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Neuroscience

Um ensaio de cálcio de alta produtividade-flux para estudar os receptores NMDA com sensibilidade de glicina/D-serina e glutamato

Published: July 10, 2018 doi: 10.3791/58160

Summary

O objetivo do presente protocolo é facilitar o estudo dos receptores de NMDA (NMDAR) em uma escala maior e permitir a análise dos efeitos moduladora de pequenas moléculas e suas aplicações terapêuticas.

Abstract

Receptores de N-metil-D-aspartato (NMDA) (NMDAR) são classificados como receptores de glutamato de geleificação e têm papel crítico na aprendizagem e memória. Mau funcionamento do NMDAR, expressado como qualquer over - ou under - activity causada por mutações, expressão alterada, tráfico ou localização, pode contribuir para inúmeras doenças, especialmente no sistema nervoso central. Portanto, compreender a biologia do receptor, bem como facilitar a descoberta de compostos e moléculas pequenas é crucial nos esforços em curso para combater doenças neurológicas. As abordagens atuais para estudar o receptor têm limitações, incluindo a incapacidade para estudar suas habilidades funcionais devido a necessária presença de bloqueadores de canais para evitar excitotoxicidade mediada por NMDAR, alto custo e baixa taxa de transferência. Além disso, os sistemas existentes de ensaio são sensíveis à estimulação por glutamato apenas e faltam de sensibilidade à estimulação por glicina, o outro ligante co do NMDAR. Aqui, apresentamos o primeiro ensaio baseado em placa de poder elevado-throughput para estudar um receptor NMDA com sensibilidade para ambos os ligantes co, glutamato e D-serina/glicina. Esta abordagem permite o estudo de diferentes composições de subunidade NMDAR e permite estudos funcionais do receptor em modos de glicina e / ou sensíveis ao glutamato. Além disso, o método não requer a presença de inibidores durante as medições. Os efeitos de moduladores alostéricos positivos e negativos podem ser detectados com este ensaio e a farmacologia conhecida de NMDAR foi replicada em nosso sistema. Esta técnica supera as limitações dos métodos existentes e é rentável. Acreditamos que esta nova técnica irá acelerar a descoberta de terapias para patologias NMDAR-mediada.

Introduction

Com os atuais avanços na medicina, a expectativa de vida aumentou significativamente; no entanto, então tem a prevalência de doenças relacionadas com a idade. Doenças do sistema nervoso central (CNS) tais como esquizofrenia, esclerose lateral amiotrófica (ela), doença de Alzheimer e doença de Parkinson, entre outros, não são excepção e tem sido projetadas para aumentar ao longo da próxima década1, 2 , 3. o mau funcionamento dos receptores de glutamato de geleificação conhecido como receptores N-metil-D-aspartato (NMDAR) tem sido associado a doença de Alzheimer, esquizofrenia, traumatismo crânio-encefálico, acidente vascular cerebral, diabetes e glaucoma, entre outros, que garante a precisa estudar sua biologia para o desenvolvimento de terapias eficazes, doença-modificando4,5,6,7.

Os NMDARs são compostos de quatro monômeros ou subunidades4,8,9. A composição estrutural do NMDAR mostra variabilidade regional e de desenvolvimento dentro do cérebro7,10. Os NMDARs estão envolvidos na plasticidade sináptica, cognição e a geração de ritmos para respiração e locomoção11,12,13. Como um canal de voltagem-dependente, é em grande parte não-condutor no potencial de membrana de repouso (-70 mV) e é bloqueado por magnésio para prevenir mais permeação de íons. O canal é activado pela ligação de dois ligantes, glutamato e a glicina/D-serina, e uma despolarização simultânea na membrana sináptica mediada por receptores de GABA, outra subclasse de receptores de glutamato de geleificação. A despolarização remove o bloqueio de magnésio de NMDAR, permitindo o influxo de cátions, particularmente cálcio14,15,16. Mesmo que a ativação do NMDAR é essencial para a sobrevivência da pilha, ativação excessiva pode levar à morte17,18,19 através da excitotoxicidade da pilha. Isso, além da natureza complexa do receptor, torna desafiador para realizar estudos necessários para o desenvolvimento de terapias eficazes.

Diferentes métodos têm sido desenvolvidos para estudar o NMDAR. No entanto, cada um tem que acompanha ressalvas. Por exemplo, uma técnica amplamente utilizada é um ensaio baseado em fluorescência que mede mudanças NMDAR-mediada em cálcio intracelular em uma linha de celular estável sob o controle de um promotor inducible-tetraciclina (Tet-On)20. No entanto, neste sistema, as concentrações de supramaximal de ligantes que são necessários e a exigência de que os inibidores NMDAR estão presentes durante a medição torna quase impossível de detectar atividade da antagonista competitivo. Em outros sistemas similares, a expressão do receptor funcional provoca toxicidade, exigir que os bloqueadores de canais como a cetamina21,22 para preservar as culturas de células. Estes bloqueadores dos canais de sentar-se no núcleo do receptor e são difíceis de lavar, especialmente em um formato baseado em placa, para que eles interfiram com estudos funcionais do receptor. Finalmente, em medidas eletrofisiológicas tais como remendo aperto, há produção limitada, e estudos em grande escala são muito caro23. Não obstante, os sistemas acima são insensíveis à estimulação de glicina; Portanto, estudando a atividade de glicina-dependente do NMDAR torna-se um desafio.

Aqui, descrevemos uma nova abordagem para o estudo NMDAR que supera as limitações discutidas. Nossa técnica capitaliza sobre o sistema de expressão de baculovirus para expressar o receptor em níveis funcionais, com uma óptima relação das subunidades em menos de 16 horas. Além disso, o uso de baculovirus permite uma abordagem simples e combinatória, que fornece uma ampla caracterização dos subtipos distintos de NMDAR recombinantes. Ao contrário de outros ensaios, este protocolo não requer bloqueadores de canal por causa do uso de antagonistas fracos. Mais forte vantagem do método é aquele fracassado depois do antagonista fraco, o receptor é sensível a modulação dos sites individual glicina e o glutamato vinculação - além de modulação dual de glicina/D-serina e glutamato ligand-ligação sites. O ensaio recapitula a farmacologia conhecida do receptor NMDAR e os efeitos de seus conhecidos moduladores positivos e negativos. Finalmente, a geração deste ensaio celular em vitro supera a toxicidade celular causada pelo influxo excessivo de cálcio e permite estudos funcionais do receptor em uma moda de alta produtividade, que pode acelerar as descobertas de moduladores NMDAR Estados de doença.

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Protocol

1. preparação das células

Nota: Este protocolo, incluindo a geração de dados, usa HEK293 células transfectadas com um baculovirus codificação NR1 e NR2A células.

  1. O número adequado de células HEK293 de sementes e adicionar o vírus NR1 e/ou NR2A nas concentrações finais apropriadas (1,00 µ l cada). Para uma placa de 384, use 10.000 células/poço em um volume final de 30 µ l.
  2. Alternativamente, as sementes células HEK293-NR1-NR2A o número de célula apropriada e volume (por um prato de 384-bem, uso 10.000 células/poço em um volume final de 30 µ l). Adicionar tetraciclina na concentração de 2 µ g/mL para induzir a expressão NR2A e adicionar a proteção composta (100 µM MDL105, 519 ou 5 µM CGP07066724).
  3. Nota: O baculovirus codificação NR1 e NR2 devem ter um título aproximado entre 5 x 109 - 10 x 109 unidade infecciosa por mililitro24.

2. medida da atividade do receptor NMDA

  1. Prepare uma placa de 384 com células HEK293 transfectadas com células NR1/NR2 ou HEK293-NR1-NR2A na presença de compostos de qualquer proteção. Use um fundo transparente, moldura preta, placa revestida de poli-D-lisina.
    Nota: Proteção com 100 µM MDL105, 519 é usado para conferir a sensibilidade a glicina, enquanto 5 µM CGP070667 é usado para conferir a sensibilidade ao glutamato.
  2. Incube a placa a 37 ° C e 5% de CO2 por 16 horas (durante a noite).
  3. Retirar a placa da incubadora e suavemente, descartar a mídia celular por abrandar capotar um recipiente de resíduos biológicos compatível com a placa. Bata levemente a placa sobre uma toalha de papel para limpar a mídia fora as bordas da placa e todos os restantes meios de drenagem.
  4. Prepare o corante calcium6 por solubilizing, um frasco de tintura de calcium6 (1 tamanho da placa) em 10 mL de tampão de incubação (HBSS pH 7,5, 20 mM HEPES, 1 mM MgCl2, probenecida 1 mM). Incube a placa por 2 horas a 37 ° C e 5% de CO2.
  5. Retirar a placa da incubadora e deixar que as células ajustar a temperatura ambiente por 10 minutos.
  6. Despeje delicadamente o corante calcium6, conforme descrito na etapa 2.3 e adicione 30 µ l de tampão do ensaio (HBSS pH 7,5, 20 mM HEPES, 1.8 mM CaCl2, probenecida 1 mM).
  7. Repita a etapa 2.6 duas vezes para um total de 3 lavagens. Deixe 30 µ l de buffer de ensaio sobre as células após a última lavagem.
  8. Deixe que as células descansar por 5 minutos à temperatura ambiente.
  9. Prepare a placa de ligante, fazendo um 4-fold estoque de 400 µM de glicina e o glutamato 400 µM (concentração final de 100 µM; concentração ideal de ligantes para ser determinada conforme descrito abaixo). Transferi um mínimo de 25 µ l de estoque de ligante para uma placa de 384 V-fundo.
  10. Carrega o ligante e chapa de célula para o FDSS (sistema de rastreio de drogas funcional).
  11. Medir a fluorescência de base (Fó) da placa de celular por 30 segundos. Transferi 10 µ l do estoque de ligante para a placa de células usando a função aplicadora FDSS e medida do fluxo de cálcio por fluorescência calcium6-corante para 5 minutos de gravação.
  12. Calcule a relação de fluorescência máxima dividindo a fluorescência máxima obtida por fluorescência de base (F/f demáximoó).

3. otimização de níveis de expressão de NMDAR

  1. Para determinar a quantidade ideal de baculovirus para utilizar, execute uma titulação do vírus tanto NR1 e NR2A. Preparar uma placa de 384 com células HEK293 (recomendação de 10.000 células/poço, 30 µ l de mídia) e incluem os compostos de proteção conforme descrito no passo 2.1.
  2. Adicionar diferentes quantidades do vírus NR1 em linhas diferentes da placa (por exemplo: Adicionar µ l 0, 2 µ l, 1 µ l, 0,5 µ l, 0,25 µ l em linhas A-E, respectivamente). Adicione duplicatas para a precisão dos dados.
  3. Adicionar diferentes quantidades do vírus NR2A em diferentes colunas da placa (por exemplo: Adicionar µ l 0, 2 µ l, 1 µ l, 0,5 µ l, 0,25 µ l em linhas A-E, respectivamente). Adicione duplicatas para a precisão dos dados.
  4. Incube a placa a 37 ° C e 5% de CO2 por 16 horas (durante a noite).
  5. Determine a melhor relação qualidade e quantidade dos vírus NR1 e NR2A realizando uma medição de fluxo de cálcio sobre o FDSS (veja acima).

4. ligante titulação

  1. Prepare as células conforme descrito na etapa 2.3.
  2. Prepare diluições de cada ligante na presença de concentrações (100 µM) para impregnação do outro ligante como 4-fold solução estoque. Por exemplo: para uma concentração de 10 µM teste final de glicina, prepare uma solução stock de 40 µM de glicina, incluindo 400 µM glutamato.
  3. Prosseguir com a medição de FDSS conforme descrito na etapa 2.11.

5. compostos de teste

  1. Prepare as células conforme descrito na etapa 1.
  2. Prepare a placa de ligante com um 5-fold estoque de concentração final de ligante no buffer de ensaio.
  3. Prepare a placa de compostos com o 4-fold estoque de concentração final desejada de compostos no buffer de ensaio. Para uma concentração final de composto de 10 µM no buffer de ensaio, prepare uma solução stock de 40 µM.
    1. Manter a concentração do dimetilsulfóxido (DMSO) constante em todas as amostras através da elaboração de uma pré-diluição do composto em DMSO antes mais diluição para o buffer de ensaio.
    2. Para uma resposta de dose do composto no ensaio final variando entre 3 e 30 µM, prepare uma diluição prévia do composto em DMSO, variando de 1 a 10 mM. Dilua os no buffer de ensaio para a concentração das ações 4-fold. A concentração final do DMSO não deve exceder 0,5%.
      Nota: É recomendável testar cada amostra em triplica.
  4. Carrega o ligante, composto e placa de células no FDSS.
  5. Medir a fluorescência de base por 30 segundos.
  6. Adicionar 10 µ l de estoque composto e medir a fluorescência por 5 minutos.
  7. Adicionar 10 µ l de estoque de ligante e medir a fluorescência por 5 minutos.
  8. Determine a integral da relação de fluorescência, calculando a área sob a curva dos rácios fluorescentes durante os últimos 5 minutos da medição.
    Nota: Como alternativa, a proporção máxima de fluorescência após adição de ligante pode ser usada para análise.

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Representative Results

Antes de testar os efeitos de pequenas moléculas, deve-se determinar os níveis de expressão ideal dos NMDARs, bem como as concentrações de ligante óptima. Conforme descrito, HEK293 células foram semeadas em 10.000 células por poço em uma placa de 384, na presença de 5 µM, CGP060667, então transfectadas com quantidades variadas de NR1 e NR2A vírus. Depois de cálcio durante a noite, induzida pelo ligante de incubação foi medido o fluxo (Figura 1). Os resultados destes experimentos revelam a melhor quantidade e proporção de vírus a ser usado para cada subunidade (Figura 1, caixa amarela).

Uma vez que a quantidade ideal e o rácio de transdução com o NR1 e NR2A foram determinados, realizou-se uma titulação de ligante para determinar a concentração de ligante ideal para ativação dos NMDARs. Para fazer isso, um dos ligantes co foi adicionado em diferentes concentrações no fixo, saturando as concentrações do outro ligante co (Figura 2A-2B). Resultados semelhantes foram obtidos para outras combinações de subunidade do NMDAR como NR1/NR2B e NR1/NR2D (Figura 2), demonstrando a aplicabilidade do ensaio de outros membros da família de NMDAR24. Depois de determinar os níveis de expressão ideal e concentrações de ligante, um pode prosseguir com testando os efeitos de NMDAR-moduladores no ensaio.

Consistente com relatórios publicados, este primeiro ensaio baseados na placa para estudar os NMDARs com sensibilidade a glicina e o glutamato em grande escala reproduz dados sobre as propriedades conhecidas do NMDAR14,25,26. Aqui, usamos a atividade de dois compostos, [(ácido R)-[(S)-1-(4-bromophenyl)-ethylamino]-(2,3-dioxo-1,2,3,4-tetrahydroquinoxalin-5-yl)-methyl]-phosphonic (NVP-AAM077), um antagonista de local de glutamato e [7-cloro-4-hydroxy-3-(3-phenoxy) fenil-2 (H) à base de quinolona] (L701, 324), um antagonista de local de glicina, para exemplificar os resultados previstos do ensaio27,28 (Figura 3). Finalmente, cada composto foi testado no EC80 do respectivo ligante natural do sítio de ligação. Redução das concentrações ligante é esperada para aumentar a potência dos antagonistas, enquanto espera-se que não têm efeito sobre a potência dos inibidores não-competitivos ou poro-bloqueadores.

Figure 1
Figura 1: titulação de subunidades NR1 e NR2A. Volumes diferentes de vírus que codificam as subunidades NMDAR NR1 e NR2A foram titulados para determinar a quantidade necessária para a atividade funcional ideal do receptor. Um rácio de 1:1 (v/v) NR1:NR2A observou-se como a relação ideal com 1 µ l de cada (caixa amarela). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: titulação ligante. R. em uma concentração fixa de glicina (100 µM), foram tituladas em diferentes concentrações de glutamato e fluxo de cálcio foi gravado. Barras de erro representam o desvio padrão. B. glutamato manteve-se na concentração de 100 µM e foi titulado sobre diferentes concentrações de D-serina e glicina, e fluxo de cálcio foi medido. Não houve diferença significativa entre o fluxo de cálcio D-serina e glicina. Barras de erro representam o desvio padrão. C. células transfectadas com baculovirus NR1 e NR2D foram estimuladas com glutamato ou 100 µM e variar as concentrações de D-serina ou 100 µM D-serina e diferentes concentrações de glutamato e cálcio fluxo foi medido. Barras de erro representam o desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: caracterizando a atividade do antagonista de sítio de ligação ligante. Usando as expressões de ligante e subunidade ideais predeterminadas, os efeitos de um antagonista do glutamato-ligação local, NVP-AAM077 e um antagonista de glicina-ligação local, L701, 324 foram caracterizados pelo ensaio de fluxo de cálcio para NR1/NR2A no indicado concentrações. Uma concentração igual a EC80 de glicina ou glutamato na presença da concentração de impregnação (100 µM) do outro ligante foi usada depois da adição do NVP-AAM077 e L701, 324, respectivamente. Barras de erro representam o desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O sucesso deste teste depende em grande parte a saúde das células HEK usado. Células em fase de crescimento exponencial e com número baixo de passagem deve ser usado. Este ensaio envolve muitas transferências e adições de soluções, usando então cuidado irão garantir maior precisão em seus resultados. Concentrações de compostos e todos os outros reagentes devem ser também cruzados para minimizar erros. Quando substituir a mídia celular com o buffer de ensaio para o ensaio de fluxo de cálcio, a placa deve ser inclinada suavemente para que as células não desanexar. Finalmente, o uso de placas revestidas de poli-D-lisina neste protocolo aumenta a fixação das células à placa.

Pode haver diferenças na expressão de NMDAR e a quantidade de vírus necessários para a expressão da subunidade dependendo do número de passagem e adequação das células HEK293 aquando da transdução. Além disso, o baculovirus tem uma vida útil curta, variando de seis meses a um ano. Portanto, a qualidade do vírus é um parâmetro importante para este ensaio. Um ensaio de imunofluorescência padrão pode ser usado para detectar e confirmar os níveis de expressão e localização das unidades NMDAR antes de experimentos mais24. Outras linhas de células podem ser usadas para estudar o receptor NMDA usando este protocolo. No entanto, a tolerância e a expressão dos NMDARs usando o baculovirus devem ser confirmadas antes de prosseguir com o protocolo; caso contrário, podem ocorrer resultados inesperados. Além disso, compostos tais como inibidores de topoisomerase II têm sido relatados para aumentar a eficácia da expressão de baculovirus29. Estas alternativas podem ser testadas e otimizadas de acordo com as preferências do usuário.

O estudo de processos biológicos em um tipo de célula diferente do que o tipo de célula original levanta questões dentro da comunidade científica. Uma limitação deste teste é o uso de linhas de células de rim (HEK 293) como um sistema modelo para estudar o receptor de glutamato de geleificação, NMDAR. Células HEK foram usadas por causa de seu potencial de membrana despolarizada similar de neurônios despolarizados. Além disso, a similaridade entre os NMDARs no cérebro e no nosso modelo é confirmada pelos nossos estudos complementares. A atividade de moduladores alostéricos positivos tais como GNE-8324, moduladores negativos tais como ifenprodil e os bloqueadores de canais como a cetamina, bem como a dependência da tensão do NMDAR, foram confirmados em nosso modelo22,23 ,24. Além disso, nossa capacidade de ajustar a quantidade de vírus para as subunidades NR1 e NR2A garante níveis de expressão funcional ideal.

Por causa da baixa eficiência, alto custo e resultado mínimo de sucesso, a caracterização de receptores individuais e sua farmacologia exclusiva atualmente são realizados em baixa taxa de transferência manual remendo-braçadeira ensaios22,23. Por outro lado, excitotoxicidade permanece um grande obstáculo quando usando estàvel transfected células, porque a superexpressão dos NMDARs funcionais são prejudiciais às células devido as ligantes (glutamato e a glicina/D-serina) que são liberados para a mídia,18. Como uma alternativa mais forte, nosso ensaio usa expressão mediada por baculovirus dos NMDARs funcionais, que supera a excitotoxicidade e produz rápida, titulável expressão dos receptores de. Em vez de ser limitado pela natureza pegajosa de bloqueadores de canais, este ensaio também tira proveito dos antagonistas do fracos locais ligand-ligando. Estes antagonistas competem com ligantes endógenos na mídia e proteger os locais de ligação de ligante. Portanto, após a lavagem dos antagonistas, sensibilidade de forma exógena-adicionado ligantes do glutamato - e sites de glicina/D-serina-vinculação é restaurada.

Neste ensaio, combinado com os avanços recentes em biologia molecular tais como CRISPR, ajudará o alvo e caracterizar o romance reguladores da expressão NMDAR e função. Simultaneamente, este ensaio ajudará a identificar pequenas moléculas que podem direta ou indiretamente modulam a atividade NMDAR sem a necessidade de gerar linhas de célula estável, proporcionando compatibilidade com genética - e pequena molécula-com base em telas.

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Disclosures

Os autores têm sem conflitos de interesses e nada de divulgar.

Acknowledgments

Os autores gostaria de agradecer o Post Bacharelado Scholars Program Office e Novartis institutos para investigação biomédica como um todo para o financiamento deste estudo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEK-293 ATCC CRL-1573
Human NMDA (NR1/NR2A) Receptor Cell Line ChanTest Corporation CT6120
pFastBac Dual Expression Vector ThermoFisher Scientific 10712-024
Corning 384-well Clear Flat Bottom Microplate Corning Life Sciences 3844
FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit Molecular Devices R8192
Glycine Sigma-Aldrich G7126
Glutamate Sigma-Aldrich 49621
D-serine Sigma-Aldrich S4250
L701,324 Tocris 907
HEPES Buffer Boston Bio Product BB-103
Magnesium Chloride Solution Sigma-Aldrich 63069
Calcium Chloride VWR E506
HBSS ThermoFisher Scientific 14025-092
Probenecid ThermoFisher Scientific P36400
DMEM/F-12, GlutaMAX media ThermoFisher Scientific 10565018
MDL105,519 NIBR Synthesized in house
NVP-AAM077 NIBR Synthesized in house
CGP070667 NIBR Synthesized in house

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References

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Yeboah, F., Guo, H., Bill, A. AMore

Yeboah, F., Guo, H., Bill, A. A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate. J. Vis. Exp. (137), e58160, doi:10.3791/58160 (2018).

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