Summary
Hovedfokuset for denne protokollen er effektivt isolere levedyktig primære glomeruli kulturer med minimal forurensninger for bruk i en rekke nedstrøms programmer. De isolerte glomeruli kan beholde strukturelle relasjoner mellom komponent celletyper og kultivert ex vivo for en kort tid.
Abstract
Bevaring av glomerular struktur og funksjon er sentral i forebygging av glomerulonefritt, en kategori preget av proteinuria som kan føre til kronisk nyresykdom og end-stegs nyre sykdom. Glomerulus er en kompleks apparater ansvarlig for filtrering av plasma fra kroppen. I sykdom, strukturell integritet går tapt og tillater unormal lekkasje av plasma innholdet i urinen. En metode for å isolere og undersøke glomeruli i kultur er avgjørende for studiet av disse sykdommene. Effektiv metode for å hente intakt glomeruli fra voksen rotte nyrer mens bevaring strukturelle og morfologiske kjennetegn er beskrevet i denne protokollen. Denne prosessen er i stand til å generere høy avkastning av glomeruli per nyre med minimal forurensning fra andre nyre segmenter. Med disse glomeruli, kan skade forhold bli etterlignet av rugende dem med en rekke kjemiske giftstoffer, inkludert protamine sulfate, som forårsaker fot prosessen effacement og proteinuria i dyremodeller. Skadegrad kan vurderes overføring elektronmikroskop, immunofluorescence flekker og vestlige blotting. Nephrin og Wilms Tumor 1 (WT1) nivåer kan også vurderes fra disse kulturene. Letthet og fleksibilitet i denne protokollen, kan de isolerte glomeruli benyttes som beskrevet eller på en måte som best passer behovene til forskeren til å bedre studie glomerular helse og struktur i syke stater.
Introduction
Glomerulus er en høyt spesialisert dusk av kapillærene ansvarlig for filtrering av sirkulerende plasma. Den danner begynnelsen av nyre, som er grunnleggende funksjonell enhet av nyrene. Glomerular-funksjonen er definert av et unikt fenestrated kapillær endotelet, slit membranen av podocytes og en mellomliggende kjelleren membran. Disse lagene danner en semipermeable barriere å tillate selektiv utskillelse av stoffer i filtratet. Vann, ioner og andre små molekyler generelt passere gjennom, mens større molekyler beholdes i plasma. Podocytes er spesialisert epitelceller som spredt over kjelleren membranen, rundt kapillærene med cytoplasmatiske anslag kjent som foten prosesser. Foten prosesser av tilstøtende podocytes interdigitate og er krysset av slit membraner består av proteiner som nephrin, podocin, P-cadherin og ZO-1-1. I tverrsnitt, disse foten prosesser er jevnt arrangert over kjelleren membranen. I syke glomeruli blir foten prosessene grovt unormal eller "visket ut," fører til unormal lekkasje av plasma innholdet i filtratet. Slik er glomerular skader vanligvis preget av tilstedeværelsen av unormalt store mengder protein (f.eks proteinuria) og/eller røde blodlegemer (f.eks hematuria) i urinen. I tillegg mister skadet podocytes uttrykk for nephrin så vel som dens regulator Wilms Tumor 1 (WT1), en nøkkel protein ansvarlig for vedlikehold av differensiering2,3. Glomeruli er en primær målet for skade i diabetiker nephropathy og andre glomerulonephritides som minimal endre sykdom og membranous nephropathy fokal Segmentinformasjon glomerulosclerosis. Disse sykdommene er viktige årsaker til progressiv nyresvikt og utviklingen av end-stegs nyre sykdom, en tilstand der overlevelse avhenger på dialyse eller nyre transplantasjon. Derfor er det viktig å studere glomeruli for bedre å forstå kroniske nyre sykdom (Parallelt) patologi.
En celle kultur-systemet er kritisk til å studere glomerular biologi. På grunn av sin sentrale rolle generere slit mellomgulvet, samt eksistensen av spesifikke proteinuric sykdommer på grunn av slit membran protein mutasjoner, har mye forskning forståelig nok utnyttet podocyte isolert. Dette har ført til generasjon av primære podocyte linjer å utnytte i vitro. Disse cellene kan kultivert under en rekke forhold og kan selv dyrkes på permeable støtter å vurdere permeabilitet4. Imidlertid velger isolering av voksende celler ofte dedifferentiated celler som har mistet noen av sine podocyte markører. Dette har ført til generasjon av betinget udødelighet podocytes avledet fra en transgene musen belastning bærer en temperatur-sensitive mutant av SV40 store T genet (f.eks immortomouse), som kan dyrkes i kultur, men også være differensiert for å uttrykke full rekke podocyte indikatorer5. Disse metodene primære kultur har vært sentral i forståelse podocyte biologi4,6,7.
Likevel, kulturer som inneholder enkelt celletyper mangler intercellulære relasjonene som oppstår i vivo samt støttestruktur og matriser, og monolayers av disse cellene nødvendigvis er recapitulate ikke den tredimensjonale arkitektur for glomeruli. Den udødeliggjort podocytes kan også være tungvint og utfordrende å kultur8, og krever besittelse av enten på immortomouse eller en start aliquot av celler fra etablerte etterforskerne å komme i gang. Videre, glomerulus består av ikke bare podocytes, men også kapillær endotelceller i kjelleren membran, samt mesangial celler som gir støtte for strukturen. Derfor er det nyttig å utvikle en ex vivo tilnærming tilgjengelig til alle etterforskere for studier av intakt glomeruli som beholder sin opprinnelige arkitektur samt alle cellene utgjør den normale glomerulus.
I 1958 beskrevet kokk og Pickering første isolering av glomeruli fra kanin nyrene. Etter observasjoner at fett emboli ble fremlagt i glomeruli, postulerte de at partikler av samme størrelse kan brukes spesielt isolere disse strukturene. Faktisk tilførsel av jernoksid partikler i nyret førte til fangst av disse partiklene i glomeruli. Etter mekanisk dissosiasjon og sikting av nyre, kan glomeruli være isolert intakt og med renhet ved hjelp av magnetiske separasjon9. I 1971 viste Misra at jernoksid infusjoner kan utelates og glomerular isolasjon med sikting av hakket menneske, hund, kanin eller rotte nyre vev10. Denne teknikken er endret siden så avhengig av målet med etterforskerne men egentlig har resultert i renset preparater som kan studeres videre eller som primært cellekulturer kan være etablert11,12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17.
Her beskriver vi en protokoll for isolering av intakt levedyktig glomeruli fra rotte nyrene. Hele protokollen tar bare noen få timer. Selv om de ikke sprer, kan eksperimentelle planer av alle størrelser støttes ved å øke antall nyrer som starter materiale. Mens det er publisert protokoller for magnetisk perle separasjon av glomeruli, de krever en intravenøs injeksjon av perler, er dyrere og kan endre biologi siden perlene beholdes enten av glomeruli i kultur eller krever glomerular" lysing"og fjerning av sentrifugering19. Sammenlignet med musen glomeruli, gjør den større størrelsen på rotte glomeruli (nesten 100 µm i to måneder gamle rotter18) det lettere å skille dem fra andre nyre strukturer ved hjelp av en enkel sieving teknikk.
Som bevis på sin nytteverdi, har vi preget glomeruli for å vise de forskjellige celletyper. De kan også være utsatt for agenter kjent å skade glomeruli i vivo, og vi viser de negative effektene av protamine sulfate (PS) på disse kulturene. PS er en polycation som nøytraliserer anionic områdene langs glomerular kapillær veggen20. Denne nøytralisering har en dramatisk effekt på glomerular filtrering barrieren og derfor øker proteinuria og fot prosessen effacement. Disse glomeruli kan vurderes med immunoblots for viktige proteiner som nephrin og WT1 å vurdere helse. Videre kan strukturen evalueres med lys, immunofluorescence og elektronmikroskop.
Samlet er denne protokollen tilgjengelig for de fleste etterforskere (en trenger bare tilgang til dyrene og noen enkle utstyr). Med morfologiske funksjoner igjen uskadd, forskeren er dugelig å analysere glomeruli og se hvordan andre viktige celletyper og matrix bevaring i glomeruli påvirke funksjonen og sykdom progresjon, en svakhet for podocyte kulturer.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av University of Pittsburgh.
1. isolering av rotte Glomeruli
- For å forberede en steril 1% isolasjon buffer, legge til 5 g av bovin serum albumin (BSA) en 600 mL kanne.
- Legge til 500 mL 1 x fosfat bufret saltvann (PBS) begeret og rør med en gripende magnetkammen til alle BSA er oppløst.
- Sterile filtrere 1% BSA/PBS bufferen i celle kultur hette.
Merk: Sterile 1% BSA/PBS bufferen kan holdes på 4 ° C i opptil en uke.
- Få 2 til 4 Sprague-Dawley rotter veier 150 til 200 g hver.
- Euthanize rotter via karbondioksid innånding bruker et kammer som 100% karbondioksid er innført med en hastighet på 10-30% av kammeret volum per minutt. Observere dyr for opphør av åndedrett og falmet øyenfarge før fjerning av karbondioksid.
- Forberede huden over fremre magen med 70% etanol og benytte hårklippere for å fjerne hår, om ønskelig. Foreta en midtlinjen snitt i huden med kirurgisk saks eller skalpell. Gjøre en annen midtlinjen snitt gjennom muskel laget å utsette indre organer. Utvide innsnitt overlegent gjennom membranen og sternum eller rib bur som sekundær av euthanasia.
- Isolere og fjerne begge nyrer og plasser i et sterilt 50 mL konisk plastrør med 30 mL av Hanks' bufrede salt løsning (HBSS) på is.
Merk: Flere rotter kan være euthanized inne i samme kammer og alle nyrene kan plasseres i samme konisk rør.
- Holde nyrene på isen og transport til sterilt celle kultur hette. Overføre nyrene til et sterilt Petriskål inneholder 5 mL av HBSS, også over isen, og fjerne og forkaste perirenal fett med saks og skarpe tang. Hvis fortsatt til stede, også fjerne og forkaste kapselen rundt nyrene ved å gjøre en liten overfladisk snitt og deretter bruke skarp tang til å dra det forsiktig fra orgelet.
Merk: Hold alltid nyre isolerer på is og praksis steril teknikk hele. Et stykke sterilt gasbind kan plasseres i Petriskål som en strukturert overflate å holde nyre på plass under manipulasjon.- Halvert nyrer på langs (midsagittal inndelingen) og fjerne og slette medulla (som er mørkere i fargen) med en skalpell i en andre Petriskål med 5 mL av HBSS.
- Overføre de gjenværende brikkene, som er overveiende nyre cortex, til en tredje Petriskål med 5 mL HBSS og hakke med et sterilt barberblad til bitene er mindre enn 1 mm i størrelse, eller til en pasta er dannet.
- Våt toppen og bunnen av en 180 µm sil med 1% BSA/PBS over et 500 mL avfall beger. Dette trinnet er viktig som den strøk silen med protein og reduserer av glomeruli, som vil forbedre avkastningen.
- Plasser hakket cortex på en liten kant av silen og bruk strukturert stempelet flensen (siden overfor gummilisten) av en 10 mL sprøyte for å grøt vevet gjennom silen inn en bunn pan sitter på is. Skyll med jevne mellomrom med HBSS men bruker så lite som mulig for å unngå eksempel fortynning.
Merk: Ikke overstige 30 mL av bufferen, så bare 25 mL mer kan brukes her. Grunnen til å plassere hakket vevet eneste utkanten av silen er å redusere av glomeruli ved å begrense eksponering for en del av silen i stedet for hele sil areal.- For å lette dette, kan du bruke væsken å samle i bunn pan skylle silen. Når sikting er fullført, forsiktig vaske bunnen av silen igjen med 1% BSA/PBS buffer fra bunnen av kjelen å fange noen glomeruli som kan bli løst overholdt.
- Samle alle væske i bunn pan i flere 10 mL sprøyter utstyrt med 20 G nåler og passere gjennom nålen minst 2 ganger. I den siste samlingen, kan du lagre glomeruli inneholder væske i sprøyten helt klar til å passere gjennom 90 µm silen.
- Mens væsken er lagret i sprøyter, vaske bunnen pannen av rødme med 1% BSA/PBS avfall kanne og våt toppen og bunnen av en 90 µm sil med 1% BSA/PBS. Plass silen over bunn pan på is.
- Bruk eksemplet i sprøyter til kanten av sil og grøt gjennom silen med en sprøyte flens som beskriver ovenfor. Vask med løsning fra bunn pan å samle alt på én kant av silen.
- Vaske forsiktig bunnen av silen som i trinn 1.5.1 når sikting er fullført. Samle alle væske i bunn pan i et 50 mL konisk plastrør.
- Vaske bunnen kjelen med 1% BSA/PBS i en avfall kanne og våt toppen og bunnen av en 75 µm sil med 1% BSA/PBS. Plass silen over bunn pan på is.
- Bruke prøven til kanten av silen. Væsken skal flyte gjennom lett. Skyll gjennom toppen med minst 20 mL 1% BSA/PBS i avfall kanne. Forsiktig vaske bunnen av silen også. Glomeruli forblir på denne 75 µm sil.
- Bruk HBSS til å samle glomeruli i en Petriskål av skylling gjennom silen opp ned. Bruke så mye HBSS behov her. Samle i én eller flere 50 mL plast konisk lysrør på is.
- Sentrifuge 1800 x g i 5 min på 4 ° C, fjerne nedbryting med en pipette og resuspend pellets i 10 mL kaldt HBSS. Kombinere prøvene hvis flere konisk rør ble samlet i 1.7.2. Gjenta trinnet sentrifugering.
- Resuspend glomeruli i 5 mL av HBSS helt klar til å fortsette til neste trinn.
- Eventuelt ta summen av de totale glomeruli. For dette, ta en 10 µL prøve med en pipette og plassere rullegardinlisten på et glass lysbilde. Se under et mikroskop, teller glomeruli i feltet og multiplisere med 500 å få totale avkastning.
Merk: Renhet kan bestemmes ved å telle antall tubuli sett i feltet og dele på totalt antall glomeruli og tubule strukturer. Det bør være > 95% glomeruli i feltet visual.- Hvis det er betydelig rørformede forurensning, gjenta 1.6.1 videre, og husk å vask når fullfører trinn 1.7.1. Dette er skritt hvilke rørformede forurensning er mest sannsynlig.
2. skade på Glomeruli
- Samle glomeruli 15 mL konisk plastrør og spinn ned på 200 x g. Resuspend i en passende mengde HBSS basert på den totale avkastningen slik at det er omtrent 9000 glomeruli per brønn. Pipetter 450 µL av prøve i hver brønn av en 24-vel-plate, eller en plate format som passer til nedstrøms analyser nødvendig.
Merk: Pipettering opp og ned å blande glomeruli i buffer sikrer en homogen løsning. Glomeruli vil er veldig klissete og tunge og holde seg til hverandre samt bosette seg på bunnen av en løsning raskt og på sidene av røret. - For å gjøre 6 mg/mL protamine sulfate (PS) løsning, først oppløse 1 g PS i 10 mL av dH2O oppvarmet til 40 ° C i en 15 mL konisk plastrør og vortex grundig. Ta 30 µL av løsningen og legge til 470 µL av dH2O.
Merk: Dette vil gi en 6 mg/mL løsning, og når 50 µL legges til brønnen som beskrevet nedenfor, siste konsentrasjonen er 0.6 mg/mL.- Duplikat, legge til 50 µL av protamine sulfate (dette er en 1:10 fortynning) til hver brønn i én gruppe, mens forsyne en annen gruppe 50 µL av HBSS (negativ kontroll).
- Inkuber plate 4 h på 37 ° C.
- Nedspinning innholdet i hver brønn i et microcentrifuge rør (4000 x g, 4 ° C, 10-15 s) og vask to ganger med 1 mL av PBS hver.
- Sug opp av siste vask og resuspend i 300 µL av PBS. Delt inn i tre dele å være forberedt på protein isolasjon, transmission elektron mikroskop (TEM) visualisering og immunofluorescence flekker (hvis).
3. forberedelser Glomeruli for analyse
- Nedspinning innholdet i de tre dele (4000 x g, 4 ° C, 10-15 s) og leveringstanken av gjenværende buffer og fortsette å prøve analyse av TEM, hvis eller protein isolasjon.
- Behandling for TEM
- Fikse glomerular pellets i 150 µL av kaldt 2,5% glutaraldehyde i 0.01 M PBS. Fjern bindemiddel nøye fra pellet bruker en Pasteur pipette, sørge for ikke å forstyrre pellets, er skylte den med PBS og etter fikse det i 1% osmium tetroxide med 1% kalium ferricyanide.
- Tørke utvalget gjennom en gradert rekke etanol (30, 50, 70, 90, 100, 100, 100%) og propylen og deretter bygge inn i epoxy innebygging materiale.
- Skjær tynne semi (300 nm) deler på et ultramicrotome. Flekker med 0,5% Toluidine blå i 1% natriumborat og undersøke dem under lys mikroskop.
- Kutte ultrathin deler (65 nm), stain dem med uranyl acetate og Reynolds bly citrate og undersøke på transmission elektron mikroskop.
- Behandling for hvis
- Legg til 150 µL av en 12% i PBS løsning og umiddelbart plassere på tørris å danne pellets. Suge pellet i 500 µL av 2% paraformaldehyde/1 x PBS i et microcentrifuge rør overnatting på 4 ° C.
- Plasser pellet i en base mold og legge ved å legge til optimal kutte temperatur (OCT) medium over tørris. Skjær 5-10 µm deler på et cryotome og fortsette med immunofluorescence/immunohistochemistry eller standard histologiske flekker.
- Protein isolering
- Legge til 150 µL RIPA bufferen sentrifugeres glomerular pellets med 1,5 µL av protease hemmer og dounce med vev homogenizers.
- Videre til protein kvantifisering og immunoblotting eller andre protein analyse.
Representative Results
Protokollen fra tidspunktet for euthanasia til isolasjon av glomeruli kan være ferdig i så lite som 2 timer og har en høy gjennomstrømning og effektivitet. Med riktig bruk av teknikken, avkastningen av glomeruli per rotte nyre varierer fra 6000-10.000 glomeruli når du starter med 8 nyrer. Siste suspensjon er tettpakket med glomeruli og har en total renhet > 95%, viser minimal forurensning fra rørformede segmenter eller andre celletyper (figur 1A, B). I tillegg kan til OCT-embedded glomeruli være farget med Hematoxylin og Eosin (H & E) flekker å se morfologi (figur 1C). Disse glomeruli beholder strukturen gjennom hele protokollen, selv etter behandling. Vi viser at isolert glomeruli ha intakt og levedyktig podocytes (figur 2A), mesangial celler (figur 2B) og endotelceller (figur 2C).
Isolerte glomeruli kan bli utsatt for kjente kjemiske skader å simulere i vivo patologi. I dette tilfellet ble protamine sulfate (PS) valgt for sin evne til å forstyrre ansvaret for glomerular filtrering barriere, som til slutt fører til fots prosessen effacement. PS-behandlet glomeruli har en slående reduksjon i nephrin (rød) og et antall kjerner positivt for WT1 (grønn) via immunofluorescence (Figur 3A, B). I glomeruli kan også tilberedes for overføring elektronmikroskop (Figur 3C). Kontroll har normal podocyte morfologi og fot prosesser mens PS-behandlet glomeruli har foten prosessen effacement (Figur 3D), som er et tegn på podocyte dysfunksjon og er sett i i vivo modeller med PS21. Dette tilsvarte også en nedgang i nephrin oppdaget av immunoblotting (Figur 3E, F).
For å bestemme levedyktigheten, ble kløyvde caspase-3 vurdert som en markør av apoptose. Bruker immunofluorescence, vises kløyvde caspase-3 først i noen celler fra 2t etter isolasjon (Figur 4). Antall celler uttrykke dette protease ble mer rikelig over tid, med de høyeste nivåene sett på 24 og 48 h. Dette tyder på at apoptose oppstår relativt tidlig i kultur og at nedstrøms programmer bør utføres etter isolasjon for best resultat.
Figur 1 . Typisk utseende rotte glomerular kulturer etter isolasjon. (A) Brightfield bildet glomerular kultur. Selv om vi valgte et felt der det er en enkelt nyre tubule i denne mikroskop-bilde (pilspiss), er kulturer innhentet generelt > 95% ren. Skala bar er lik 100 µm. (B) forstørret bilde av en enkelt glomerulus. (C) Hematoxylin og eosin flekk av en enkelt glomerulus. Skala barer i B og C er lik 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Konstituerende celletyper beholdes i isolerte glomeruli. AC confocal immunofluorescence mikroskopi ble utført for nephrin (rød, podocytes) og celle-spesifikke indikatorer for å identifisere podocytes og mesangial celler endotelet. (A) Costain for nephrin og WT1 (grønn, podocytes). (B) Costain for nephrin og PDGFR-β (grønn, mesangial celler, pil). (C) Costain for nephrin og CD31 (grønn, endothelial celler, fartøy i tverrsnitt preget av pilspisser). Skala bar = 25 µm på alle paneler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Podocyte skade kan være indusert i vitro med isolert rotten glomeruli. (A) immunofluorescence AC Confocal mikroskopi for nephrin og WT1 i en ubehandlet glomerular kultur. Note lineær nephrin flekker (rød) og tilstedeværelsen av WT1-positive kjerner (grønn) som er vanligvis sett når det er sunt podocytes. (B) etter at protamine sulfate behandling, nephrin uttrykk er redusert og ikke-lineære WT1 er fraværende, angir podocyte skade. (C) Transmission elektron microscpy (TEM) bildet viser foten prosesser, kjelleren membran og en fenestrated endotelet typisk for normal glomerular struktur. Bar lik 500 nm. (D) etter protamine sulfate, foten prosesser er langstrakte eller visket ut (pilspisser), som indikerer podocyte skade. (E) Western blot for nephrin viser redusert nephrin etter protamine sulfate behandling. (F) utgangen lasting kontroll for western blot vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Vurdering av cellen levedyktighet i isolerte glomeruli. AC confocal immunofluorescence mikroskopi for kløyvde caspase-3 (grønn) ble utført. En nephrin co flekk ble utført for å enkelt finne glomeruli. Mens det var ingen cleaved caspase-3 positivitet på 0 og 1 time etter isolering av glomeruli, ble fluorescens signalet i noen celler notert på 2 h. stadig flere celler slått positivt lenger etter isolasjon de ble undersøkt. Det største antallet caspase-3 positive celler ble bemerket på 24 og 48 h. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Dette er en effektiv metode for å utvinne glomeruli fra rotte nyre billig, gjenbrukbare utstyr med en enkel protokoll. Som med alle prosedyrer, finnes det begrensninger å dens nytte. Først, selv om vi får > 95% renhet, hen sieving protokollen og den starte materialet det er umulig å utelate alle forurensninger, og noen røde blodlegemer og sporadiske rørformede segmentet finnes i kulturen. Vi regner ikke disse små forurensning er et problem for de aller fleste av programmer. Andre sieving protokollen er avhengig av bruken av rotte nyrene, der glomeruli er mye større enn mus. Hvis musen glomeruli er nødvendig, har en teknikken bruker kommersielle magnetiske perler (f.eksDynabeads) vært utgitt22. Tredje, har det vært vist at bestemte mRNAs (plasminogen aktivator inhibitor-1 og kollagen jeg) i isolerte glomeruli utlede nesten utelukkende fra Bowman's capsule stedet intraglomerular celler23. Dette kan føre til upassende konklusjoner hvis mRNA isolasjon er forsøkt fra disse glomeruli. Det bør bemerkes at i våre hender fleste av glomeruli er decapsulated og bør derfor mangler betydelige bidrag fra Bowmans kapsler. Fjerde begynner celledød å oppstå relativt raskt under kultur forhold.
Vi fant at apoptotisk programmet, som dokumentert ved kløyvde caspase-3, ble aktivert fra 2t kultur. Dette er generelt avtale med tidligere rapporter viser at apoptose, som vurdert av DNA fragmentering, tunnel og histologic analyse, begynner å skje innen 1-2 h etter isolasjon24. Men bør det også bemerkes at tidlig observasjoner viste at metabolsk aktivitet ble oppdaget fra isolert soldet glomeruli når kultivert for minst 3 h, tyder betydelig mobilnettet levedyktighet på denne timepoint16. Likevel tror vi basert på resultatene, at det ville være forsvarlig å benytte isolert glomeruli umiddelbart i tiltenkte eksperimenter for de beste resultatene. Vi anbefaler at alle eksperimenter utføres før 72 h som vi har observert at hele glomerular strukturen begynner å svekkes utover det timepoint.
Det er mye lettere å få høyere avkastning når du starter med 4-8 nyrene i motsetning til bare 2 fordi et visst antall glomeruli er tapt på grunn av overholdelse av ulike sikter, men når sikter er maksimalt belagt det er ikke flere tap. Av samme grunn er det viktig å suge sikter i den BSA/PBS buffer før bruk som glomeruli er mer sannsynlig å følge en tørr sil og begrense vev eksponering til kanten av silen. Vi foreslår at du starter med ikke mindre enn 6 nyrene (3 rotter) å få en rimelig avkastning.
Noen etterforskere har isolert primære podocyte kulturer fra isolert glomeruli som pleier å vokse ut av glomeruli under kultur17. Vi har registrert at noen isolerte glomeruli vil følge kultur parabol plast og at celler vil begynne å overføre av glomerular strukturen på slutten timepoints (72 h etter isolasjon). Studiet av disse cellene er utenfor omfanget av denne isolasjon-protokollen, og det er noen uenighet om disse cellene er podocytes, parietal epitelceller eller både15,25. Spesielt Mundel et al., har rapportert at brosteinsbelagte celler høstet fra soldet glomeruli kan bli overtalt til å skille ut moden podocytes under bestemte dyrking forhold26. Noen av forvirring om cellen identitet kan avhenge av om de isolerte glomeruli er innkapslet (inkludert Bowman's capsule som er befolket av parietal epitelceller) eller decapsulated i sieving prosedyren. I våre hender, bruke sekvensiell sil størrelser 180, 90 og 75 µm førte til fleste glomeruli blir decapsulated.
De fleste er proteinuric kronisk nyresykdom på grunn av økninger i glomerular permeabilitet. Flere forfattere har benyttet isolert glomeruli ex vivo permeabilitet eksperimenter. I en metode, ble endringen i glomerular volum etter endre osmotisk innholdet i omkringliggende media brukt til å beregne permeabilitet27. Nylig ble det etablert at lekkasje av en fluorescerende sonde fra isolert glomeruli kan kvantifiseres for å måle permeabilitet og kan utføres i gnagere utsatt for glomerular sykdom eksperimentelle modeller28.
Vi har bemerket at i TEM forberedelsesprosessen, vi noen ganger se podocyte fot prosesser løft av kjelleren membranen. Vi føler ikke dette skjer i kultur og er mer sannsynlig en gjenstand under TEM eksempel forberedelse. Spesielt, selv når dette skjer, er det klart om foten prosessene se "normal" eller er visket ut.
Samlet inneholder denne protokollen en metode som man kan vurdere morfologiske og cellulær endringer i respons til skade. Vi forventer at den kan brukes som en følgesvenn teknikk isolert podocyte kulturer, spesielt når interaksjon med ekstracellulær matrix eller andre innfødte celletyper vurderes. Det holder løftet for å øke forståelsen av proteinuric Parallelt, noe som vil øke muligheten til å utvikle fremtidige legemiddelselskap for denne ødeleggende sykdommen.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av American Heart Association grant FTF 16990086, NIH P30 DK079307, American Society of Nephrology Gottschalk Award, en University of Pittsburgh Medical Center konkurransedyktig medisinsk forskning fondet Award og en University of Pittsburgh Leger akademiske Foundation Award. Vi takker Gerard Apodaca for hans tekniske forslag til glomerular bevaring for histologic analyse, Mara Sullivan og Ming solen for hjelp med elektronmikroskop, og Yingjian Li og Youhua Liu for deres faglige innspill i denne protokollen. Vi takker også Cynthia St. Hilaire CD31 antistoffer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions, Chemicals, and Animals | |||
| Sprague-Dawley Rats | Envigo | 207M | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1605100 | |
| Hank's Balanced Salt Solution with Ca2+ and Mg2+ | Thermo | 14025092 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline | VWR | 97063-660 | |
| Protamine sulfate | MP Bio | ICN15197105 | |
| Karnovsky's Fixative | |||
| Gelatin | |||
| Paraformaldehyde | EMD | EM-PX0055-3 | |
| O.C.T. | Scigen | 23730571 | |
| RIPA Buffer | |||
| Halt Protease Inhibitors | Thermo | PI78442 | |
| Nephrin Antibody | Fitzgerald | 2OR-NP002 | |
| WT-1 Antibody | Abcam | ab89901-10ul | |
| PDGFR-β Antibody | Cell Signaling | #3169S | |
| CD31 Antibody | LSBio | LS-C348736 | |
| Cleaved caspase-3 antibody | Cell Signaling | 9661S | |
| Poly/Bed 812 (Luft) epoxy | Polysciences | 08792-1 | |
| Equipment | |||
| Carbon dioxide chamber | |||
| Conical tubes, 15 mL | |||
| Conical tubes, 50 mL | |||
| Surgical scissors | |||
| Surgical forceps | |||
| Sterile gauze | |||
| Petri dishes, 100 mm | |||
| Scalpels | |||
| Razor blades | |||
| Sterile filter apparatus | |||
| Sieve Pan | Alfa Aesar | AA39999ON | |
| 180um Sieve | Alfa Aesar | AA39996ON | |
| 90um Sieve | Alfa Aesar | AA39990ON | |
| 75um Sieve | Alfa Aesar | AA39991ON | |
| 10 mL syringes | |||
| 600 mL beakers | |||
| Cell culture incubator | |||
| Picofuge | |||
| Vortex | |||
| Tissue Homogenizers | Fisher Scientific | 50550226 | |
| 20 G needles | |||
| Leica Reichart Ultracut | ultramicrotome |
References
- Grahammer, F., Schell, C., Huber, T. B. Molecular understanding of the slit diaphragm. Pediatric Nephrology. 28 (10), 1957-1962 (2013).
- Tan, R. J., Zhou, L., Zhou, D., Lin, L., Liu, Y. Endothelin receptor a blockade is an ineffective treatment for adriamycin nephropathy. PLoS One. 8 (11), 79963 (2013).
- Wagner, N., Wagner, K. D., Xing, Y., Scholz, H., Schedl, A. The major podocyte protein nephrin is transcriptionally activated by the Wilms' tumor suppressor WT1. Journal of the American Society of Nephrology. 15 (12), 3044-3051 (2004).
- Rogacka, D., et al. Insulin increases filtration barrier permeability via TRPC6-dependent activation of PKGIalpha signaling pathways. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (6), 1312-1325 (2017).
- Mundel, P., et al. Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines. Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).
- Moller, C. C., et al. Induction of TRPC6 channel in acquired forms of proteinuric kidney disease. Journal of the American Society of Nephrology. 18 (1), 29-36 (2007).
- Tian, D., et al. Antagonistic regulation of actin dynamics and cell motility by TRPC5 and TRPC6 channels. Science Signaling. 3 (145), 77 (2010).
- Shankland, S. J., Pippin, J. W., Reiser, J., Mundel, P. Podocytes in culture: past, present, and future. Kidney Internationalernational. 72 (1), 26-36 (2007).
- Cook, W. F., Pickering, G. W. A rapid method for separating glomeruli from rabbit kidney. Nature. 182 (4642), 1103-1104 (1958).
- Misra, R. P. Isolation of glomeruli from mammalian kidneys by graded sieving. American Journal of Clinical Pathology. 58 (2), 135-139 (1972).
- Burlington, H., Cronkite, E. P. Characteristics of cell cultures derived from renal glomeruli. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 142 (1), 143-149 (1973).
- Harper, P. A., Robinson, J. M., Hoover, R. L., Wright, T. C., Karnovsky, M. J. Improved methods for culturing rat glomerular cells. Kidney International. 26 (6), 875-880 (1984).
- Kreisberg, J. I., Hoover, R. L., Karnovsky, M. J. Isolation and characterization of rat glomerular epithelial cells in vitro. Kidney International. 14 (1), 21-30 (1978).
- Weinstein, T., Cameron, R., Katz, A., Silverman, M. Rat glomerular epithelial cells in culture express characteristics of parietal, not visceral, epithelium. Journal of the American Society of Nephrology. 3 (6), 1279-1287 (1992).
- Yaoita, E., Kurihara, H., Sakai, T., Ohshiro, K., Yamamoto, T. Phenotypic modulation of parietal epithelial cells of Bowman's capsule in culture. Cell and Tissue Research. 304 (3), 339-349 (2001).
- Meezan, E., Brendel, K., Ulreich, J., Carlson, E. C. Properties of a pure metabolically active glomerular preparation from rat kidneys. I. Isolation. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 187 (2), 332-341 (1973).
- Piwkowska, A., et al. Insulin increases glomerular filtration barrier permeability through PKGIalpha-dependent mobilization of BKCa channels in cultured rat podocytes. Biochimica et Biophysica Acta. 1852 (8), 1599-1609 (2015).
- Kotyk, T., et al. Measurement of glomerulus diameter and Bowman's space width of renal albino rats. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 126, 143-153 (2016).
- Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Exp Ther Med. 5 (5), 1322-1326 (2013).
- Leeuwis, J. W., Nguyen, T. Q., Dendooven, A., Kok, R. J., Goldschmeding, R. Targeting podocyte-associated diseases. Advanced Drug Delivery Reviews. 62 (14), 1325-1336 (2010).
- Subramanian, B., et al. Mice with mutant Inf2 show impaired podocyte and slit diaphragm integrity in response to protamine-induced kidney injury. Kidney International. 90 (2), 363-372 (2016).
- Takemoto, M., et al. A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice. American Journal of Pathology. 161 (3), 799-805 (2002).
- Steinmetz, O. M., et al. A pitfall of glomerular sieving: profibrotic and matrix proteins derive from the Bowman's capsule and not the glomerular tuft in rats with renovascular hypertension. Nephrology Dialysis Transplantation. 22 (10), 3055-3060 (2007).
- Ishikawa, Y., Kitamura, M. Spontaneous apoptosis of podocytes in explanted glomeruli. Technical note. Kidney International. 54 (6), 2008-2013 (1998).
- Krtil, J., Platenik, J., Kazderova, M., Tesar, V., Zima, T. Culture methods of glomerular podocytes. Kidney and Blood Pressure Research. 30 (3), 162-174 (2007).
- Mundel, P., Reiser, J., Kriz, W. Induction of differentiation in cultured rat and human podocytes. Journal of the American Society of Nephrology. 8 (5), 697-705 (1997).
- McCarthy, E. T., et al. TNF-alpha increases albumin permeability of isolated rat glomeruli through the generation of superoxide. Journal of the American Society of Nephrology. 9 (3), 433-438 (1998).
- Desideri, S., et al. A novel assay provides sensitive measurement of physiologically relevant changes in albumin permeability in isolated human and rodent glomeruli. Kidney International. 93 (5), 1086-1097 (2018).
