Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist es, das Studium der NMDA-Rezeptoren (NMDAR) in einem größeren Maßstab erleichtern und ermöglichen die Prüfung der modulierende Effekte von kleinen Molekülen und deren therapeutische Anwendungen.
Abstract
N-Methyl-D-Aspartat-(NMDA)-Rezeptoren (NMDAR) gelten als Ionotropic Glutamat-Rezeptoren und haben entscheidende Rollen in lernen und Gedächtnis. NMDAR Störung, ausgedrückt als entweder über - oder unter - activity verursacht durch Mutationen, veränderten Ausdruck, Menschenhandel oder Lokalisierung, kann zahlreiche Krankheiten, insbesondere in das zentrale Nervensystem beitragen. Daher unbedingt Verständnis der Rezeptor Biologie sowie zur Erleichterung der Entdeckung von Verbindungen und kleine Moleküle in laufenden Bemühungen zur Bekämpfung von neurologischer Erkrankungen. Aktuelle Ansätze zur Untersuchung des Rezeptors haben Beschränkungen, einschließlich niedriger Durchsatz, hohen Kosten und der Unfähigkeit, seine funktionellen Fähigkeiten durch die notwendige Anwesenheit von Kalziumkanalblocker NMDAR-vermittelten Excitotoxizität verhindern zu studieren. Darüber hinaus die bestehenden Assay-Systeme sind empfindlich auf die Stimulation durch Glutamat nur und Empfindlichkeit auf Anregung von Glycin, die andere Co Liganden der NMDAR fehlt. Hier präsentieren wir die erste Platte-basierte Assay mit hohem Durchsatz macht einen NMDA-Rezeptor mit Sensibilität für Co-Liganden, Glutamat sowohl D-Serin/Glycin zu studieren. Dieser Ansatz ermöglicht die Untersuchung der verschiedenen NMDAR Untereinheit Kompositionen und funktionelle Studien des Rezeptors in Glycin und/oder Glutamat-sensitiven Modi ermöglicht. Darüber hinaus erfordert die Methode nicht die Anwesenheit von Inhibitoren während der Messung. Die Auswirkungen der positive und negative allosterische Modulatoren können mit diesem Test erkannt werden und die bekannten Pharmakologie des NMDAR in unserem System repliziert wurden. Diese Technik überwindet die Grenzen der bestehenden Methoden und ist kostengünstig. Wir glauben, dass diese neuartige Technik die Entdeckung von Therapien für NMDAR-vermittelten Erkrankungen beschleunigen wird.
Introduction
Mit den aktuellen Fortschritten in der Medizin hat die Lebenserwartung deutlich zugenommen; Allerdings hat also die Prävalenz der altersbedingten Erkrankungen. Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS) wie Amyotrophe Lateralsklerose (ALS), Schizophrenie, Alzheimer-Krankheit und Parkinson-Krankheit, unter anderem sind da keine Ausnahme und haben voraussichtlich in den nächsten zehn Jahren1, zu erhöhen 2 , 3. die Fehlfunktion von Ionotropic Glutamat-Rezeptoren bekannt als N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptoren (NMDAR), Alzheimer-Krankheit, Schizophrenie, Schädel-Hirn-Verletzungen, Schlaganfall, Diabetes und Glaukom u.a. die Optionsscheine verknüpft wurde die Ihre Biologie für die Entwicklung von wirksamen, krankheitsmodifizierende Therapien4,5,6,7studieren müssen.
NMDARs bestehen aus vier Monomeren oder Untereinheiten4,8,9. Das Strukturbild der NMDAR zeigt Entwicklungs- und regionale Streuung innerhalb der Gehirn-7,-10. NMDARs engagieren sich in Synaptische Plastizität, Kognition und die Generation der Rhythmen für Atmung und Fortbewegung11,12,13. Als Voltage-gated-Kanal, es ist weitgehend nicht leitend bei ruhenden Membranpotential (-70 mV) und wird durch Magnesium zur Verhinderung weiterer Permeation von Ionen blockiert. Der Kanal wird durch die Bindung von zwei Liganden, Glutamat und Glycin/D-Serin aktiviert, und eine gleichzeitige Depolarisation an der synaptischen Membran durch AMPA-Rezeptoren, eine andere Unterklasse von Ionotropic Glutamat-Rezeptoren vermittelt. Die Depolarisation entfernt die Magnesium-Blockade der NMDAR, so dass des Zustroms von Kationen, insbesondere Kalzium14,15,16. Obwohl die Aktivierung von NMDAR essentiell für das Überleben der Zelle ist, kann übermäßige Aktivierung zu Tod17,18,19 bis Excitotoxizität Zelle führen. Dies macht neben der komplexen Natur des Rezeptors, es schwierig durchzuführenden Studien notwendig für die Entwicklung wirksamer Therapien.
Verschiedene Methoden wurden entwickelt, um die NMDAR zu studieren. Allerdings hat jeweils begleitenden Einschränkungen. Beispielsweise ist eine weit verbreitete Technik eine Fluoreszenz basierende Assays, die NMDAR-vermittelte Änderungen in intrazellulären Calcium in eine stabile Zelllinie unter der Kontrolle eines Tetracyclin-induzierbaren Promotors (Tet-On)20misst. Jedoch in diesem System macht supramaximalen Konzentrationen von Liganden, die benötigt werden und die Anforderung, dass NMDAR Inhibitoren vorhanden während der Messung sind es nahezu unmöglich, Aktivität der kompetitiver Antagonist zu erkennen. In anderen ähnlichen Systemen verursacht der Ausdruck des funktionalen Rezeptors Toxizität, erfordern-Antagonisten wie Ketamin21,22 , die Zellkulturen zu bewahren. Diese Kanalblocker das Herzstück des Rezeptors sitzen und sind schwierig zu waschen, vor allem in einem Teller-basierte Format, damit sie funktionellen Studien des Rezeptors beeinträchtigt. Zu guter Letzt in elektrophysiologische Messungen wie Patch spannen, gibt es begrenzter Durchsatz, und groß angelegte Studien sind sehr teuer23. Dennoch sind die oben genannten Systeme unempfindlich gegen Glycin Stimulation; Daher wird das Studium Glycin-abhängige Aktivität von der NMDAR eine Herausforderung.
Hier beschreiben wir einen neuartigen Ansatz für das Studium NMDAR, die die besprochenen Grenzen überwindet. Unsere Technik nutzt Baculovirus Expressionssystems Rezeptor auf Funktionsebenen mit optimalem Verhältnis der Untereinheiten in weniger als 16 Stunden zum Ausdruck zu bringen. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von Baculovirus für einen einfachen und kombinatorische Ansatz, wonach eine breite Charakterisierung der verschiedenen rekombinanten NMDAR Untertypen. Im Gegensatz zu anderen Assays erfordert dieses Protokoll nicht-Kanal-Blocker wegen des Einsatzes von schwachen Antagonisten. Stärkste Vorteil der Methode ist, dass nach dem Auswaschen des schwachen Antagonisten, der Rezeptor reagiert empfindlich auf Modulation der einzelnen Glycin - und Glutamat-Bindungsstellen neben duale Modulation von Glycin/D-Serin und Glutamat Ligand-Bindung Seiten. Der Assay rekapituliert bekannten Pharmakologie des NMDAR-Rezeptors und die Auswirkungen seiner bekannten positiven und negativen Modulatoren. Zu guter Letzt Generation von in-vitro- zelluläre Assays überwindet die zelluläre Toxizität verursacht durch übermäßigen Kalzium Zustrom und ermöglicht funktionelle Studien des Rezeptors in einer Hochdurchsatz-Mode, die Entdeckungen der NMDAR Modulatoren beschleunigen können bei Krankheitszuständen.
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Protocol
1. Vorbereitung der Zellen
Hinweis: Dieses Protokoll, einschließlich der Datengenerierung, verwendet HEK293 Zellen mit einem Baculovirus Codierung NR1 und NR2A Zellen ausgestrahlt.
- Die entsprechende Anzahl an HEK293 Zellen Saatgut und NR1 und/oder NR2A Virus am entsprechenden Endkonzentrationen (1,00 µL) hinzufügen. Verwenden Sie für ein 384-Well-Platte 10.000 Zellen/Brunnen in einem Endvolumen von 30 µL.
- Alternativ HEK293-NR1-NR2A Samenzellen über die entsprechende Zellenzahl und Volumen (für ein 384-Well-Platte, Verwendung 10.000 Zellen/Brunnen in einem Endvolumen von 30 µL). Tetracyclin in einer Konzentration von 2 µg/mL zu induzieren NR2A Ausdruck und fügen Sie den zusammengesetzten Schutz hinzufügen (100 µM MDL105, 519 oder 5 µM CGP07066724).
- Hinweis: Das Baculovirus Codierung NR1 und NR2 sollte eine ungefähre Titer zwischen 5 x 10-9 - 10 x 109 infektiösen Einheiten pro Milliliter24haben.
2. Messung der NMDA-Rezeptor-Aktivität
- Bereiten Sie eine 384-Well-Platte mit HEK293 Zellen mit NR1/NR2 oder HEK293-NR1-NR2A Zellen in Anwesenheit von entweder schützende Verbindung ausgestrahlt. Verwenden Sie eine klare Boden, schwarzer Rahmen, Poly-D-Lysin beschichtete Platte.
Hinweis: Schutz mit 100 µM MDL105, 519 wird verwendet, um die Empfindlichkeit zu Glycin, während 5 µM verleihen CGP070667 wird verwendet, um die Empfindlichkeit gegenüber Glutamat zu verleihen. - 16 Stunden (über Nacht) inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C und 5 % CO2 .
- Entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und entsorgen Sie sanft die Zelle Medien durch die Verlangsamung, spiegeln die Platte über eine kompatible Bioabfälle Container. Tippen Sie die Platte auf ein Papiertuch zu reinigen die Medien Kanten der Platte und entwässern alle übrigen Medien vorsichtig an.
- Bereiten Sie den calcium6-Farbstoff durch Gefäss-eine Phiole mit calcium6 Farbstoff (1 Plattengröße) in 10 mL Inkubation Puffer (HBSS pH 7.5, 20 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 1 mM Probenecid). 2 Stunden bei 37 ° C und 5 % CO2inkubieren Sie Platte.
- Entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und lassen Sie die Zellen, die für 10 Minuten auf Raumtemperatur anpassen.
- Gießen Sie vorsichtig, des calcium6-Farbstoffes, wie unter Punkt 2.3 beschrieben und 30 µL testpuffer (HBSS pH 7.5, 20 mM HEPES, 1,8 mM CaCl2, 1 mM Probenecid).
- Wiederholen Sie Schritt 2.6 zweimal für eine Gesamtmenge von 3 Wäschen. Lassen Sie 30 µL testpuffer auf die Zellen nach dem letzten waschen.
- Lassen Sie die Zellen für 5 Minuten bei Raumtemperatur ruhen.
- Bereiten Sie die Liganden-Platte machen ein 4-fold Lager von 400 µM Glycin und 400 µM Glutamat (Endkonzentration von 100 µM; optimale Konzentration des Liganden ermittelt werden, wie unten beschrieben). Übertragen Sie ein Minimum von 25 µL des Liganden bestand in einem V-Boden-384-Well-Platte.
- Laden Sie die Liganden Platte und Zellplatte in FDSS (funktionelle Drug Screening-System).
- Die Baseline-Fluoreszenz (Fo) der Zellplatte für 30 Sekunden zu messen. Übertragen Sie 10 µL der Liganden bestand in der Zellplatte mit FDSS Abgabe Funktion und Maßnahme der Kalzium-Fluss durch die Aufnahme calcium6-Farbstoff Fluoreszenz für 5 Minuten.
- Berechnen Sie die maximale Fluoreszenz-Verhältnis dividiert die maximale Fluoreszenz durch die Basislinie Fluoreszenz (Fmax/fo) gewonnen.
(3) Optimierung der NMDAR Ausdruck Niveaus
- Um die optimale Menge an Baculovirus nutzen zu ermitteln, führen Sie eine Titrierung NR1 und NR2A Viren. Bereiten Sie eine 384-Well-Platte mit HEK293 Zellen (Empfehlung von 10.000 Zellen/gut, 30 µL der Medien) und umfassen Sie die Schutz-Verbindungen, wie unter Punkt 2.1 beschrieben.
- Fügen Sie unterschiedliche Mengen des Virus NR1 in verschiedenen Reihen der Platte (zum Beispiel: Fügen Sie 0 µL, 2 µL, 1 µL, 0,5 µL 0.25 µL bzw. in den Reihen A-E). Fügen Sie Duplikate für Korrektheit der Daten.
- Fügen Sie unterschiedliche Mengen an das NR2A-Virus in verschiedenen Spalten der Platte (zum Beispiel: Fügen Sie 0 µL, 2 µL, 1 µL, 0,5 µL 0.25 µL bzw. in den Reihen A-E). Fügen Sie Duplikate für Korrektheit der Daten.
- 16 Stunden (über Nacht) inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C und 5 % CO2 .
- Bestimmen Sie die optimale Verhältnis und die Höhe der NR1 und NR2A Viren durch Ausführen einer Kalzium-flussmessung FDSS (siehe oben).
(4) Liganden Titration
- Bereiten Sie die Zellen, wie unter Punkt 2.3 beschrieben.
- Bereiten Sie Verdünnungen von jeder Ligand in Anwesenheit von Sättigung Konzentrationen (100 µM vor) des anderen Liganden als eine 4-fold Stammlösung. Zum Beispiel: für eine 10 µM Abschlusstest Konzentration von Glycin, bereiten Sie eine 40 µM-Stammlösung von Glycin einschließlich 400 µM Glutamat.
- Fahren Sie mit der Messung von FDSS wie in Schritt 2.11 beschrieben.
5. Verbindung testen
- Bereiten Sie die Zellen, wie in Schritt 1 beschrieben.
- Bereiten Sie die Liganden-Platte mit einem 5-fold bestand der endgültigen Liganden-Konzentration in der Assay-Puffer.
- Bereiten Sie die Verbindungen-Platte mit dem 4-fold bestand der gewünschten Endkonzentration von Verbindungen in der Assay-Puffer. Bereiten Sie eine zusammengesetzte Endkonzentration von 10 µM in der Assay-Puffer eine Stammlösung 40 µM.
- Halten Sie die Konzentration von Dimethyl Sulfoxid (DMSO) konstant über alle Proben durch die Vorbereitung einer Vorverdünnung der Verbindung in DMSO vor weiteren Verdünnung in den Assay-Puffer.
- Bereiten Sie für eine Dosis-Antwort der Verbindung in der letzten Probe zwischen 3 und 30 µM eine Vorverdünnung der Verbindung im Bereich von 1 bis 10 mM DMSO. In der Assay-Puffer, die 4-fold Lager Konzentration zu verdünnen. Die Endkonzentration der DMSO sollte 0,5 % nicht überschreiten.
Hinweis: Es wird empfohlen, jede Probe in Triplicates zu testen.
- Laden Sie die Liganden, die Verbindung und die Zellplatte in FDSS.
- Messen Sie die Grundlinie Fluoreszenz für 30 Sekunden.
- Fügen Sie 10 µL des zusammengesetzten Materials und Messung der Fluoreszenz für 5 Minuten.
- Fügen Sie 10 µL des Liganden Lager und Messung der Fluoreszenz für 5 Minuten.
- Das Integral der Fluoreszenz-Verhältnis durch die Berechnung der Fläche unter der Kurve der fluoreszierenden Verhältnisse während der letzten 5 Minuten der Messung zu bestimmen.
Hinweis: Alternativ kann das maximale Verhältnis der Fluoreszenz nach Ligand Zugabe für die Analyse verwendet werden.
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Representative Results
Vor der Prüfung der Auswirkungen von kleinen Molekülen, muss die optimalen Ausdruck Ebenen des NMDARs sowie die optimale Liganden-Konzentrationen festgestellt werden. Wie beschrieben, HEK293 Zellen bei 10.000 Zellen pro Bohrloch in einem 384-Well-Platte ausgesät wurden, in Anwesenheit von 5 µM CGP060667, dann ausgestrahlt mit unterschiedlichen Mengen von NR1 und NR2A Viren. Nach Inkubation über Nacht, Liganden-induzierte Kalzium Flussmittel gemessen wurde (Abbildung 1). Die Ergebnisse dieser Experimente zeigen die beste Menge und Verhältnis der Virus für jede Untereinheit (Abbildung 1, gelber Kasten) zu verwenden.
Sobald die optimale Menge und das Verhältnis für die Transduktion mit NR1 und NR2A festgestellt wurden, wurde ein Ligand Titration durchgeführt, um die optimalen Liganden-Konzentration für die Aktivierung des NMDARs zu bestimmen. Um dies zu erreichen, einer der Co-Liganden wurde hinzugefügt in unterschiedlichen Konzentrationen an behoben, sättigen Konzentrationen des anderen Co Liganden (Abbildung 2A-2 b). Ähnliche Ergebnisse wurden für andere Untereinheit Kombinationen von NMDAR wie NR1/NR2B und NR1/NR2D (Abbildung 2), zeigt der Test Anwendbarkeit auf anderen NMDAR Familienmitglieder24. Nach der Bestimmung der optimalen Ausdruck Niveaus und Liganden-Konzentration, kann man Vorgehen mit Prüfung der Auswirkungen der NMDAR-Modulatoren in der Probe.
In Übereinstimmung mit veröffentlichten Berichten, erste Platte basierende Assays, NMDARs mit Sensibilität für Glycin und Glutamat in großem Maßstab zu studieren reproduziert Daten über die bekannten Eigenschaften der NMDAR14,25,26. Hier verwenden wir die Aktivität der beiden Verbindungen [(R)-[(S)-1-(4-bromophenyl)-ethylamino]-(2,3-dioxo-1,2,3,4-tetrahydroquinoxalin-5-yl)-methyl]-phosphonic Säure (NVP-AAM077), eine Glutamat-Website-Antagonist und [7-Chlor-4-hydroxy-3-(3-phenoxy) Phenyl-2 (H) CHINOLON] (L701, 324), ein Glycin Website Antagonist zu veranschaulichen die vorhergesagten Werte der Assay27,28 (Abbildung 3). Zu guter Letzt wurde jede Verbindung an die EC80 des jeweiligen natürlichen Liganden der Bindungsstelle getestet. Reduzierung der Liganden-Konzentration wird voraussichtlich erhöhen die Potenz des Antagonisten, während es keinen Einfluss auf die Wirksamkeit von nicht-kompetitiver Hemmer oder Pore-Blocker haben soll.
Abbildung 1: Titration von Untereinheiten NR1 und NR2A. Unterschiedliche Volumina des Virus, die kodieren NMDAR Untereinheiten NR1 und NR2A wurden zur Bestimmung der Menge benötigt für optimale funktionelle Aktivität des Rezeptors titriert. Eine Verhältnis von 1:1 (V/V) NR1:NR2A wurde als das optimale Verhältnis mit 1 µL jeder (gelbe Box) beobachtet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Liganden Titration. A. in einer festen Konzentration von Glycin (100 µM) unterschiedlichen Glutamat Konzentrationen wurden titriert und Kalzium Flussmittel aufgenommen wurde. Fehlerbalken darzustellen Standardabweichung. B. Glutamat blieb bei einer Konzentration von 100 µM und war gegen verschiedene Konzentrationen von D-Serin und Glycin titriert, und Kalzium Flussmittel wurde gemessen. Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen den Kalzium-Fluss in Glycin und D-Serin gefunden. Fehlerbalken darzustellen Standardabweichung. C. Zellen mit NR1 und NR2D Baculovirus ausgestrahlt wurden angeregt, mit entweder 100 µM Glutamat und unterschiedlichen Konzentrationen von D-Serin oder 100 µM D-Serin und unterschiedlichen Konzentrationen von Glutamat und Kalzium Flussmittel wurde gemessen. Fehlerbalken darzustellen Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Charakterisierung Aktivität des Liganden Bindung Website Antagonisten. Mit Hilfe der vorgegebenen optimalen Liganden und Untereinheit Ausdrücke, die Auswirkungen von einem Glutamat-Bindungsstelle Antagonisten NVP-AAM077 und ein Glycin-Bindung-Website-Antagonist, L701, 324 durch die Kalzium-Flux-Test für NR1/NR2A zu den o.g. zeichneten sich Konzentrationen. Eine Konzentration der EC80 gleich von Glycin oder Glutamat in Anwesenheit der Sättigung Konzentration (100 µM) des anderen Liganden diente nach Zugabe von NVP-AAM077 und L701, 324. Fehlerbalken darzustellen Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Der Erfolg dieser Assay hängt die Gesundheit der HEK Zellen verwendet. Zellen, exponentielles Wachstum erlebt und mit niedrigen Passagenanzahl sollte verwendet werden. Dieser Test beinhaltet viele Transfers und Ergänzungen von Lösungen, also mit Vorsicht sorgt für höhere Genauigkeit des Ergebnisses. Konzentrationen von Verbindungen und alle anderen Reagenzien sollten auch abgeglichen, Fehler zu minimieren. Beim Austausch der Zelle Medien mit dem Assay-Puffer für die Kalzium-Flux-Assay sollte die Platte vorsichtig gekippt werden, damit die Zellen nicht trennen. Schließlich erhöht die Verwendung von Poly-D-Lysin beschichteten Platten in diesem Protokoll Anlage der Zellen auf den Teller.
Möglicherweise gibt es Unterschiede bei NMDAR Ausdruck und der Virusmenge für Untereinheit Ausdruck je nach Passagenanzahl und Fitness der HEK293 Zellen zum Zeitpunkt der Transduktion benötigt. Auch hat das Baculovirus eine kurze Haltbarkeit von sechs Monate bis ein Jahr. Daher ist die Qualität des Virus ein wichtiger Parameter für diesen Test. Ein standard Immunfluoreszenz-Assay kann verwendet werden, zu erkennen und zu bestätigen, die Ausdruck Niveaus und Lokalisierung der NMDAR Einheiten vor weiteren Experimente24. Anderen Zelllinien können verwendet werden, um den NMDA-Rezeptor unter Verwendung dieses Protokolls zu studieren. Allerdings müssen die Toleranz und die Expression von NMDARs mit den Baculovirus bevor Sie mit dem Protokoll bestätigt werden; Andernfalls können unerwartete Ergebnisse auftreten. Darüber hinaus wurden Verbindungen wie Topoisomerase-II-Hemmer erhöhen die Wirksamkeit von Baculovirus Ausdruck29gemeldet. Diese Alternativen können getestet und entsprechend den Einstellungen des Benutzers optimiert werden.
Die Studie der biologischen Prozesse in einem Zelltyp unterscheidet sich von der ursprünglichen Zellentyp wirft Fragen innerhalb der wissenschaftlichen Gemeinschaft. Eine Einschränkung dieser Assay ist die Verwendung von Nieren-Zell-Linien (HEK 293) als Modellsystem den Ionotropic Glutamat-Rezeptor, NMDAR zu studieren. HEK Zellen wurden verwendet, da Sie ihre depolarisiert Membran depolarisiert Neuronen ähnelt. Darüber hinaus wird die Ähnlichkeit zwischen NMDARs im Gehirn und in unserem Modell durch unsere ergänzenden Studien bestätigt. Die Tätigkeit des positive allosterische Modulatoren wie Genentech-8324, negative Modulatoren wie Ifenprodil und -Antagonisten wie Ketamin, sowie die Spannung Abhängigkeit der NMDAR wurden in unserem Modell22,23 bestätigt ,24. Auch unsere Fähigkeit, die Menge des Virus für die Untereinheiten NR1 und NR2A justieren sorgt für optimale funktionelle Expression Ebenen.
Aufgrund der geringen Wirkungsgrad, hohe Kosten und minimalen Erfolg Ergebnis die Charakterisierung der einzelnen Rezeptoren und ihrer einzigartigen Pharmakologie werden derzeit in niedrigen Durchsatz manuellen Patch-Clamp-Assays22,23durchgeführt. Auf der anderen Seite bleibt Excitotoxizität ein großes Hindernis bei Verwendung stabil Zellen transfizierten, weil Überexpression des funktionalen NMDARs sind schädlich für die Zellen durch die Liganden (Glutamat und Glycin/D-Serin), die in den Medien18freigegeben werden. Als eine stärkere Alternative nutzt unsere Assay Baculovirus-vermittelten Ausdruck des funktionalen NMDARs die Excitotoxizität überwindet und liefert schnelle, titrierbare Ausdruck der Rezeptoren. Nicht nur durch die klebrige Art der Kalziumkanalblocker, nutzt dieser Assay auch Antagonisten des schwachen Liganden-Bindungsstellen. Diese Antagonisten konkurrieren mit endogenen Liganden in den Medien und schützen die Liganden-Bindungsstellen. Daher wird nach dem Auswaschen der Gegenspieler, Sensibilität für exogen hinzugefügt Liganden Glutamat und Glycin/D-Serin-Bindungsstellen wiederhergestellt.
Dieser Assay, kombiniert mit den jüngsten Fortschritten im Bereich der Molekularbiologie wie CRISPR, hilft Ziel und Charakterisierung neuartige Regulatoren der NMDAR Ausdruck und Funktion. Dieser Test hilft gleichzeitig, kleine Moleküle zu identifizieren, die direkt oder indirekt NMDAR Tätigkeit ohne die Notwendigkeit zu stabilen Zelllinien, wodurch Kompatibilität mit genetischen und kleine Molekül-basierte Bildschirme erzeugen modulieren kann.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte und nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren möchten den Post Baccalaureate Scholars Program Office und Novartis Institutes for BioMedical Research als Ganzes für die Finanzierung dieser Studie danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK-293 | ATCC | CRL-1573 | |
| Human NMDA (NR1/NR2A) Receptor Cell Line | ChanTest Corporation | CT6120 | |
| pFastBac Dual Expression Vector | ThermoFisher Scientific | 10712-024 | |
| Corning 384-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning Life Sciences | 3844 | |
| FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit | Molecular Devices | R8192 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | 49621 | |
| D-serine | Sigma-Aldrich | S4250 | |
| L701,324 | Tocris | 907 | |
| HEPES Buffer | Boston Bio Product | BB-103 | |
| Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | 63069 | |
| Calcium Chloride | VWR | E506 | |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14025-092 | |
| Probenecid | ThermoFisher Scientific | P36400 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX media | ThermoFisher Scientific | 10565018 | |
| MDL105,519 | NIBR | Synthesized in house | |
| NVP-AAM077 | NIBR | Synthesized in house | |
| CGP070667 | NIBR | Synthesized in house |
References
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