Summary
Цель настоящего Протокола заключается в том, чтобы облегчить изучение NMDA-рецепторов (NMDAR) в большем масштабе и позволить изучение модулирующее влияние малых молекул и их терапевтического применения.
Abstract
N-метил D-аспартат (NMDA) рецепторы (NMDAR), классифицируются как ИОНОТРОПНЫХ ГЛУТАМАТНЫХ рецепторов и важнейшую роль в учить и память. NMDAR неисправность, выраженные как либо над - или под - activity вызванных мутациями, измененное выражение, торговлей или локализации, может способствовать к многочисленным заболеваниям, особенно в центральной нервной системе. Таким образом понимание биологии рецепторов, а также облегчение открытия соединений и малых молекул имеет решающее значение в продолжающихся усилиях по борьбе с неврологическими заболеваниями. Нынешние подходы к изучению рецептор имеют ограничения, включая низкую пропускную способность, высокая стоимость и невозможность для изучения его функциональные возможности из-за необходимости присутствие блокаторы кальциевых каналов для предотвращения NMDAR-опосредованной Эксайтотоксичность. Кроме того существующие системы пробирного чувствительны к стимуляции от глутамата только и отсутствие чувствительности к стимуляции, глицин, другой сопредседатель лигандом NMDAR. Здесь мы представляем первый на основе плиты пробирного с высок объём мощности для изучения NMDA-рецептора с чувствительностью к совместно лигандов, глутамата и D-Серин/глицина. Этот подход позволяет изучение различных композиций субъединица NMDAR и позволяет функциональные исследования рецептора в глицин и/или глутамат чувствительных режимах. Кроме того этот метод не требуется присутствие ингибиторов во время измерений. Эффекты положительных и отрицательных аллостерический модуляторы могут быть обнаружены с этот assay и известных фармакологии NMDAR была воспроизведена в нашей системе. Эта техника преодолевает ограничения существующих методов и экономически эффективным. Мы считаем, что эта технология будет ускорить открытие терапии для NMDAR-опосредованной патологий.
Introduction
С текущих достижений в области медицины продолжительность жизни возросла значительно; Однако так что имеет распространенность заболеваний, связанных с возрастом. Заболевания центральной нервной системы (ЦНС), таких, как шизофрения, боковой амиотрофический склероз (ALS), болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона, среди прочих, не являются исключением и были предполагается увеличить в течение следующего десятилетия1, 2 , 3. неисправности ИОНОТРОПНЫХ ГЛУТАМАТНЫХ рецепторов, известный как N-метил D-аспартат рецепторы (NMDAR) был связан с болезни Альцгеймера, шизофрении, черепно-мозговой травмы, инсульта, диабета и глаукомы, среди прочего, который гарантирует необходимо изучать их биологии для развития эффективных, Болезнь модифицирующие терапии4,5,6,7.
NMDARs состоят из четырех мономеров или подразделения4,8,9. Структурный состав NMDAR показывает развития и региональной изменчивости в мозг7,10. NMDARs участвуют в синаптической пластичности, познания и генерации ритмов для дыхания и локомоции11,12,13. Как напряжения закрытый канал, это во многом непроводящую на мембранного потенциала покоя (-70 mV) и блокируется магния, чтобы предотвратить дальнейшее проникновение ионов. Канал активируется путем связывания двух лигандов, глутамата и глицина/D-Серин, и одновременное деполяризации в синаптических мембран при посредничестве АМПА рецепторов, другой подкласс ИОНОТРОПНЫХ ГЛУТАМАТНЫХ рецепторов. Скорость деполяризации удаляет блокировку магния NMDAR, позволяя приток катионов, особенно кальция14,,1516. Несмотря на то, что активация NMDAR имеет важное значение для выживания клетки, чрезмерное активации может привести к ячейке смерти17,18,19 через Эксайтотоксичность. Это, помимо сложного характера рецептора, делает его сложным для выполнения исследования необходимых для разработки эффективных терапевтических методов.
Различные методы были разработаны для изучения NMDAR. Однако каждый из них имеет, сопровождающих предостережений. Например один широко используемый метод — на основе флуоресценции assay который измеряет NMDAR-опосредованной изменения в внутриклеточного кальция в стабильной клеток линии под контролем промотора тетрациклин индуцибельной (тет-на)20. Однако в этой системе, supramaximal концентраций лигандов, которые необходимы и требование, что ингибиторы NMDAR присутствуют во время измерения делает его почти невозможным для обнаружения деятельности конкурентным антагонистом. В других подобных системах выражение функциональных рецепторов вызывает токсичности, требующих блокаторы кальциевых каналов, такие как кетамин21,22 для сохранения культур клеток. Эти блокаторы кальциевых каналов сидеть в ядре рецептора и трудны для того промыть, особенно в формате на основе плиты, так что они мешают функциональных исследований рецептора. Наконец в электрофизиологические измерения например патч зажима, ограниченной пропускной способности, и крупномасштабные исследования являются очень дорогими23. Несмотря на это перечисленных выше систем нечувствительны к стимуляции глицин; Следовательно изучение деятельности глицин зависимой NMDAR становится проблемой.
Здесь мы опишем новый подход для изучения NMDAR, который преодолевает обсудили ограничения. Наша методика основывается на системе выражение бакуловирусы выразить рецептор на функциональных уровнях с оптимальным соотношением подразделений в качестве лишь 16 часов. Кроме того использование бакуловирусы позволяет для простой и комбинаторные подход, который обеспечивает широкую характеристику различных подтипов рекомбинантных NMDAR. В отличие от других анализов этот протокол не требует блокаторы кальциевых каналов из-за использования слабых противников. Сильным преимуществом метода является что после вымывания слабым антагонистом, рецептор чувствителен к модуляции отдельных глицин и глутамата привязки сайтов в дополнение к двойной модуляции глицин/D-серина и глутамата лиганд привязки сайтов. Assay резюмирует известных фармакологии рецептора NMDAR и последствия его известных положительные и отрицательные модуляторов. Наконец поколение этот в vitro сотовой assay преодолевает сотовой токсичности, вызванные чрезмерным кальция приток и позволяет для функциональных исследований рецептора в высок объём моды, которые могут ускорить открытий NMDAR модуляторы в положениях заболеванием.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка клеток
Примечание: Этот протокол, включая генерации данных, использует HEK293 клетки преобразованы с бакуловирусы кодирования NR1 и NR2A клетки.
- Семя соответствующее количество клеток HEK293 и добавьте NR1 и/или NR2A вируса в соответствующие окончательные концентрации (по 1,00 мкл). Для 384-ну плиты используйте 10 000 клеток/хорошо в окончательный объем 30 мкл.
- Кроме того семена HEK293-NR1-NR2A клетки в соответствующую ячейку число и объем (для 384-ну плита, использование 10 000 клеток/колодец в окончательный объем 30 мкл). Добавить Тетрациклин в концентрации 2 мкг/мл, чтобы побудить NR2A выражение и добавить защиту соединения (100 мкм MDL105, 519 или 5 мкм CGP07066724).
- Примечание: Бакуловирусы кодирования NR1 и NR2 должны иметь приблизительное титр между 5 х 109 - 10 х 109 инфекционные единицу в миллилитр24.
2. измерение активности NMDA-рецептора
- Подготовьте 384-ну плиты с HEK293 клетками преобразованы с NR1/NR2 или HEK293-NR1-NR2A клеток присутствии либо защитного соединения. Используйте ясно снизу, черная рамка, поли D-лизин покрытием плиты.
Примечание: Защита с 100 мкм MDL105, 519 используется для того, чтобы придать чувствительность к глицин, в то время как 5 мкм CGP070667 используется для того, чтобы придать чувствительность к глутамата. - Инкубируйте пластины при 37 ° C и 5% CO2 16 часов (на ночь).
- Удалить пластину из инкубатора и аккуратно Выбросьте ячейки СМИ путем замедления, перевернув контейнер совместимый биоотходов пластину. Аккуратно нажмите пластину на бумажное полотенце, чтобы очистить СМИ края пластины и слейте любых оставшихся средств массовой информации.
- Подготовьте calcium6-краска, растворяющие один флакон calcium6 краска (1 Размер плиты) в 10 мл инкубации буфера (HBSS рН 7,5, 20 мм HEPES, 1 MgCl2, пробенецид 1 мм). Проинкубируйте 2 часов при 37 ° C и 5% CO2пластины.
- Снять пластину из инкубатора и пусть клетки приспособиться к комнатной температуре в течение 10 минут.
- Осторожно вылейте calcium6-краска, как описано в шаге 2.3 и добавьте 30 мкл аналитического буфера (HBSS рН 7,5, 20 мм HEPES, 1.8 мм2CaCl, пробенецид 1 мм).
- Повторите шаг 2.6 дважды для всего 3 стирок. После последнего стирки оставьте 30 мкл аналитического буфера на клетки.
- Пусть на 5 минут при комнатной температуре клетки.
- Подготовьте пластину лиганд, делая 4-кратный запас 400 мкм глицин и 400 мкм глутамата (конечная концентрация 100 мкм; оптимальная концентрация лигандов определяется как описано ниже). Передача минимум 25 мкл акций лиганд в V-днище 384-хорошо.
- Загрузите лигандом пластины и ячейки пластины в FDSS (функциональная система скрининга наркотиков).
- Измерьте базовые флуоресценции (oF) клетки пластины на 30 секунд. Передача 10 мкл акций лиганд в пластину ячейки, используя дозирования функции FDSS и измерения потока кальция при записи calcium6-краска флуоресценции для 5 минут.
- Вычислить коэффициент максимального флуоресценции путем деления максимального флуоресценции, получаемая базовой флуоресцирования (FМакс/fo).
3. Оптимизация NMDAR выражение уровней
- Чтобы определить оптимальное количество бакуловирусы использовать, выполните титрования NR1 и NR2A вирусов. Подготовить 384-ну плиты с HEK293 клетками (рекомендация 10 000 клеток/Ну, 30 мкл СМИ) и включают в себя защиту соединений, как описано в шаге 2.1.
- Добавить различные количества NR1 вируса в разных строках пластины (например: добавить 0 мкл, 2 мкл, 1 мкл, 0.5 мкл, 0,25 мкл в строк Е соответственно). Добавление дубликатов для точности данных.
- Добавить различные количества вируса NR2A в разных столбцах пластины (например: добавить 0 мкл, 2 мкл, 1 мкл, 0.5 мкл, 0,25 мкл в строк Е соответственно). Добавление дубликатов для точности данных.
- Инкубируйте пластины при 37 ° C и 5% CO2 16 часов (на ночь).
- Определите оптимальное соотношение и количество вирусов NR1 и NR2A, выполняя измерения потока кальция на FDSS (см. выше).
4. лигандом титрования
- Подготовка клетки, как описано в шаге 2.3.
- Подготовка разведений каждого лиганда присутствии насыщения концентрации (100 мкм) другим лигандом как 4-кратный Стоковый раствор. Например: для 10 мкм финальный тест концентрации глицина, подготовить 40 мкм Стоковый раствор глицина, включая 400 мкм глутамата.
- Перейти с FDSS измерения, как описано в шаге 2.11.
5. сложные испытания
- Подготовка клетки, как описано в шаге 1.
- Подготовьте пластину лиганда с 5 раз запас окончательного лигандом концентрации в assay buffer.
- Подготовьте соединений плита с 4-кратный запас желаемой конечной концентрации соединений в assay buffer. Для окончательного соединения концентрации 10 мкм в assay buffer Подготовьте раствор 40 мкм.
- Сохранить концентрацию диметилсульфоксида (ДМСО) постоянной во всех образцах путем подготовки предварительного разбавления комплекса в ДМСО перед дальнейшего разбавления в assay buffer.
- Для ответа дозу комплекса в окончательный анализ, колеблется от 3 до 30 мкм Подготовьте предварительное разбавление комплекса в ДМСО, от 1 до 10 мм. Развести в Пробирной буфера 4-кратный запасов концентрации. Конечная концентрация ДМСО не должна превышать 0,5%.
Примечание: Рекомендуется для проверки каждого образца в triplicates.
- Загрузите лиганд, соединение и плита клетки в FDSS.
- Измерьте базовые флуоресценции для 30 секунд.
- 10 мкл, комплекса запасов и измерения флуоресценции для 5 минут.
- 10 мкл лигандом запасов и измерения флуоресценции для 5 минут.
- Определите интеграл флуоресценции коэффициент расчета площадь под кривой люминесцентные показатели за последние 5 минут измерения.
Примечание: в качестве альтернативы, Максимальное соотношение флуоресценции после добавления лиганд может использоваться для анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Перед началом тестирования эффекты малых молекул, необходимо определить оптимальное выражение уровня NMDARs, а также концентрации лиганд оптимальной. Как описано, HEK293 клетки были посеяны на 10 000 ячеек на хорошо в пластине 384-Ну, при наличии 5 мкм CGP060667, затем преобразованы с различным количеством NR1 и NR2A вирусов. После инкубации на ночь, лиганд индуцированной кальция измерялась потока (рис. 1). Результаты этих экспериментов показывают лучшие количество и соотношение вируса для использования для каждого субъединицы (рис. 1, желтом).
После того, как были определены оптимальное количество и соотношение трансдукция с NR1 и NR2A, титрование лигандом была проведена для определения концентрации оптимальный лигандом для активации NMDARs. Для этого, один из совместного лигандов был добавлен в различных концентрациях в фиксированной, насыщая концентрации других совместно лиганда (рисунок 2A-2B). Аналогичные результаты были получены для других комбинаций субъединица NMDAR как NR1/NR2B и NR1/NR2D (рис. 2 c), демонстрируя пробирного применимость к другим членам семьи NMDAR24. После определения оптимальных выражение уровня и концентраций лигандов, один можно перейти к тестированию эффекты NMDAR-модуляторы в assay.
В соответствии с опубликованными отчетами, этот первый assay основанного на пластину для изучения NMDARs с чувствительностью к глицин и глутамата в крупных масштабах воспроизводит данные о свойствах известно14,NMDAR,25,,26. Здесь, мы используем деятельность двух соединений, [(R)-[(S)-1-(4-bromophenyl)-ethylamino]-(2,3-dioxo-1,2,3,4-tetrahydroquinoxalin-5-yl)-methyl]-phosphonic кислота (НВП-AAM077), глютамат сайт антагониста, а [7-хлоро-4-hydroxy-3-(3-phenoxy) хинолона фенил-2 (H)] (L701, 324), антагонист сайт глицин, чтобы проиллюстрировать предсказал результаты анализа27,28 (рис. 3). Наконец каждый комплекс был испытан на EC80 соответствующих природных лигандом привязки сайта. Ожидается, что сокращение концентраций лигандов повышения потенции антагонистов, хотя он, как ожидается, будет иметь никакого эффекта на потенцию неконкурентной ингибиторы или поры блокаторы.
Рисунок 1: титрование NR1 и NR2A субблоков. Различные объемы вируса, которые кодируют NMDAR субблоков NR1 и NR2A были титруют определить суммы, необходимой для оптимального функциональную активность рецептора. В соотношении 1:1 (v/v) NR1:NR2A было отмечено как оптимальное соотношение с 1 мкл каждого (желтом). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: титрование лиганда. A. в фиксированной концентрации глицин (100 мкм) были титруют различной концентрации глутамата и был записан потока кальция. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение. B. глутамата оставался в концентрации 100 мкм и титруют против различных концентраций D-серина и глицина, и была измерена потока кальция. Существует никакого существенного различия между потока кальция в глицин и D-серина. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение. C. клетки преобразованы с NR1 и NR2D бакуловирусы были стимулировали с либо 100 мкм глутамата и различной концентрации D-Серина или 100 мкм D-серина и различной концентрации глутамата и кальция потока была измерена. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: характеризующих активность лигандом привязки сайта антагониста. Используя заранее оптимального лиганда и Субблок выражения, эффекты антагонистов глутамат привязки сайта, НВП-AAM077 и Глицин привязки сайта антагонист, L701, 324 характеризовались assay потока кальция для NR1/NR2A на указанный концентрации. Концентрация равна EC80 глицин или глутамата присутствии насыщения концентрация (100 мкм) другим лигандом был использован после добавления НВП-AAM077 и L701, 324, соответственно. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Успех этот assay в значительной степени зависит от состояния здоровья ГЭС ячеек, которые используются. Клетки проходят экспоненциальный рост и с числом низкий проход должен быть использован. Этот assay включает в себя многие переводы и дополнения решений, поэтому использование осторожно обеспечит более высокую точность в его результатах. Концентрации соединений и другие реагенты должны быть перепроверены свести к минимуму ошибки. При замене клеток СМИ с Пробирной буфер для анализа потока кальция, пластины должны быть наклонен аккуратно, так что клетки не отсоединяйте. Наконец использование пластины с покрытием поли D-Лизин в этот протокол увеличивает вложения клеток к пластине.
Там могут быть различия в NMDAR выражении и количество необходимых для субблока выражения в зависимости от числа проход и фитнес HEK293 клеток на момент передачи вируса. Кроме того бакуловирусы имеет короткий срок от шести месяцев до года. Таким образом качество вируса является важным параметром для этот assay. Стандартный иммунофлюоресценции assay может использоваться для выявления и подтверждения уровни выражения и локализации NMDAR единиц до дальнейших экспериментов24. Другие клеточные линии могут быть использованы для изучения NMDA-рецептора, используя этот протокол. Однако терпимости и выражения с помощью бакуловирусы NMDARs должна быть подтверждена перед переходом с протоколом; в противном случае могут возникнуть непредвиденные результаты. Кроме того для увеличения эффективности бакуловирусы выражение29поступили соединений например ингибиторов топоизомеразы II. Эти альтернативы могут быть протестированы и оптимизированы в соответствии с предпочтениями пользователя.
Исследование биологических процессов в ячейки типа отличается от исходного типа клеток вызывает вопросы в рамках научного сообщества. Ограничение этого анализа является использование линий клеток почек (ГЭС 293) как модель системы для изучения ИОНОТРОПНЫХ рецептор глутамата, NMDAR. ГЭС клетки были использованы из-за их деполяризованный мембранный потенциал аналогична деполяризованный нейронов. Кроме того сходство между NMDARs в мозге и в нашей модели подтверждается нашими дополнительного исследования. Деятельность положительных аллостерический модуляторы, например сбой-8324, отрицательные модуляторы, например ifenprodil и блокаторы кальциевых каналов, такие как кетамин, а также зависимость напряжения NMDAR, были подтверждены в нашей модели22,23 ,24. Кроме того наша способность регулировать количество вируса для подразделений NR1 и NR2A обеспечивает оптимальное функциональных выражение уровня.
Из-за низкой эффективности, высокой стоимости и минимальной успех результатов характеристика отдельных рецепторов и их уникальные фармакологии в настоящее время проводятся в низкой пропускной способностью ручной фиксации анализов22,23. С другой стороны Эксайтотоксичность остается главным препятствием при использовании стабильно transfected клеток, потому что гиперэкспрессия функциональных NMDARs вредны для клеток вследствие лигандами (глутамата и глицина/D-Серин), которые выбрасываются в СМИ18. Как альтернатива сильнее наши пробирного использует бакуловирусы опосредованной выражение функционального NMDARs, которая преодолевает Эксайтотоксичность и дает быстрый, титруемой экспрессии рецепторов. Вместо ограничиваясь липкие характер блокаторы кальциевых каналов, этот assay также использует антагонисты слабых лиганд связывая места. Эти антагонисты конкурировать с эндогенные лиганды в средствах массовой информации и защиты лиганд связывая места. Следовательно после вымывания антагонистов, восстанавливается чувствительность к экзогенно Добавлено лигандов глутамата и глицина/D-Серин связывая места.
Этот assay, в сочетании с последние достижения в области молекулярной биологии как ТРИФОСФАТЫ, поможет целевой и характеризуют Роман регуляторы NMDAR выражения и функции. Одновременно этот assay поможет выявить маленьких молекул, которые могут прямо или косвенно модулируют активность NMDAR без необходимости создания стабильных клеточных линий, тем самым обеспечивая совместимость с генетическими - и малые молекулы-на основе экранов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы имеют без конфликта интересов и ничего не разглашать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить ученых программы бакалавриата почтовое отделение и Новартис институтов для биомедицинских исследований в целом для финансирования этого исследования.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK-293 | ATCC | CRL-1573 | |
| Human NMDA (NR1/NR2A) Receptor Cell Line | ChanTest Corporation | CT6120 | |
| pFastBac Dual Expression Vector | ThermoFisher Scientific | 10712-024 | |
| Corning 384-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning Life Sciences | 3844 | |
| FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit | Molecular Devices | R8192 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | 49621 | |
| D-serine | Sigma-Aldrich | S4250 | |
| L701,324 | Tocris | 907 | |
| HEPES Buffer | Boston Bio Product | BB-103 | |
| Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | 63069 | |
| Calcium Chloride | VWR | E506 | |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14025-092 | |
| Probenecid | ThermoFisher Scientific | P36400 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX media | ThermoFisher Scientific | 10565018 | |
| MDL105,519 | NIBR | Synthesized in house | |
| NVP-AAM077 | NIBR | Synthesized in house | |
| CGP070667 | NIBR | Synthesized in house |
References
- Farrall, A. J., Wardlaw, J. M. Blood-brain barrier: ageing and microvascular disease--systematic review and meta-analysis. Neurobiology of Aging. 30 (3), 337-352 (2009).
- Walhovd, K. B., Fjell, A. M., Espeseth, T. Cognitive decline and brain pathology in aging--need for a dimensional, lifespan and systems vulnerability view. Scandinavian Journal of Psychology. 55 (3), 244-254 (2014).
- Wittchen, H. U., et al. The size and burden of mental disorders and other disorders of the brain in Europe 2010. European Neuropsychopharmacology. 21 (9), 655-679 (2011).
- Traynelis, S. F., et al. Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function. Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).
- Mony, L., Kew, J. N., Gunthorpe, M. J., Paoletti, P. Allosteric modulators of NR2B-containing NMDA receptors: molecular mechanisms and therapeutic potential. British Journal of Pharmacology. 157 (8), 1301-1317 (2009).
- Lau, C. G., Zukin, R. S. NMDA receptor trafficking in synaptic plasticity and neuropsychiatric disorders. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 413-426 (2007).
- Zhou, Q., Sheng, M. NMDA receptors in nervous system diseases. Neuropharmacology. 74, 69-75 (2013).
- Paoletti, P., Bellone, C., Zhou, Q. NMDA receptor subunit diversity: impact on receptor properties, synaptic plasticity and disease. Nature Reviews Neuroscience. 14, 383 (2013).
- Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. Diversity in NMDA receptor composition: many regulators, many consequences. Neuroscientist. 19 (1), 62-75 (2013).
- Neyton, J., Paoletti, P. Relating NMDA receptor function to receptor subunit composition: limitations of the pharmacological approach. Journal of Neuroscience. 26 (5), 1331-1333 (2006).
- Hunt, D. L., Castillo, P. E. Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 496-508 (2012).
- Huganir, R. L., Nicoll, R. A. AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years. Neuron. 80 (3), 704-717 (2013).
- Shimomura, H., et al. Glycine plays a crucial role as a co-agonist of NMDA receptors in the neuronal circuit generating body movements in rat fetuses. Neuroscience Research. 97, 13-19 (2015).
- Tajima, N., et al. Activation of NMDA receptors and the mechanism of inhibition by ifenprodil. Nature. 534 (7605), 63-68 (2016).
- Mayer, M. L., Westbrook, G. L., Guthrie, P. B. Voltage-dependent block by Mg2+ of NMDA responses in spinal cord neurones. Nature. 309 (5965), 261-263 (1984).
- Zhu, S., et al. Mechanism of NMDA Receptor Inhibition and Activation. Cell. 165 (3), 704-714 (2016).
- Yildiz-Unal, A., Korulu, S., Karabay, A. Neuroprotective strategies against calpain-mediated neurodegeneration. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 11, 297-310 (2015).
- Gascon, S., Sobrado, M., Roda, J. M., Rodriguez-Pena, A., Diaz-Guerra, M. Excitotoxicity and focal cerebral ischemia induce truncation of the NR2A and NR2B subunits of the NMDA receptor and cleavage of the scaffolding protein PSD-95. Molecular Psychiatry. 13 (1), 99-114 (2008).
- Uttara, B., Singh, A. V., Zamboni, P., Mahajan, R. T. Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options. Current Neuropharmacology. 7 (1), 65-74 (2009).
- Hansen, K. B., et al. Implementation of a fluorescence-based screening assay identifies histamine H3 receptor antagonists clobenpropit and iodophenpropit as subunit-selective N-methyl-D-aspartate receptor antagonists. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 333 (3), 650-662 (2010).
- Bettini, E., et al. Identification and characterization of novel NMDA receptor antagonists selective for NR2A- over NR2B-containing receptors. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335 (3), 636-644 (2010).
- Feuerbach, D., Loetscher, E., Neurdin, S., Koller, M. Comparative pharmacology of the human NMDA-receptor subtypes R1-2A, R1-2B, R1-2C and R1-2D using an inducible expression system. European Journal of Pharmacology. 637 (1-3), 46-54 (2010).
- Hansen, K. B., Brauner-Osborne, H., Egebjerg, J. Pharmacological characterization of ligands at recombinant NMDA receptor subtypes by electrophysiological recordings and intracellular calcium measurements. Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 11 (4), 304-315 (2008).
- Guo, H., et al. A NMDA-receptor calcium influx assay sensitive to stimulation by glutamate and glycine/D-serine. Scientific Reports. 7 (1), 11608 (2017).
- Hackos, D. H., et al. Positive Allosteric Modulators of GluN2A-Containing NMDARs with Distinct Modes of Action and Impacts on Circuit Function. Neuron. 89 (5), 983-999 (2016).
- Romero-Hernandez, A., Furukawa, H. Novel Mode of Antagonist Binding in NMDA Receptors Revealed by the Crystal Structure of the GluN1-GluN2A Ligand-Binding Domain Complexed to NVP-AAM077. Molecular Pharmacology. 92 (1), 22-29 (2017).
- Auberson, Y. P., et al. 5-Phosphonomethylquinoxalinediones as competitive NMDA receptor antagonists with a preference for the human 1A/2A, rather than 1A/2B receptor composition. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 12 (7), 1099-1102 (2002).
- Danysz, W., Parsons, C. G. Glycine and N-methyl-D-aspartate receptors: physiological significance and possible therapeutic applications. Pharmacological Reviews. 50 (4), 597-664 (1998).
- Liu, M. K., et al. Topoisomerase II Inhibitors Can Enhance Baculovirus-Mediated Gene Expression in Mammalian Cells through the DNA Damage Response. International Journal of Molecular Science. 17 (6), (2016).
