat over een compatibel biologisch afbreekbaar afval container. Tik zachtjes op de plaat op een papieren handdoek voor het reinigen van de media uit de randen van de plaat en afvoer van alle resterende media.
- Bereid de calcium6-kleurstof door één flacon van calcium6 kleurstof (1 plaat grootte) solubilizing in 10 mL incubatie buffer (HBSS pH 7.5, van 20 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 1 mM probenecide). Incubeer de plaat gedurende 2 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
- Verwijderen de plaat uit de incubator en laat de cellen aan te passen aan kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
- Zachtjes aan de calcium6-kleurstof zoals beschreven in stap 2.3 uitstorten en Voeg 30 µL van assay buffer (HBSS pH 7.5, van 20 mM HEPES, 1,8 mM CaCl2, 1 mM probenecide).
- Herhaal stap 2.6 tweemaal voor een totaal van 3 wasbeurten. Laat 30 µL van assay buffer op de cellen na de laatste wasbeurt.
- Laat de cellen 5 minuten bij kamertemperatuur rusten.
- Bereid de ligand-plaat door het maken van een 4-fold voorraad van 400 µM glycine en 400 µM glutamaat (eindconcentratie van 100 µM; optimale concentratie van liganden te bepalen zoals hieronder beschreven). Pipetteer een minimum van 25 µL van het ligand materieel in een bodemplaat die V-384-well.
- Laad de ligand plaat en de plaat van de cel in de FDSS (functionele Drug Screening System).
- Het meten van de basislijn fluorescentie (Fo) van de cel plaat voor 30 seconden. Pipetteer 10 µL van het ligand-voorraad in de plaat van de cel met behulp van de FDSS verstrekking functie en de maatregel de calcium-flux door het opnemen van calcium6-kleurstof fluorescentie gedurende 5 minuten.
- Berekenen de maximale fluorescentie verhouding door te delen van de maximale fluorescentie verkregen door de basislijn fluorescentie (Fmax/fo).
3. optimalisatie van NMDAR expressie niveaus
- Uitvoeren om te bepalen van de optimale hoeveelheid baculovirus te gebruiken, een titratie van zowel de NR2A als de NR1 virussen. Bereid een 384-well plaat met HEK293 cellen (aanbeveling van 10.000 cellen/well, 30 µL van media) en omvatten de bescherming-verbindingen, zoals beschreven in stap 2.1.
- Toevoegen van wisselende hoeveelheden van het virus van de NR1 in verschillende rijen van de plaat (bijvoorbeeld: Voeg respectievelijk 0 µL, 2 µL, 1 µL, 0,5 µL, 0,25 µL in rijen A-E). Toevoegen van duplicaten voor nauwkeurigheid van gegevens.
- Toevoegen van wisselende hoeveelheden van het NR2A-virus in verschillende kolommen van de plaat (bijvoorbeeld: Voeg respectievelijk 0 µL, 2 µL, 1 µL, 0,5 µL, 0,25 µL in rijen A-E). Toevoegen van duplicaten voor nauwkeurigheid van gegevens.
- Incubeer de plaat bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 16 uur ('s nachts).
- Het bepalen van de optimale verhouding en het bedrag van de NR1 en NR2A virussen door het uitvoeren van een meting van de flux calcium op de FDSS (zie hierboven).
4. ligand titratie
- Bereiden de cellen zoals beschreven in stap 2.3.
- Maak verdunningen van elke ligand in aanwezigheid van concentraties (100 µM) verzadigen van de andere ligand als de stamoplossing van een 4-fold. Bijvoorbeeld: voor een concentratie van de laatste test 10 µM van glycine, bereiden een 40 µM-stockoplossing van glycine, met inbegrip van 400 µM glutamaat.
- Ga verder met de meting van de FDSS zoals beschreven in stap 2.11.
5. samengestelde testen
- Bereiden de cellen zoals beschreven in stap 1.
- De ligand-plaat met een 5-fold voorraad van definitieve ligand concentratie in de buffer assay voor te bereiden.
- De plaat van de verbindingen met de 4-fold voorraad van gewenste eindconcentratie van verbindingen in de buffer assay voor te bereiden. Voor een samengestelde eindconcentratie van 10 µM in de buffer assay, bereiden een stamoplossing van 40 µM.
- Houd de concentratie van de dimethylsulfoxide (DMSO) constant over alle monsters door het opstellen van een pre verdunning van de stof in DMSO vóór verdere verdunning in de buffer assay.
- Maak voor een dosis-respons van de verbinding in de definitieve bepaling variërend tussen de 3 en 30 µM, een pre verdunning van de stof in DMSO variërend van 1 tot 10 mM. Verdun die in de buffer van de test bij de 4-fold voorraad concentratie. De uiteindelijke concentratie van de DMSO mag niet meer dan 0,5%.
Opmerking: Het wordt aanbevolen om te testen van elk monster in triplicates.
- Laad de ligand, samengestelde en cel plaat in FDSS.
- Het meten van de fluorescentie van de basislijn voor 30 seconden.
- Voeg 10 µL van samengestelde materieel en meten van de fluorescentie gedurende 5 minuten.
- Voeg 10 µL van het ligand materieel en meten van de fluorescentie gedurende 5 minuten.
- De integraal van de fluorescentie verhouding bepalen door het berekenen van het oppervlak onder de kromme van de fluorescerende verhoudingen tijdens de laatste 5 minuten van de meting.
Opmerking: U kunt ook de maximale verhouding van fluorescentie na toevoeging van het ligand kan worden gebruikt voor analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voor het testen van de effecten van kleine molecules, moet men de optimale expressie niveaus van NMDARs, alsmede de optimale ligand concentraties bepalen. Zoals beschreven, HEK293 cellen werden zaadjes op 10.000 cellen per putje in een 384-well plaat, in aanwezigheid van 5 µM CGP060667, dan getransduceerde met wisselende hoeveelheden van NR1 en NR2A virussen. Na incubatie overnachting, ligand-geïnduceerde calcium flux werd gemeten (Figuur 1). De resultaten van deze experimenten blijkt de beste hoeveelheid en verhouding van virus te gebruiken voor elke subeenheid (Figuur 1, gele box).
Zodra de optimale hoeveelheid en verhouding voor signaaltransductie met de NR1 en NR2A werden bepaald, werd een titratie ligand uitgevoerd om te bepalen van de concentratie van de optimale ligand voor activering van NMDARs. Om dit te bereiken, een van de mede liganden werd toegevoegd in uiteenlopendeconcentratiesverkrijgbaar op vaste, verzadigen van de concentraties van de andere co ligand (figuur 2A-2B). Vergelijkbare resultaten werden verkregen voor andere combinaties van de subeenheid van de NMDAR zoals NR1/NR2B en NR1/NR2D (figuur 2C), aan te tonen van de bepaling toepasselijkheid op andere NMDAR familieleden24. Na bepaling van de optimale expressie niveaus en de ligand concentraties, kan een doorgaan met het testen van de effecten van NMDAR-modulatoren in de test.
In overeenstemming met de gepubliceerde rapporten, deze eerste plaat gebaseerde bepaling te studeren van NMDARs met gevoeligheid voor zowel glycine en glutamaat op grote schaal reproduceert gegevens over de bekende eigenschappen van de NMDAR14,25,26. Hier, gebruiken we de activiteit van twee verbindingen, [(R)-[(S)-1-(4-bromophenyl)-ethylamino]-(2,3-dioxo-1,2,3,4-tetrahydroquinoxalin-5-yl)-methyl]-phosphonic zuur (NVP-AAM077), een glutamaat site antagonist, en [7-chloro-4-hydroxy-3-(3-phenoxy) fenyl-2 (H) quinolone] (L701, 324), een antagonist glycine site, om te illustreren de voorspelde resultaten van de test27,28 (Figuur 3). Tot slot, elke compound werd getest op de EC80 van de respectieve natuurlijke ligand van de bindende site. Verlaging van de concentraties van het ligand naar verwachting toenemen de potentie van antagonisten, terwijl verwacht wordt dat het geen invloed hebben op de potentie van niet-competitieve remmers of porie-blokkers.
Figuur 1: titratie van NR1 en NR2A subeenheden. Verschillende volumes van virus dat NMDAR subeenheden NR1 en NR2A coderen waren getitreerd om te bepalen van het bedrag dat nodig is voor optimale functionele activiteit van de receptoren. Een verhouding van 1:1 (v/v) NR1:NR2A werd waargenomen als de optimale verhouding met 1 µL van elke (gele box). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Ligand titratie. A. in een vaste concentratie van glycine (100 µM), glutamaat uiteenlopendeconcentratiesverkrijgbaar waren getitreerd en calcium flux werd opgenomen. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie. B. glutamaat bleef bij een concentratie van 100 µM en werd getitreerd tegen verschillende concentraties van D-serine en glycine en calcium flux werd gemeten. Er was geen significant verschil gevonden tussen de calcium-flux in glycine en D-serine. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie. C. cellen met NR1 en NR2D baculovirus getransduceerde werden gestimuleerd met ofwel 100 µM glutamaat en wisselende concentraties van D-serine of 100 µM-D-serine en uiteenlopende concentraties van glutamaat en calcium flux werd gemeten. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: karakterisering van de activiteit van ligand bindende site antagonist. Met behulp van de vooraf vastgestelde optimale ligand en subeenheid expressies, de gevolgen van een antagonist van glutamaat-bindende site, NVP-AAM077 en een glycine-bindende site antagonist, L701, werden 324 gekenmerkt door de calcium flux assay voor NR1/NR2A op de aangegeven concentraties. Een concentratie die gelijk is aan de EC80 van glycine of glutamaat in aanwezigheid van de saturating concentratie (100 µM) van de andere ligand werd gebruikt na toevoeging van de NVP-AAM077 en L701, 324, respectievelijk. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het succes van deze test hangt grotendeels af van de gezondheid van de cellen van de HEK gebruikt. Cellen die een exponentiële groei en met lage passage nummer moet worden gebruikt. Deze bepaling omvat vele overdrachten en toevoegingen van oplossingen, dus met behulp van voorzichtigheid zorgt voor hogere nauwkeurigheid in de resultaten. Concentraties van stoffen en alle andere reagentia moeten ook kruiscontrole minimaliseren van fouten. Bij het vervangen van mobiele media met de buffer assay voor de calcium flux assay, moet de plaat worden gekanteld voorzichtig zodat de cellen niet kunnen loskoppelen. Tot slot, het gebruik van poly-D-lysine gecoate platen in dit protocol verhoogt gehechtheid van de cellen aan de plaat.
Er kunnen verschillen in NMDAR expressie en de hoeveelheid virus die nodig zijn voor de expressie van de subeenheid afhankelijk van het aantal van de passage en de geschiktheid van de HEK293 cellen op het moment van signaaltransductie. Ook heeft de baculovirus een korte houdbaarheid variërend van zes maanden tot een jaar. Daarom is de kwaliteit van het virus is een belangrijke parameter voor deze test. Een standaard immunofluorescentie assay kan worden gebruikt om te detecteren en de expressie niveaus en de lokalisatie van de NMDAR eenheden ook vóór verdere experimenten24bevestigen. Andere cellijnen kunnen worden gebruikt om te studeren de NMDA-receptor met behulp van dit protocol. Echter, de tolerantie en de uitdrukking van NMDARs met behulp van de baculovirus moeten worden bevestigd voordat u verdergaat met het protocol; anders, kunnen onverwachte resultaten optreden. Bovendien zijn verbindingen zoals II topoisomeraseremmers gemeld te verhogen van de doeltreffendheid van baculovirus expressie29. Deze alternatieven kunnen worden getest en geoptimaliseerd volgens de voorkeuren van de gebruiker.
De studie van de biologische processen in een anders dan de oorspronkelijke celtype celtype vragen binnen de wetenschappelijke gemeenschap. Een beperking van deze test is het gebruik van nier cellijnen (HEK 293) als een modelsysteem om te studeren het ionotropic glutamaat-receptor, NMDAR. HEK cellen werden gebruikt vanwege hun depolarized membraanpotentiaal vergelijkbaar met die van de depolarized neuronen. Daarnaast is de gelijkenis tussen NMDARs in de hersenen en in ons model wordt bevestigd door onze aanvullende studies. De activiteit van positieve allosteric modulatoren zoals GNE-8324, negatieve modulatoren zoals ifenprodil en kanaal-blokkers zoals ketamine, evenals de afhankelijkheid van de spanning van de NMDAR, werden alle bevestigd in onze model22,23 ,24. Ook zorgt ons vermogen om de hoeveelheid virus voor de NR1 en NR2A subeenheden aanpassen voor optimale functionele expressie niveaus.
Vanwege de lage efficiëntie, hoge kosten en minimale succes resultaat, de karakterisatie van individuele receptoren en hun unieke farmacologie worden momenteel uitgevoerd in lage-doorvoer handmatige patch-clamp assays22,23. Aan de andere kant, blijft excitotoxicity een groot obstakel wanneer met behulp van stabiel transfected cellen, omdat overexpressie van functionele NMDARs zijn schadelijk voor de cellen als gevolg van de liganden (glutamaat en glycine/D-serine) die worden uitgebracht in de media-18. Als een sterker alternatief gebruikt onze assay baculovirus-gemedieerde expressie van functionele NMDARs, die excitotoxicity overwint en levert snelle, getitreerde uitdrukking van de receptoren. In plaats van wordt beperkt door het kleverige karakter van kanaal blokkers, profiteert deze bepaling ook van antagonisten van zwakke ligand-bindende plaatsen. Deze antagonisten concurreren met endogene liganden in de media en de ligand-bandplaatsen te beschermen. Dus, na het wassen van de antagonisten, gevoeligheid voor exogenously toegevoegde liganden van de glutamaat- en glycine/D-serine-bandplaatsen wordt hersteld.
Deze bepaling, in combinatie met de recente vooruitgang in moleculaire biologie zoals CRISPR, helpt doel en karakteriseren van roman regulatoren van NMDAR expressie en functie. Gelijktijdig, zal deze bepaling helpen identificeren van kleine moleculen die direct of indirect NMDAR activiteit zonder de noodzaak moduleren kunnen voor het genereren van stabiele cellijnen, waardoor compatibiliteit met genetische- en kleine molecuul gebaseerde schermen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten en niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedank het postkantoor baccalaureaat geleerden programma en Novartis instituten voor biomedisch onderzoek als een geheel voor de financiering van deze studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK-293 | ATCC | CRL-1573 | |
| Human NMDA (NR1/NR2A) Receptor Cell Line | ChanTest Corporation | CT6120 | |
| pFastBac Dual Expression Vector | ThermoFisher Scientific | 10712-024 | |
| Corning 384-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning Life Sciences | 3844 | |
| FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit | Molecular Devices | R8192 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | 49621 | |
| D-serine | Sigma-Aldrich | S4250 | |
| L701,324 | Tocris | 907 | |
| HEPES Buffer | Boston Bio Product | BB-103 | |
| Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | 63069 | |
| Calcium Chloride | VWR | E506 | |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14025-092 | |
| Probenecid | ThermoFisher Scientific | P36400 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX media | ThermoFisher Scientific | 10565018 | |
| MDL105,519 | NIBR | Synthesized in house | |
| NVP-AAM077 | NIBR | Synthesized in house | |
| CGP070667 | NIBR | Synthesized in house |
References
- Farrall, A. J., Wardlaw, J. M. Blood-brain barrier: ageing and microvascular disease--systematic review and meta-analysis. Neurobiology of Aging. 30 (3), 337-352 (2009).
- Walhovd, K. B., Fjell, A. M., Espeseth, T. Cognitive decline and brain pathology in aging--need for a dimensional, lifespan and systems vulnerability view. Scandinavian Journal of Psychology. 55 (3), 244-254 (2014).
- Wittchen, H. U., et al. The size and burden of mental disorders and other disorders of the brain in Europe 2010. European Neuropsychopharmacology. 21 (9), 655-679 (2011).
- Traynelis, S. F., et al. Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function. Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).
- Mony, L., Kew, J. N., Gunthorpe, M. J., Paoletti, P. Allosteric modulators of NR2B-containing NMDA receptors: molecular mechanisms and therapeutic potential. British Journal of Pharmacology. 157 (8), 1301-1317 (2009).
- Lau, C. G., Zukin, R. S. NMDA receptor trafficking in synaptic plasticity and neuropsychiatric disorders. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 413-426 (2007).
- Zhou, Q., Sheng, M. NMDA receptors in nervous system diseases. Neuropharmacology. 74, 69-75 (2013).
- Paoletti, P., Bellone, C., Zhou, Q. NMDA receptor subunit diversity: impact on receptor properties, synaptic plasticity and disease. Nature Reviews Neuroscience. 14, 383 (2013).
- Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. Diversity in NMDA receptor composition: many regulators, many consequences. Neuroscientist. 19 (1), 62-75 (2013).
- Neyton, J., Paoletti, P. Relating NMDA receptor function to receptor subunit composition: limitations of the pharmacological approach. Journal of Neuroscience. 26 (5), 1331-1333 (2006).
- Hunt, D. L., Castillo, P. E. Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 496-508 (2012).
- Huganir, R. L., Nicoll, R. A. AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years. Neuron. 80 (3), 704-717 (2013).
- Shimomura, H., et al. Glycine plays a crucial role as a co-agonist of NMDA receptors in the neuronal circuit generating body movements in rat fetuses. Neuroscience Research. 97, 13-19 (2015).
- Tajima, N., et al. Activation of NMDA receptors and the mechanism of inhibition by ifenprodil. Nature. 534 (7605), 63-68 (2016).
- Mayer, M. L., Westbrook, G. L., Guthrie, P. B. Voltage-dependent block by Mg2+ of NMDA responses in spinal cord neurones. Nature. 309 (5965), 261-263 (1984).
- Zhu, S., et al. Mechanism of NMDA Receptor Inhibition and Activation. Cell. 165 (3), 704-714 (2016).
- Yildiz-Unal, A., Korulu, S., Karabay, A. Neuroprotective strategies against calpain-mediated neurodegeneration. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 11, 297-310 (2015).
- Gascon, S., Sobrado, M., Roda, J. M., Rodriguez-Pena, A., Diaz-Guerra, M. Excitotoxicity and focal cerebral ischemia induce truncation of the NR2A and NR2B subunits of the NMDA receptor and cleavage of the scaffolding protein PSD-95. Molecular Psychiatry. 13 (1), 99-114 (2008).
- Uttara, B., Singh, A. V., Zamboni, P., Mahajan, R. T. Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options. Current Neuropharmacology. 7 (1), 65-74 (2009).
- Hansen, K. B., et al. Implementation of a fluorescence-based screening assay identifies histamine H3 receptor antagonists clobenpropit and iodophenpropit as subunit-selective N-methyl-D-aspartate receptor antagonists. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 333 (3), 650-662 (2010).
- Bettini, E., et al. Identification and characterization of novel NMDA receptor antagonists selective for NR2A- over NR2B-containing receptors. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335 (3), 636-644 (2010).
- Feuerbach, D., Loetscher, E., Neurdin, S., Koller, M. Comparative pharmacology of the human NMDA-receptor subtypes R1-2A, R1-2B, R1-2C and R1-2D using an inducible expression system. European Journal of Pharmacology. 637 (1-3), 46-54 (2010).
- Hansen, K. B., Brauner-Osborne, H., Egebjerg, J. Pharmacological characterization of ligands at recombinant NMDA receptor subtypes by electrophysiological recordings and intracellular calcium measurements. Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 11 (4), 304-315 (2008).
- Guo, H., et al. A NMDA-receptor calcium influx assay sensitive to stimulation by glutamate and glycine/D-serine. Scientific Reports. 7 (1), 11608 (2017).
- Hackos, D. H., et al. Positive Allosteric Modulators of GluN2A-Containing NMDARs with Distinct Modes of Action and Impacts on Circuit Function. Neuron. 89 (5), 983-999 (2016).
- Romero-Hernandez, A., Furukawa, H. Novel Mode of Antagonist Binding in NMDA Receptors Revealed by the Crystal Structure of the GluN1-GluN2A Ligand-Binding Domain Complexed to NVP-AAM077. Molecular Pharmacology. 92 (1), 22-29 (2017).
- Auberson, Y. P., et al. 5-Phosphonomethylquinoxalinediones as competitive NMDA receptor antagonists with a preference for the human 1A/2A, rather than 1A/2B receptor composition. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 12 (7), 1099-1102 (2002).
- Danysz, W., Parsons, C. G. Glycine and N-methyl-D-aspartate receptors: physiological significance and possible therapeutic applications. Pharmacological Reviews. 50 (4), 597-664 (1998).
- Liu, M. K., et al. Topoisomerase II Inhibitors Can Enhance Baculovirus-Mediated Gene Expression in Mammalian Cells through the DNA Damage Response. International Journal of Molecular Science. 17 (6), (2016).
