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Neuroscience

एक उच्च प्रवाह कैल्शियम-फ्लक्स परख मोर्फिन अध्ययन करने के लिए Glycine के लिए संवेदनशीलता के साथ रिसेप्टर्स/डी-serine और ग्लूटामेट

Published: July 10, 2018 doi: 10.3791/58160
Automatic Translation
1, 1, 1
1Chemical Biology and Therapeutics, Novartis Institutes for BioMedical Research

Summary

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एक बड़े पैमाने पर मोर्फिन रिसेप्टर्स (NMDAR) के अध्ययन की सुविधा और छोटे अणुओं और उनके चिकित्सीय अनुप्रयोगों के modulatory प्रभाव की परीक्षा की अनुमति है.

Abstract

N-मिथाइल-D-aspartate (मोर्फिन) रिसेप्टर्स (NMDAR) ionotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर्स के रूप में वर्गीकृत किया जाता है और सीखने और स्मृति में महत्वपूर्ण भूमिका है । NMDAR खराबी, या तो पर के रूप में व्यक्त की या के तहत उत्परिवर्तनों की वजह से गतिविधि, बदल अभिव्यक्ति, तस्करी, या स्थानीयकरण, कई रोगों के लिए योगदान कर सकते हैं, विशेष रूप से केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में । इसलिए, रिसेप्टर के जीवविज्ञान को समझने के साथ ही यौगिकों और छोटे अणुओं की खोज को सुविधाजनक बनाने के लिए मस्तिष्क संबंधी रोगों का मुकाबला करने के लिए चल रहे प्रयासों में महत्वपूर्ण है. इस रिसेप्टर का अध्ययन करने के लिए वर्तमान दृष्टिकोण कम प्रवाह, उच्च लागत सहित सीमाओं है, और NMDAR-मध्यस्थता excitotoxicity को रोकने के लिए चैनल ब्लॉकर्स की आवश्यक उपस्थिति के कारण अपनी कार्यात्मक क्षमताओं का अध्ययन करने में असमर्थता. इसके अतिरिक्त, मौजूदा परख प्रणालियों ग्लूटामेट केवल और कमी glycine द्वारा उत्तेजना के लिए संवेदनशीलता के प्रति संवेदनशील हैं, अंय सह NMDAR के ligand । यहां, हम दोनों को सह लाइगैंडों, ग्लूटामेट और डी serine/glycine के लिए संवेदनशीलता के साथ एक मोर्फिन रिसेप्टर का अध्ययन करने के लिए उच्च प्रवाह शक्ति के साथ पहली थाली आधारित परख प्रस्तुत करते हैं । इस दृष्टिकोण अलग NMDAR उपइकाई रचनाओं के अध्ययन की अनुमति देता है और glycine में रिसेप्टर के कार्यात्मक अध्ययन की अनुमति देता है-और/या ग्लूटामेट-संवेदी मोड । इसके अतिरिक्त, विधि माप के दौरान अवरोधकों की उपस्थिति की आवश्यकता नहीं है । सकारात्मक और नकारात्मक allosteric मॉडुलन के प्रभाव इस परख के साथ पता लगाया जा सकता है और NMDAR के ज्ञात औषध विज्ञान हमारे सिस्टम में दोहराया गया है. इस तकनीक मौजूदा तरीकों की सीमाओं पर काबू पाता है और लागत प्रभावी है । हमें विश्वास है कि इस उपंयास तकनीक NMDAR-मध्यस्थता विकृतियों के लिए चिकित्सा की खोज में तेजी लाने जाएगा ।

Introduction

चिकित्सा में वर्तमान अग्रिमों के साथ, जीवन प्रत्याशा में काफी वृद्धि हुई है; हालांकि, इसलिए उम्र से संबंधित रोगों की व्यापकता है । केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के रोग जैसे एक प्रकार का पागलपन के रूप में, पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस (ALS), अल्जाइमर रोग, और पार्किंसंस रोग, दूसरों के बीच, कोई अपवाद नहीं हैं और अगले1दशक से अधिक वृद्धि करने के लिए पेश किया गया है, 2 , 3. N-मिथाइल-D-aspartate रिसेप्टर्स (NMDAR) के रूप में जाना ionotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर्स की खराबी अल्जाइमर रोग, एक प्रकार का पागलपन, दर्दनाक मस्तिष्क चोट, स्ट्रोक, मधुमेह, और मोतियाबिंद दूसरों के बीच में जोड़ा गया है, जो वारंट के विकास के लिए अपने जीव विज्ञान का अध्ययन करने की आवश्यकता प्रभावी, रोग संशोधित चिकित्सा4,5,6,7.

NMDARs चार मोनोमर या उपइकाईयों4,8,9से बना रहे हैं । NMDAR की संरचनात्मक रचना मस्तिष्क7,10के भीतर विकासात्मक और क्षेत्रीय परिवर्तनशीलता से पता चलता है । NMDARs synaptic प्लास्टिक, अनुभूति, और श्वास और गतिवान11,12,13के लिए लय की पीढ़ी में शामिल हैं । एक वोल्टेज-gated चैनल के रूप में, यह काफी हद तक गैर आराम झिल्ली क्षमता पर आयोजित है (-७० एमवी) और मैग्नीशियम द्वारा अवरुद्ध है आयनों के आगे permeation को रोकने के । चैनल दो लाइगैंडों, ग्लूटामेट और glycine/डी-serine, और AMPA रिसेप्टर्स, ionotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर्स के एक अन्य उपवर्ग द्वारा मध्यस्थता synaptic झिल्ली पर एक साथ ध्रुवीकरण के बंधन से सक्रिय है । ध्रुवीकरण NMDAR की मैग्नीशियम रुकावट को हटा, cations की आमद को सक्षम करने, विशेष रूप से कैल्शियम14,15,16। हालांकि NMDAR के सक्रियण सेल अस्तित्व के लिए आवश्यक है, अत्यधिक सक्रियण सेल मौत17,18,excitotoxicity के माध्यम से19 के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । यह, रिसेप्टर की जटिल प्रकृति के अलावा, यह प्रभावी चिकित्सा के विकास के लिए आवश्यक अध्ययन करने के लिए चुनौतीपूर्ण बनाता है.

NMDAR का अध्ययन करने के लिए अलग तरीके विकसित किए गए हैं । हालांकि, हर एक के साथ निरंतर है । उदाहरण के लिए, एक व्यापक रूप से इस्तेमाल तकनीक एक प्रतिदीप्ति आधारित परख है कि एक स्थिर सेल लाइन में एक टेट्रासाइक्लिन-inducible प्रमोटर (Tet-On)20के नियंत्रण के तहत intracellular कैल्शियम में NMDAR-मध्यस्थता परिवर्तन के उपाय है । हालांकि, इस प्रणाली में, लाइगैंडों की supramaximal सांद्रता कि जरूरत है और आवश्यकता है कि NMDAR अवरोधकों माप के दौरान मौजूद हैं यह लगभग असंभव प्रतिस्पर्धी विरोधी की गतिविधि का पता लगाने के लिए बनाता है. अंय इसी तरह की प्रणालियों में, कार्यात्मक रिसेप्टर की अभिव्यक्ति विषाक्तता का कारण बनता है, चैनल ब्लॉकर्स जैसे ketamine21,22 सेल संस्कृतियों के संरक्षण के लिए की आवश्यकता होती है । ये चैनल ब्लॉकर्स रिसेप्टर के कोर पर बैठते हैं और बाहर धोने के लिए मुश्किल हैं, विशेष रूप से एक थाली में आधारित प्रारूप, तो वे रिसेप्टर के कार्यात्मक अध्ययन के साथ हस्तक्षेप. अंत में, इस तरह के पैच clamping के रूप में electrophysiological माप में, सीमित प्रवाह है, और बड़े पैमाने पर अध्ययन बहुत महंगे हैं23. इसके बावजूद, उपर्युक्त प्रणालियां glycine उत्तेजना के प्रति असंवेदनशील हैं; इसलिए, NMDAR के glycine निर्भर गतिविधि का अध्ययन एक चुनौती बन जाता है ।

यहां, हम अध्ययन NMDAR कि चर्चा की सीमाओं पर काबू के लिए एक उपंयास दृष्टिकोण का वर्णन । हमारी तकनीक baculovirus अभिव्यक्ति प्रणाली पर मूल के रूप में छोटे रूप में 16 घंटे में उपइकाईयों का एक इष्टतम अनुपात के साथ कार्यात्मक स्तर पर रिसेप्टर व्यक्त करने के लिए कैपिटल्स । इसके अलावा, baculovirus का उपयोग एक सरल और मिश्रित दृष्टिकोण है, जो विशिष्ट रिकॉमबिनेंट NMDAR उपप्रकार का एक व्यापक लक्षण वर्णन प्रदान करता है के लिए अनुमति देता है । अंय परख के विपरीत, इस प्रोटोकॉल क्योंकि कमजोर विरोधी के उपयोग के चैनल ब्लॉकर्स की आवश्यकता नहीं है । विधि का सबसे मजबूत लाभ यह है कि कमजोर प्रतिपक्षी के वॉशआउट के बाद, रिसेप्टर दोनों glycine/डी-serine और ग्लूटामेट ligand-बाइंडिंग के दोहरे मॉडुलन के अलावा व्यक्तिगत glycine-और ग्लूटामेट-बाध्यकारी साइटों के मॉडुलन के प्रति संवेदनशील है साइटों. परख recapitulates NMDAR रिसेप्टर और इसके ज्ञात सकारात्मक और नकारात्मक मॉडुलन के प्रभाव के औषध विज्ञान जाना जाता है । अंत में, इन विट्रो में इस की पीढ़ी सेलुलर परख अत्यधिक कैल्शियम आमद की वजह से सेलुलर विषाक्तता पर काबू पाता है और एक उच्च प्रवाह फैशन में रिसेप्टर के कार्यात्मक अध्ययन के लिए अनुमति देता है, जो NMDAR मॉडुलन की खोजों को तेज कर सकते हैं रोग राज्यों में ।

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Protocol

1. कोशिकाओं की तैयारी

नोट: यह प्रोटोकॉल, जिसमें डेटा जनरेशन शामिल है, baculovirus एंकोडिंग NR1 और NR2A कक्षों के साथ transduced HEK293 कक्षों का उपयोग करता है ।

  1. HEK293 कोशिकाओं की उचित संख्या बीज और उपयुक्त अंतिम सांद्रता (१.०० µ l प्रत्येक) पर NR1 और/या NR2A वायरस जोड़ें । एक ३८४-अच्छी प्लेट के लिए, 30 µ एल की एक अंतिम मात्रा में १०,००० कोशिकाओं का उपयोग/
  2. वैकल्पिक रूप से, बीज HEK293-NR1-NR2A कोशिकाओं पर उचित कोशिका संख्या और मात्रा (एक ३८४-well प्लेट के लिए, का उपयोग १०,००० कोशिकाओं/अच्छी तरह से एक अंतिम मात्रा में 30 µ l). NR2A अभिव्यक्ति प्रेरित और संरक्षण यौगिक जोड़ने के लिए 2 µ g/mL की एकाग्रता पर टेट्रासाइक्लिन जोड़ें (१०० µ m MDL105, 519 या 5 µ m CGP07066724) ।
  3. नोट: baculovirus एन्कोडिंग NR1 और NR2 के बीच अनुमानित titer होना चाहिए 5 x 109 -10 x 109 milliliter प्रति संक्रामक इकाई24.

2. मोर्फिन-रिसेप्टर गतिविधि का मापन

  1. या तो सुरक्षात्मक यौगिक की उपस्थिति में NR1/NR2 या HEK293-NR1-NR2A कोशिकाओं के साथ transduced HEK293 कोशिकाओं के साथ एक ३८४-अच्छी प्लेट तैयार करें । एक स्पष्ट नीचे, काले फ्रेम, पाली-डी-lysine लेपित प्लेट का प्रयोग करें ।
    नोट: १०० के साथ संरक्षण µ एम MDL105, 519 glycine के लिए संवेदनशीलता प्रदान करने के लिए प्रयोग किया जाता है, जबकि 5 µ एम CGP070667 ग्लूटामेट के लिए संवेदनशीलता प्रदान करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
  2. ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह 16 घंटे (रात) के लिए2 पर थाली मशीन ।
  3. मशीन से प्लेट निकालें और धीरे से एक सुसंगत अपशिष्ट कंटेनर पर प्लेट flipping धीमा द्वारा सेल मीडिया त्यागें । धीरे प्लेट के किनारों से मीडिया को साफ करने के लिए एक कागज तौलिया पर थाली नल और किसी भी शेष मीडिया नाली ।
  4. calcium6-डाई तैयार (HBSS पीएच ७.५, 20 मिमी HEPES, 1 मिमी MgCl2, 1 मिमी प्रोबेनेसिड) के 10 मिलीलीटर में calcium6 डाई (1 प्लेट आकार) की एक शीशी solubilizing द्वारा । ३७ ° c और 5% सह2पर 2 घंटे के लिए थाली मशीन ।
  5. मशीन से प्लेट निकालें और कोशिकाओं को 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान को समायोजित करते हैं ।
  6. धीरे से बाहर डालो calcium6-डाई के रूप में २.३ कदम में वर्णित है और 30 परख बफर के µ एल जोड़ने (HBSS पीएच ७.५, 20 मिमी HEPES, १.८ mm CaCl2, 1 मिमी प्रोबेनेसिड) ।
  7. दोहराएं चरण २.६ के लिए दो बार एक कुल 3 बहाकर । पिछले धोने के बाद कोशिकाओं पर परख बफर के 30 µ एल छोड़ दें ।
  8. कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए आराम करते हैं ।
  9. ४०० µ m glycine और ४०० µ m ग्लूटामेट का 4 गुना स्टॉक बनाकर ligand प्लेट तैयार करें (१०० µ m का अंतिम एकाग्रता; नीचे बताए अनुसार निर्धारित किया जाने वाला लाइगैंडों का इष्टतम एकाग्रता) । एक V-नीचे ३८४-अच्छी तरह से थाली में ligand स्टॉक के 25 µ एल की एक ंयूनतम स्थानांतरण ।
  10. FDSS (कार्यात्मक दवा स्क्रीनिंग सिस्टम) में ligand प्लेट और सेल प्लेट लोड करें ।
  11. 30 सेकंड के लिए सेल प्लेट के आधारभूत प्रतिदीप्ति (Fo) को मापने । ligand शेयर के 10 µ एल स्थानांतरण सेल प्लेट में FDSS वितरण समारोह का उपयोग और 5 मिनट के लिए calcium6-डाई प्रतिदीप्ति रिकॉर्डिंग द्वारा कैल्शियम फ्लक्स उपाय ।
  12. आधारभूत प्रतिदीप्ति (Fmax/o) द्वारा प्राप्त अधिक से अधिक प्रतिदीप्ति को विभाजित करके अधिक से अधिक प्रतिदीप्ति अनुपात की गणना करें ।

3. NMDAR अभिव्यक्ति के स्तर का अनुकूलन

  1. उपयोग करने के लिए baculovirus की इष्टतम मात्रा निर्धारित करने के लिए, NR1 और NR2A दोनों वायरस का एक अनुमापन प्रदर्शन । HEK293 कक्षों के साथ एक ३८४-well प्लेट तैयार करें (१०,००० कक्षों की अनुशंसा/well, मीडिया के 30 µ l) और चरण २.१ में वर्णित के रूप में सुरक्षा यौगिकों शामिल करें ।
  2. प्लेट की विभिन्न पंक्तियों में NR1 वायरस की बदलती मात्रा जोड़ें (उदाहरण के लिए: 0 µ l, 2 µ l, 1 µ l, ०.५ µ l, ०.२५ µ l को पंक्तियों में एक-ए क्रमशः जोड़ें). डेटा सटीकता के लिए डुप्लिकेट जोड़ें ।
  3. प्लेट के विभिन्न स्तंभों में NR2A वायरस की बदलती मात्रा जोड़ें (उदाहरण के लिए: 0 µ l, 2 µ l, 1 µ l, ०.५ µ l, ०.२५ µ l को पंक्तियों में एक-ए क्रमशः जोड़ें). डेटा सटीकता के लिए डुप्लिकेट जोड़ें ।
  4. ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह 16 घंटे (रात) के लिए2 पर थाली मशीन ।
  5. FDSS पर एक कैल्शियम फ्लक्स माप प्रदर्शन द्वारा इष्टतम अनुपात और NR1 और NR2A वायरस की राशि का निर्धारण (ऊपर देखें) ।

4. Ligand अनुमापन

  1. चरण २.३ में बताए अनुसार कक्ष तैयार करें ।
  2. एक 4-गुना शेयर समाधान के रूप में अन्य ligand के संतृप्त सांद्रता (१०० µ m) की उपस्थिति में प्रत्येक ligand की कमजोरियां तैयार करें । उदाहरण के लिए: glycine के 10 µ m अंतिम परीक्षण एकाग्रता के लिए, ४०० µ m ग्लूटामेट सहित glycine के ४० µ m शेयर समाधान तैयार करें ।
  3. चरण २.११ में वर्णित के रूप में FDSS माप के साथ आगे बढ़ें ।

5. यौगिक परीक्षण

  1. चरण 1 में बताए अनुसार कक्ष तैयार करें ।
  2. एक 5-परख बफर में अंतिम ligand एकाग्रता के शेयर गुना के साथ ligand थाली तैयार करते हैं ।
  3. परख बफर में यौगिकों के वांछित अंतिम एकाग्रता के 4 गुना शेयर के साथ यौगिकों प्लेट तैयार करते हैं । परख बफर में 10 µ मीटर की एक अंतिम यौगिक एकाग्रता के लिए, एक ४० µ मीटर शेयर समाधान तैयार करते हैं ।
    1. dimethyl sulfoxide की एकाग्रता रखें (DMSO) लगातार एक पूर्व DMSO में यौगिक के कमजोर पड़ने की तैयारी द्वारा परख बफर में आगे कमजोर पड़ने से पहले सभी नमूनों भर में ।
    2. 3 और 30 µ एम के बीच लेकर अंतिम परख में यौगिक की एक खुराक प्रतिक्रिया के लिए, 1 से 10 मिमी से लेकर DMSO में यौगिक के एक पूर्व कमजोर पड़ने की तैयारी. 4 को परख बफर में उन पतला-शेयर एकाग्रता गुना । DMSO की अंतिम एकाग्रता ०.५% से अधिक नहीं होनी चाहिए ।
      नोट: यह triplicates में प्रत्येक नमूने का परीक्षण करने के लिए सिफारिश की है.
  4. FDSS में ligand, यौगिक, और सेल प्लेट लोड करें ।
  5. 30 सेकंड के लिए आधारभूत प्रतिदीप्ति को मापने ।
  6. यौगिक स्टॉक के 10 µ एल जोड़ें और 5 मिनट के लिए प्रतिदीप्ति को मापने ।
  7. ligand शेयर के 10 µ एल जोड़ें और 5 मिनट के लिए प्रतिदीप्ति को मापने ।
  8. माप के अंतिम 5 मिनट के दौरान फ्लोरोसेंट अनुपात के वक्र के तहत क्षेत्र की गणना करके प्रतिदीप्ति अनुपात का अभिंन अंग निर्धारित करें ।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, ligand अतिरिक्त के बाद प्रतिदीप्ति के अधिकतम अनुपात विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Representative Results

छोटे अणुओं के प्रभाव का परीक्षण करने से पहले, एक NMDARs के इष्टतम अभिव्यक्ति के स्तर के साथ ही इष्टतम ligand सांद्रता निर्धारित करना चाहिए । वर्णित के रूप में, HEK293 कोशिकाओं १०,००० कोशिकाओं में प्रति अच्छी तरह से एक ३८४ प्लेट में वरीयता प्राप्त थे, 5 µ एम CGP060667 की उपस्थिति में, तो transduced NR1 और NR2A वायरस की बदलती मात्रा के साथ । रात भर की मशीन के बाद, ligand-प्रेरित कैल्शियम प्रवाह मापा गया था (चित्रा 1) । इन प्रयोगों के परिणाम सबसे अच्छी मात्रा और वायरस के अनुपात प्रत्येक उपइकाई (चित्रा 1, पीला बॉक्स) के लिए उपयोग करने के लिए प्रकट होता है ।

एक बार इष्टतम मात्रा और NR1 और NR2A के साथ transduction के लिए अनुपात निर्धारित किया गया था, एक ligand अनुमापन ligand के सक्रियकरण के लिए इष्टतम NMDARs एकाग्रता निर्धारित करने के लिए किया गया था । यह पूरा करने के लिए, सह लाइगैंडों में से एक निश्चित पर अलग सांद्रता में जोड़ा गया था, अन्य सह की सांद्रता संतृप्ति-ligand (चित्रा 2a-बी). इसी तरह के परिणाम NR1/NR2B और NR1/NR2D (चित्र 2c), अंय NMDAR परिवार के सदस्यों को24के लिए है परख लागू प्रदर्शन के रूप में NMDAR के अंय उपइकाई संयोजन के लिए प्राप्त किए गए । इष्टतम अभिव्यक्ति का स्तर और ligand सांद्रता निर्धारित करने के बाद, एक परख में NMDAR-मॉडुलन के प्रभाव के परीक्षण के साथ आगे बढ़ना कर सकते हैं ।

प्रकाशित रिपोर्टों के अनुरूप, यह पहली थाली के लिए एक बड़े पैमाने पर दोनों glycine और ग्लूटामेट के लिए संवेदनशीलता के साथ NMDARs अध्ययन आधारित परख NMDAR14,25,26के ज्ञात गुणों पर डेटा reproduces । यहाँ, हम दो यौगिकों की गतिविधि का उपयोग करते हैं, [(R)-[(S)-1-(4-bromophenyl)-ethylamino]-(2, 3-dioxo-1, 2, 3, 4-tetrahydroquinoxalin-5-yl)-मिथाइल]-phosphonic अम्ल (NVP-AAM077), एक ग्लूटामेट स्थल विरोधी, और [7-क्लोरोफ्लूरोकार्बन-4-hydroxy-3-(3-phenoxy) फिनाइल-2 (एच) क्विनोलोन] (L701, 324), एक glycine साइट विरोधी, परख27,28 (चित्रा 3) के पूर्वानुमानित परिणामों को उदाहरण देना करने के लिए । अंत में, प्रत्येक यौगिक बाध्यकारी साइट के संबंधित प्राकृतिक ligand के EC80 में परीक्षण किया गया था । ligand सांद्रता की कमी विरोधी की शक्ति में वृद्धि की उंमीद है, जबकि यह गैर प्रतिस्पर्धी अवरोधकों या ताकना-ब्लॉकर्स की शक्ति पर कोई प्रभाव नहीं है की उंमीद है ।

Figure 1
चित्र 1: NR1 और NR2A उपइकाईयों का अनुमापन । वायरस के विभिंन संस्करणों है कि सांकेतिक शब्दों में बदलना NMDAR उपइकाईयों NR1 और NR2A रिसेप्टर के इष्टतम कार्यात्मक गतिविधि के लिए आवश्यक राशि निर्धारित करने के लिए titrated थे । एक 1:1 (v/v) अनुपात NR1: NR2A प्रत्येक (पीला बॉक्स) के 1 µ एल के साथ इष्टतम अनुपात के रूप में मनाया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: Ligand अनुमापन । a. glycine (१०० µ m) की एक निश्चित एकाग्रता में, अलग ग्लूटामेट सांद्रता titrated थे और कैल्शियम फ्लक्स रिकॉर्ड किया गया था । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । बी ग्लूटामेट १०० µ मीटर की एकाग्रता पर बने रहे और डी-serine और glycine के विभिंन सांद्रता के खिलाफ titrated था, और कैल्शियम प्रवाह मापा गया था । glycine में और डी-serine में कैल्शियम प्रवाह के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । C. NR1 और NR2D baculovirus के साथ transduced कक्षों को १०० µ m ग्लूटामेट और d-serine या १०० µ m d-serine की बदलती सांद्रता के साथ उत्तेजित किया गया था और ग्लूटामेट और कैल्शियम प्रवाह की बदलती सांद्रता को मापा गया था । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: ligand बंधन साइट प्रतिपक्षी की निस्र्पक गतिविधि । पूर्व निर्धारित इष्टतम ligand और उपइकाई के भाव का प्रयोग, एक ग्लूटामेट-बाध्यकारी साइट विरोधी, NVP-AAM077 के प्रभाव, और एक glycine-बाध्यकारी साइट विरोधी, L701, 324 NR1/NR2A के लिए कैल्शियम प्रवाह परख द्वारा संकेत पर विशेषता थे सांद्रता. अन्य ligand के संतृप्त एकाग्रता (१०० µ मीटर) की उपस्थिति में glycine या ग्लूटामेट की EC80 के बराबर एकाग्रता का उपयोग NVP-AAM077 और L701, 324, क्रमशः के अलावा किया गया था । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस परख की सफलता का इस्तेमाल HEK कोशिकाओं के स्वास्थ्य पर काफी हद तक निर्भर करता है । घातीय वृद्धि के दौर से गुजर कोशिकाओं और कम गद्यांश संख्या के साथ प्रयोग किया जाना चाहिए । इस परख कई स्थानांतरण और समाधान के परिवर्धन शामिल है, तो सावधानी का उपयोग कर अपने परिणामों में उच्च सटीकता सुनिश्चित करेगा । यौगिकों और अन्य सभी रिएजेंट की सांद्रता भी त्रुटियों को कम करने के लिए पार से जाँच की जानी चाहिए. जब कैल्शियम फ्लक्स परख के लिए परख बफर के साथ सेल मीडिया की जगह, थाली धीरे झुका दिया जाना चाहिए ताकि कोशिकाओं को अलग नहीं है । अंत में, इस प्रोटोकॉल में पाली-डी-lysine लेपित प्लेटों का उपयोग प्लेट के लिए कोशिकाओं के लगाव बढ़ जाती है ।

वहां NMDAR अभिव्यक्ति में मतभेद हो सकता है और मार्ग संख्या और transduction के समय HEK293 कोशिकाओं की फिटनेस के आधार पर उपइकाई अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक वायरस की मात्रा । साथ ही, baculovirus में छह महीने से लेकर एक साल तक शॉर्ट शेल्फ लाइफ होती है । इसलिए, वायरस की गुणवत्ता इस परख के लिए एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है । एक मानक इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख का पता लगाने और अभिव्यक्ति का स्तर और NMDAR इकाइयों के स्थानीयकरण आगे24प्रयोगों से पहले की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । अंय सेल लाइनों के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर मोर्फिन रिसेप्टर अध्ययन किया जा सकता है । हालांकि, सहिष्णुता और baculovirus का उपयोग कर NMDARs की अभिव्यक्ति प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ने से पहले की पुष्टि की जानी चाहिए; अंयथा, अनपेक्षित परिणाम हो सकते हैं । साथ ही, चतुर्थ तोपोइसोमेरसे द्वितीय अवरोधकों जैसे यौगिकों29baculovirus अभिव्यक्ति की प्रभावकारिता को बढ़ाने के लिए सूचित किया गया है । इन विकल्पों का परीक्षण किया जा सकता है और उपयोगकर्ता की वरीयताओं के अनुसार अनुकूलित ।

मूल कोशिका प्रकार से भिन्न कोशिका प्रकार में जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन वैज्ञानिक समुदाय के भीतर प्रश्न उठाता है. इस परख की कमी एक मॉडल प्रणाली के रूप में गुर्दे की कोशिका लाइनों (HEK २९३) का उपयोग करने के लिए ionotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर, NMDAR का अध्ययन है । HEK कोशिकाओं के कारण उनके ध्रुवीकरण झिल्ली की क्षमता है कि विश्लेषित ंयूरॉंस के समान के लिए इस्तेमाल किया गया । इसके अलावा, मस्तिष्क में NMDARs के बीच समानता और हमारे मॉडल में हमारे अनुपूरक अध्ययन द्वारा पुष्टि की है । ऐसे ्ेने के रूप में सकारात्मक allosteric मॉडुलन की गतिविधि-८३२४, ऐसे ifenprodil के रूप में नकारात्मक मॉडुलन, और ketamine के रूप में चैनल ब्लॉकर्स, साथ ही NMDAR की वोल्टेज निर्भरता, सभी हमारे मॉडल22,23 में पुष्टि की गई ,24. इसके अलावा, हमारे NR1 और NR2A उपइकाइयों के लिए वायरस की मात्रा को समायोजित करने की क्षमता इष्टतम कार्यात्मक अभिव्यक्ति स्तर सुनिश्चित करता है ।

क्योंकि कम दक्षता, उच्च लागत, और ंयूनतम सफलता के परिणाम, व्यक्तिगत रिसेप्टर्स और उनके अद्वितीय औषध विज्ञान के लक्षण वर्तमान में कम प्रवाह मैनुअल पैच-दबाना22,23परख में आयोजित की जाती हैं । दूसरी ओर, excitotoxicity छुरा transfected कोशिकाओं का उपयोग करते समय एक बड़ी बाधा बनी हुई है, क्योंकि कार्यात्मक NMDARs के व्यक्त लाइगैंडों (ग्लूटामेट और glycine/डी-serine) है कि18मीडिया में जारी कर रहे है के कारण कोशिकाओं के लिए हानिकारक हैं । एक मजबूत विकल्प के रूप में, हमारे परख कार्यात्मक NMDARs की baculovirus मध्यस्थता अभिव्यक्ति है, जो excitotoxicity और पैदावार तेजी से काबू पाता है, रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति titratable का उपयोग करता है । बल्कि चैनल ब्लॉकर्स के चिपचिपा प्रकृति द्वारा सीमित किया जा रहा से, यह परख भी कमजोर ligand-बाध्यकारी साइटों के विरोधी का लाभ लेता है । इन विरोधी मीडिया में अंतर्जात लाइगैंडों के साथ प्रतिस्पर्धा और ligand-बाध्यकारी साइटों की रक्षा करना । इसलिए, विरोधी के वॉशआउट के बाद, exogenously-जोड़ा लाइगैंडों ग्लूटामेट-और glycine/डी-serine-बाइंडिंग साइटों के लिए संवेदनशीलता बहाल कर दिया है ।

इस परख, ऐसे CRISPR के रूप में आणविक जीवविज्ञान में हाल ही में अग्रिमों के साथ संयुक्त, लक्ष्य और NMDAR अभिव्यक्ति और समारोह के उपंयास नियामकों विशेषताएं मदद मिलेगी । समवर्ती, इस परख मदद करेगा छोटे अणुओं है कि प्रत्यक्ष या परोक्ष रूप से स्थिर सेल लाइनों उत्पंन करने की आवश्यकता के बिना NMDAR गतिविधि मिलाना, जिससे आनुवंशिक के साथ संगतता प्रदान करने और छोटे अणु आधारित स्क्रीन की पहचान ।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है और कुछ भी खुलासा नहीं है.

Acknowledgments

लेखक इस अध्ययन के वित्तपोषण के लिए एक पूरे के रूप में जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए बेक्कालॉरेट विद्वानों कार्यक्रम कार्यालय और नोवार्टिस संस्थानों के बाद शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEK-293 ATCC CRL-1573
Human NMDA (NR1/NR2A) Receptor Cell Line ChanTest Corporation CT6120
pFastBac Dual Expression Vector ThermoFisher Scientific 10712-024
Corning 384-well Clear Flat Bottom Microplate Corning Life Sciences 3844
FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit Molecular Devices R8192
Glycine Sigma-Aldrich G7126
Glutamate Sigma-Aldrich 49621
D-serine Sigma-Aldrich S4250
L701,324 Tocris 907
HEPES Buffer Boston Bio Product BB-103
Magnesium Chloride Solution Sigma-Aldrich 63069
Calcium Chloride VWR E506
HBSS ThermoFisher Scientific 14025-092
Probenecid ThermoFisher Scientific P36400
DMEM/F-12, GlutaMAX media ThermoFisher Scientific 10565018
MDL105,519 NIBR Synthesized in house
NVP-AAM077 NIBR Synthesized in house
CGP070667 NIBR Synthesized in house

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक १३७ NMDAR कैल्शियम-फ्लक्स excitotoxicity सेल व्यवहार्यता विरोधी glycine/डी-serine ग्लूटामेट मॉडुलन
एक उच्च प्रवाह कैल्शियम-फ्लक्स परख मोर्फिन अध्ययन करने के लिए Glycine के लिए संवेदनशीलता के साथ रिसेप्टर्स/डी-serine और ग्लूटामेट
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Yeboah, F., Guo, H., Bill, A. A… More

Yeboah, F., Guo, H., Bill, A. A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate. J. Vis. Exp. (137), e58160, doi:10.3791/58160 (2018).

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