Summary
В основном этот протокол является эффективно изолировать жизнеспособных первичных клубочков культур с минимальными загрязняющих веществ для использования в различных нисходящие приложения. Изолированные клубочков удерживать структурные отношения между типами компонентов клеток и может быть культивировали ex vivo на короткое время.
Abstract
Ключевую роль в предотвращении гломерулонефрит, категории характерны протеинурия, который в конечном итоге может привести к хронической болезни почек и терминальной стадии почечной болезни является сохранение клубочковых структуры и функции. Glomerulus это сложный аппарат ответственным для фильтрации плазмы от тела. В болезни структурная целостность теряется и позволяет аномальной утечки содержимого плазмы в моче. Метод, чтобы изолировать и изучить клубочков в культуре имеет решающее значение для изучения этих заболеваний. В этом протоколе описан эффективный метод извлечения нетронутыми клубочков почек взрослых крыс сохраняя структурно-морфологические характеристики. Этот процесс способен генерировать высокие урожаи клубочков за почек с минимальным загрязнением от других сегментов нефрон. С этими клубочков можно имитировать условия травмы по инкубации их с различных химических токсинов, включая протамина сульфат, который вызывает ноги процесс самоотречение и протеинурии на животных моделях. Степень повреждения может быть оценена с помощью просвечивающей электронной микроскопии иммунофлуоресценции окрашивание и Западный blotting. От этих культур могут также оценить Nephrin и 1 опухоли Вильмса (РК1) уровнях. Благодаря легкости и гибкости этого протокола изолированные клубочков могут быть использованы как описано, или способом, который лучше всего соответствует потребностям исследователь помочь лучше исследование клубочковых здравоохранения и структуры государства в больными.
Introduction
Glomerulus это узкоспециализированные пучок капилляров, ответственных для фильтрации циркулирующей плазмы. Он образует начало нефрон, которая является основной функциональной единицей почки. Клубочковых функция определяется однозначно перфорированную эндотелия капилляров, щели диафрагма podocytes и промежуточные базальной мембраны. Эти слои образуют полупроницаемых барьер для селективного экскреции веществ в фильтрате. Воды, ионов и других малых молекул обычно проходят, в то время как более крупные молекулы сохраняются в плазме. Podocytes являются специализированные эпителиальные клетки, которые распространились базальной мембраны, окружающие капилляров с цитоплазматических прогнозы, известный как нога процессов. Подножия процессы смежных podocytes interdigitate и пересек диафрагмами щели, состоит из белков, таких как nephrin, podocin, P-Кадгерины и ZO-11. В сечении эти ноги процессы равномерно расположены над базальной мембраны. В пораженной клубочков ноги процессы стали грубо ненормальное или «стираются», ведущий к аномальной утечки содержимого плазмы в фильтрат. Таким образом повреждения клубочковых обычно характеризуется наличием ненормально большое количество белков (например, протеинурия) и/или красных кровяных клеток (например, гематурия) в моче. Кроме того раненых podocytes потерять выражение nephrin, а также его регулятор Вильмс опухоли 1 (РК1), основных белков, отвечает за поддержание дифференциации2,3. Клубочков являются основной мишенью повреждения в диабетической нефропатии и другие glomerulonephritides болезни минимальные изменения, мембранное нефропатии и фокуса сегментарный гломерулосклероза. Эти заболевания являются основными причинами прогрессивного почечной недостаточности и развития терминальной стадии почечной болезни, состояние, в котором выживания опирается на диализ или трансплантации почки. Таким образом важно изучить клубочков лучше понять хронической почечной болезни (CKD) патологии.
В системе культуры клеток имеет решающее значение для изучения клубочковых биологии. Из-за его центральную роль в генерации щели диафрагмы, а также наличие конкретных протеинурией заболеваний из-за мутации белка диафрагмы щели много исследований понятно использовал Подоцит в изоляции. Это привело к генерации первичных Подоцит клеточных линий для использования в пробирке. Эти клетки могут быть культивировали при различных условиях и даже может быть выращен на проницаемых опоры для оценки проницаемость4. Однако изоляции пролиферирующих клеток часто выбирает Дедифференцированная клетки, которые потеряли некоторые из их Подоцит маркеров. Это привело к генерации условно увековечен podocytes, производный от штамма трансгенные мыши, перевозящих чувствительных к температуре мутант SV40 гена большой T (например immortomouse), который может быть выращен в культуре, но также быть дифференцированные выразить полный спектр Подоцит маркеры5. Эти методы первичной культуры были ключевую роль в понимании Подоцит биология4,6,7.
Тем не менее культур, содержащих одну ячейку типы не хватает межклеточных связей, которые происходят в естественных условиях , а также структуры поддержки и матрицы, и монослои этих клеток не обязательно пилки трехмерной Архитектура клубочков. Увековечен podocytes также может быть громоздким и сложным для культуры8и требуется владение либо immortomouse или начальный Алиготе клеток от установленных следователей для начала. Кроме того glomerulus состоит из не только podocytes, но также капиллярных эндотелиальных клеток и базальной мембраны, а также Мезангиальный клетках, которые предоставляют поддержку для структуры. Поэтому полезно разработать ex vivo подход, доступных для всех следователей для изучения нетронутыми клубочков, которые сохраняют их собственная архитектура, а также всех клеток, составляющих нормального glomerulus.
В 1958 году повар и Пикеринг описал первый изоляции от кролика почечных клубочков. После замечания, что жировой эмболии стал подал в клубочков они постулируется, что частицы такого же размера могут использоваться специально изолировать эти структуры. Действительно вливание частицы окиси железа в почках, привели к треппинга этих частиц в клубочков. После механических диссоциации и просеивания почки клубочков может быть изолированы нетронутыми и с чистотой с помощью магнитной сепарации9. В 1971 году Мисра показали, что оксид железа, которое инфузии может быть опущен и клубочковых изоляции, достигнутые с просеивание фарша человека, собака, кролик или крыса почечной ткани10. Этот метод был изменен с момента затем в зависимости от цели следователей, но по существу привело к чистые препараты, может быть дополнительно изучить или из которого культуры главной ячейки может быть установленным11,12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17.
Здесь мы описываем протокол для изоляции нетронутыми жизнеспособных клубочков из почек крыс. Весь протокол занимает всего несколько часов. Хотя они не размножаются, экспериментальные планы любого размера могут поддерживаться, просто увеличив количество почек как исходный материал. Хотя есть опубликованные протоколы для разделения магнитный шарик клубочков, они требуют внутривенным введением бусы, являются более дорогостоящими и может изменить биологии, поскольку бисера либо удерживаются клубочков в культуре или требуют клубочковых» лизировать» и удаления с помощью центрифугирования19. По сравнению с мыши клубочков, больший размер крыса клубочков (около 100 мкм в два месяца старых крыс18) делает его гораздо проще отделить их от других структур почек, используя простой метод просеивания.
Как свидетельство их полезность мы были характерны клубочков для демонстрации различных типов клеток. Они также могут быть подвержены агентов, известных травмировать клубочков в естественных условиях, и мы демонстрируем неблагоприятных последствий протамина сульфат (PS) на этих культур. PS это поликатион, который нейтрализует анионные сайты вдоль клубочковых капилляров стены20. Эта нейтрализация имеет сильнейшее влияние на барьер клубочковой фильтрации и таким образом увеличивает протеинурия и ног процесс самоотречение. Эти клубочков можно оценить с иммуноблотов для ключевых белков, таких как nephrin и РК1 оценить общее состояние здоровья. Кроме того их структура может оцениваться с света, иммунофлюоресценции и электронной микроскопии.
В целом этот протокол является доступным для большинства следователей (одна только необходим доступ к животных и некоторых простых оборудования). Морфологические особенности оставили неповрежденными исследователь способен анализировать клубочков и посмотреть, как другие типы важных клеток и сохранение матрицы в клубочков влияют на функции и болезнь прогрессии, недостатком Подоцит культур.
Protocol
Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из университета Питтсбурга.
1. изоляция клубочков крыса
- Подготовить стерильные буфер 1% изоляции, добавьте 5 g бычьим сывороточным альбумином (БСА) 600 мл стакан.
- Добавьте стакан 500 мл 1 x-фосфатный буфер (PBS) и перемешать с магнитной палочки помешивая, пока все BSA не растворится.
- Стерильные фильтр 1% BSA/PBS буфера в капюшоне культуры клеток.
Примечание: Стерильные 1% BSA/PBS буфер может храниться на 4 ° C на срок до недели.
- Получите 2-4 крысах Sprague-Dawley весом 150-200 г.
- Усыпить крыс через двуокиси углерода ингаляции с помощью камеры, в которой вводится 100% двуокиси углерода в размере 10-30% от объема камеры в минуту. Наблюдать животных для прекращение дыхания и исчез цвет глаз до удаления от углекислого газа.
- Подготовить кожу над передней брюшной полости с 70% этанола и использовать для удаления волос, стрижки, при желании. Сделайте срединной разрез в коже, используя Ножницы хирургические или скальпелем. Сделайте еще один срединной линии разреза через слой мышц подвергать внутренние органы. Расширить надрез сверху через диафрагму и грудины или грудная клетка как дополнительный метод эвтаназии.
- Изолировать и удалить обе почки и место в стерильных 50 мл пластиковых Конические трубки с 30 мл Hanks буфферезированный раствор соли (HBSS) на льду.
Примечание: Несколько крыс может быть euthanized в той же камере и все функции почек могут быть размещены в том же конической трубки.
- Держите почки на льду и транспорта капот культуры стерильных клеток. Передаче почки в стерильных Петри блюдо, содержащих 5 мл HBSS, также над льдом и удалить и сбросить околопочечный жир с ножницами и острые щипцы. Если по-прежнему присутствует, также удалить и сбросить капсулы вокруг почки, сделав небольшой поверхностный надрез, а затем использовать острые щипцы аккуратно вытащить его от органа.
Примечание: Всегда держите изолятов почек на льду и практики стерилизации во всем. Кусок стерильной марли могут быть размещены в чашке Петри как текстурированная поверхность держать почки на месте во время манипуляции.- Почки пополам продольно (среднесагиттальную раздел) и снимите и выбросьте продолговатого мозга (которая темне в цвете) с помощью скальпеля в второй Петри с 5 мл HBSS.
- Перевести оставшиеся куски, которые являются преимущественно почечной коры, в третьей чашке Петри с 5 мл HBSS и фарш с стерильные лезвия бритвы, пока кусочки размером менее 1 мм, или до тех пор, пока тесто формируется.
- Влажные в верхней и нижней части 180 мкм сито с 1% BSA/PBS над 500 мл стакан отходов. Этот шаг очень важен, как пальто сито с белком и уменьшает прилипание клубочков, повышающих доходность.
- Место рубленой коры на острие небольшой сита и использовать текстурированные поршень фланец (противоположной резиновое уплотнение) 10 мл шприц для Муш ткани через сито в сковороду снизу, сидя на льду. Периодически промыть HBSS, но использовать как можно меньше избежать разбавления образца.
Примечание: Не превышать 30 мл буфера общей, так что только 25 мл больше могут быть использованы здесь. Причина для размещения в фарш из ткани на только одном краю сита для уменьшения присоединение клубочков, ограничивая воздействие частью сито, вместо того, чтобы весь ситовой поверхности области.- Чтобы облегчить это, повторно используйте жидкость, собирая в дно кастрюли для полоскания сито. После просеивания, тщательно вымойте в нижней части сита еще раз с 1% BSA/PBS буфер из нижней части кастрюлю, чтобы захватить любые клубочков, которые могут соблюдаться слабо.
- Собрать все жидкости в дно кастрюли в несколько 10 мл-шприцы, с иглы 20 G и передать его через иглу по крайней мере 2 дополнительных раз. На последней коллекции Держите клубочков содержащие жидкости в шприц до готовности передать его через сито 90 мкм.
- В то время как жидкость хранится в шприцы, мыть дно кастрюли, перемещая с 1% BSA/PBS в отходов стакан и мокрой верхней и нижней части 90 мкм сито с 1% BSA/PBS. Поместите сито поверх нижней кастрюли на льду.
- Применение образца в шприцы к одному краю сито и Муш через сито с другой шприц фланцем, как описывается выше. Вымойте решения из нижней кастрюли собрать все на одном краю сита.
- После просеивания завершения, тщательно мыть нижней части сита как шаг 1.5.1. Соберите все жидкости в нижней кастрюли в 50 мл пластиковых Конические трубки.
- Мыть дно кастрюли с 1% BSA/PBS в отходов стакан и мокрой верхней и нижней части 75 мкм сито с 1% BSA/PBS. Поместите сито поверх нижней кастрюли на льду.
- Применение образца к одному краю сита. Жидкость должна течь через легко. Смыть через вершину с по крайней мере 20 мл 1% BSA/PBS в отходов стакан. Тщательно вымойте в нижней части сито также. Клубочков будет оставаться на вершине этой сито 75 мкм.
- Использование HBSS для сбора клубочков в чашке Петри, промыв через сито вверх дном. Используйте столько HBSS необходимости здесь. Соберите в одной или более 50 мл пластиковых Конические трубки на льду.
- Центрифуга на 1800 g x 5 минут при температуре 4 ° C, удалить супернатант тщательно с пипетки и Ресуспензируйте Пелле в 10 мл холодного HBSS. Объединить образцы, если несколько конические трубы были собраны в 1.7.2. Повторите шаг центрифугирования.
- Ресуспензируйте клубочков в 5 мл HBSS до готовности для перехода к следующему шагу.
- При желании, взять количество всего клубочков. Для этого Возьмите 10 мкл пример с пипеткой и место падения на стеклянное скольжение. Просмотр под микроскопом, граф клубочков в поле и умножить на 500, чтобы получить общий урожай.
Примечание: Чистота может быть определен путем подсчета количества канальцев, видели в поле и деления на общее количество клубочков и трубочку структур. В поле зрения должно быть > 95% клубочков.- Если есть значительное загрязнение трубчатые, повторите шаги 1.6.1 вперед и убедитесь, что тщательно мыть, когда завершения Шаг 1.7.1. Это шаг в котором трубчатых загрязнение чаще всего происходят.
2. травмы клубочков
- Соберите клубочков в 15 мл пластиковая коническая труба и спин вниз на 200 x g. Ресуспензируйте в соответствующее количество HBSS основаны на общей доходности так, что существует примерно 9000 клубочков за хорошо. Пипетка 450 мкл пример в каждую лунку 24-ну плиты, или любой формат пластины, который соответствует течению анализов требуется.
Примечание: Закупорить вверх и вниз, чтобы смешать клубочков в буфере обеспечивает однородный раствор. Клубочков очень липкий и тяжелые и будет прилипают друг к другу а также поселиться в нижней части решения быстро и по бокам трубки. - Чтобы сделать 6 мг/мл протамина сульфат раствор (PS), сначала растворяют 1 г в 10 мл подогретой до 40 ° C в 15 мл пластиковая коническая труба и вихревой тщательно dH2O ПС. Возьмите 30 мкл раствора и добавить в 470 мкл dH2O.
Примечание: Это будет производить 6 мг/мл раствора, и когда 50 мкл добавляются к также, как описано ниже, конечная концентрация 0,6 мг/мл.- В двух экземплярах, добавьте 50 мкл протамина сульфат (это 1:10 разрежения) к каждой хорошо одной группы, в то время поставки другой группы 50 мкл HBSS (отрицательный контроль).
- Инкубировать пластину для 4 ч при 37 ° C.
- Спин вниз содержимое каждой скважины в пробки microcentrifuge (4000 x g, 4 ° C, 10-15 s) и мыть дважды с 1 мл раствора PBS каждый.
- Аспирационная от окончательного мыть и Ресуспензируйте в 300 мкл PBS. Разделить на три аликвоты должен быть подготовлен для белка изоляции, передачи электронного микроскопа (ТЕА) визуализации и иммунофлюоресценции, окрашивание (если).
3. Подготовка клубочков для анализа
- Уменьшается содержание три аликвоты (4000 x g, 4 ° C, 10-15 s) и аспирата покинуть оставшиеся буфера и приступить к анализу выборки по ТЕА, если, или белков изоляции.
- Обработка для ТЕА
- Исправьте клубочковых окатышей в 150 мкл холодной глютаральдегид 2,5% в 0,01 М PBS. Осторожно снимите фиксатор из гранул с помощью пипетки Пастера, убедившись в том, чтобы не нарушить Пелле, затем промыть PBS и пост исправить это в 1% осмия тетраоксид с 1% калия Гексацианоферрат.
- Обезвоживает образца через серию градуированных этанола (30, 50, 70, 90, 100, 100, 100%) и окись пропилена затем встроить в эпоксидных, встраивание материала.
- Вырезать полутонкая (300 Нм) разделы на ultramicrotome. Пятно с 0,5% толуидиновый синий в Борат натрия 1% и рассматривать их под микроскопом света.
- Вырезать ультратонких секции (65 нм), линяют с уранила ацетат и Рейнольдса в свинец цитрат и изучить на просвечивающий электронный микроскоп.
- Обработка для если
- 150 мкл 12% желатина в PBS решение и сразу же место на сухой лед в форме гранул. Замочите гранулы в 500 мкл 2% параформальдегида/1 x PBS в пробки microcentrifuge на ночь при 4 ° C.
- Гранулы в базовой формы и вставлять путем добавления оптимального раскроя средней температуры (OCT) над сухого льда. Вырезать разделы 5-10 мкм на cryotome и продолжите иммунофлюоресценции/иммуногистохимия или стандартные гистологические пятна.
- Для изоляции белка
- 150 мкл Буфер RIPA, центрифугировали клубочковых лепешка с 1,5 мкл ингибитора протеазы и dounce с ткани гомогенизаторы.
- Перейти к количественной белка и immunoblotting или другие анализа белка.
Representative Results
Протокол от времени эвтаназии для изоляции клубочков может быть завершена в качестве лишь 2 h и имеет высокую пропускную способность и эффективность. С надлежащее использование техники доходность клубочков в почках крыс колеблется от 6000-10000 клубочков когда начиная с 8 почек. Окончательное приостановление плотно упакованные с клубочков и имеет общую > 95% чистоты, показаны минимальное загрязнение из трубчатых сегментов или другие типы клеток (рис. 1A, B). Кроме того Сен встроенный клубочков можно окрашивали гематоксилином и эозином (H & E) пятна, чтобы увидеть морфологии (рис. 1C). Эти клубочков сохранять свои структуры на протяжении всего протокола, даже после обработки. Мы демонстрируем, что изолированные клубочков обладают нетронутыми и жизнеспособного podocytes (рисA), Мезангиальный клетках (рис. 2B) и эндотелиальных клеток (рис. 2C).
После того, как изолированные, клубочков может подвергаться воздействию известных химических повреждений для имитации в естественных условиях патологии. В этом случае протамина сульфат (PS) был выбран за его способность сорвать заряд клубочковой фильтрации барьер, который в конечном итоге приводит к ноге процесса самоотречение. PS-лечение клубочков имеют поразительное сокращение nephrin (красный) и количество ядер позитивные для РК1 (зеленый) через иммунофлюоресценции (рис. 3A, B). Клубочков также могут быть подготовлены для передачи электронной микроскопии (рис. 3C). Примеры элементов управления имеют нормальное Подоцит морфологии и ног процессы, тогда как клубочков PS-лечение ног процесс самоотречение (Рисунок 3D), который является признаком Подоцит дисфункции и видели в в естественных условиях модели с помощью PS21. Это также соответствует уменьшение nephrin, обнаруженных immunoblotting (Рисунок 3E, F).
Чтобы определить жизнеспособность, рассеченного каспазы-3 был оценен как маркер апоптоза. С помощью иммунофлюоресценции, рассеченного каспазы-3 впервые появляется в нескольких ячейках, начиная с 2 ч после изоляции (рис. 4). Количество клеток, выражая это протеазы стал более обильные, со временем, с самыми высокими уровнями, видели на 24 и 48 ч. Это свидетельствует о том, что apoptosis происходят довольно рано в культуре и что нисходящие приложения должно быть выполнено вскоре после изоляции для достижения наилучших результатов.
Рисунок 1 . Типичный вид крысы клубочковых культур после изоляции. (A) Brightfield изображения клубочковых культуры. Хотя мы выбрали поле, в котором есть один почечной трубочку в этом микрофотография (стрелки), полученные культур, как правило, > 95% чистой. Линейки шкалы равен 100 µm. (B) Расширенное изображение одного glomerulus. (C) гематоксилином и эозином пятно из одного glomerulus. Масштаб баров в B и C равны 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Типы клеток, составляющих сохраняются в изолированных клубочков. Конфокальный иммунофлуоресценции была исполнена для nephrin (красный, podocytes) и клеток специфических маркеров для выявления podocytes и Мезангиальный клетках эндотелия. Костейн (A) для nephrin и РК1 (зеленый, podocytes). (B) Костейн для nephrin и PDGFR-β (зеленый, Мезангиальный клетках, стрелка). Костейн (C) для nephrin и CD31 (зеленый, эндотелиальные клетки, судов в сечении, отмеченные стрелки). Шкалы бар = 25 мкм на всех панелях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . Подоцит травма может быть индуцированные в пробирке с помощью изолированных крыса клубочков. (A) конфокальный иммунофлуоресценции для nephrin и РК1 в необработанной клубочковых культуры. Обратите внимание на линейной nephrin окрашивание (красный) и присутствие РК1 позитивных ядер (зеленый), которые обычно видели когда есть здоровый podocytes. (.B) после протамина сульфат лечения, nephrin выражение является снижение и нелинейных и РК1 отсутствует, указывающее Подоцит травмы. (C) передачи электронов microscpy (ТЕА) изображения показаны ног процессы, базальной мембраны и перфорированную эндотелия, типичных для нормального клубочковых структуры. Бар равен 500 Нм. (D) после протамина сульфат, ноги процессы являются удлиненные или стертых (стрелки), который указывает Подоцит травмы. (E) западную помарку для nephrin показаны уменьшилось nephrin после лечения протамина сульфат. (F) актин контроля для западной помарки загрузки отображается. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 . Оценка жизнеспособности клеток в изолированных клубочков. Конфокальный иммунофлуоресценции рассеченного каспазы-3 (зеленый) была выполнена. Пятно со nephrin была исполнена легко найти клубочков. Хотя не рассеченного позитивность каспазы-3 на 0 и 1 h после изоляции клубочков, сигнал флуоресценции в нескольких клеток было отмечено в в 2 ч. постепенно, больше клеток оказалось позитивные больше после изоляции, они были рассмотрены. Наибольшее количество положительных клеток каспазы-3 были отмечены на 24 и 48 ч. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Это эффективный метод для восстановления клубочков почек крыс с помощью недорогой, многократного использования оборудования с простой протокол. Как и в случае со всеми процедурами, существуют ограничения на его полезность. Во-первых хотя мы получаем > 95% чистоты, из-за просеивание характер протокола и исходного материала, которую невозможно исключить все загрязнители и несколько красных кровяных клеток и иногда трубчатых сегмент будет присутствовать в культуре. Мы не ожидаем этих небольших загрязнений быть проблемой для большинства приложений. Во-вторых просеивание протокол основывается на использовании почек крыс, в которых клубочков гораздо больше, чем у мышей. Если требуется мышь клубочков, техника, с помощью коммерческих магнитные бусы (например, Dynabeads) был Опубликовано22. В-третьих, было доказано, что конкретные мРНК (активатор плазминогена ингибитор-1 и коллаген я) в изолированных клубочков наследовать почти полностью Bowman's капсула вместо того, чтобы intraglomerular клетки23. Это может привести к неуместным выводы, если предпринимается попытка мРНК изоляции от этих клубочков. Следует отметить, что в наших руках большинство клубочков очищенные и должны поэтому не хватает значительный вклад от боуменова капсулы. В-четвертых смерть клетки начинает проявляться относительно быстро в условиях культуры.
Мы обнаружили, что апоптотической программы, о чем свидетельствует появление рассеченного каспазы-3, был активирован начиная 2 h культуры. Это в целом соглашение с предыдущими докладами, показывающ что apoptosis, как фрагментация ДНК, TUNEL и гистологический анализ, оценку начинает происходить в течение 1-2 ч после изоляции24. Однако следует также отметить, что ранние наблюдения показали, что метаболической активности могут быть обнаружены от изолированных фильтруют клубочков, когда культивировали для по крайней мере 3 h, предлагая значительные клеточной жизнеспособности этой timepoint16. Тем не менее основываясь на результатах, мы считаем, что было бы разумно использовать изолированные клубочков сразу в эксперименты предназначены для достижения наилучших результатов. Мы рекомендуем, что все эксперименты выполняться до 72 ч, как мы заметили, что вся структура клубочковых начинает ухудшаться после этого timepoint.
Это гораздо проще получить более высокие урожаи, когда начиная с 4-8 почек в отличие от только 2 потому что определенное количество клубочков теряются в результате присоединения к различным сита, но как только максимально покрыты сита без дополнительных потерь. По той же причине важно впитать сита в BSA/PBS буфера до использования как клубочков, скорее присоединиться к сухой сито и ограничить воздействие ткани к одному краю сита. Мы рекомендуем, начиная с не менее чем 6 почки (3 крысы) для получения разумной доходности.
Некоторые исследователи выделили первичной Подоцит культур от изолированных клубочков, которые имеют тенденцию расти из клубочков во время культуры17. Мы отмечаем, что некоторые изолированные клубочков будет придерживаться пластической культуры блюдо и что клетки начнут мигрировать из клубочковых структуры в конце timepoints (72 ч после изоляции). Изучение этих клеток выходит за рамки настоящего Протокола изоляции, и есть некоторые споры относительно того, являются ли эти клетки podocytes, теменной эпителиальных клеток или оба15,25. В частности, Манделл et al., сообщили, что булыжником клетки заготавливаемым от фильтруют клубочков, может быть вызван дифференцироваться в зрелых podocytes под конкретные культивирования условий26. Некоторые из путаницы относительно личности клетки может зависеть ли изолированных клубочков инкапсулируются (включая лучник в капсулу, которая заполняется эпителиальными клетками париетальной) или очищенные в процедуре просеивания. В наших руках, используя последовательный сито размеры 180 90 и 75 мкм привело к большинству клубочков, что очищенные.
Большинство форм протеинурией хронические заболевания почек, за счет увеличения проницаемости клубочковых. Некоторые авторы использовали изолированные клубочков в ex vivo проницаемость экспериментов. В одном методе изменение объема клубочковых после изменения осмотической содержание окружающих СМИ использовалась для оценки проницаемость27. Недавно было установлено, что утечка флуоресцентный зонд из изолированных клубочков может быть количественно измерить проницаемости и может быть выполнена в грызунов, подвергается клубочковых болезни экспериментальные модели28.
Мы отметили, что в процессе подготовки ТЕА, мы иногда видим Подоцит ног процессы подъема базальной мембраны. Мы не считаем это происходит в культуре и скорее является артефактом во время подготовки проб ТЕА. В частности даже когда это происходит, ясно ли выглядеть «нормальный» или являются стертых ноги процессы.
В целом этот протокол предоставляет метод, по которому можно оценить морфологические и клеточные изменения в ответ на травмы. Мы ожидаем, что он может использоваться как метод компаньон для изолированных Подоцит культур, особенно когда рассматриваются взаимодействия с внеклеточного матрикса или другие типы собственных клеток. Это открывает перспективы для повышения понимания протеинурией CKD, которая повысит способность разрабатывать будущие терапии для этой изнурительной болезни.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана американской ассоциации сердца Грант FTF 16990086, низ Р30 DK079307, американского общества нефрологии Готтшальк премии, Университет Питтсбурга медицинский центр конкурентных медицинских исследований фонда премии и Университет Питтсбурга Врачей академического фонда премии. Мы благодарим Gerard Apodaca за его технического предложения для клубочковых сохранения для гистологического анализа, Мара Салливан и Ming Sun для помощи с электронной микроскопии и ли Yingjian и Лю Youhua для их технический вклад в настоящем Протоколе. Мы также благодарим Синтия St. Hilaire за CD31 антител.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions, Chemicals, and Animals | |||
| Sprague-Dawley Rats | Envigo | 207M | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1605100 | |
| Hank's Balanced Salt Solution with Ca2+ and Mg2+ | Thermo | 14025092 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline | VWR | 97063-660 | |
| Protamine sulfate | MP Bio | ICN15197105 | |
| Karnovsky's Fixative | |||
| Gelatin | |||
| Paraformaldehyde | EMD | EM-PX0055-3 | |
| O.C.T. | Scigen | 23730571 | |
| RIPA Buffer | |||
| Halt Protease Inhibitors | Thermo | PI78442 | |
| Nephrin Antibody | Fitzgerald | 2OR-NP002 | |
| WT-1 Antibody | Abcam | ab89901-10ul | |
| PDGFR-β Antibody | Cell Signaling | #3169S | |
| CD31 Antibody | LSBio | LS-C348736 | |
| Cleaved caspase-3 antibody | Cell Signaling | 9661S | |
| Poly/Bed 812 (Luft) epoxy | Polysciences | 08792-1 | |
| Equipment | |||
| Carbon dioxide chamber | |||
| Conical tubes, 15 mL | |||
| Conical tubes, 50 mL | |||
| Surgical scissors | |||
| Surgical forceps | |||
| Sterile gauze | |||
| Petri dishes, 100 mm | |||
| Scalpels | |||
| Razor blades | |||
| Sterile filter apparatus | |||
| Sieve Pan | Alfa Aesar | AA39999ON | |
| 180um Sieve | Alfa Aesar | AA39996ON | |
| 90um Sieve | Alfa Aesar | AA39990ON | |
| 75um Sieve | Alfa Aesar | AA39991ON | |
| 10 mL syringes | |||
| 600 mL beakers | |||
| Cell culture incubator | |||
| Picofuge | |||
| Vortex | |||
| Tissue Homogenizers | Fisher Scientific | 50550226 | |
| 20 G needles | |||
| Leica Reichart Ultracut | ultramicrotome |
References
- Grahammer, F., Schell, C., Huber, T. B. Molecular understanding of the slit diaphragm. Pediatric Nephrology. 28 (10), 1957-1962 (2013).
- Tan, R. J., Zhou, L., Zhou, D., Lin, L., Liu, Y. Endothelin receptor a blockade is an ineffective treatment for adriamycin nephropathy. PLoS One. 8 (11), 79963 (2013).
- Wagner, N., Wagner, K. D., Xing, Y., Scholz, H., Schedl, A. The major podocyte protein nephrin is transcriptionally activated by the Wilms' tumor suppressor WT1. Journal of the American Society of Nephrology. 15 (12), 3044-3051 (2004).
- Rogacka, D., et al. Insulin increases filtration barrier permeability via TRPC6-dependent activation of PKGIalpha signaling pathways. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (6), 1312-1325 (2017).
- Mundel, P., et al. Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines. Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).
- Moller, C. C., et al. Induction of TRPC6 channel in acquired forms of proteinuric kidney disease. Journal of the American Society of Nephrology. 18 (1), 29-36 (2007).
- Tian, D., et al. Antagonistic regulation of actin dynamics and cell motility by TRPC5 and TRPC6 channels. Science Signaling. 3 (145), 77 (2010).
- Shankland, S. J., Pippin, J. W., Reiser, J., Mundel, P. Podocytes in culture: past, present, and future. Kidney Internationalernational. 72 (1), 26-36 (2007).
- Cook, W. F., Pickering, G. W. A rapid method for separating glomeruli from rabbit kidney. Nature. 182 (4642), 1103-1104 (1958).
- Misra, R. P. Isolation of glomeruli from mammalian kidneys by graded sieving. American Journal of Clinical Pathology. 58 (2), 135-139 (1972).
- Burlington, H., Cronkite, E. P. Characteristics of cell cultures derived from renal glomeruli. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 142 (1), 143-149 (1973).
- Harper, P. A., Robinson, J. M., Hoover, R. L., Wright, T. C., Karnovsky, M. J. Improved methods for culturing rat glomerular cells. Kidney International. 26 (6), 875-880 (1984).
- Kreisberg, J. I., Hoover, R. L., Karnovsky, M. J. Isolation and characterization of rat glomerular epithelial cells in vitro. Kidney International. 14 (1), 21-30 (1978).
- Weinstein, T., Cameron, R., Katz, A., Silverman, M. Rat glomerular epithelial cells in culture express characteristics of parietal, not visceral, epithelium. Journal of the American Society of Nephrology. 3 (6), 1279-1287 (1992).
- Yaoita, E., Kurihara, H., Sakai, T., Ohshiro, K., Yamamoto, T. Phenotypic modulation of parietal epithelial cells of Bowman's capsule in culture. Cell and Tissue Research. 304 (3), 339-349 (2001).
- Meezan, E., Brendel, K., Ulreich, J., Carlson, E. C. Properties of a pure metabolically active glomerular preparation from rat kidneys. I. Isolation. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 187 (2), 332-341 (1973).
- Piwkowska, A., et al. Insulin increases glomerular filtration barrier permeability through PKGIalpha-dependent mobilization of BKCa channels in cultured rat podocytes. Biochimica et Biophysica Acta. 1852 (8), 1599-1609 (2015).
- Kotyk, T., et al. Measurement of glomerulus diameter and Bowman's space width of renal albino rats. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 126, 143-153 (2016).
- Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Exp Ther Med. 5 (5), 1322-1326 (2013).
- Leeuwis, J. W., Nguyen, T. Q., Dendooven, A., Kok, R. J., Goldschmeding, R. Targeting podocyte-associated diseases. Advanced Drug Delivery Reviews. 62 (14), 1325-1336 (2010).
- Subramanian, B., et al. Mice with mutant Inf2 show impaired podocyte and slit diaphragm integrity in response to protamine-induced kidney injury. Kidney International. 90 (2), 363-372 (2016).
- Takemoto, M., et al. A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice. American Journal of Pathology. 161 (3), 799-805 (2002).
- Steinmetz, O. M., et al. A pitfall of glomerular sieving: profibrotic and matrix proteins derive from the Bowman's capsule and not the glomerular tuft in rats with renovascular hypertension. Nephrology Dialysis Transplantation. 22 (10), 3055-3060 (2007).
- Ishikawa, Y., Kitamura, M. Spontaneous apoptosis of podocytes in explanted glomeruli. Technical note. Kidney International. 54 (6), 2008-2013 (1998).
- Krtil, J., Platenik, J., Kazderova, M., Tesar, V., Zima, T. Culture methods of glomerular podocytes. Kidney and Blood Pressure Research. 30 (3), 162-174 (2007).
- Mundel, P., Reiser, J., Kriz, W. Induction of differentiation in cultured rat and human podocytes. Journal of the American Society of Nephrology. 8 (5), 697-705 (1997).
- McCarthy, E. T., et al. TNF-alpha increases albumin permeability of isolated rat glomeruli through the generation of superoxide. Journal of the American Society of Nephrology. 9 (3), 433-438 (1998).
- Desideri, S., et al. A novel assay provides sensitive measurement of physiologically relevant changes in albumin permeability in isolated human and rodent glomeruli. Kidney International. 93 (5), 1086-1097 (2018).
