Summary
Das Hauptaugenmerk dieses Protokolls ist es, tragfähige primäre Glomeruli Kulturen mit minimalen Verunreinigungen für den Einsatz in einer Vielzahl von downstream-Anwendungen effizient zu isolieren. Die isolierten Glomeruli können strukturellen Beziehungen zwischen Komponente Zelltypen zu behalten und kultivierten ex Vivo für kurze Zeit.
Abstract
Erhaltung der glomerulären Struktur und Funktion ist von zentraler Bedeutung in der Prävention von Glomerulonephritis, eine Kategorie von zeichnet sich durch Proteinurie führt schließlich zu chronischen Nierenerkrankungen und terminaler Niereninsuffizienz. Der Glomerulus ist ein komplexer Apparat verantwortlich für die Filtration von Plasma aus dem Körper. Bei Krankheit strukturelle Integrität geht verloren und ermöglicht die abnorme Austritt von Plasma Inhalt in den Urin. Eine Methode zu isolieren und zu untersuchen, Glomeruli in Kultur ist von entscheidender Bedeutung für die Erforschung dieser Krankheiten. In diesem Protokoll ist eine effiziente Methode zum Abrufen von intakten Glomeruli aus Erwachsenen Ratte Nieren bei gleichzeitiger Einsparung von strukturellen und morphologischen Eigenschaften beschrieben. Dieser Prozess ist in der Lage hohe Erträge von Glomeruli pro Niere mit minimalen Kontamination aus anderen Segmenten Nephron zu erzeugen. Mit diesen Glomeruli können Verletzungen Bedingungen durch Inkubation mit einer Vielzahl von chemischen Giften, einschließlich Protamin Sulfat, welche Ursachen Prozess Auslöschung und Proteinurie in Tiermodellen Fuß nachgeahmt werden. Grad der Schädigung kann mit Transmissions-Elektronenmikroskopie, Immunfluoreszenz-Färbung und westliche Beflecken beurteilt werden. Nephrin und Wilms-Tumor-1 (WT1) Ebenen können auch aus diesen Kulturen beurteilt werden. Aufgrund der Einfachheit und Flexibilität dieses Protokolls können die isolierte Glomeruli genutzt werden, wie beschrieben oder in einer Weise, die die Anforderungen des Forschers zu helfen, bessere Studie glomerulären Gesundheit und Struktur in Kranken Staaten am besten.
Introduction
Der Glomerulus ist eine hochspezialisierte Büschel der Kapillaren für die Filtration von zirkulierenden Plasma verantwortlich. Es bildet den Beginn des Nephron, die die grundlegende Funktionseinheit der Niere ist. Glomerulären Funktion wird durch eine einzigartige fenestrierten Kapillaren Endothel, die Schlitz-Membran des Podocytes und einer dazwischen liegenden Basalmembran definiert. Diese Schichten bilden eine halbdurchlässige Barriere, um die selektive Ausscheidung von Substanzen in das Filtrat zu ermöglichen. Wasser, Ionen und andere kleine Moleküle durchlaufen in der Regel, während größere Moleküle im Plasma erhalten bleiben. Podocytes sind spezialisierte Epithelzellen, die über die Basalmembran verteilt rund um die Kapillaren mit zytoplasmatischen Projektionen als Fuß Prozesse bekannt. Der Fuß des angrenzenden Podocytes interdigitate verarbeitet und sind durchzogen von Schlitz Membranen bestehend aus Proteinen wie Nephrin, Podocin, P-Cadherin und ZO-11. Im Querschnitt sind diese Fuß Prozesse über die Basalmembran gleichmäßig angeordnet. In erkrankten Glomeruli werden der Fuß Prozesse grob abnorme oder "verwischt", in das Filtrat auf abnorme Leck Plasma Inhalt führt. Als solche ist glomerulären Schäden in der Regel durch die Anwesenheit von ungewöhnlich große Mengen an Protein (z. B. Proteinurie) und/oder roten Blutkörperchen (z. B. Hämaturie) im Urin gekennzeichnet. Darüber hinaus verlieren verletzten Podocytes Ausdruck von Nephrin sowie seine Regler Wilms Tumor 1 (WT1), einem wichtigen Protein verantwortlich für die Wartung von Differenzierung2,3. Die Glomeruli sind ein primäres Ziel des Schadens in diabetischen Nephropathie und andere Glomerulonephritides wie minimale Änderung Krankheit, membranöse Nephropathie und Fokal segmentale Glomerulosklerose. Diese Krankheiten sind Hauptursachen für progressives Nierenversagen und die Entwicklung von terminaler Niereninsuffizienz, ein Zustand, in dem Überleben auf Dialyse oder Nierentransplantation angewiesen ist. Daher ist es wichtig, die Glomeruli um besser zu verstehen, chronische Niere-Krankheit (CKD) Pathologie zu studieren.
Ein Zellkultursystem ist entscheidend für die glomeruläre Biologie zu studieren. Aufgrund seiner zentralen Rolle bei der Erzeugung der Schlitz-Membran sowie die Existenz von spezifischen proteinuric Erkrankungen, die durch Schlitz Membrane Protein Mutationen hat viel Forschung verständlicherweise die hemolytic isoliert genutzt. Dies führte zu der Generation von primären hemolytic Zelllinien in Vitrozu nutzen. Diese Zellen können unter einer Vielzahl von Bedingungen kultiviert werden und können sogar auf durchlässigen unterstützt Durchlässigkeit4bewerten angebaut werden. Allerdings wählt die Isolation der proliferierenden Zellen oft entdifferenzierten Zellen, die einige ihrer hemolytic Marker verloren haben. Dies führte zu der Generation von bedingt verewigt Podocytes, abgeleitet aus einem transgenen Maus Stamm trägt eine temperaturempfindliche Mutante des SV40 große T-Gens (z.B. Immortomouse), die in Kultur angebaut werden könnte aber auch sein differenziert, um eine vollständige Palette von hemolytic Marker5zum Ausdruck bringen. Diese Methoden der Primärkultur wurden entscheidende Verständnis hemolytic Biologie4,6,7.
Dennoch, Kulturen, enthält einzelne Zelle Arten fehlen die interzellulären Beziehungen, die in Vivo sowie der Tragstruktur und Matrizen auftreten und Monolagen dieser Zellen sind nicht unbedingt die dreidimensionale rekapitulieren Architektur der Glomeruli. Verewigt Podocytes kann umständlich und schwierig zu Kultur8, und erfordern Besitz entweder die Immortomouse oder ab Aliquot der Zellen von hergestellt Ermittler um loszulegen. Darüber hinaus besteht der Glomerulus aus nicht nur Podocytes, sondern auch Kapillare endothelial Zellen die Basalmembran, sowie mesangialen Zellen, die die Struktur zu unterstützen. Es ist daher sinnvoll, einen ex-Vivo Ansatz zur Verfügung für alle Ermittler für das Studium der intakten Glomeruli, die behalten ihre native Architektur sowie alle die Zellen der normalen Glomerulus zu entwickeln.
1958 beschrieben Koch und Pickering die erste Isolierung der Glomeruli von der Kaninchen-Niere. Nach Beobachtungen, dass Fett Emboli in Glomeruli eingereicht wurde postuliert sie, dass Teilchen gleicher Größe verwendet werden, um speziell diese Strukturen zu isolieren. In der Tat, die Infusion von Eisenoxid-Partikel in die Niere führte zu das Abfangen dieser Teilchen in Glomeruli. Nach dem mechanischen Dissoziation und Siebung der Niere konnte die Glomeruli intakt und mit Reinheit durch den Einsatz von magnetische Trennung9isoliert werden. Im Jahr 1971 zeigte Misra, dass das Eisenoxid, die Infusionen weggelassen werden könnte und glomerulären Isolation mit Siebung von Hackfleisch / Mensch, Hund, Kaninchen oder Ratte Niere Gewebe10erreicht. Diese Technik wurde geändert seit dann je nach Ziel der Ermittler aber führte im wesentlichen gereinigte Vorbereitungen, die weiter untersucht werden könnte oder aus dem primären Zellkulturen könnte etablierten11,12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17.
Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Isolierung von intakten tragfähige Glomeruli von der Ratte Niere. Das gesamte Protokoll dauert nur wenige Stunden. Obwohl sie sich nicht vermehren, können experimentelle Pläne beliebiger Größe unterstützt werden, indem man einfach die Anzahl der Nieren als Ausgangsmaterial. Zwar veröffentlichten Protokolle für die magnetic Bead Trennung der Glomeruli, sie erfordern eine intravenöse Injektion von Perlen, sind teurer und können Biologie verändern, da die Perlen entweder durch die Glomeruli in Kultur beibehalten werden oder glomerulären erfordern" lyse"und Entfernung durch Zentrifugation19. Im Vergleich zu Maus Glomeruli, macht die größere Größe der Ratte Glomeruli (fast 100 µm in zwei Monate alten Ratten18) es viel einfacher, sie von anderen Niere-Strukturen mit einer einfachen siebenden Technik zu trennen.
Als Beleg für ihre Nützlichkeit haben wir die Glomeruli demonstrieren die verschiedenen Zelltypen gekennzeichnet. Sie können auch Agenten bekannt, Glomeruli in vivo verletzen ausgesetzt sein und zeigen wir die negativen Auswirkungen von Protamin Sulfat (PS) auf diesen Kulturen. PS ist ein Polykation, die die anionischen Sehenswürdigkeiten entlang der glomerulären Kapillaren Wand20neutralisiert. Diese Neutralisation hat einen dramatischen Einfluss auf die glomeruläre Filtration-Barriere und erhöht folglich Proteinurie und Fuß Prozess Auslöschung. Diese Glomeruli können mit Immunoblots für wichtige Proteine wie Nephrin und WT1 Gesamtzustand eingeschätzt werden. Darüber hinaus kann ihre Struktur mit Licht, Immunfluoreszenz und Elektronenmikroskopie ausgewertet werden.
Insgesamt ist dieses Protokoll für die meisten Ermittler (man braucht nur Zugriff auf die Tiere und einige einfache Ausstattung) zugänglich. Mit morphologischen Merkmale bleibt unbeschädigt der Forscher ist in der Lage, die Glomeruli analysieren und sehen, wie andere wichtige Zelltypen und Matrix-Erhaltung in den Glomeruli Einfluss auf Funktion und Krankheit fortschreiten, ein Manko der hemolytic Kulturen.
Protocol
Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der University of Pittsburgh genehmigt.
1. Isolierung der Ratte Glomeruli
- Um einem sterilen 1 % Isolierung Puffer vorzubereiten, fügen Sie 5 g Rinderserumalbumin (BSA hinzu) zu einem 600 mL-Becherglas.
- Den Becher 500 mL 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) hinzu und rühren mit einem magnetischen Rührstäbchen, bis alle BSA aufgelöst ist.
- Sterilfilter die 1 % BSA/PBS-Puffer in einer Zelle Kultur Kapuze.
Hinweis: Die sterile 1 % BSA/PBS-Puffer kann bei 4 ° C bis zu einer Woche aufbewahrt werden.
- Erhalten Sie 2 bis 4 Sprague-Dawley Ratten mit einem Gewicht von 150 bis 200 g.
- Einschläfern Sie Ratten über Kohlendioxid einatmen mit einer Kammer, in der 100 % Kohlendioxid eingeführt wird, mit einer Rate von 10-30 % des Kammervolumens pro Minute. Beobachten Sie Tiere für Atemstillstand und verblasst Augenfarbe bis zur Entfernung von Kohlendioxid.
- Bereiten Sie die Haut über den vorderen Bauch mit 70 % Ethanol und nutzen Sie Haarschneidemaschinen zu enthaaren, zu, falls gewünscht. Machen Sie einen Mittellinie Schnitt in der Haut mit einer chirurgischen Schere oder Skalpell. Machen Sie einen anderen Mittellinie Schnitt durch die Muskelschicht, inneren Organe verfügbar zu machen. Erweitern Sie den Einschnitt kranial durch die Membran und Brustbein oder Brustkorb als sekundäre Methode der Euthanasie.
- Isolieren und entfernen Sie beide Nieren und in einem sterilen 50 mL konische Plastikrohr mit 30 mL Hanks gepufferte Salzlösung (HBSS) auf Eis legen.
Hinweis: Mehrere Ratten können in der gleichen Kammer eingeschläfert werden und alle die Nieren in der gleichen konischem Rohr platziert werden können.
- Halten Sie die Nieren auf Eis und Transport zu einer sterilen Zelle Kultur Kapuze. Übertragen Sie die Nieren auf eine sterile Petrischale mit 5 mL HBSS, auch über Eis, und entfernen und verwerfen Tubulussystem Fett mit einer Schere und Pinzette scharf. Falls noch vorhanden, auch entfernen Sie und entsorgen Sie die Kapsel rund um die Niere durch einen kleinen oberflächlichen Einschnitt und verwenden Sie scharfe Pinzette, ziehen Sie es weg von der Orgel.
Hinweis: Halten Sie immer Niere Isolate auf Eis und Praxis steriler Technik im gesamten. Ein Stück sterile Gaze kann als eine strukturierte Oberfläche um die Niere während der Bearbeitung zu fixieren in der Petrischale platziert werden.- Nieren in zwei Hälften geschnitten längs (Midsagittal Abschnitt) und entfernen und entsorgen die Medulla (das ist in der Farbe dunkler) mit einem Skalpell in einer zweiten Petrischale mit 5 mL HBSS.
- Die restlichen Stücke, die überwiegend Niere Kortex sind, zu einem dritten Petrischale mit 5 mL HBSS übertragen und Hackfleisch mit einer sterilen Rasierklinge, bis die Stücke weniger als 1 mm groß sind, oder bis eine Paste entsteht.
- Nass von oben und unten von einem 180 µm-Sieb mit 1 % BSA/PBS über ein Abfall 500 mL-Becherglas. Dieser Schritt ist wichtig, da es das Sieb mit Protein überzieht und reduziert die Einhaltung der Glomeruli, die Ausbeute verbessert wird.
- Hackfleisch / Kortex auf einen kleinen Rand des Siebes und verwenden Sie strukturierte Kolben Flansch (der Gegenseite die Gummidichtung) eine 10 mL Spritze, um das Gewebe durch ein Sieb in eine Bodenwanne sitzt auf dem Eis zu Brei. In regelmäßigen Abständen mit HBSS spülen Sie, aber verwenden Sie so wenig wie möglich Probenverdünnung zu vermeiden.
Hinweis: Nicht überschreiten Sie 30 mL Puffer insgesamt, also nur 25 mL Mehr kann hier verwendet werden. Der Grund für das Inverkehrbringen von Hackfleisch / Gewebe auf nur eine Kante des Siebs ist, Einhaltung der Glomeruli durch Begrenzung der Exposition gegenüber Bestandteil das Sieb, anstatt die gesamte Siebfläche zu reduzieren.- Um dies zu erleichtern, wiederverwenden der Flüssigkeit sammeln in der Wanne, das Sieb zu spülen. Sobald die Siebung abgeschlossen ist, waschen Sie sorgfältig unten das Sieb wieder mit 1 % BSA/PBS-Puffer von der Unterseite der Wanne, Glomeruli zu erfassen, die lose eingehalten werden können.
- Sammeln Sie alle die Flüssigkeit in der Wanne in mehreren 10 mL Spritzen mit 20 G Nadeln ausgestattet und führen Sie ihn durch die Nadel mindestens 2 weitere Male. Die letzte Sammlung behalten Sie die Glomeruli-haltige Flüssigkeit in der Spritze bis bereit es 90 µm-Sieb passieren.
- Während die Flüssigkeit in die Spritzen gespeichert ist, waschen Sie die Bodenwanne durch Spülung mit 1 % BSA/PBS in Abfall Becherglas und nassen oben und unten von einem 90 µm-Sieb mit 1 % BSA/PBS. Legen Sie das Sieb auf der Wanne auf dem Eis.
- Wenden Sie die Probe in die Spritzen auf eine Kante der Sieb und Brei durch ein Sieb mit einer anderen Spritze Flansch wie oben beschrieben an Waschen Sie mit Lösung aus der Wanne, alles auf einer Kante des Siebes zu sammeln.
- Einmal Siebung ist abgeschlossen, der Unterseite des Siebes wie in Schritt 1.5.1 sorgfältig waschen. Sammeln Sie die Flüssigkeit in der Wanne in 50 mL konische Kunststoffhülse.
- Waschen Sie die Bodenwanne mit 1 % BSA/PBS zu einem Abfall Becher und nassen oben und unten von einem 75 µm-Sieb mit 1 % BSA/PBS. Legen Sie das Sieb auf der Wanne auf dem Eis.
- Wenden Sie die Probe an einem Rand des Siebes. Flüssigkeit sollte leicht durchströmen. Spülen durch oben mit mindestens 20 mL 1 % BSA/PBS in Abfall Becherglas. Waschen Sie die Unterseite des Siebes sowie sorgfältig. Die Glomeruli bleibt auf der Oberseite dieser 75 µm-Sieb.
- Verwenden Sie HBSS Glomeruli in einer Petrischale zu sammeln, durch Spülen durch das Sieb auf dem Kopf stehend. Verwenden Sie soviel HBSS Bedarf hier. Sammeln Sie in mindestens 50 mL Kunststoff konische Tube(n) auf Eis.
- Zentrifugieren bei 1800 X g für 5 min bei 4 ° C, überstand vorsichtig mit einer Pipette entfernen und Pellet in 10 mL kalte HBSS aufzuwirbeln. Kombinieren Sie die Proben, wenn mehrere konische Rohren 1.7.2 gesammelt wurden. Wiederholen Sie die Zentrifugationsschritt.
- Aufschwemmen der Glomeruli in 5 mL HBSS erst mit dem nächsten Schritt fortfahren.
- Falls gewünscht, nehmen Sie die Anzahl der insgesamt Glomeruli. Dazu nehmen Sie eine 10 µL Probe mit einer Pipette und geben Sie die Tropfen auf einen Objektträger. Unter dem Mikroskop sehen, zählen die Glomeruli im Feld und multiplizieren mit 500 Gesamtausbeute bekommen.
Hinweis: Reinheit kann durch zählen der Anzahl der Tubuli gesehen im Bereich bestimmt und dividiert durch die Gesamtzahl der Glomeruli und Röhrchen Strukturen. Es sollte > 95 % Glomeruli im Gesichtsfeld.- Gibt es signifikante röhrenförmigen Kontamination, wiederholen Sie Schritte 1.6.1 vorwärts, und achten Sie darauf, gründlich zu waschen, wenn 1.7.1 Schritt abschließen. Dies ist der Schritt in die röhrenförmigen Kontamination ist am wahrscheinlichsten auftreten.
(2) Schädigung der Glomeruli
- Sammeln Sie die Glomeruli in einem 15 mL konische Kunststoffrohr und Spin down am 200 X g. Aufschwemmen in angemessener Höhe von HBSS basierend auf den Gesamtertrag damit gibt es ca. 9.000 Glomeruli pro Bohrloch. Pipette 450 µL der Probe in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte oder irgendwelche Plattenformat, das passt die nachgelagerten Assays erforderlich.
Hinweis: Pipettieren rauf und runter zu mischen Glomeruli im Puffer sorgt für eine homogene Lösung. Die Glomeruli werden sind sehr klebrig und schwer und halten Sie sich an einander sowie am unteren Rand eine Lösung schnell und auf den Seiten des Rohres zu begleichen. - Um 6 mg/mL Protamin Sulfat-Lösung (PS) zu machen, zuerst lösen Sie PS 1 g in 10 mL dH2O auf 40 ° C in einem 15 mL konische Kunststoffrohr und Wirbel gründlich erhitzt auf. Nehmen Sie 30 µL der Lösung und 470 µL dH2O hinzufügen.
Hinweis: Dies erzeugt eine 6 mg/mL Lösung, und wenn 50 µL werden hinzugefügt, um den Brunnen, wie unten beschrieben, die Endkonzentration 0,6 mg/mL.- Fügen Sie in zweifacher Ausfertigung, 50 µL Protamin Sulfat (Dies ist eine 01:10 Verdünnung) zu jedem Bohrloch einer Gruppe, bei der Lieferung von einer anderen Gruppe 50 µL HBSS (Negativkontrolle).
- Inkubieren Sie die Platte für 4 h bei 37 ° c
- Spin-down Inhalt jedes gut in einem Microcentrifuge Schlauch (4000 X g, 4 ° C, 10-15 s) und zweimal mit 1 mL PBS jedes waschen.
- Aus dem letzten Waschen Aspirieren und in 300 µL PBS aufzuwirbeln. Aufgeteilt in drei Aliquote für Protein isoliert, Getriebe-Elektronenmikroskop (TEM) Visualisierung und Immunfluoreszenz-Färbung (IF) vorbereitet werden.
3. Vorbereitung der Glomeruli für die Analyse
- Spin-down den Inhalt der drei Aliquote (4000 x g, 4 ° C, 10-15 s) und Absaugen aus verbleibenden Puffer und fahren Sie mit der Analyse von Proben durch TEM, IF, oder Protein isoliert.
- Verarbeitung für TEM
- Glomeruläre Pellets in 150 µL des kalten 2,5 % Glutaraldehyd in 0,01 M PBS zu beheben. Nehmen Sie das Fixiermittel vorsichtig aus dem Pellet mit einer Pasteurpipette, und achten Sie nicht auf das Pellet stören dann mit PBS gespült und Post-fix it in 1 % Osmium ausgefällt mit 1 % Kalium Ferricyanid.
- Austrocknen die Probe durch eine abgestufte Reihe von Ethanol (30, 50, 70, 90, 100, 100, 100 %) und Propylenoxid dann in Epoxy Material einbetten einzubetten.
- Semi-dünn geschnitten (300 nm) Abschnitte auf einer regungsloses. Färben mit 0,5 % Toluidin blau in 1 % Natrium Borat und unter dem Lichtmikroskop zu untersuchen.
- Ultradünne Abschnitte geschnitten (65 nm), färben sie mit Uranyl Acetat und Reynold es Blei Citrat und auf einem Transmissions-Elektronenmikroskop untersuchen.
- Denn wenn Verarbeitung
- Fügen Sie 150 µL eine 12 % Gelatine in PBS-Lösung hinzu und sofort auf Trockeneis, eine Kugel zu bilden. Genießen Sie das Pellet in 500 µL 2 % Paraformaldehyd/1 x PBS in einem Microcentrifuge Schlauch über Nacht bei 4 ° C.
- Das Pellet in einer base Form legen und durch Zugabe von optimale Temperatur (OCT) Medium über Trockeneis einbetten. Schneiden Sie ca. 5-10 µm Abschnitte auf einer Cryotome und mit Immunfluoreszenz/Immunohistochemistry oder standard histologischen Flecke fortfahren.
- Für Protein isoliert
- 150 µL RIPA Puffer hinzu kommen zentrifugiert glomerulären Pellet mit 1,5 µL Protease-Inhibitor und Dounce mit Gewebe Homogenisatoren.
- Fahren Sie mit Protein Quantifizierung und Immunoblotting oder andere Protein-Analyse.
Representative Results
Das Protokoll aus der Zeit der Euthanasie zur Isolierung von der Glomeruli kann in weniger als 2 h abgeschlossen sein und hat einen hohen Durchsatz und Effizienz. Mit der richtigen Nutzung der Technik, den Ertrag der Glomeruli pro Ratte Niere reicht von 6.000-10.000 Glomeruli beim Starten mit 8 Nieren. Die endgültige Aufhebung ist dicht gepackt mit Glomeruli und hat insgesamt Reinheit > 95 %, zeigt minimale Kontamination von röhrenförmigen Segmenten oder anderen Zelltypen (Abbildung 1A, B). Darüber hinaus können die OCT-embedded Glomeruli mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) Flecken zu sehen, die Morphologie (Abbildung 1C) gefärbt werden. Diese Glomeruli pflegen ihre Struktur in das ganze Protokoll auch nach der Verarbeitung. Wir zeigen, dass isolierte Glomeruli intakt und tragfähige Podocytes (Abb. 2A), mesangialen Zellen (Abbildung 2B) und Endothelzellen (Abbildung 2C) besitzen.
Einmal isoliert, können bekannte chemische Verletzungen, in-Vivo -Pathologie zu simulieren die Glomeruli ausgesetzt werden. In diesem Fall wählte Protamin Sulfat (PS) für seine Fähigkeit, die Ladung der glomerulären Filtration Barriere, stören die schließlich führt um zu Prozess Auslöschung zu Fuß. PS-behandelten Glomeruli haben einen markanten Rückgang der Nephrin (rot) und eine Anzahl von Kernen für WT1 (grün) über Immunfluoreszenz (Abb. 3A, B) positiv. Die Glomeruli können auch für Transmissions-Elektronenmikroskopie (Abb. 3C) zubereitet werden. Kontrollproben haben normale hemolytic Morphologie und Fuß Prozesse während der PS-behandelten Glomeruli haben Fuß Prozess Auslöschung (Abbildung 3-D), das ist ein Zeichen der hemolytic Dysfunktion und ist in in Vivo Modellen mit PS21gesehen. Dies entsprach auch eine Abnahme der Nephrin durch Immunoblotting (Abbildung 3E, F) erkannt.
Um die Tragfähigkeit zu ermitteln, wurde gespalten Caspase-3 als Marker der Apoptose bewertet. Mit Immunfluoreszenz, erscheint gespalten Caspase-3 zuerst in ein paar Zellen ab 2 h nach Isolierung (Abbildung 4). Die Anzahl der Zellen mit dem Ausdruck dieser Protease wurde im Laufe der Zeit mit einem Höchstmaß an 24 und 48 Stunden gesehen häufiger. Dies deutet darauf hin, dass Apoptose tritt relativ früh in Kultur und downstream-Anwendungen bald nach Isolierung für optimale Ergebnisse erfolgen.
Abbildung 1 . Typisches Erscheinungsbild der Ratte glomerulären Kulturen nach Isolierung. (A) Hellfeld Bild der glomerulären Kultur. Obwohl wir ein Feld entschieden haben, gibt es einen einzigen renal Röhrchen in diesem Schliffbild (Pfeilspitze), sind die Kulturen erhalten in der Regel > 95 % rein. Maßstabsbalken entspricht 100 µm. (B) vergrößerte Bild von einem einzigen Glomerulus. (C) Hämatoxylin und Eosin Fleck von einem einzigen Glomerulus. Maßstabsbalken in B und C gleich 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Konstituierenden Zelltypen werden in isolierten Glomeruli beibehalten. Konfokale Immunofluoreszenz Mikroskopie erfolgte für Nephrin (rot, Podocytes) und zellspezifische Marker, Podocytes, mesangialen Zellen und dem Endothel zu identifizieren. (A) Costain für Nephrin und WT1 (grün, Podocytes). (B) Costain für Nephrin und PDGFR-β (grün, mesangialen Zellen, Pfeil). (C) Costain für Nephrin und CD31 (grün, endothelial Zellen, Schiffe im Querschnitt gekennzeichnet durch Pfeilspitzen). Maßstabsleiste = 25 µm auf allen Tafeln. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Hemolytic Verletzungen kann induzierte in Vitro mit isolierten Ratte Glomeruli werden. (A) konfokale Immunofluoreszenz Mikroskopie für Nephrin und WT1 in einer unbehandelten glomerulären Kultur. Beachten Sie die lineare Nephrin Färbung (rot) und die Anwesenheit von WT1-positiven Kerne (grün), die in der Regel angesehen werden, wenn es gesunde Podocytes gibt. (B) nach Protamin Sulfat-Behandlung, Nephrin Ausdruck ist verringert und nicht-lineare und WT1 fehlt, zeigt hemolytic Verletzungen. (C) Transmission Electron Microscpy (TEM) Bild zeigt Fuß Prozesse, Basalmembran und eine gefensterten Endothels typisch für normale glomerulären Struktur. Bar ist gleich 500 nm. (D) nach Protamin Sulfat, Fuß Prozesse länglich oder ausgelöscht (Pfeilspitzen), was darauf hindeutet, hemolytic Verletzungen. (E) Western-Blot für Nephrin zeigt verringert Nephrin nach Protamin Sulfat Behandlung. (F) Aktin Ladekontrolle für western-Blot wird angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 . Bewertung der Zellviabilität in isolierten Glomeruli. Konfokale Immunfluoreszenz-Mikroskopie für gespalten Caspase-3 (grün) wurde durchgeführt. Nephrin Co Fleck wurde durchgeführt, um die Glomeruli auffinden. Zwar gab es keine gespalten Caspase-3-Positivität bei 0 und 1 h nach Isolierung der Glomeruli, war Fluoreszenzsignal in ein paar Zellen um 2 h schrittweise merkten mehr Zellen positiv je länger nach Isolierung wandte sie untersucht wurden. Die größte Anzahl von Caspase-3 positive Zellen wurden festgestellt, um 24 bis 48 h Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Discussion
Dies ist eine effiziente Methode zur Wiederherstellung der Glomeruli nach Ratte Niere mit preiswerten, wiederverwendbare Ausrüstung mit ein einfaches Protokoll. Wie bei allen Eingriffen gibt es Beschränkungen in Bezug auf seine Nützlichkeit. Zuerst, obwohl wir > 95 % Reinheit erhalten, aufgrund der siebenden Natur des Protokolls und das Ausgangsmaterial ist es nicht ausgeschlossen alle Verunreinigungen, und ein paar roten Blutkörperchen und das gelegentliche röhrenförmigen Segment in der Kultur werden. Wir rechnen nicht diese kleine Verunreinigungen ein Problem für die meisten Anwendungen. Zweitens setzt die Absiebung Protokoll über die Verwendung der Ratte Nieren, in denen Glomeruli viel größer als bei Mäusen sind. Wenn Maus Glomeruli benötigt werden, ist eine Technik, die mit kommerziellen magnetische Beads (z.B.Dynabeads) veröffentlichten22gewesen. Drittens: Es hat sich gezeigt, dass bestimmte mRNAs (Plasminogen Aktivator Inhibitor-1 und Kollagen ich) in isolierten Glomeruli entstammen fast ausschließlich Bowman der Kapsel statt Intraglomerular23Zellen. Dies könnte zu unangemessenen Ergebnissen führen, wenn mRNA isoliert von diesen Glomeruli versucht wird. Es sei darauf hingewiesen, dass in unseren Händen die Mehrheit der Glomeruli Decapsulated sind und sollten daher nicht bedeutende Beiträge von Bowmans Kapseln. Viertens: Zelltod beginnt relativ schnell unter Kulturbedingungen auftreten.
Wir fanden, dass das Apoptose-Programm wie Aussehen des gespalten Caspase-3, belegt aktiviert wurde ab 2 h der Kultur. Dies ist im allgemeinen Vereinbarung mit früheren Berichte, die zeigen, dass die Apoptose, wie DNA-Fragmentierung, TUNEL und histologische Analyse bewertet beginnt innerhalb von 1-2 h nach Isolierung24auftreten. Allerdings sei auch darauf hingewiesen, dass frühe Beobachtungen haben gezeigt, dass die Stoffwechselaktivität von isolierten gesiebt Glomeruli, wenn mindestens 3 h, schlägt beträchtliche zellulären Lebensfähigkeit bei diesem Timepoint16kultiviert nachgewiesen werden konnte. Dennoch, basierend auf den Ergebnissen, glauben wir, dass es klug wäre, isolierte Glomeruli sofort im geplanten Experimente für die besten Ergebnisse zu nutzen. Es wird empfohlen, dass alle Experimente vor 72 h durchgeführt werden, wie wir haben beobachtet, dass die gesamte Struktur der glomeruläre beginnt jenseits dieser Timepoint verschlechtern.
Es ist viel einfacher, höhere Erträge zu erzielen als mit 4-8 Nieren im Gegensatz zu nur 2 gestartet, weil eine bestimmte Anzahl von Glomeruli durch Einhaltung der verschiedenen Siebe verloren sind, aber sobald die Siebe maximal beschichtet sind gibt es keine zusätzlichen Verlust. Aus dem gleichen Grund ist es wichtig, die Siebe in der BSA/PBS-Puffer vor dem Gebrauch als Glomeruli sind wahrscheinlicher, an einem trockenen Sieb zu halten und zur Begrenzung der Exposition der Gewebe an einem Rand des Siebes einweichen. Wir empfehlen Ihnen, beginnend mit nicht weniger als 6 Nieren (3 Ratten) um einen angemessenen Ertrag zu erhalten.
Einige Forscher haben primären hemolytic Kulturen aus isolierten Glomeruli isoliert die tendenziell wachsen aus den Glomeruli während Kultur17. Wir haben festgestellt, dass einige isolierte Glomeruli an der Kultur Teller Kunststoff halten werden, beginnen die Zellen aus der glomerulären Struktur an späten Zeitpunkten (72 h nach Isolierung) zu migrieren. Die Studie dieser Zellen sprengt den Rahmen dieses Protokolls isoliert, und es gibt eine Kontroverse darüber, ob diese Zellen Podocytes, parietalen Epithelzellen oder beide15,25 sind. Vor allem Mundel Et Al., haben berichtet, dass Kopfsteinpflaster Zellen geerntet aus gesiebten Glomeruli induziert werden können, in Reifen Podocytes unter bestimmten Bedingungen26Kultivierung zu unterscheiden. Einige der Verwirrung in Bezug auf Zelle Identität kann davon abhängen, ob die isolierten Glomeruli gekapselt sind (einschließlich Bowman die Kapsel, die von parietalen Epithelzellen aufgefüllt wird) oder Decapsulated im siebenden Verfahren. In unseren Händen, mit sequenzieller Sieb Größen von 180 90 und 75 µm zu die Mehrheit der Glomeruli als Decapsulated geführt.
Die meisten Formen der proteinuric chronischer Nierenerkrankung sind aufgrund von glomeruläre Permeabilität. Mehrere Autoren haben isolierte Glomeruli in ex Vivo Durchlässigkeit Experimente genutzt. In einer Methode wurde die Änderung in glomeruläre Volumen nach einer Änderung des osmotischen Inhalts des umgebenden Mediums zur Durchlässigkeit27zu schätzen. Vor kurzem wurde festgestellt, dass Leckagen von fluoreszierende Sonden aus isolierten Glomeruli quantifiziert werden, könnte um die Durchlässigkeit zu messen und bei Nagetieren ausgesetzt glomeruläre Erkrankung Versuchsmodelle28durchgeführt werden konnte.
Wir haben festgestellt, dass im Vorbereitungsprozess TEM sehen wir manchmal die hemolytic Prozesse abheben der Basalmembran Fuß. Wir glauben nicht, dies geschieht in der Kultur und ist eher ein Artefakt während der TEM Probenvorbereitung. Vor allem, auch wenn in diesem Fall ergibt sich ob die Fuß-Prozesse "normal" aussehen oder ausgelöscht werden.
Insgesamt bietet dieses Protokoll eine Methode, durch die eine morphologische und zelluläre Veränderungen in Reaktion auf eine Verletzung zu bewerten. Wir erwarten, dass sie als Begleiter Technik isoliert hemolytic Kulturen genutzt werden kann, vor allem dann, wenn Wechselwirkungen mit extrazellulären Matrix oder anderen einheimischen Zelltypen in Betracht gezogen werden. Es verspricht für die Verbesserung des Verständnisses der proteinuric CKD, die Verbesserung der Fähigkeit, zukünftige Therapeutika für diese schwächende Krankheit entwickeln würde.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch die American Heart Association Grant FTF 16990086, NIH P30 DK079307, American Society of Nephrology Gottschalk Award, ein University of Pittsburgh Medical Center wettbewerbsfähigen medizinische Forschung Fund Award und eine Universität von Pittsburgh Preis der akademischen Stiftung Ärzte. Wir danken Gerard Apodaca für seine technische Vorschläge für glomeruläre Erhaltung für histologische Analyse, Mara Sullivan und Ming Sun für Unterstützung bei der Elektronenmikroskopie, und Yingjian Li und Youhua Liu für ihre technische Beiträge in diesem Protokoll. Wir danken auch Cynthia St. Hilaire für den CD31 Antikörper.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions, Chemicals, and Animals | |||
| Sprague-Dawley Rats | Envigo | 207M | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1605100 | |
| Hank's Balanced Salt Solution with Ca2+ and Mg2+ | Thermo | 14025092 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline | VWR | 97063-660 | |
| Protamine sulfate | MP Bio | ICN15197105 | |
| Karnovsky's Fixative | |||
| Gelatin | |||
| Paraformaldehyde | EMD | EM-PX0055-3 | |
| O.C.T. | Scigen | 23730571 | |
| RIPA Buffer | |||
| Halt Protease Inhibitors | Thermo | PI78442 | |
| Nephrin Antibody | Fitzgerald | 2OR-NP002 | |
| WT-1 Antibody | Abcam | ab89901-10ul | |
| PDGFR-β Antibody | Cell Signaling | #3169S | |
| CD31 Antibody | LSBio | LS-C348736 | |
| Cleaved caspase-3 antibody | Cell Signaling | 9661S | |
| Poly/Bed 812 (Luft) epoxy | Polysciences | 08792-1 | |
| Equipment | |||
| Carbon dioxide chamber | |||
| Conical tubes, 15 mL | |||
| Conical tubes, 50 mL | |||
| Surgical scissors | |||
| Surgical forceps | |||
| Sterile gauze | |||
| Petri dishes, 100 mm | |||
| Scalpels | |||
| Razor blades | |||
| Sterile filter apparatus | |||
| Sieve Pan | Alfa Aesar | AA39999ON | |
| 180um Sieve | Alfa Aesar | AA39996ON | |
| 90um Sieve | Alfa Aesar | AA39990ON | |
| 75um Sieve | Alfa Aesar | AA39991ON | |
| 10 mL syringes | |||
| 600 mL beakers | |||
| Cell culture incubator | |||
| Picofuge | |||
| Vortex | |||
| Tissue Homogenizers | Fisher Scientific | 50550226 | |
| 20 G needles | |||
| Leica Reichart Ultracut | ultramicrotome |
References
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