Summary
التركيز الرئيسي لهذا البروتوكول كفاءة عزل الثقافات glomeruli الأولية قابلة للبقاء مع الحد الأدنى من الملوثات لاستخدامها في مجموعة متنوعة من التطبيقات المتلقين للمعلومات. الاحتفاظ بعلاقات هيكلية بين أنواع الخلايا مكون glomeruli معزولة ويمكن مثقف السابقين فيفو لفترة قصيرة.
Abstract
الحفاظ على بنية الكبيبي والدالة دور أساسي في الوقاية من التهاب الكلية، وفئة من أمراض الكلي تميزت بروتينية يمكن أن تؤدي في نهاية المطاف إلى المزمنة ونهاية مرحلة المرض الكلوي. الكبيبة جهاز معقد مسؤولة عن تنقية البلازما من الجسم. في المرض، يتم فقدان السلامة الهيكلية ويسمح بتسرب محتويات البلازما غير طبيعية في البول. طريقة لعزل ودراسة جلوميرولي في الثقافة أمر بالغ الأهمية لدراسة هذه الأمراض. ويرد في هذا البروتوكول، طريقة فعالة لاسترداد glomeruli سليمة من الفئران الكبار الكلي مع المحافظة على الخصائص الهيكلية والمورفولوجية. هذه العملية قادرة على توليد عالية الغلة من glomeruli الواحد الكلي مع الحد الأدنى من التلوث من سائر شرائح كليون. بهذه جلوميرولي، يمكن أن تحاكي ظروف الإصابة التي تفرخ منهم مع مجموعة متنوعة من السموم الكيميائية، بما في ذلك سلفات البروتامين، وهي أسباب القدم إغاراته العملية وبروتينيه في نماذج حيوانية. ويمكن تقييم درجة الإصابة باستخدام مجهر إلكتروني وتلطيخ الفلورة والنشاف الغربية. ويمكن أيضا تقييم نيفرين ومستويات Wilms الورم 1 (WT1) من هذه الثقافات. نظراً لسهولة ومرونة من هذا البروتوكول، يمكن أن تستخدم glomeruli معزولة كما هو موضح أو بطريقة تناسب احتياجات الباحث لمساعدة أفضل دراسة الصحة الكبيبي وهيكل في الدول المريضة.
Introduction
الكبيبة درجة عالية من التخصص خصل من الشعيرات الدموية المسؤولة عن الترشيح لتعميم البلازما. وهو يشكل بداية كليون، وهي الوحدة الوظيفية الأساسية للكلى. يتم تعريف الدالة الكبيبي بطانة شعرية فريد فينيستراتيد وشق الحجاب الحاجز من بودوسيتيس وغشاء الفاصلة. وتشكل هذه الطبقات حاجز سيميبيرميابل للسماح لإفراز المواد انتقائية في فيلتراتي. الماء والايونات والجزيئات الصغيرة الأخرى عموما تمر عبر، بينما تبقى الجزيئات الكبيرة في البلازما. بودوسيتيس هي الخلايا الظهارية المتخصصة أن تنتشر على الغشاء السفلي، المحيطة بالشعيرات الدموية مع إسقاطات هيولى المعروفة باسم عمليات سيرا على الأقدام. عمليات بودوسيتيس المتاخمة إينتيرديجيتاتي القدم وعبرت بشق أغشية تتكون من البروتينات مثل نيفرين، بودسين، فكادهيرين وزوى--11. في المقطع العرضي، قدم هذه العمليات بالتساوي مرتبة على الغشاء السفلي. في glomeruli المريضة، تصبح عمليات القدم صارخ غير طبيعي أو "ديانتهم"، مما أدى إلى تسرب غير طبيعي من محتويات البلازما إلى فيلتراتي. على هذا النحو، والضرر الكبيبي عموما تتميز بوجود كميات كبيرة عادية من البروتين (بروتينيةمثلاً ) و/أو خلايا الدم الحمراء في البول (بيله دمويةمثلاً ). وبالإضافة إلى ذلك، تفقد الجرحى بودوسيتيس التعبير نيفرين، فضلا عن أن منظم Wilms الورم 1 (WT1)، بروتين رئيسية مسؤولة عن الحفاظ على التمايز2،3. جلوميرولي هي هدفا أساسيا للضرر في حدوث السكري والأخرى جلوميرولونيفريتيديس مثل المرض سوى تغيير طفيف، وحدوث الغشائي، والتنسيق القطاعي glomerulosclerosis. هذه الأمراض هي الأسباب الرئيسية للفشل الكلوي التدريجي ووضع نهاية مرحلة المرض الكلوي، وشرط الذي يعتمد بقاء الغسيل الكلوي أو زرع الكلي. ولذلك، من المهم دراسة glomeruli فهم أفضل لأمراض الكلي المزمنة مرض (كد).
نظام ثقافة خلية أمر بالغ الأهمية لدراسة البيولوجيا الكبيبي. نظراً لدورها المركزي في توليد فتحه الحجاب الحاجز، فضلا عن وجود أمراض معينة بروتينوريك بسبب شق غشاء بروتين الطفرات، استخدمت الكثير من البحوث ومن المفهوم أن بودوسيتي في عزلة. وادي ذلك إلى توليد خطوط الخلايا بودوسيتي الأولية استخدامها في المختبر. هذه الخلايا يمكن أن تكون مثقف تحت مجموعة متنوعة من الظروف، وحتى يمكن أن تزرع على نفاذية يدعم تقييم نفاذية4. ومع ذلك، عزل الخلايا المتكاثرة كثيرا ما يختار ديديفيرينتياتيد الخلايا التي فقدت بعض علامات بودوسيتي على. وهذا أدى إلى توليد مخلدة مشروط بودوسيتيس المستمدة من سلالة ماوس المحورة وراثيا تحمل متحولة حساسة للحرارة SV40 كبيرة تي الجينات (مثل إيمورتوموسي)، التي يمكن أن تزرع في الثقافة ولكن أيضا أن تكون متباينة للتعبير عن مجموعة كاملة من علامات بودوسيتي5. هذه الأساليب من الثقافة الأولية كانت محورية في فهم بيولوجيا بودوسيتي4،،من67.
ومع ذلك، الثقافات التي تحتوي على أنواع خلية مفردة تفتقر إلى العلاقات بين الخلايا التي تحدث في فيفو ، فضلا عن دعم هيكل والمصفوفات، ومونولاييرس من هذه الخلايا لا الخص بالضرورة ثلاثي الأبعاد بنية glomeruli. بودوسيتيس مخلدة أيضا يمكن أن تكون مرهقة ومليئة بالتحديات الثقافة8، وتتطلب حيازة أما إيمورتوموسي أو قاسمة انطلاق من الخلايا في المنشأة المحققين الشروع في العمل. علاوة على ذلك، يتكون في الكبيبة ليس فقط بودوسيتيس، ولكن أيضا خلايا بطانية الشعرية والغشاء، كذلك خلايا mesangial التي توفر الدعم للهيكل. ولذلك أنها مفيدة لوضع السابقين فيفو نهج متاح لجميع المحققين لدراسة سليمة جلوميرولي التي تحتفظ بها الهندسة المعمارية الأصلية، فضلا عن كافة الخلايا التي تشكل الكبيبة العادية.
ووصف كوك وبيكرينغ في عام 1958، عزل أول glomeruli من الكلي أرنب. بعد الملاحظات أن أصبح قدم انصمام الدهون في جلوميرولي، افترض أن جزيئات من نفس الحجم يمكن أن تستخدم لعزل هذه الهياكل على وجه التحديد. وفي الواقع، ضخ جسيمات أكسيد الحديد في الكلي أدى إلى محاصرة هذه الجسيمات في glomeruli. بعد الانفصال الميكانيكية والنخل الكلي، يمكن glomeruli عزل سليمة ومع نقاء عن طريق استخدام الفاصل المغناطيسي9. في عام 1971، ميسرا أظهرت أن أكسيد الحديد يمكن حذف دفعات، والعزل الكبيبي مع النخل مفروم الإنسان، الكلب، والأرانب أو الفئران أنسجة الكلي10. هذا الأسلوب قد تم تعديلها منذ ثم تبعاً لهدف المحققين ولكن أدى أساسا إلى تنقية الأعمال التحضيرية التي يمكن دراستها كذلك أو التي يمكن أن تكون الثقافات الخلية الابتدائية أنشئت11،12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17.
هنا يمكننا وصف بروتوكول لعزل glomeruli سليمة قابلة للاستمرار من الكلي الفئران. بروتوكول كامل يستغرق ساعات قليلة فقط. على الرغم من أنها لا تتكاثر، يمكن دعم الخطط التجريبية لأي حجم ببساطة زيادة عدد الكلي كابتداء من المواد. بينما هناك بروتوكولات المنشورة لفصل المغناطيسية حبة glomeruli، أنها تتطلب حقن الوريد الخرز وهي أكثر تكلفة، وقد يغير بيولوجيا منذ الخرز يتم أما الاحتفاظ جلوميرولي في الثقافة أو تتطلب الكبيبي " ليسينج "وإزالتها بواسطة الطرد المركزي19. مقارنة glomeruli الماوس، حجم أكبر من الفئران جلوميرولي (ما يقرب من 100 ميكرومتر في الفئران هما شهرا من العمر18) يجعلها أسهل بكثير لفصلها عن غيرها من الهياكل الكلي باستخدام تقنية سيفينج بسيطة.
وكدليل على فائدتها، اتسمت نحن glomeruli لإظهار أنواع الخلايا المختلفة. يمكن أيضا أن يتعرضوا لعوامل معروفة لتصيب glomeruli الحية، ونظهر الآثار السلبية من كبريتات البروتامين (PS) على هذه الثقافات. ملاحظة: هو بوليكيشن أن يحيد أنيونى المواقع على طول الجدار الشعرية الكبيبي20. تحييد هذا له تأثير كبير على الحاجز الترشيح الكبيبي وذلك يزيد إغاراته عملية بروتينية وسيرا على الأقدام. ويمكن تقييم هذه جلوميرولي مع إيمونوبلوتس للبروتينات الرئيسية مثل نيفرين و WT1 لتقييم الصحة العامة. وعلاوة على ذلك، يمكن تقييم هيكلها مع الضوء، الفلورة والمجهر الإلكتروني.
عموما، أن هذا البروتوكول الوصول إلى معظم المحققين (واحد فقط يحتاج إلى الوصول إلى الحيوانات وبعض المعدات البسيطة). مع الميزات المورفولوجية ترك غير التالفة، الباحث قادراً على تحليل جلوميرولي وانظر كيف سائر أنواع الخلايا الهامة والحفاظ على المصفوفة في جلوميرولي تؤثر على تطور وظيفة والمرض، عيب ثقافات بودوسيتي.
Protocol
عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة بيتسبرغ.
1-عزل Glomeruli الفئران
- لإعداد المخزن مؤقت عزلة 1% عقيمة، إضافة 5 غ ألبومين المصل البقري (BSA) إلى 600 مل كوب.
- إضافة 500 مل 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) إلى الكأس ويقلب بقضيب إثارة مغناطيسية حتى يذوب جميع جيش صرب البوسنة.
- تصفية العقيمة المخزن المؤقت جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني 1% في غطاء ثقافة خلية.
ملاحظة: يمكن الاحتفاظ المخزن المؤقت جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني 1% العقيمة في 4 درجات مئوية لتصل إلى أسبوع.
- الحصول على الفئران سبراغ داولي 2 إلى 4 يزن 150 إلى 200 غ.
- Euthanize الفئران عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون باستخدام دائرة الذي قدم فيه 100% ثاني أكسيد الكربون بمعدل 10-30% حجم الدائرة في الدقيقة. مراقبة الحيوانات لوقف التنفس وتلاشي لون العين قبل إزالة من ثاني أكسيد الكربون.
- تعد الجلد على البطن الأمامي مع الإيثانول 70% واستخدام مقص الشعر لإزالة الشعر، إذا رغبت في ذلك. جعل شق خط الوسط في الجلد باستخدام المقص الجراحي أو مشرط. جعل آخر شق خط الوسط من خلال طبقة العضلات لكشف الأجهزة الداخلية. تمديد شق ﻷسلحته عن طريق الحجاب الحاجز والقص أو القفص الصدري كوسيلة ثانوية للقتل الرحيم.
- عزل وإزالة كلا الكليتين ووضعه في أنبوب مخروطي بلاستيك معقمة 50 مل مع 30 مل هانكس الحل الملح مخزنة (حبس) على الجليد.
ملاحظة: يمكن أن euthanized الفئران عدة في الدائرة نفسها وكل من الكليتين يمكن أن توضع في أنبوب مخروطي الشكل نفسه.
- الحفاظ على الكليتين على الجليد والنقل إلى غطاء ثقافة خلية عقيمة. نقل الكلي إلى طبق بتري عقيمة التي تحتوي على 5 مل حبس، أيضا فوق الجليد، وإزالة وتجاهل الدهون بيريرينال بالمقص والملقط حادة. إذا كان لا يزال موجوداً، أيضا إزالة وتجاهل الكبسولة المحيطة بالكلى بجعل شق سطحية صغيرة وثم استخدم الملقط حادة للطف تسحبه بعيداً عن الجهاز.
ملاحظة: دائماً يعزل الكلي على تقنية تعقيم الجليد والممارسة في جميع أنحاء. يمكن وضع قطعة من شاش معقم في طبق بتري على سطح مادة عقد الكلي في مكانها من خلال التلاعب.- قص الكلي في نصف الطول (قسم ميدساجيتال)، وإزالة وتجاهل لب (والذي أكثر قتامة في اللون) مع مشرط في طبق بتري ثاني مع 5 مل حبس.
- نقل القطع المتبقية، وغالباً قشرة الكلي، إلى ثالث طبق بيتري مع 5 مل حبس وفرم مع شفرة حلاقة عقيمة حتى القطع أقل من 1 ملم في الحجم، أو حتى يتم تشكيل عجينة.
- الرطب أعلى وأسفل لغربال 180 ميكرون مع 1% جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني على مدى 500 مل كوب نفايات. هذه الخطوة غير الحرجة كما المعاطف غربال مع البروتين ويقلل من تمسك جلوميرولي، التي من شأنها تحسين الغلة.
- ضع قشرة مفروم على حافة صغيرة لغربال واستخدم شفة المكبس محكم (الجهة المقابلة للختم المطاطي) لحقنه 10 مل الهريسة الأنسجة من خلال المنخل في عموم أسفل يجلس على الجليد. شطف دورياً بحبس ولكن استخدام أقل قدر ممكن لتجنب إضعاف العينة.
ملاحظة: لا تتجاوز 30 مل إجمالي المخزن المؤقت، لذا فقط 25 مل أكثر يمكن استخدامها هنا. والسبب في وضع الأنسجة مفروم على حافة واحدة فقط لغربال خفض التزام جلوميرولي عن طريق الحد من التعرض لجزء المنخل بدلاً من المساحة السطحية غربال كامل.- ولتسهيل ذلك، إعادة استخدام السوائل جمع في عموم السفلي شطف المنخل. بمجرد اكتمال النخل، بعناية غسل الجزء السفلي من غربال مرة أخرى مع المخزن المؤقت لجيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني 1% من الجزء السفلي من عموم لالتقاط أي جلوميرولي التي قد تكون فضفاضة التقيد بها.
- جمع كل من السائل في عموم أسفل إلى عدة 10 مل المحاقن مجهزة بابر ز 20 وتمريرها من خلال الإبرة مرات إضافية على الأقل 2. في المجموعة الأخيرة، الحفاظ على السوائل المحتوية على جلوميرولي في المحاقن حتى جاهزة تمريرها من خلال غربال 90 ميكرون.
- بينما يتم تخزين السوائل في الحقن، يغسل عموم السفلي بالتنظيف مع 1% جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني في الكأس النفايات والرطب الأعلى وأسفل غربال 90 ميكرون مع 1% جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني. ضعه المنخل أعلى عموم السفلي على الجليد.
- تطبيق العينة في الحقن إلى حافة واحدة من غربال ومش من خلال غربال مع شفة حقنه أخرى كما وصف أعلاه. يغسل مع الحل من عموم أسفل لجمع كل شيء على حافة واحدة من المنخل.
- النخل مرة واحدة كاملة، وتغسل بعناية أسفل غربال كما في الخطوة 1.5.1. جمع جميع السوائل في عموم السفلي في أنبوب 50 مل مخروطية بلاستيك.
- أغسل المقلاة السفلي مع 1% جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني في الكأس النفايات والرطب الأعلى وأسفل منخل 75 ميكرون مع 1% جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني. ضعه المنخل أعلى عموم السفلي على الجليد.
- تطبيق العينة على حافة واحدة لغربال. وينبغي أن تدفق السائل من خلال بسهولة. شطف من خلال الأعلى مع مالا يقل عن 20 مل من 1% جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني في الكأس النفايات. أغسل بعناية أسفل غربال كذلك. Glomeruli سيبقى على رأس هذا منخل 75 ميكرون.
- استخدام حبس لجمع جلوميرولي في طبق بتري قبل الشطف من خلال غربال رأسا على عقب. استخدام قدر حبس حسب الحاجة هنا. جمع في واحد أو أكثر 50 مل البلاستيك مخروطية الشكل tube(s) على الجليد.
- الطرد المركزي في 1800 س ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وإزالة المادة طافية بعناية مع ماصة ريسوسبيند بيليه في 10 مل حبس الباردة. تجمع العينات إذا جمعت الأنابيب المخروطية المتعددة في 1.7.2. كرر الخطوة الطرد المركزي.
- ريسوسبيند جلوميرولي في 5 مل حبس حتى على استعداد للمضي قدما إلى الخطوة التالية.
- إذا رغبت في ذلك، اتخاذ عدد من جلوميرولي المجموع. لهذا، أخذ عينة ميليلتر 10 مع ماصة ومكان الهبوط على شريحة زجاجية. عرض تحت مجهر، عد جلوميرولي في الميدان وأضرب 500 للحصول على إجمالي العائد.
ملاحظة: قد يتم تحديد نقاء بإحصاء عدد الأنابيب التي ينظر إليها في الحقل وقسمة مجموع عدد glomeruli وأنبوب الهياكل. ينبغي أن يكون هناك > 95% glomeruli في المجال البصري.- إذا كان هناك تلوث أنبوبية كبيرة، كرر الخطوات 1.6.1 فصاعدا، وتأكد من أن يغسل جيدا عند إكمال الخطوة 1.7.1. وهذه هي الخطوة التي تلوث أنبوبي هو الأكثر احتمالاً أن يحدث.
2-الإصابة جلوميرولي
- جمع glomeruli في أنبوب مخروطي البلاستيكية 15 مل وتدور إلى أسفل في 200 x زاي ريسوسبيند في مبلغ مناسب لحبس استناداً إلى العائد الكلي حيث أن هناك حوالي 9,000 glomeruli كل بئر. "الماصة؛" ميليلتر 450 من العينة في كل من لوحة 24-جيدا جيدا، أو أي شكل اللوحة التي تناسبها فحوصات المتلقين للمعلومات المطلوبة.
ملاحظة: بيبيتينج صعودا ونزولاً مزيج glomeruli في المخزن المؤقت ليضمن حلاً متجانسة. Glomeruli لزجة وثقيلة جداً وسوف تتمسك ببعضها البعض، فضلا عن تسوية في الجزء السفلي من التوصل إلى حل بسرعة وعلى جانبي الأنبوب. - جعل 6 مغ/مل البروتامين سلفات الحل (PS)، أولاً حل ز 1 من PS إلى 10 مل dH2O ساخنة إلى 40 درجة مئوية في الأنبوبة المخروطية البلاستيكية 15 مل ودوامه تماما. تأخذ 30 ميليلتر من الحل، وإضافة إلى 470 ميليلتر من dH2O.
ملاحظة: هذا سوف ينتج حلاً 6 مغ/مل، وعند إضافة 50 ميليلتر للبئر كما هو موضح أدناه، يكون التركيز النهائي 0.6 ملغ/مل.- في التكرارات، إضافة 50 ميليلتر من كبريتات البروتامين (هذا 01:10 إضعاف) لكل بئر من مجموعة واحدة، وحين تزويد آخر مجموعة 50 ميليلتر من حبس (مراقبة سلبية).
- احتضان لوحة ح 4 في 37 درجة مئوية.
- تدور أسفل محتويات كل بئر في أنبوب ميكروسينتريفوجي (4000 x ز، 4 درجة مئوية، 10-15 ثانية) وتغسل مرتين مع 1 مل من كل برنامج تلفزيوني.
- نضح إيقاف الغسيل النهائي وريسوسبيند في 300 ميليلتر من برنامج تلفزيوني. تقسيم إلى مختبرين الثلاثة التي سيتم إعدادها لعزل البروتين والتصور المجهر الإلكتروني (TEM) انتقال الفلورة تلطيخ (إذا).
3-إعداد جلوميرولي للتحليل
- تدور أسفل محتويات مختبرين (4000 x ز، 4 درجة مئوية، 10-15 ق) وأسبيراتي إيقاف تشغيل المخزن المؤقت المتبقية الثلاث والمضي قدما إلى تحليل العينات بال، إذا، أو عزل البروتين.
- التجهيز لل
- إصلاح الكريات الكبيبي في 150 ميليلتر من بارد glutaraldehyde 2.5% في برنامج تلفزيوني 0.01 متر. إزالة مثبت عناية من بيليه استخدام ماصة باستور، مع التأكد من عدم عرقلة بيليه، ثم تشطف أنه مع برنامج تلفزيوني، وبعد إصلاحه في أكسيد الاوزميوم 1% مع سيانيد البوتاسيوم 1%.
- يذوي العينة من خلال سلسلة متدرجة من الإيثانول (30، 50، 70، 90، 100، 100، 100 ٪)، وأكسيد البروبيلين ثم تضمينها في تضمين مادة الإيبوكسي.
- قطع شبه رقيقة (300 نانومتر) الأقسام على أولتراميكروتومي. وصمة عار مع 0.5% أزرق تولويدين في بورات الصوديوم 1% ودراستها تحت المجهر الخفيفة.
- قطع المقاطع سامسونج (65 nm) ووصمة عار لهم مع خلات اليورانيل وسترات رينولد بالرصاص، وفحص مجهر إلكتروني انتقال.
- التجهيز لحالة
- إضافة 150 ميليلتر الجيلاتين 12% في برنامج تلفزيوني الحل ووضع فورا في الثلج الجاف لتشكيل بيليه. نقع بيليه في 500 ميليلتر بارافورمالدهيد 2%/1 × برنامج تلفزيوني في أنبوب ميكروسينتريفوجي بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- وضع بيليه في قاعدة العفن وتضمينها عن طريق إضافة قطع الأمثل (OCT) درجة الحرارة المتوسطة فوق الجليد الجاف. قص 5-10 ميكرون المقاطع في كريوتومي ومتابعة الفلورة/إيمونوهيستوتشيميستري أو البقع النسيجي القياسية.
- لعزل البروتين
- إضافة 150 ميليلتر من المخزن المؤقت للمعهد الملكي لبيليه الكبيبي تثفيل مع 1.5 ميليلتر من مثبطات البروتياز ودونس مع أجهزة المجانسة الأنسجة.
- تشرع في تحديد مقدار البروتين وإيمونوبلوتينج أو تحليل البروتين الأخرى.
Representative Results
يمكن أن تكتمل في أقل من 2 ح البروتوكول من وقت القتل الرحيم لعزله glomeruli وعالية الإنتاجية والكفاءة. مع الاستخدام السليم لهذه التقنية، يتراوح عائد جلوميرولي كل الفئران الكلي glomeruli 6,000-10,000 عند بدء تشغيل مع الكلي 8. تعليق نهائي هو المزدحمة مع جلوميرولي ونقاء شاملة > 95%، عرض الحد الأدنى من التلوث من شرائح أنبوبي أو أنواع الخلايا الأخرى (الشكل 1أ، ب). وبالإضافة إلى ذلك، يمكن الملون glomeruli جزءا لا يتجزأ من أكتوبر مع البقع (H & E) الهيماتوكسيلين وويوزين لمعرفة مورفولوجية (الشكل 1ج). هذه glomeruli الحفاظ على بنيتها في جميع أنحاء البروتوكول كله، حتى بعد المعالجة. علينا أن نظهر أن تمتلك glomeruli المعزولة بودوسيتيس سليمة وقابلة للتطبيق (الشكل 2أ) وخلايا mesangial (الشكل 2ب) وخلايا بطانية (الشكل 2ج).
مرة واحدة معزولة، يمكن أن يتعرض glomeruli للإصابات الكيميائية المعروفة لمحاكاة في فيفو الباثولوجيا. في هذه الحالة، قد اختير كبريتات البروتامين (PS) لقدرتها على إعاقة المسؤول عن الحاجز الترشيح الكبيبي، الأمر الذي يؤدي في نهاية المطاف إلى القدم إغاراته العملية. وقد تعامل PS glomeruli تخفيض ملفتة للنظر في نيفرين (أحمر) وعدد من النوى إيجابية بالنسبة WT1 (الأخضر) عبر الفلورة (الشكل 3أ، ب). يمكن أيضا إعداد glomeruli مجهر إلكتروني (الشكل 3ج). عينات مراقبة بودوسيتي عادية مورفولوجية والقدم العمليات في حين glomeruli تعامل PS إغاراته العملية سيرا على الأقدام (الشكل 3د)، وهو علامة على الخلل في بودوسيتي وينظر في النماذج في فيفو باستخدام PS21. هذا يقابل أيضا انخفاضا في نيفرين الكشف عنها بواسطة immunoblotting (الشكل 3هاء، واو).
لتحديد صلاحية، وجرى تقييم ملصوق caspase-3 كعلامة للمبرمج. استخدام الفلورة، ملصوق caspase-3 يظهر أولاً في الخلايا قليلة بدأت ح 2 بعد عزلة (الشكل 4). عدد الخلايا معربا عن حوزتي هذا أصبح أكثر وفرة على مر الزمن، مع أعلى مستويات ينظر في 24 و 48 ساعة. وهذا يوحي بأن المبرمج تحدث نسبيا مبكرا في الثقافة، وأنه ينبغي إجراء تطبيقات المصب قريبا بعد عزلة للحصول على أفضل النتائج.
الشكل 1 . المظهر نموذجية من الثقافات الكبيبي الفئران بعد عزلة. (أ) صورة برايتفيلد للثقافة الكبيبي. على الرغم من أننا اختيار حقل الذي يوجد أنبوب كلوي واحد في هذه صورة مجهرية (رأس السهم)، الثقافات التي تم الحصول عليها بشكل عام > 95% نقية. شريط مقياس يساوي 100 ميكرومتر-(ب) الموسع صورة الكبيبة واحدة. (ج) توضع وويوزين وصمة عار الكبيبة واحدة. أشرطة مقياس في ب وج تساوي 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . يتم الاحتفاظ بأنواع الخلايا المكونة في عزلة glomeruli. وأجرى الفحص المجهري الفلورة [كنفوكل] نيفرين (أحمر، بودوسيتيس) وعلامات خلية على حدة لتحديد بودوسيتيس وخلايا mesangial والبطانة. (أ) Costain نيفرين و WT1 (الخضراء، بودوسيتيس). (ب) Costain نيفرين وبدجفر-β (أخضر، وخلايا mesangial، السهم). (ج) Costain نيفرين و CD31 (الخلايا الخضراء، بطانية، سفن في المقطع العرضي تميزت رؤوس الأسهم). شريط المقياس = 25 ميكرومتر في كل اللوحات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . يمكن أن تكون الإصابة بودوسيتي المستحث في المختبر باستخدام الفئران المعزولة glomeruli. (أ) [كنفوكل] الفلورة مجهرية نيفرين و WT1 بالثقافة الكبيبي غير معالجة. ملاحظة خطية نيفرين تلطيخ (أحمر) ووجود نواة WT1 الإيجابية (الأخضر) التي تعتبر عادة عندما يكون هناك بودوسيتيس صحية. (ب) بعد كبريتات البروتامين المعاملة، التعبير نيفرين المنخفض وغير الخطية، و WT1 غائب، مشيراً إلى إصابة بودوسيتي. (ج) انتقال إلكترون ميكروسكبي (TEM) صورة تبين عمليات سيرا على الأقدام والغشاء بطانة فينيستراتيد نموذجية لهيكل الكبيبي العادية. شريط يساوي 500 نانومتر. (د) بعد سلفات البروتامين، وعمليات القدم ممدود أو تﻻشيه (رؤوس)، الذي يشير إلى إصابة بودوسيتي. (ه) لطخة غربية نيفرين عرض انخفضت نيفرين بعد العلاج سلفات البروتامين. ويرد أكتين (F) تحميل عنصر التحكم للطخة غربية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 . تقييم سلامة الخلية في عزلة glomeruli. تم إجراء الفحص المجهري [كنفوكل] الفلورة ملصوق caspase-3 (أخضر). وأجرى نيفرين وصمة عار المشارك بسهولة تحديد موقع في جلوميرولي. بينما لا يوجد أي الإيجابية caspase-3 ملصوق على 0 وح 1 بعد عزل glomeruli، إشارة fluorescence في الخلايا قليلة لوحظ في حاء 2 تدريجيا المزيد من الخلايا تحولت إيجابية أطول بعد العزلة التي بحثت. أكبر عدد من الخلايا إيجابية caspase-3 لوحظ في 24 و 48 h. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
هذا وسيلة فعالة لاسترداد جلوميرولي من الكلي الفئران باستخدام معدات غير مكلفة، والقابل لإعادة الاستخدام مع بروتوكول بسيط. كما هو الحال مع جميع الإجراءات، توجد قيود على فائدته. أولاً، على الرغم من أن نحصل على نقاء > 95%، بسبب طبيعة sieving البروتوكول والمواد بدءاً من المستحيل استبعاد جميع الملوثات، وعدد قليل من خلايا الدم الحمراء وجزء أنبوبي عرضية سوف تكون موجودة في الثقافة. أننا لا نتوقع هذه الملوثات الصغيرة أن تكون مشكلة بالنسبة للغالبية العظمى من التطبيقات. ثانيا، البروتوكول sieving يعتمد على استخدام الكلي الفئران، التي جلوميرولي أكبر بكثير من الفئران. إذا كانت هناك حاجة إلى glomeruli الماوس، أسلوب استخدام الخرز المغناطيسي التجاري (مثلاً، دينابيدس) قد نشرت22. ثالثا، وقد ثبت أن مرناس محددة (البلاسمينوجين منشط المانع-1 والكولاجين أنا) في glomeruli معزولة تستمد كلياً تقريبا من كبسولة بومان الشعبية بدلاً من الخلايا إينتراجلوميرولار23. هذا يمكن أن يؤدي إلى استنتاجات غير مناسب إذا تمت محاولة عزل مرناً من هذه جلوميرولي. تجدر الإشارة إلى أن غالبية جلوميرولي في أيدينا هي ديكابسولاتيد وينبغي لذلك تفتقر إلى مساهمات كبيرة من كبسولة بومان. رابعا، يبدأ موت الخلية لتحدث بسرعة نسبيا في ظروف الثقافة.
ووجدنا أن apoptotic، كما يدل على ذلك ظهور ملصوق caspase-3، تم تنشيط البرنامج بدءاً من ح 2 للثقافة. بشكل عام هذا هو الاتفاق مع التقارير السابقة التي تبين أن المبرمج، حسب تقييم الحمض النووي التشرذم و TUNEL، وتحليل النسجية، يبدأ تحدث داخل ح 1-2 بعد عزل24. ومع ذلك، تجدر الإشارة أيضا إلى أن الملاحظات المبكرة أظهرت أنه يمكن اكتشاف النشاط الأيضي من glomeruli ينخل المعزولة عند مثقف على الأقل 3 ح، مما يشير إلى بقاء الخلوية كبيرة في هذه تيميبوينت16. ومع ذلك، واستنادا إلى النتائج، نعتقد أنه سيكون من الحكمة أن تستخدم glomeruli معزولة فورا في تجارب المقصود لأفضل النتائج. نوصي بإجراء جميع التجارب قبل ح 72 كما لاحظنا أن هيكل الكبيبي الكامل يبدأ في التدهور بعد أن تيميبوينت.
أسهل بكثير للحصول على مردود أعلى عند بدء تشغيل مع الكلي 4-8 مقابل 2 فقط لعدد معين من glomeruli تضيع بسبب التمسك بثقب سيتا مختلف، ولكن مجرد شكل أقصى المغلفة ثقب سيتا هناك لا خسائر إضافية. ولنفس السبب، من المهم أن نقع في ثقب سيتا في جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني المخزن المؤقت مسبقة لاستخدام جلوميرولي أكثر احتمالاً على التمسك بغربال جافة، والحد من تعرض الأنسجة إلى حافة واحدة لغربال. ونحن نقترح بدءاً بالكلى لا يقل عن 6 (الفئران 3) الحصول عائد معقول.
وقد عزل بعض المحققين الثقافات بودوسيتي الابتدائي من glomeruli المعزولة التي تميل إلى أن تنمو للخروج جلوميرولي خلال الثقافة17. وقد لاحظنا أن بعض glomeruli معزولة ستلتزم بالبلاستيك طبق الثقافة وأن تبدأ الخلايا إلى الهجرة خارج هيكل الكبيبي في أواخر تيميبوينتس (ح 72 بعد عزلة). دراسة هذه الخلايا خارج نطاق هذا البروتوكول العزلة، وهناك بعض الجدل حول ما إذا كانت هذه الخلايا بودوسيتيس، والخلايا الظهارية الجدارية، أو كل15،25. جدير بالذكر أن مونديل et al.، وأفادت أن قد فعل الخلايا حصاة كبيرة تحصد من glomeruli ينخل تفرق في بودوسيتيس ناضجة تحت الخاصة باستزراع ظروف26. بعض الالتباس فيما يتعلق بهوية الخلية قد يتوقف على ما إذا كان يتم تغليف glomeruli معزولة (بما في ذلك بومان كبسولة الشعبية التي يسكنها الخلايا الظهارية الجدارية) أو ديكابسولاتيد في الإجراء سيفينج. في أيدينا، باستخدام أحجام غربال المتسلسلة من 180، أدت ميكرومتر 90، و 75 إلى أغلبية glomeruli يجري ديكابسولاتيد.
معظم أشكال أمراض الكلي المزمنة بروتينوريك بسبب زيادة نفاذية الكبيبي. وقد استخدمت العديد من المؤلفين glomeruli معزولة في السابقين فيفو تجارب النفاذية. في أسلوب واحد، استخدم لتقدير نفاذية27التغيير في حجم الكبيبي بعد تغيير محتوى ناضح وسائل الإعلام المحيطة بها. في الآونة الأخيرة، ثبت أن تسرب التحقيق الفلورسنت من glomeruli معزولة يمكن تحديده كمياً لقياس النفاذية ويمكن أداؤها في القوارض المعرضين للمرض الكبيبي النماذج التجريبية28.
وقد لاحظنا أن في عملية إعداد TEM، نرى في بعض الأحيان بودوسيتي القدم رفع عمليات إيقاف الغشاء الطابق السفلي. أننا لا نرى هذا يحدث في الثقافة، وهو أكثر احتمالاً من قطعة أثرية أثناء إعداد عينة تيم. جدير بالذكر أن حتى عندما يحدث هذا، فمن الواضح ما إذا كانت عمليات القدم تبدو "عادية" أو هي تﻻشيه.
وبوجه عام، يوفر هذا البروتوكول أسلوب بموجبه أحد تقييم التغييرات مورفولوجك والخلوية استجابة للإصابة. ونحن نتوقع أن يمكن استخدامه كأسلوب مصاحب للثقافات بودوسيتي معزولة، ولا سيما عندما يجري النظر في التفاعلات مع المصفوفة خارج الخلية أو سائر أنواع الخلايا الأصلية. أنها تبشر بزيادة تفاهم كد بروتينوريك، الأمر الذي من شأنه تحسين القدرة على تطوير العلاجات المستقبلية لهذا المرض الموهن.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذا العمل كان يدعمها "جمعية القلب الأمريكية" منحة 16990086 تأسيسها، DK079307 P30 المعاهد الوطنية للصحة والمجتمع الأمريكي لأمراض الكلي جوتشالك جائزة، وجامعة بيتسبرغ الطبية مركز تنافسي الطبية البحوث الصندوق جائزة ومن جامعة بيتسبرغ جائزة مؤسسة أكاديمية الأطباء. ونحن نشكر Apodaca جيرار على اقتراحاته التقنية للمحافظة على الكبيبي لتحليل النسجية وسوليفان مارا ومينغ الشمس للمساعدة مع المجهر الإلكتروني، ولي يينغ والتحقيق ليو لمدخلاتها التقنية في هذا البروتوكول. ونشكر أيضا سينثيا سانت هيلير لجسم CD31.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions, Chemicals, and Animals | |||
| Sprague-Dawley Rats | Envigo | 207M | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1605100 | |
| Hank's Balanced Salt Solution with Ca2+ and Mg2+ | Thermo | 14025092 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline | VWR | 97063-660 | |
| Protamine sulfate | MP Bio | ICN15197105 | |
| Karnovsky's Fixative | |||
| Gelatin | |||
| Paraformaldehyde | EMD | EM-PX0055-3 | |
| O.C.T. | Scigen | 23730571 | |
| RIPA Buffer | |||
| Halt Protease Inhibitors | Thermo | PI78442 | |
| Nephrin Antibody | Fitzgerald | 2OR-NP002 | |
| WT-1 Antibody | Abcam | ab89901-10ul | |
| PDGFR-β Antibody | Cell Signaling | #3169S | |
| CD31 Antibody | LSBio | LS-C348736 | |
| Cleaved caspase-3 antibody | Cell Signaling | 9661S | |
| Poly/Bed 812 (Luft) epoxy | Polysciences | 08792-1 | |
| Equipment | |||
| Carbon dioxide chamber | |||
| Conical tubes, 15 mL | |||
| Conical tubes, 50 mL | |||
| Surgical scissors | |||
| Surgical forceps | |||
| Sterile gauze | |||
| Petri dishes, 100 mm | |||
| Scalpels | |||
| Razor blades | |||
| Sterile filter apparatus | |||
| Sieve Pan | Alfa Aesar | AA39999ON | |
| 180um Sieve | Alfa Aesar | AA39996ON | |
| 90um Sieve | Alfa Aesar | AA39990ON | |
| 75um Sieve | Alfa Aesar | AA39991ON | |
| 10 mL syringes | |||
| 600 mL beakers | |||
| Cell culture incubator | |||
| Picofuge | |||
| Vortex | |||
| Tissue Homogenizers | Fisher Scientific | 50550226 | |
| 20 G needles | |||
| Leica Reichart Ultracut | ultramicrotome |
References
- Grahammer, F., Schell, C., Huber, T. B. Molecular understanding of the slit diaphragm. Pediatric Nephrology. 28 (10), 1957-1962 (2013).
- Tan, R. J., Zhou, L., Zhou, D., Lin, L., Liu, Y. Endothelin receptor a blockade is an ineffective treatment for adriamycin nephropathy. PLoS One. 8 (11), 79963 (2013).
- Wagner, N., Wagner, K. D., Xing, Y., Scholz, H., Schedl, A. The major podocyte protein nephrin is transcriptionally activated by the Wilms' tumor suppressor WT1. Journal of the American Society of Nephrology. 15 (12), 3044-3051 (2004).
- Rogacka, D., et al. Insulin increases filtration barrier permeability via TRPC6-dependent activation of PKGIalpha signaling pathways. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (6), 1312-1325 (2017).
- Mundel, P., et al. Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines. Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).
- Moller, C. C., et al. Induction of TRPC6 channel in acquired forms of proteinuric kidney disease. Journal of the American Society of Nephrology. 18 (1), 29-36 (2007).
- Tian, D., et al. Antagonistic regulation of actin dynamics and cell motility by TRPC5 and TRPC6 channels. Science Signaling. 3 (145), 77 (2010).
- Shankland, S. J., Pippin, J. W., Reiser, J., Mundel, P. Podocytes in culture: past, present, and future. Kidney Internationalernational. 72 (1), 26-36 (2007).
- Cook, W. F., Pickering, G. W. A rapid method for separating glomeruli from rabbit kidney. Nature. 182 (4642), 1103-1104 (1958).
- Misra, R. P. Isolation of glomeruli from mammalian kidneys by graded sieving. American Journal of Clinical Pathology. 58 (2), 135-139 (1972).
- Burlington, H., Cronkite, E. P. Characteristics of cell cultures derived from renal glomeruli. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 142 (1), 143-149 (1973).
- Harper, P. A., Robinson, J. M., Hoover, R. L., Wright, T. C., Karnovsky, M. J. Improved methods for culturing rat glomerular cells. Kidney International. 26 (6), 875-880 (1984).
- Kreisberg, J. I., Hoover, R. L., Karnovsky, M. J. Isolation and characterization of rat glomerular epithelial cells in vitro. Kidney International. 14 (1), 21-30 (1978).
- Weinstein, T., Cameron, R., Katz, A., Silverman, M. Rat glomerular epithelial cells in culture express characteristics of parietal, not visceral, epithelium. Journal of the American Society of Nephrology. 3 (6), 1279-1287 (1992).
- Yaoita, E., Kurihara, H., Sakai, T., Ohshiro, K., Yamamoto, T. Phenotypic modulation of parietal epithelial cells of Bowman's capsule in culture. Cell and Tissue Research. 304 (3), 339-349 (2001).
- Meezan, E., Brendel, K., Ulreich, J., Carlson, E. C. Properties of a pure metabolically active glomerular preparation from rat kidneys. I. Isolation. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 187 (2), 332-341 (1973).
- Piwkowska, A., et al. Insulin increases glomerular filtration barrier permeability through PKGIalpha-dependent mobilization of BKCa channels in cultured rat podocytes. Biochimica et Biophysica Acta. 1852 (8), 1599-1609 (2015).
- Kotyk, T., et al. Measurement of glomerulus diameter and Bowman's space width of renal albino rats. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 126, 143-153 (2016).
- Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Exp Ther Med. 5 (5), 1322-1326 (2013).
- Leeuwis, J. W., Nguyen, T. Q., Dendooven, A., Kok, R. J., Goldschmeding, R. Targeting podocyte-associated diseases. Advanced Drug Delivery Reviews. 62 (14), 1325-1336 (2010).
- Subramanian, B., et al. Mice with mutant Inf2 show impaired podocyte and slit diaphragm integrity in response to protamine-induced kidney injury. Kidney International. 90 (2), 363-372 (2016).
- Takemoto, M., et al. A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice. American Journal of Pathology. 161 (3), 799-805 (2002).
- Steinmetz, O. M., et al. A pitfall of glomerular sieving: profibrotic and matrix proteins derive from the Bowman's capsule and not the glomerular tuft in rats with renovascular hypertension. Nephrology Dialysis Transplantation. 22 (10), 3055-3060 (2007).
- Ishikawa, Y., Kitamura, M. Spontaneous apoptosis of podocytes in explanted glomeruli. Technical note. Kidney International. 54 (6), 2008-2013 (1998).
- Krtil, J., Platenik, J., Kazderova, M., Tesar, V., Zima, T. Culture methods of glomerular podocytes. Kidney and Blood Pressure Research. 30 (3), 162-174 (2007).
- Mundel, P., Reiser, J., Kriz, W. Induction of differentiation in cultured rat and human podocytes. Journal of the American Society of Nephrology. 8 (5), 697-705 (1997).
- McCarthy, E. T., et al. TNF-alpha increases albumin permeability of isolated rat glomeruli through the generation of superoxide. Journal of the American Society of Nephrology. 9 (3), 433-438 (1998).
- Desideri, S., et al. A novel assay provides sensitive measurement of physiologically relevant changes in albumin permeability in isolated human and rodent glomeruli. Kidney International. 93 (5), 1086-1097 (2018).
