Summary
המוקד העיקרי של פרוטוקול זה הוא לבודד ביעילות glomeruli העיקרי קיימא תרבויות עם מזהמים מינימלית לשימוש במגוון רחב של יישומים במורד הזרם. Glomeruli מבודד שומרים על קשרים מבניים בין סוגי תאים רכיב וניתן בתרבית שמחוץ לזמן קצר.
Abstract
שימור מבנה glomerular ותפקוד הוא מכריע למניעת דלקת פקעיות הכליה, קטגוריה של מחלת כליות מאופיין פרוטאינוריה אשר יכול להוביל בסופו של דבר את כרונית, מחלת כליות סופנית. פקעית הוא מנגנון מורכב אחראי על הסינון של פלסמה מן הגוף. במחלה, שלמות מבנית אובד ומאפשר חריג לדליפת פלזמה תוכן לתוך השתן. שיטה לבודד ולבחון glomeruli בתרבות חיוני לחקר מחלות אלו. ב פרוטוקול זה, מתוארת שיטה יעילה לאחזור glomeruli ללא פגע מן החולדה למבוגרים כליות תוך שימור מאפיינים מורפולוגיים מבניים. תהליך זה הוא מסוגל לייצר תפוקה גבוהה של glomeruli לכל כליה עם זיהום מזערי של מקטעים אחרים נפרון. עם אלה glomeruli, ופציעות ספורט יכול להיות חיקה מאת המקננת אותם עם מגוון של רעלנים כימיים, כולל מה לעזאזל קרה סולפט, הגורמת רגל תהליך הצטנעות, פרוטאינוריה במודלים של בעלי חיים. חומרת הפגיעה יכול להיות מוערך באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים, immunofluorescence מכתים סופג המערבי. Nephrin ורמות 1 גידול Wilms (WT1) יכול גם להיות מוערך מהתרביות האלה. בשל נוחות וגמישות של פרוטוקול זה, glomeruli מבודד יכול להיות מנוצל כמתואר או בצורה המתאימה ביותר לצרכים של החוקר כדי לסייע טוב יותר בריאות glomerular המחקר ומבנה במדינות נגועים.
Introduction
פקעית הוא ציצה מאוד מיוחדים של נימים אחראי על הסינון של מחזורי פלזמה. היא יוצרת את תחילת נפרון, אשר היא היחידה הפונקציונלית הבסיסית של הכליה. Glomerular פונקציה מוגדרת על-ידי אנדותל נימי fenestrated ייחודי של הסרעפת שסע של podocytes, של קרום המרתף להתערב. שכבות אלה ליצור מחסום semipermeable כדי לאפשר הפרשה סלקטיבית של חומרים לתוך פילטרט. מים, יונים, מולקולות קטנות אחרות בדרך כלל עוברים דרך, ואילו מולקולות גדולות יותר נשמרים ב הפלזמה. Podocytes הן מיוחדות לתאי האפיתל שהתפשט על פני קרום המרתף, סביב הנימים עם תחזיות cytoplasmic המכונה רגל תהליכים. כף הרגל מעבד של interdigitate הסמוכה podocytes, נרשמו על ידי חריץ דיאפרגמות מורכב של חלבונים כגון nephrin, podocin, P-קדהרין זואי-11. במקטע קרוס, רגל אלה תהליכים באופן שווה מסודרים על קרום המרתף. התהליכים רגל glomeruli נגועים, הופכים בגסות חריג או "התרחבות", שמוביל חריג לדליפת פלזמה תוכן לתוך פילטרט. ככזה, נזק glomerular מאופיין בדרך כלל על ידי הנוכחות של כמות גדולה באופן חריג של חלבון (למשל, פרוטאינוריה) ו/או תאי דם אדומים (למשל, המטוריה) בשתן. בנוסף, podocytes הפצוע מאבד הביטוי של nephrin, כמו גם את הרגולטור 1 גידול Wilms (WT1), חלבון מפתח אחראי על תחזוקה של בידול2,3. Glomeruli מהווה מטרה עיקרית של נזק ב סוכרת כלייתית הינם glomerulonephritides אחרים כגון שינויים מזעריים מחלה כלייתית עלי הלוואי קרומיים, glomerulosclerosis סגמנטלי מוקד. מחלות אלו הם הגורמים העיקריים אי ספיקת כליות מתקדמת, ההתפתחות של מחלת כליות סופנית, מצב שבו הישרדות נשענת על דיאליזה או השתלת כליות. לכן, חשוב ללמוד glomeruli להבין טוב יותר את כליות כרונית (CKD) המחלה פתולוגיה.
מערכת התרבות התא חיוני ללמוד ביולוגיה glomerular. בשל תפקידה מרכזי ביצירת הסרעפת שסע, כמו גם על קיום מחלות ספציפיות proteinuric עקב מוטציות חלבון הסרעפת שסע, מחקרים רבים בצורה מובנת ניצל את podocyte בבידוד. זה הוביל הדור של שורות תאים podocyte העיקרית לנצל במבחנה. תאים אלה יכולים להיות בתרבית תחת מגוון תנאים, ניתן לגדל אפילו על תמיכה חדיר כדי להעריך את חדירות4. עם זאת, הבידוד של תאים מתרבים לעיתים קרובות בוחר תאים dedifferentiated שאיבדת חלק סמנים podocyte שלהם. זה הוביל הדור של podocytes מותנית מונצחים נגזר זן העכבר הטרנסגניים נושא מוטציה רגיש לטמפרטורה של SV40 גדול T הגן (למשל immortomouse), אשר יכול להיות גדלו בתרבות אלא גם להיות הבדיל לבטא מערך מלא של סמנים podocyte5. שיטות אלה של התרבות העיקרי היה מרכזי ההבנה podocyte ביולוגיה4,6,7.
למרות זאת, תרבויות המכילה סוגי תאים יחיד חוסר המערכת היחסים המתרחשות ויוו וכן את מבנה התמיכה של מטריצות, monolayers של תאים אלה לא בהכרח לסכם את תלת מימדי הארכיטקטורה של glomeruli. Podocytes immortalized ניתן גם מסורבל ומאתגרים תרבות8, והם ידרשו אחזקת או immortomouse או aliquot ההתחלתי של תאים מ הוקמה חוקרים כדי להתחיל. עוד יותר, פקעית מורכבת לא רק podocytes, אבל גם תאי אנדותל נימי קרום המרתף, וכן תאים mesangial אשר מספקים תמיכה עבור המבנה. לכן זה שימושי לפתח שמחוץ גישה זמינה כל החוקרים לחקר glomeruli שלם לשמור את הארכיטקטורה הטבעית שלהם, כמו גם כל התאים המהווים את פקעית נורמלי.
בשנת 1958, קוק, פיקרינג תיאר את הבידוד הראשון של glomeruli מן הכליה ארנב. לאחר תצפיות תסחיף שומני הפך תקוע glomeruli, הם הניחו כי חלקיקים בגודל זהה יכול לשמש לבודד במיוחד מבנים אלה. אכן, העירוי של חלקיקי תחמוצת ברזל לתוך הכליה הובילו ההשמנה של החלקיקים ב glomeruli. לאחר דיסוציאציה מכני, ניפוי של הכליה, glomeruli יכול להיות מבודדת ללא פגע עם טוהר באמצעות הפרדה מגנטית9. ב-1971 Misra הראה כי את תחמוצת ברזל יכול להיות מושמט חליטות, ובידוד glomerular מושגת עם ניפוי של האדם טחון, כלב, ארנבת או עכבר כליות רקמות10. טכניקה זו שונתה מאז ואז בהתאם למטרה של החוקרים, אבל בעיקרו של דבר הביא מטוהרים ההכנות זה. יכול להיות עוד יותר למד או שממנו תרבויות התא הראשי יכול להיות הוקמה11,12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17.
כאן נתאר פרוטוקול עבור בידודו של glomeruli קיימא ללא פגע מן הכליה חולדה. פרוטוקול כולה אורכת שעות ספורות. למרות שהם לא להתרבות, תוכניות ניסיוני בכל גודל ייתמכו על-ידי פשוט להגדיל את מספר הכליות כמתחילה חומר. אמנם ישנם פרוטוקולים שפורסמו עבור הפרדת חרוז מגנטי glomeruli, הם דורשים זריקה תוך ורידי של חרוזים יקרים יותר, עשוי לשנות ביולוגיה מאז החרוזים נשמרות גם על-ידי glomeruli בתרבות או לדרוש glomerular" lysing"והסרה על ידי צנטריפוגה19. לעומת עכבר glomeruli, גודל גדול יותר של עכברוש glomeruli (קרוב ל-100 מיקרומטר חולדות בת שני חודשים18) מקלה בהרבה להפריד אותם מבנים אחרים הכליה באמצעות טכניקה פשוטה sieving.
כראיה של התועלת שלהם, אנחנו שאפיינו glomeruli להפגין את סוגי תאים שונים. הם יכולים גם להיות חשופים סוכנים ידוע לפצוע glomeruli ויוו, נדגים את ההשפעות השליליות של? מה לעזאזל קרה סולפט (PS) על תרבויות אלה. נ. ב הוא polycation זה מנטרל את האתרים anionic לאורך הקיר נימי glomerular20. סתירה זו השפעה דרמטית על המכשול סינון glomerular ומגביר לכן הצטנעות תהליך פרוטאינוריה ו כף הרגל. יכול להיות מוערך glomeruli אלה עם immunoblots חלבונים מפתח כגון nephrin ו- WT1 כדי להעריך את הבריאות הכללית. יתר על כן, ניתן להעריך את המבנה שלהם עם אור, immunofluorescence של מיקרוסקופ אלקטרונים.
פרוטוקול זה נגיש באופן כללי, רוב החוקרים (ורק צריך גישה החיות, ציוד פשוט). עם תכונות מורפולוגיות נשאר ניזוק, החוקר לנתח glomeruli ולראות סוגי תאים חשוב איך אחרים, שימור מטריקס glomeruli להשפיע על תפקוד ומחלות התקדמות, חסרונה תרבויות podocyte.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת פיטסבורג.
1. בידוד של עכברוש Glomeruli
- כדי להכין מאגר בידוד סטרילי של 1%, להוסיף 5 g של אלבומין שור (BSA) גביע 600 מ.
- להוסיף 500 מ של 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) כשהספל ומערבבים עם מוט מגנטי מלהיב עד כל BSA היא התפרקה.
- מסנן סטרילי המאגר BSA/PBS 1% בשכונה התרבות תאים.
הערה: המאגר BSA/PBS 1% סטרילי ניתן לשמור ב 4 מעלות צלזיוס במשך שבוע.
- להשיג חולדות ספראג-Dawley 2-4 במשקל 150-200 גרם כל אחד.
- המתת חסד חולדות באמצעות פחמן דו-חמצני שאיפת באמצעות חדר שבו 100% פחמן דו-חמצני הוא הציג בשיעור של 10-30% נפח החדר לדקה. לצפות בבעלי חיים עבור הפסקת נשימה ובניחוח צבע עיניים לפני ההסרה של פחמן דו-חמצני.
- להכין את העור מעל הבטן הקדמי עם 70% אתנול ולנצל קוצץ שיער להסרת שיער, אם רצונך בכך. עושים חתך קו האמצע של העור באמצעות מספריים כירורגיים או אזמל. לעשות חיתוך קו האמצע נוסף דרך השכבה שריר לחשוף איברים פנימיים. להרחיב את החתך עליונית דרך הסרעפת ואת עצם החזה או כלוב הצלעות כשיטה משנית של המתת חסד.
- לבודד ו להסיר שתי הכליות למקם את צינור פלסטיק 50 מל סטרילי חרוט עם 30 מ של הנקס במאגר תמיסת מלח (HBSS) על קרח.
הערה: מספר עכברים יכולים המתה בבית הבליעה אותה, של הכליות יכול להציב בצינור חרוט אותו.
- לשמור על הכליות על קרח, תחבורה ברדס תרבות תא סטרילי. להעביר את הכליות צלחת פטרי סטריליות המכיל 5 מ של HBSS, גם על קרח, להסיר, למחוק perirenal שומן עם מספריים, חדים מלקחיים. אם עדיין קיים, גם להסיר, למחוק את הקפסולה סביב הכליה על ידי הפיכת שטחי חתך קטן ולאחר מכן להשתמש מלקחיים חדה כדי משוך אותו בעדינות מן האיבר.
הערה: תמיד לשמור כליות מבודד על הקרח ותרגול סטרילי טכניקה ברחבי. ניתן להציב פיסת גזה סטרילית בצלוחית הפטרי כמו משטח עם מרקם כדי להחזיק את הכליה במקום במהלך מניפולציה.- הכליות לחצי לאורכו (סעיף midsagittal), להסיר ולמחוק את לשד (שהוא כהה בצבעו) עם איזמל בצלוחית השנייה עם 5 מ של HBSS.
- להעביר את חתיכות הנותרים, שהן בעיקר בקליפת הכליה, שליש צלחת פטרי עם 5 מ של HBSS, מינצ עם סכין גילוח סטרילי עד החלקים נמצאים פחות מ 1 מ"מ גודל או עד נוצרת עיסה.
- רטוב העליון והתחתון של מסננת 180 מיקרומטר עם 1% BSA/PBS מעל 500 מ"ל גביע פסולת. שלב זה הוא קריטי כמו זה ציפוי המסננת עם חלבון ומפחית הדבקות של glomeruli, אשר תשפר את התשואה.
- במקום קליפת טחון על יתרון קטן של המסננת ולהשתמש מקורבות הבוכנה עם מרקם (הצלע שממול חותמת גומי) של מזרק 10 מ"ל מוש הרקמה דרך המסננת לתוך מחבת התחתון יושב על קרח. לשטוף מעת לעת עם HBSS אך להשתמש כמה שפחות למנוע דילול הדגימה.
הערה: לא יעלה על 30 מ של מאגר הכולל, כך שרק 25 מ ל יותר ניתן להשתמש כאן. הסיבה להנחה הרקמה טחון על קצה אחד של המסננת היא לצמצם את דבקותה של glomeruli על-ידי הגבלת החשיפה לחלק של המסננת ולא את המסננת כל פני השטח.- כדי להקל על זה, שימוש חוזר הנוזל איסוף במחבת התחתון לשטוף המסננת. לאחר ניפוי תושלם, בזהירות לשטוף בתחתית המסננת פעם נוספת עם 1% מאגר BSA/PBS מתחתית המחבת כדי ללכוד כל glomeruli זה ייתכן שיש להקפיד באופן רופף.
- לאסוף את כל הנוזל במחבת למטה לתוך מזרקים 10 מ"ל במספר מצויד עם 20 גרם מחטים, להעביר את זה דרך המחט לפחות 2 פעמים נוספות. על האוסף האחרון, לשמור את הנוזלים המכילות glomeruli במזרק עד מוכן להעביר את זה דרך מסננת 90 מיקרומטר.
- בעוד הנוזל מאוחסן במזרקים, לשטוף את המחבת התחתון על ידי שטיפה עם 1% BSA/PBS לתוך הספל פסולת רטובה העליון והתחתון של מסננת 90 מיקרומטר עם 1% BSA/PBS. מניחים המסננת מעל המחבת התחתון על קרח.
- להחיל את הדגימה במזרקים לקצה אחד של מסננת, דייסה דרך המסננת עם-והסתיר מזרק נוסף כמתואר לעיל. לשטוף עם פתרון מהמחבת התחתון כדי לאסוף את הכל על קצה אחד של המסננת.
- פעם ניפוי הושלם, לשטוף היטב בתחתית המסננת כמו שלב 1.5.1. לאסוף את כל הנוזל במחבת התחתון של צינור חרוטי פלסטיק 50 מל.
- לשטוף את המחבת לתחתית עם 1% BSA/PBS לתוך הספל פסולת רטובה העליון והתחתון של מסננת מיקרומטר 75% 1 BSA/PBS. מניחים המסננת מעל המחבת התחתון על קרח.
- להחיל את הדגימה על קצה אחד של המסננת. הנוזל צריך לזרום דרך בקלות. לשטוף דרך הדף עם פחות 20 מ של 1% BSA/PBS לתוך הספל פסולת. לשטוף היטב בתחתית המסננת גם כן. Glomeruli יישאר בראש זו מסננת 75 מיקרומטר.
- השתמש HBSS כדי לאסוף glomeruli בצלחת פטרי בשטיפת דרך המסננת במהופך. השתמש כאן כמה שיותר HBSS לפי הצורך. לאסוף לתוך אחד או יותר 50 מ ל פלסטיק חרוט צינור על קרח.
- צנטריפוגה ב 1800 g x עבור 5 דקות ב 4 ° C, להסיר את תגובת שיקוע בזהירות עם פיפטה ו resuspend צנפה ב 10 מ"ל של HBSS קר. לשלב את הדגימות אם מספר צינורות חרוט נאספו ב 1.7.2. חזור על השלב צנטריפוגה.
- Resuspend glomeruli ב 5 מ של HBSS עד מוכן להמשיך לשלב הבא.
- אם רצונך בכך, לקחת ספירה של glomeruli הכולל. בשביל זה, לקחת דגימה µL 10 עם פיפטה ולמקם את המסירה על משטח זכוכית. הצג תחת מיקרוסקופ, לספור glomeruli בשדה, להכפיל ב- 500 כדי לקבל את התשואה הכוללת.
הערה: טוהר יכול להיקבע על ידי ספירת מספר בקוריאנית ראיתי בשטח, חילוק המספר הכולל של glomeruli ואת צנורית מבנים. צריך להיות > 95% glomeruli בשדה הראייה.- אם יש זיהום צינורי משמעותית, חזור על שלבים 1.6.1 ואילך, וודא כי מומלץ לשטוף ביסודיות כאשר השלמת שלב 1.7.1. זהו הצעד ב זיהום צינורי אשר קרוב לוודאי להתרחש.
2. פגיעה Glomeruli
- לאסוף glomeruli צינור חרוטי פלסטיק 15 מ"ל ו ספין למטה ב- x 200 ג' Resuspend בסכום המתאים של HBSS בהתבסס על התשואה הכוללת, כך שישנם כ- 9,000 glomeruli לכל טוב. פיפטה µL 450 מדגם לתוך כל טוב של צלחת 24-ובכן, או כל פורמט צלחת שמתאים את מבחני במורד הזרם הנדרש.
הערה: Pipetting למעלה ולמטה כדי לערבב glomeruli במאגר מבטיח פתרון הומוגני. Glomeruli הם דביקים מאוד כבד, לדבוק אחד בשני כמו גם להתישב בתחת של פתרון ובמהירות אל צידי הצינור. - כדי להפוך את מה לעזאזל קרה 6 מ"ג/מ"ל חומצה גופרתית (PS) פתרון, להמיס קודם 1g של PS לתוך 10 מ"ל של dH2O מחומם ל 40 ° C 15 מ"ל פלסטיק צינור חרוטי ו מערבולת ביסודיות. לקחת 30 µL של התמיסה ולהוסיף 470 µL של dH2O.
הערה: זה יהיה לייצר פתרון 6 מ"ג/מ"ל, כאשר 50 µL נוספים לבאר כפי שמתואר להלן, הריכוז הסופי הוא 0.6 מ"ג/מ"ל.- ב כפולות, להוסיף 50 µL של סולפט? מה לעזאזל קרה (זה 1:10 דילול) כל אחד טוב של קבוצה אחת, תוך הספקת עוד קבוצה 50 µL של HBSS (בקרה שלילית).
- דגירה את הצלחת במשך 4 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס.
- ספין למטה התוכן של כל טוב צינור microcentrifuge (4000 x g, 4 ° C, s 10-15), לשטוף פעמיים עם 1 מ"ל של PBS בכל.
- מחוק לגמרי מחוץ למכונה הסופי, resuspend ב µL 300 ל- PBS. פצל aliquots שלוש כדי להיות מוכנים לכל חלבון בידוד, הילוכים מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) ויזואליזציה ופתוח immunofluorescence מכתים (אם).
3. מכינים את Glomeruli לניתוח
- ספין למטה התוכן של aliquots (4000 x גרם, 4 ° C, s 10-15), לשאוב את מאגר הנותרים שלושה והמשך ניתוח מדגם על ידי TEM, אם, או בידוד חלבון.
- עיבוד עבור TEM
- לתקן את כדורי glomerular µL 150 של גלוטראלדהיד 2.5% קר ב- PBS 0.01 M. הסרת מקבע את בקפידה בגדר באמצעות פיפטה של פסטר, מקפיד לא לשבש את צניפה, ולאחר מכן שטפה אותו עם PBS, שלאחר לתקן אותו בבית 1% אוסמיום ארבע-חמצני עם 1% אשלגן ferricyanide.
- מייבשים את הדגימה דרך סדרה מדורגת של אתנול (30, 50, 70, 90, 100, 100, 100%) ופרופילן אוקסיד ואז להטביע אפוקסי הטמעת החומר.
- לחתוך דק למחצה (300 ננומטר) מקטעים ultramicrotome. כתם עם 0.5% טולדין כחול ב 1% נתרן בוראט ולבחון אותם תחת מיקרוסקופ אור.
- חותכים למקטעים זגוגית (65 ננומטר) תכתים אותם עם uranyl אצטט וחומצה ציטרית הראשי של וריינולד, לבחון על מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים.
- עיבוד אם
- להוסיף 150 µL של ג'לטין 12% ב- PBS פתרון ומניחים מיד על קרח יבש כדי ליצור גלולה. להשרות בגדר µL 500 של 2% paraformaldehyde/1 x PBS צינור microcentrifuge בין לילה ב 4 º C.
- הכנס בגדר תבנית בסיס, להטביע על-ידי הוספת חיתוך אופטימאליים טמפרטורה (אוקטובר) בינוני מעל קרח יבש. לחתוך 5-10 מיקרומטר מקטעים cryotome והמשך עם immunofluorescence/אימונוהיסטוכימיה או כתמים היסטולוגית סטנדרטי.
- בידוד חלבון
- להוסיף 150 µL ריפה מאגר centrifuged צנפה glomerular עם 1.5 µL של מעכב פרוטאז של דאונס עם רקמת לטקס.
- המשך כימות חלבון ו immunoblotting או חלבונים אחרים.
Representative Results
הפרוטוקול מימי המתת חסד בידוד של glomeruli בעיר קטנה כמו 2 h, כולל תפוקה גבוהה, יעילות. עם ניצול נכון של הטכניקה, התשואה של glomeruli לכל כליה עכברוש נע בין 6,000-10,000 glomeruli כאשר החל 8 הכליות. המתלה הסופי הוא ארוז בצפיפות עם glomeruli ויש של הכללית טוהר > 95%, מציג זיהום מזערי צינורי מקטעים או סוגי תאים אחרים (איור 1א', ב'). בנוסף, יכול להיות מוכתם glomeruli OCT-מוטבע עם כתמים (H & E) Hematoxylin ואאוזין לראות המורפולוגיה (איור 1C). אלה glomeruli לשמור על המבנה שלהם לאורך כל פרוטוקול שלם, אפילו לאחר העיבוד. נדגים glomeruli מבודד מחזיקים podocytes ללא שינוי בר -קיימא (איור 2א), תאים mesangial (איור 2B), תאי אנדותל (איור 2C).
מבודדת בעבר, ניתן לחשוף glomeruli ידועים פציעות כימי כדי לדמות ויוו פתולוגיה. במקרה זה, מה לעזאזל קרה סולפט (PS) נבחר בשל יכולתו לשבש את המטען של המכשול glomerular סינון, אשר בסופו של דבר מוביל רגל תהליך הצטנעות. Glomeruli שטופלו PS יש ירידה מרשימה nephrin (אדום), מספר גרעינים חיובי עבור WT1 (ירוק) באמצעות immunofluorescence (איור 3A, B). גם יכול להיות מוכנים glomeruli במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (איור 3ג'). דגימות הבקרה יש מורפולוגיה podocyte נורמלי, רגל תהליכים ואילו glomeruli שטופלו PS יש הצטנעות תהליך רגל (איור 3ד'), אשר הוא סימן של חוסר תפקוד podocyte נתפסת ויוו דגמים בעזרת PS21. גם התאים כדי ירידה nephrin שזוהה על-ידי immunoblotting (איור 3E, F).
כדי לקבוע את הכדאיות, קספאז cleaved-3 הוערכה כסמן של אפופטוזיס. שימוש immunofluorescence, קספאז cleaved-3 מופיע לראשונה כמה תאים מתחיל שעתיים לאחר בידוד (איור 4). מספר התאים לבטא פרוטאז הזה הפך בשפע רב יותר לאורך זמן, עם הרמות הגבוהות ביותר לראותם 24 ו 48 שעות. הדבר מצביע על זה אפופטוזיס מתרחשים יחסית מוקדם בתרבות, יישומים במורד הזרם, יש לבצעו לאחר בידוד לקבלת התוצאות הטובות ביותר.
איור 1 . מראה אופייני של תרבויות glomerular עכברוש לאחר הבידוד. (א) Brightfield תמונה של תרבות glomerular. למרות בחרנו שדה שבו יש צנורית כליות יחיד הזה micrograph (חץ), התרבויות שהושג בדרך כלל > 95% טהור. סרגל קנה מידה שווה 100 מיקרומטר (B) מוגדל תמונת פקעית יחיד. Hematoxylin (C) ו eosin כתם של פקעית יחיד. ברים בקנה מידה B ו- C שווה 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . סוגי תאים המרכיבים אותה נשמרים ב- glomeruli מבודד. מיקרוסקופ קונפוקלי immunofluorescence בוצעה עבור nephrin (אדום, podocytes) וסמנים תא ספציפי כדי לזהות podocytes, mesangial תאי אנדותל. (א) Costain nephrin, WT1 (ירוק, podocytes). Costain (B) עבור nephrin ו- PDGFR-β (ירוק, תאים mesangial, חץ). (ג) Costain nephrin, CD31 (תאים ירוקים, אנדותל, כלי חתך מסומן על ידי חץ). סרגל קנה מידה = מיקרומטר 25 על כל לוחות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . פגיעה Podocyte יכולה להיות המושרה במבחנה באמצעות glomeruli עכברוש מבודד. (א) immunofluorescence קונאפוקלית מיקרוסקופ עבור nephrin ו- WT1 ב תרבות glomerular ללא טיפול. שימו לב ליניארי nephrin מכתים (אדום), נוכחות של גרעינים WT1-חיוביות (ירוק) אשר ראו בדרך כלל כאשר יש podocytes בריאים. (B) אחרי? מה לעזאזל קרה חומצה גופרתית טיפול, ביטוי nephrin ירד ולא לינארי, WT1 נעדר, המציינת פגיעה podocyte. (ג) העברת אלקטרונים microscpy (TEM) התמונה מראה הרגל תהליכים קרום המרתף, של אנדותל fenestrated אופייני של מבנה glomerular נורמלי. בר שווה 500 ננומטר. (ד) לאחר? מה לעזאזל קרה סולפט, הרגל תהליכים מוארכת או התרחבות (חץ), אשר מצביע על פגיעה podocyte. תספיג חלבון (E) עבור nephrin מציג ירד nephrin לאחר הטיפול סולפט? מה לעזאזל קרה. (F) אקטין טעינת פקד עבור תספיג מוצג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 . הערכת הכדאיות תא ב glomeruli מבודד. מיקרוסקופ קונפוקלי immunofluorescence קספאז cleaved-3 (ירוק) בוצעה. כתם שיתוף nephrin בוצעה לאתר בקלות את glomeruli. למרות שלא היתה שום חיוביות cleaved קספאז-3-0 ו- 1 h לאחר ניתוקה של glomeruli, קרינה פלואורסצנטית אותות בתאים כמה צוין ב ה 2 למחמיר שיותר תאים הפך חיובית ככל לאחר בידוד שהם נבחנו. המספר הגדול ביותר של קספאז-3 תאים חיוביים נרשמו ב ה 24 ו 48 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
זוהי שיטה יעילה להתאוששות glomeruli מן החולדה הכליה באמצעות ציוד זול, לשימוש חוזר עם פרוטוקול פשוט. כמו עם כל ההליכים, קיימות מגבלות על תועלתו. ראשית, למרות אנו משיגים > 95% טוהר, בשל מהות sieving את הפרוטוקול ואת חומר המוצא שזה בלתי אפשרי לא לכלול כל מזהמים, ואת מספר כדוריות דם אדומות על קטע צינורי ומדי פעם להיות נוכחים בתרבות אנו מצפים האלה מזהמים קטנים כדי להיות בעיה עבור הרוב המכריע של יישומים. שנית, פרוטוקול sieving מסתמך על השימוש של עכברוש כליות, שבה glomeruli הם הרבה יותר גדול מאשר בעכברים. אם העכבר glomeruli נדרשים, טכניקה שימוש מסחרי beads מגנטי (למשל, Dynabeads) כבר פורסם22. שלישית, הוכח mRNAs הספציפי הזה (plasminogen activator מעכב-1 וקולגן אני) ב glomeruli מבודד שואבים כמעט לחלוטין כמוסה של באומן ולא intraglomerular תאים23. זה עלול להוביל למסקנות לא הולם אם mRNA בידוד מתבצע ניסיון של אלה glomeruli. יצוין כי בידיים שלנו רוב glomeruli הם decapsulated ולא צריך ולכן חוסר תרומה משמעותית מן קפסולות של באומן. רביעית, מוות של תאים מתחיל להתרחש במהירות יחסית בתנאים תרבות.
מצאנו כי התוכנית מוות, כפי שמעידים המראה של קספאז cleaved-3, הופעלה החל מ- 2 h של תרבות. . זה בדרך-כלל הסכם עם דוחות קודמים מציג שאת אפופטוזיס, כפי מוערך על ידי ה-DNA פיצול TUNEL, ניתוח היסטולוגית, מתחילה להתרחש בתוך 1-2 h לאחר בידוד24... עם זאת, גם יצוין כי מוקדם תצפיות הראו כי פעילות חילוף החומרים יכול להתגלות מ glomeruli sieved מבודד כאשר תרבותי לפחות 3 h, רומז ניכר הכדאיות הסלולר בגיל הזה timepoint16. למרות זאת, בהתבסס על התוצאות, אנו מאמינים שזה יהיה שקול לנצל glomeruli מבודד מיד בניסויים המיועד לקבלת התוצאות הטובות ביותר. אנו ממליצים כי כל ניסויים להתבצע לפני 72 h כפי שצפינו בה כל המבנה glomerular מתחיל להתדרדר מעבר timepoint הזה.
. זה הרבה יותר קל להשיג תשואות גבוהות כאשר החל מ 4-8 הכליות ולא רק 2 כי מספר מסוים של glomeruli הם איבדו בשל ההקפדה הנפות השונות, אבל ברגע הנפות הן מצופה מקסימאלית יש אין הפסד נוסף. מאותה סיבה, חשוב לטבול את הנפות המנזר מאגר BSA/PBS להשתמש glomeruli נוטים יותר לדבוק מסננת יבש, וכדי להגביל את החשיפה רקמות לקצה אחד של המסננת. אנו מציעים החל הכליות לא פחות מ 6 (3 חולדות) להשיג תשואה סבירה.
כמה חוקרים שללו podocyte העיקרי של glomeruli מבודד אשר נוטים לצמוח מתוך glomeruli במהלך תרבות17תרבויות. אנו ציינו כי כמה glomeruli מבודד דוגלים תרבות צלחת פלסטיק, כי התאים יתחיל להגר המבנה glomerular בשעה מאוחרת timepoints (72 h לאחר בידוד). המחקר של תאים אלה הוא מעבר להיקף של פרוטוקול זה בידוד, ויש מחלוקת באשר אם תאים אלה הם podocytes, הקודקוד תאי אפיתל או בני15,25. ראוי לציין, Mundel. et al., דיווחו כי תאים המרוצף שנקטפו sieved glomeruli עשוי להיגרם כדי להתמיין podocytes בוגרים תחת ספציפיים culturing תנאים26. חלק מן הבלבול לגבי זהות תא תלויים אם glomeruli מבודד כמוסות (כולל הקפסולה של באומן אשר מאוכלס על ידי תאים אפיתל הקודקוד) או decapsulated בהליך sieving. בידיים שלנו, באמצעות מסננת רציפים בגדלים של 180, 90, ו- 75 מיקרומטר הובילו רוב glomeruli להיות decapsulated.
רוב צורות של מחלת כליות כרונית proteinuric הן בשל עליות glomerular חדירות. מספר סופרים נעזרו glomeruli מבודד בניסויים חדירות ' ex-vivo . בשיטה אחת, שינוי נפח glomerular לאחר שינוי תוכן osmotic התקשורת שמסביב שימש להערכת חדירות27. לאחרונה, נקבע כי דליפה של בדיקה פלורסנט מ glomeruli מבודדים ניתן לכמת למדוד פרמאביליות, היה יכול. להתבצע בחולדות חשופים למחלות glomerular ניסיוניות28.
אנו ציינו כי בתהליך הכנה TEM, אנחנו לפעמים לראות את podocyte ברגל תהליכי הרמה את קרום המרתף. אנחנו לא מרגישים זה קורה בתרבות, סביר יותר להניח חפץ במהלך הכנת הדוגמא TEM. ראוי לציין, גם כאשר מצב זה מתרחש, ברור אם התהליכים הרגל נראה "נורמלי" או הם התרחבות.
בסך הכל, פרוטוקול זה מספק שיטה שבה אחד יכול להעריך שינויים מורפולוגיות, הסלולר, בתגובה לפציעה. אנו צופים כי זה עשוי לשמש. טכניקה לוויה לתרבויות podocyte מבודדים, במיוחד כאשר שוקלים את האינטראקציות עם מטריצה חוץ-תאית או סוגי תאים מקומיים אחרים. זה טומן בחובו הבטחה להגברת ההבנה של CKD proteinuric, אשר לשפר את היכולת לפתח בעתיד הרפוי במחלה הזו מתישה.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי איגוד הלב האמריקאי גרנט FTF 16990086, NIH P30 DK079307, אמריקאי החברה של נפרולוגיה גוטשאלק, של אוניברסיטת פיטסבורג רפואי מרכז תחרותי רפואי מחקר קרן פרס, ובפרס של אוניברסיטת פיטסבורג רופאים האקדמי פרס. אנו מודים ג'רארד Apodaca על שלו הצעות טכניות לשימור glomerular עבור ניתוח היסטולוגית, מארה סאליבן, מינג סאן לקבלת סיוע עם מיקרוסקופ אלקטרונים, Yingjian Li, Youhua ליו לקלט הטכני שלהם ב פרוטוקול זה. אנו מודים גם סינתיה סנט הילר על הנוגדן CD31.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions, Chemicals, and Animals | |||
| Sprague-Dawley Rats | Envigo | 207M | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1605100 | |
| Hank's Balanced Salt Solution with Ca2+ and Mg2+ | Thermo | 14025092 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline | VWR | 97063-660 | |
| Protamine sulfate | MP Bio | ICN15197105 | |
| Karnovsky's Fixative | |||
| Gelatin | |||
| Paraformaldehyde | EMD | EM-PX0055-3 | |
| O.C.T. | Scigen | 23730571 | |
| RIPA Buffer | |||
| Halt Protease Inhibitors | Thermo | PI78442 | |
| Nephrin Antibody | Fitzgerald | 2OR-NP002 | |
| WT-1 Antibody | Abcam | ab89901-10ul | |
| PDGFR-β Antibody | Cell Signaling | #3169S | |
| CD31 Antibody | LSBio | LS-C348736 | |
| Cleaved caspase-3 antibody | Cell Signaling | 9661S | |
| Poly/Bed 812 (Luft) epoxy | Polysciences | 08792-1 | |
| Equipment | |||
| Carbon dioxide chamber | |||
| Conical tubes, 15 mL | |||
| Conical tubes, 50 mL | |||
| Surgical scissors | |||
| Surgical forceps | |||
| Sterile gauze | |||
| Petri dishes, 100 mm | |||
| Scalpels | |||
| Razor blades | |||
| Sterile filter apparatus | |||
| Sieve Pan | Alfa Aesar | AA39999ON | |
| 180um Sieve | Alfa Aesar | AA39996ON | |
| 90um Sieve | Alfa Aesar | AA39990ON | |
| 75um Sieve | Alfa Aesar | AA39991ON | |
| 10 mL syringes | |||
| 600 mL beakers | |||
| Cell culture incubator | |||
| Picofuge | |||
| Vortex | |||
| Tissue Homogenizers | Fisher Scientific | 50550226 | |
| 20 G needles | |||
| Leica Reichart Ultracut | ultramicrotome |
References
- Grahammer, F., Schell, C., Huber, T. B. Molecular understanding of the slit diaphragm. Pediatric Nephrology. 28 (10), 1957-1962 (2013).
- Tan, R. J., Zhou, L., Zhou, D., Lin, L., Liu, Y. Endothelin receptor a blockade is an ineffective treatment for adriamycin nephropathy. PLoS One. 8 (11), 79963 (2013).
- Wagner, N., Wagner, K. D., Xing, Y., Scholz, H., Schedl, A. The major podocyte protein nephrin is transcriptionally activated by the Wilms' tumor suppressor WT1. Journal of the American Society of Nephrology. 15 (12), 3044-3051 (2004).
- Rogacka, D., et al. Insulin increases filtration barrier permeability via TRPC6-dependent activation of PKGIalpha signaling pathways. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (6), 1312-1325 (2017).
- Mundel, P., et al. Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines. Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).
- Moller, C. C., et al. Induction of TRPC6 channel in acquired forms of proteinuric kidney disease. Journal of the American Society of Nephrology. 18 (1), 29-36 (2007).
- Tian, D., et al. Antagonistic regulation of actin dynamics and cell motility by TRPC5 and TRPC6 channels. Science Signaling. 3 (145), 77 (2010).
- Shankland, S. J., Pippin, J. W., Reiser, J., Mundel, P. Podocytes in culture: past, present, and future. Kidney Internationalernational. 72 (1), 26-36 (2007).
- Cook, W. F., Pickering, G. W. A rapid method for separating glomeruli from rabbit kidney. Nature. 182 (4642), 1103-1104 (1958).
- Misra, R. P. Isolation of glomeruli from mammalian kidneys by graded sieving. American Journal of Clinical Pathology. 58 (2), 135-139 (1972).
- Burlington, H., Cronkite, E. P. Characteristics of cell cultures derived from renal glomeruli. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 142 (1), 143-149 (1973).
- Harper, P. A., Robinson, J. M., Hoover, R. L., Wright, T. C., Karnovsky, M. J. Improved methods for culturing rat glomerular cells. Kidney International. 26 (6), 875-880 (1984).
- Kreisberg, J. I., Hoover, R. L., Karnovsky, M. J. Isolation and characterization of rat glomerular epithelial cells in vitro. Kidney International. 14 (1), 21-30 (1978).
- Weinstein, T., Cameron, R., Katz, A., Silverman, M. Rat glomerular epithelial cells in culture express characteristics of parietal, not visceral, epithelium. Journal of the American Society of Nephrology. 3 (6), 1279-1287 (1992).
- Yaoita, E., Kurihara, H., Sakai, T., Ohshiro, K., Yamamoto, T. Phenotypic modulation of parietal epithelial cells of Bowman's capsule in culture. Cell and Tissue Research. 304 (3), 339-349 (2001).
- Meezan, E., Brendel, K., Ulreich, J., Carlson, E. C. Properties of a pure metabolically active glomerular preparation from rat kidneys. I. Isolation. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 187 (2), 332-341 (1973).
- Piwkowska, A., et al. Insulin increases glomerular filtration barrier permeability through PKGIalpha-dependent mobilization of BKCa channels in cultured rat podocytes. Biochimica et Biophysica Acta. 1852 (8), 1599-1609 (2015).
- Kotyk, T., et al. Measurement of glomerulus diameter and Bowman's space width of renal albino rats. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 126, 143-153 (2016).
- Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Exp Ther Med. 5 (5), 1322-1326 (2013).
- Leeuwis, J. W., Nguyen, T. Q., Dendooven, A., Kok, R. J., Goldschmeding, R. Targeting podocyte-associated diseases. Advanced Drug Delivery Reviews. 62 (14), 1325-1336 (2010).
- Subramanian, B., et al. Mice with mutant Inf2 show impaired podocyte and slit diaphragm integrity in response to protamine-induced kidney injury. Kidney International. 90 (2), 363-372 (2016).
- Takemoto, M., et al. A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice. American Journal of Pathology. 161 (3), 799-805 (2002).
- Steinmetz, O. M., et al. A pitfall of glomerular sieving: profibrotic and matrix proteins derive from the Bowman's capsule and not the glomerular tuft in rats with renovascular hypertension. Nephrology Dialysis Transplantation. 22 (10), 3055-3060 (2007).
- Ishikawa, Y., Kitamura, M. Spontaneous apoptosis of podocytes in explanted glomeruli. Technical note. Kidney International. 54 (6), 2008-2013 (1998).
- Krtil, J., Platenik, J., Kazderova, M., Tesar, V., Zima, T. Culture methods of glomerular podocytes. Kidney and Blood Pressure Research. 30 (3), 162-174 (2007).
- Mundel, P., Reiser, J., Kriz, W. Induction of differentiation in cultured rat and human podocytes. Journal of the American Society of Nephrology. 8 (5), 697-705 (1997).
- McCarthy, E. T., et al. TNF-alpha increases albumin permeability of isolated rat glomeruli through the generation of superoxide. Journal of the American Society of Nephrology. 9 (3), 433-438 (1998).
- Desideri, S., et al. A novel assay provides sensitive measurement of physiologically relevant changes in albumin permeability in isolated human and rodent glomeruli. Kidney International. 93 (5), 1086-1097 (2018).
