Summary
Tyngdpunkten i detta protokoll är att effektivt isolera livskraftig primära glomeruli kulturer med minimala föroreningar för användning i en mängd olika nedströms tillämpningar. De isolerade glomeruli behålla strukturella relationer mellan komponent celltyper och kan vara odlade ex vivo för en kort tid.
Abstract
Bevarandet av glomerulär struktur och funktion är avgörande för en kategori av njursjukdom kännetecknas av proteinuri vilket så småningom kan leda till kronisk och slutstadiet njursjukdom, förebyggande av glomerulonefrit. I glomeruli är en komplex apparat som är ansvarig för filtrering av plasma från kroppen. Vid sjukdom, strukturell integritet är förlorad och möjliggör onormala läckage av plasma innehållet i urinen. En metod för att isolera och undersöka glomeruli i kultur är kritisk för studiet av dessa sjukdomar. I detta protokoll beskrivs en effektiv metod för att hämta intakt glomeruli från vuxen råtta njurar samtidigt bevara strukturella och morfologiska egenskaper. Denna process är kan generera hög avkastning i glomeruli per njure med minimal förorening från andra nefronet segment. Med dessa glomeruli, kan skada villkor vara härmade av inkubering med en mängd kemiska gifter, inklusive protaminsulfat, som orsakar mul processen utplåning och proteinuri i djurmodeller. Graden av skada kan bedömas med transmissionselektronmikroskopi, immunofluorescens färgning och western blotting. Nephrin och Wilms tumör 1 (WT1) nivåer kan också bedömas utifrån dessa kulturer. På grund av enkelheten och flexibiliteten i detta protokoll, kan de isolerade glomeruli utnyttjas som beskrivs eller på ett sätt som bäst passar behoven hos forskaren att hjälpa bättre studie glomerulär hälsa och struktur i sjuka staterna.
Introduction
I glomeruli är en högt specialiserad tofs av kapillärer ansvarar för filtrering av cirkulerande plasma. Det bildar början av den nefronen, vilket är den grundläggande funktionella enheten i njuren. Glomerulär funktion definieras av ett unikt fenestrated kapillär endotelet, slit membranen av podocytes och en mellanliggande basalmembran. Dessa skikt bildar en semipermeable barriär som möjliggör selektiv utsöndring av ämnen i filtratet. Vatten, joner och andra små molekyler generellt passera, medan större molekyler behålls i plasma. Podocytes är specialiserade epitelceller som spridit sig över basalmembranet, omgivande kapillärerna med cytoplasmiska prognoser kallas fot processer. Foten bearbetar av intilliggande podocytes interdigitate och korsas av slit membraner består av proteiner som nephrin, podocin, P-cadherin och ZO-11. I tvärsnitt, dessa foten processer arrangeras jämnt över basalmembranet. I sjuka glomeruli blir foten processerna grovt onormal eller ”anspråkslös”, leder till onormala läckage av plasma innehållet i filtratet. Som sådan, kännetecknas glomerulär skada generellt av närvaron av onormalt stora mängder protein (t.ex. proteinuri) och/eller röda blodkroppar (t.ex. hematuri) i urinen. Dessutom förlora skadade podocytes uttryck av nephrin as well as dess regulator Wilms tumör 1 (WT1), en viktig protein som ansvarar för underhåll av differentiering2,3. I glomeruli är ett primärt mål av skador i diabetisk nefropati och andra glomerulonephritides såsom minimal förändring sjukdom, membranös nefropati och fokal segmentell glomeruloskleros. Dessa sjukdomar är stora orsaker till progressiv njursvikt och utvecklingen av njursjukdom i slutstadiet, ett tillstånd där överlevnad är beroende av dialys eller njurtransplantation. Det är därför viktigt att studera glomeruli för att bättre förstå kronisk sjukdom (CKD) patologi.
Ett cellodlingssystem är avgörande för att studera glomerulär biologi. På grund av dess centrala roll i att generera slitsbländaren, liksom förekomsten av specifika proteinuric sjukdomar på grund av slit membran protein mutationer, har mycket forskning förståeligt utnyttjat podocyte isolerat. Detta har lett till generation av primära podocyte cellinjer att utnyttja i vitro. Dessa celler kan vara odlade under olika villkor och kan även odlas på genomsläppliga stöder att bedöma permeabilitet4. Emellertid, isolering av prolifererande celler ofta väljer dedifferentiated celler som har förlorat en del av deras podocyte markörer. Detta har lett till generation av villkorligt förevigade podocytes härrör från en transgen mus stam bär en temperaturkänsliga mutant av den SV40 stora T gen (t.ex. immortomouse), som kan odlas i kultur men också vara differentierade för att uttrycka en hel uppsättning podocyte markörer5. Dessa metoder av primära kultur har varit avgörande i förståelse podocyte biologi4,6,7.
Dock kulturer som innehåller enstaka celltyper saknar de intercellulära relationer som uppstår i vivo samt den stödstruktur och matriser, och enskiktslager av dessa celler nödvändigtvis recapitulate inte det tredimensionella arkitekturen i glomeruli. Den förevigade podocytes kan också vara besvärligt och utmanande att kultur8, och kräver innehav av antingen i immortomouse eller en start alikvot av celler från etablerade utredarna att komma igång. Ytterligare, glomeruli består av inte bara podocytes, men även kapillära endotelceller och den basalmembranet, samt mesangialceller som ger stöd för strukturen. Det är därför lämpligt att utveckla en ex vivo strategi finns för alla utredare för studien av intakt glomeruli som behåller sin ursprungliga arkitektur samt alla celler som utgör de normala glomeruli.
1958 beskrivs Cook och Pickering den första isoleringen av glomeruli från kanin njuren. Efter observationer att fett embolier blev ingavs i glomeruli, förutsatte de att partiklar av samma storlek kan användas specifikt isolera dessa strukturer. Infusion av järnoxid partiklar i njuren ledde faktiskt till fångst av dessa partiklar i glomeruli. Efter mekanisk dissociation och siktning av njure, kunde glomeruli isoleras intakt och med renhet med hjälp av magnetisk separering9. 1971 visade Misra att den järnoxid som infusioner kan utelämnas och glomerulär isolering uppnås med siktning av malet människa, hund, kanin eller råtta njure vävnad10. Denna teknik har ändrats sedan sedan beroende på målet att utredarna men i huvudsak har resulterat i renade preparat som kunde studeras ytterligare eller som primära cellkulturer kan vara etablerade11,12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17.
Här beskriver vi ett protokoll för isolering av intakt livskraftig glomeruli från råtta njuren. Hela protokollet tar bara några timmar. Även om de inte föröka, kan experimentell planer av valfri storlek stödjas genom att helt enkelt öka antalet njurar som utgångsmaterial. Medan det finns publicerade protokoll för magnetiska pärla separation av glomeruli, de kräver intravenös injektion av pärlor, är dyrare och kan förändra biologi eftersom pärlorna behålls antingen av glomeruli i kultur eller kräva glomerulär ” lyseringslösning ”och borttagning av centrifugering19. Jämfört med musen glomeruli, gör större storleken på råtta glomeruli (nästan 100 µm i två månader gamla råttor18) det mycket lättare att skilja dem från andra njure strukturer med hjälp av en enkel siktning teknik.
Som bevis för deras användbarhet, har vi kännetecknas av glomeruli för att demonstrera de olika celltyper. De kan också utsättas för agenter känt att skada glomeruli in vivo och vi visa de negativa effekterna av protaminsulfat (PS) på dessa kulturer. PS är en polycation som neutraliserar anjoniska platserna längs den glomerulära kapillära väggen20. Denna neutralisering har en dramatisk effekt på den glomerulära barriären och därför ökar proteinuri och foten processen utplåning. Dessa glomeruli kan bedömas med immunoblots för viktiga proteiner som nephrin och WT1 att bedöma övergripande hälsa. Dessutom kan deras struktur utvärderas med ljus, immunofluorescens och elektronmikroskopi.
Övergripande, detta protokoll är tillgängligt för de flesta utredarna (behöver man bara tillgång till djuren och några enkla utrustning). Med morfologiska egenskaper kvar oskadad, forskaren kunna analysera glomeruli och se hur andra viktiga celltyper och matrix bevarande i glomeruli påverka funktion och proteinsjukdomar progression, en brist i podocyte kulturer.
Protocol
Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) University of Pittsburgh.
1. isolering av råtta Glomeruli
- För att förbereda en steril 1% isolering buffert, tillsätt 5 g bovint serumalbumin (BSA) till en 600 mL-bägare.
- Tillsätt 500 mL 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till bägaren och rör med en magnetisk omrörning stav tills alla BSA är upplöst.
- Sterila filter 1% BSA/PBS-bufferten i en cell kultur huva.
Obs: Sterila 1% BSA/PBS-bufferten kan förvaras vid 4 ° C i upp till en vecka.
- Få 2 till 4 Sprague-Dawley-råttor väger 150 till 200 g vardera.
- Avliva råttor via koldioxid inandning med hjälp av en kammare där 100% koldioxid införs med en hastighet av 10-30% av volymen per minut. Observera djur för upphörande av andning och bleknat ögonfärg före borttagning från koldioxid.
- Förbereda huden över främre buken med 70% etanol och utnyttja hårklippningsmaskiner för att ta bort hår, om så önskas. Göra en mittlinjen snitt i huden med hjälp av kirurgisk sax eller skalpell. Gör en annan mittlinjen snitt genom muskellagrar att exponera inre organ. Förlänga snittet fint genom membranet och bröstbenet eller revben bur som en sekundär metod för dödshjälp.
- Isolera och ta bort båda njurarna och placera i en steril 50 mL koniskt plaströr med 30 mL av Hanks buffrad saltlösning (HBSS) på is.
Obs: Flera råttor kan bli euthanized i samma kammare och alla i njurarna kan placeras i samma koniska rör.
- Hålla njurarna på is och transport till en steril cell kultur huva. Överföra njurarna till en steril petriskål innehållande 5 mL HBSS, också över isen, och ta bort och kassera perirenal fett med sax vassa pincetten. Om det fortfarande finns också ta bort och kassera den kapsel som omger njure genom att göra ett litet ytliga snitt och sedan använda vass pincett att försiktigt dra den bort från orgeln.
Obs: Alltid hålla njure isolat på is och praktiken steril teknik i hela. En bit av steril gasbinda kan placeras i petriskål som en strukturerad yta att hålla njurarna på plats under manipulation.- Skär njurarna i halv på längden (Mediana avsnitt) och avlägsna och kassera medulla (som är mörkare i färgen) med en skalpell i en andra petriskål med 5 mL HBSS.
- Överföra de återstående bitar, vilka huvudsakligen njure cortex, i en tredje petriskål med 5 mL HBSS och färs med en steril rakblad tills bitarna är mindre än 1 mm i storlek, eller en pasta bildas.
- Fukta toppen och botten av en 180 µm SIL med 1% BSA/PBS över en avfall 500 mL-glasbägare. Detta steg är avgörande eftersom det rockar sikten med protein och minskar vidhäftning av glomeruli, vilket kommer att förbättra avkastningen.
- Placera malet cortex på en liten kant av sikten och texturerat kolven flänsen (motsatt gummitätningen sida) av en 10 mL spruta till mush vävnaden genom sikten i en botten kastrull sitter på isen. Skölj regelbundet med HBSS men använda så lite som möjligt för att undvika provspädning.
Obs: Inte överstiger 30 mL buffert totalt, så endast 25 mL mer kan användas här. Anledningen till att placera malet vävnaden på bara ena kanten av sikten är att minska vidhäftning av glomeruli genom att begränsa exponering för del av sikten i stället för den hela sieve yta.- För att underlätta detta, återanvända den vätska som samlande i nedre pannan att skölja sikten. När siktning är klar, noggrant tvätta botten av sikten återigen med 1% BSA/PBS-bufferten från botten av pannan att fånga någon glomeruli som löst kan följas.
- Samla alla vätskan i nedre pannan till flera 10 mL sprutor utrustad med 20 G nålar och passera den genom nålen minst 2 ytterligare gånger. På den senaste samlingen, hålla glomeruli-innehållande vätska i sprutan förrän du är klar att passera det 90 µm sikten.
- När vätskan lagras i sprutorna, tvätta botten pannan genom att spola med 1% BSA/PBS till avfall bägare och våt toppen och botten av en 90 µm SIL med 1% BSA/PBS. Placera sikten ovanpå botten pan på is.
- Gälla en kant av sikten och mush provet i sprutorna genom sikten med en annan spruta fläns som beskriver ovan. Tvätta med lösning från botten pan att samla allt på ena kanten av sikten.
- En gång siktning är klar, tvätta noggrant botten av sikten som i steg 1.5.1. Samla alla vätskan i botten pan i en 50 mL konisk plaströr.
- Tvätta botten pannan med 1% BSA/PBS i en avfall bägare och våt toppen och botten av en 75 µm SIL med 1% BSA/PBS. Placera sikten ovanpå botten pan på is.
- Tillämpas provet på ena kanten av sikten. Vätska bör flödet genom enkelt. Skölj igenom toppen med minst 20 mL 1% BSA/PBS till avfall bägare. Noggrant tvätta botten av sikten samt. I glomeruli förblir på toppen av denna 75 µm sikt.
- Använda HBSS för att samla glomeruli i en petriskål genom att skölja genom sikten uppochner. Använd så mycket HBSS som behövs här. Samla in i en eller flera 50 mL plast koniska rör på is.
- Centrifugera vid 1800 x g i 5 minuter vid 4 ° C, ta bort supernatanten noggrant med en pipett och återsuspendera pelleten i 10 mL kall HBSS. Kombinera proverna om flera koniska rör samlades i 1.7.2. Upprepa detta centrifugering.
- Återsuspendera i glomeruli i 5 mL HBSS förrän du är klar att gå vidare till nästa steg.
- Om du vill ta en sammanräkning av de totala glomeruli. För detta, ta en 10 µL prov med en pipett och placera en droppe på en glasskiva. Visa under ett mikroskop, räkna glomeruli i fältet och multiplicera med 500 för att få totala avkastning.
Obs: Renhet kan bestämmas genom att räkna antalet tubuli sett i fältet och dividera med antalet glomeruli och tubuli strukturer. Det bör finnas > 95% glomeruli i synfältet.- Om det finns betydande tubulär förorening, upprepa steg 1.6.1 framåt och se till att tvätta när att slutföra steg 1.7.1. Detta är steget som tubulär kontaminering är troligast.
2. skada av Glomeruli
- Samla glomeruli i en 15 mL koniskt plaströr och spinn ner på 200 x g. Återsuspendera i en lämplig mängd HBSS baserat på den totala avkastningen så att det finns cirka 9.000 glomeruli per brunn. Pipettera över 450 µL prov till varje brunn 24-well platta, eller platta format som passar de nedströms analyser som krävs.
Obs: Pipettera upp och ner för att blanda glomeruli i buffert säkerställer en homogen lösning. I glomeruli kommer att är mycket klibbiga och tunga och hålla sig till varandra samt lösa på botten av en lösning snabbt och på sidorna av röret. - För att göra 6 mg/mL protamine sulfate (PS) lösning, först Lös 1 g PS i 10 mL dH2O uppvärmd till 40 ° C i en 15 mL koniskt plaströr och vortex grundligt. Ta 30 µL av lösningen och lägga till 470 µL av dH2O.
Obs: Detta kommer att producera en 6 mg/mL lösning, och när 50 µL läggs till brunnen som beskrivs nedan, slutliga koncentration 0,6 mg/mL.- I två exemplar, tillsätt 50 µL av protaminsulfat (detta är en 1:10 utspädning) till varje brunn i en grupp, samtidigt som den tillför en annan grupp 50 µL av HBSS (negativ kontroll).
- Inkubera plattan för 4 h vid 37 ° C.
- Snurra ner innehållet i varje brunn i en mikrocentrifug rör (4000 x g, 4 ° C, 10-15 s) och tvätta två gånger med 1 mL PBS varje.
- Aspirera ut den sista tvätten och återsuspendera i 300 µL av PBS. Uppdelad i tre delprover ska förberedas för protein isolering, överföring elektronmikroskop (TEM) visualisering och immunofluorescens färgning (om).
3. Förbered Glomeruli för analys
- Snurra ner innehållet i tre delprover (4000 x g, 4 ° C, 10-15 s) och aspirera ut kvarvarande buffert och vidare till exempel analys av TEM, om, eller protein isolering.
- Bearbetning för TEM
- Fixa glomerulär pellets i 150 µL kallt 2,5% glutaraldehyd i 0,01 M fosfatbuffrad Koksaltlösning. Ta bort fixeringsvätskan försiktigt från pelleten med Pasteur pipett, se till att inte störa pelleten, sedan tvättas det med PBS och efter fixa det i 1% osmium vanligtvis med 1% Kaliumferricyanid.
- Torkar ut provet genom en graderad serie av etanol (30, 50, 70, 90, 100, 100, 100%) och propylenoxid sedan bädda in i epoxy inbäddning material.
- Skär tunna semi (300 nm) sektioner på en ultramicrotome. Fläcken med 0,5% toluidin Blue i 1% natriumborat och granska dem under mikroskopet ljus.
- Skär ultrathin sektioner (65 nm), färga dem med uranyl acetat och Reynolds bly citrat och undersöka på ett transmissionselektronmikroskop.
- Bearbetning för om
- Tillsätt 150 µL av en 12% gelatin i PBS lösning och placera omedelbart på torris att bilda en pellet. Blötlägg pelleten i 500 µL av 2% PARAFORMALDEHYD/1 x PBS i en mikrocentrifug rör över natten vid 4 ° C.
- Placera pelleten i en bas mögel och bädda in genom att lägga till optimal styckning temperatur (ULT) medium över torr-is. Skär 5-10 µm sektioner på en cryotome och fortsätta med immunofluorescens/immunohistokemi eller standard histologiska fläckar.
- För Protein isolering
- Tillsätt 150 µL av RIPA bufferten till centrifugeras glomerulär pellets med 1,5 µL av proteashämmare och dounce med vävnad Homogenisatorer.
- Fortsätt till protein kvantifiering och immunoblotting eller andra proteinanalys.
Representative Results
Protokollet från tiden av dödshjälp till isolering av glomeruli kan fyllas i så lite som 2 h och har en hög genomströmning och effektivitet. Med korrekt användning av tekniken, avkastningen av glomeruli per råtta njure varierar från 6 000-10 000 glomeruli när start med 8 njurar. Den slutliga fjädringen är tätt packade med glomeruli och har en övergripande renhet > 95%, visar minimala föroreningar från tubulär segment eller andra celltyper (figur 1A, B). Dessutom kan de OCT-embedded glomeruli färgas med Hematoxylin och Eosin (H & E) fläckar att se morfologi (figur 1C). Dessa glomeruli bibehåller sin struktur i hela hela protokollet, även efter bearbetning. Vi visar att isolerade glomeruli besitter intakt och livskraftig podocytes (figur 2A), mesangialceller (figur 2B) och endotelceller (figur 2C).
När isolerade, kan i glomeruli utsättas för välkända kemiska skador att simulera i vivo patologi. I det här fallet valdes protaminsulfat (PS) för dess förmåga att störa laddningen av den glomerulära barriären, som så småningom leder till foten processen utplåning. PS-behandlade glomeruli har en slående minskning nephrin (röd) och ett antal kärnor positivt för WT1 (grön) via immunofluorescens (figur 3A, B). I glomeruli kan också förberedas för transmissionselektronmikroskopi (figur 3C). Kontrollprover har normala podocyte morfologi och fot processer medan de PS-behandlade glomeruli har foten processen utplåning (figur 3D), vilket är ett tecken på podocyte dysfunktion och ses i i vivo modeller med PS21. Detta motsvarade också till en minskning av nephrin upptäckts av immunoblotting (figur 3E, F).
För att avgöra lönsamhet, bedömdes klyvs kaspas-3 som markör för apoptos. Med hjälp av immunofluorescens, visas klyvs kaspas-3 först i några celler börjar 2 h efter isolering (figur 4). Antalet celler som uttrycker detta proteas blev rikligare över tid, med de högsta nivåerna som ses vid 24 och 48 timmar. Detta tyder på att apoptos uppstår relativt tidigt i kultur och att nedströms tillämpningar bör utföras strax efter isolering för bästa resultat.
Figur 1 . Typiska utseende av råtta glomerulär kulturer efter isolering. (A) Brightfield bild av glomerulär kultur. Även om vi valde ett fält där det finns en enda renala tubuli i denna Mikrograf (pilspets), är de kulturer som erhålls i allmänhet > 95% ren. Skalstapeln motsvarar 100 µm. (B) förstorad bild av ett enstaka glomeruli. (C) Hematoxylin och eosin fläcken av en enstaka glomeruli. Skala barer i B och C lika 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2 . Konstituerande celltyper finns kvar i enstaka glomeruli. Confocal immunofluorescens mikroskopi utfördes för nephrin (röd, podocytes) och cell-specifika markörer för att identifiera podocytes, mesangialceller och endotelet. (A) Costain för nephrin och WT1 (grön, podocytes). (B) Costain för nephrin och PDGFR-β (grön, mesangialceller, pil). (C) Costain för nephrin och CD31 (grön, endothelial celler, fartyg i tvärsnitt som präglas av pilspetsar). Skalstapeln = 25 µm på alla paneler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Podocyte skada kan vara inducerade i vitro med isolerade råtta glomeruli. (A) Confocal immunofluorescens mikroskopi för nephrin och WT1 i en obehandlad glomerulär kultur. Observera den linjära nephrin färgning (röd) och förekomsten av WT1-positiva kärnor (grön) som är typiskt sett när det finns friska podocytes. (B) efter protamine sulfate behandling, nephrin uttryck är minskad och icke-linjära och WT1 är frånvarande, som anger podocyte skada. (C) Transmission electron microscpy (TEM) bilden visar foten processer, basalmembranet och en fenestrated endotel som är typiska för normal glomerulär struktur. Bar lika med 500 nm. (D) efter protaminsulfat, foten processer är avlånga eller utplånade (pilspetsar), vilket indikerar podocyte skada. (E) Western blot för nephrin visar minskade nephrin efter protamine sulfate behandling. (F) aktin lastning kontroll för western blot visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . Bedömning av cellernas viabilitet i isolerade glomeruli. Confocal immunofluorescens mikroskopi för klyvs kaspas-3 (grön) utfördes. En nephrin samtidig fläck utfördes för att enkelt hitta i glomeruli. Fanns inga kluvna kaspas-3 positivitet vid 0 och 1 h efter isolering av glomeruli, noterades fluorescens signal i några celler på 2 h. successivt fler celler visade positivt längre efter isolering de undersöktes. Det största antalet kaspas-3 positiva celler noterades vid 24 och 48 h. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Discussion
Detta är en effektiv metod för att återställa glomeruli från råtta njure med billig, återanvändbar utrustning med ett enkelt protokoll. Som med alla förfaranden, finns det begränsningar för dess användbarhet. Först, även om vi får > 95% renhet, på grund av protokollet och utgångsmaterialet är det omöjligt att utesluta siktning alla föroreningar, och några röda blodkroppar och enstaka tubulär segmentet kommer att närvara i kulturen. Vi räknar inte dessa små föroreningar för att vara ett problem för flesta applikationer. Andra åberopat protokollet siktning användningen av råtta njurarna, där glomeruli är mycket större än hos möss. Om musen glomeruli behövs, varit en teknik som använder kommersiella magnetiska pärlor (t.ex., Dynabeads) publicerad22. För det tredje har det visat att specifika mRNA (plasminogen aktivator inhibitor-1 och kollagen jag) i enstaka glomeruli härleda nästan helt från Bowman's kapsel i stället för att intraglomerular celler23. Detta kan leda till olämpliga slutsatser om mRNA isolering görs från dessa glomeruli. Det bör noteras att majoriteten av glomeruli i våra händer är decapsulated och bör därför saknar betydande bidrag från Bowmans kapslar. Det fjärde börjar celldöd uppstå relativt snabbt under kultur.
Vi hittade att programmet apoptotiska, vilket framgår av utseendet på klyvs kaspas-3, aktiverades börjar på 2 h av kultur. Detta är i allmänhet avtal med tidigare rapporter visar att apoptos, enligt bedömning av DNA fragmentering, TUNEL och histologisk analys, börjar uppstå inom 1-2 h efter isolering24. Det bör dock även noteras att tidiga observationer visade att metabolisk aktivitet kunde upptäckas från isolerade Söll glomeruli när odlade för minst 3 h, vilket tyder på betydande cellulära lönsamhet vid denna tidpunkt16. Baserat på resultaten, anser vi dock att det skulle vara klokt att använda isolerade glomeruli omedelbart i avsedda experiment för bästa resultat. Vi rekommenderar att alla experiment utförs före 72 h som vi har observerat att hela glomerulär struktur börjar försämras efter denna tidpunkt.
Det är mycket lättare att få högre avkastning när start med 4-8 njurar i motsats till bara 2 eftersom ett visst antal glomeruli är förlorad på grund av adherencen till de olika siktarna, men när siktarna beläggs maximally finns det ingen ytterligare förlust. Av samma anledning är det viktigt att blöta siktarna i den BSA/PBS buffert före användning eftersom glomeruli är mer benägna att följa en torr SIL, och begränsa vävnad exponering till en kant på sikten. Vi föreslår att man börjar med inte mindre än 6 njurar (3 råttor) att få en rimlig avkastning.
Vissa utredare har isolerade primära podocyte kulturer från isolerade glomeruli som tenderar att växa ur glomeruli under kultur17. Vi har noterat att vissa isolerade glomeruli kommer följa kultur maträtt plast och att celler kommer att börja migrera av glomerulär strukturen vid sena tidpunkter (72 h efter isolering). Studien av dessa celler är utanför ramen för denna isolering protokoll, och det finns viss kontrovers om huruvida dessa celler är podocytes, parietala epitelcellerna eller båda15,25. Noterbart Mundel et al., har rapporterat att kullersten celler skördas från Söll glomeruli kan förmås att differentieras till mogen podocytes enligt särskilda odlingsskålar villkor26. Några av förvirringen angående cellidentiteten kan bero på huruvida de isolerade glomeruli är inkapslade (inklusive Bowman's kapsel som är befolkad av parietala epitelcellerna) eller decapsulated i förfarandet för siktning. I våra händer, med hjälp av sekventiella sieve storlekar av 180, 90 och 75 µm ledde till majoriteten av glomeruli är decapsulated.
De flesta former av proteinuric kronisk njursjukdom är på grund av ökad glomerulär permeabilitet. Flera författare har utnyttjat isolerade glomeruli i ex vivo permeabilitet experiment. I en metod, var förändringen av glomerulär volym efter att förändra osmotisk innehållet i det omgivande mediet används för att uppskatta permeabilitet27. Nyligen, det fastställdes att läckage av en fluorescerande sond från isolerade glomeruli kunde kvantifieras för att mäta permeabilitet och kunde utföras på gnagare utsätts för glomerulär sjukdom experimentella modeller28.
Vi har noterat att i TEM förberedelseprocessen, ser vi ibland podocyte fot processer lift off basalmembranet. Vi tycker inte detta händer i kulturen och är mer sannolikt en artefakt under TEM provberedning. Noterbart även när detta inträffar, är det klart om foten processerna ser ”normala” eller är utplånade.
Sammantaget ger detta protokoll en metod genom vilken man kan utvärdera morphologic och cellulära förändringar som svar på skadan. Vi räknar med att det kan användas som en följeslagare teknik till isolerade podocyte kulturer, särskilt när interaktioner med extracellulära matrix eller andra infödda celltyper övervägs. Den rymmer löfte för att öka förståelsen för proteinuric CKD, som skulle förbättra förmågan att utveckla framtida therapeutics för denna handikappande sjukdom.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av American Heart Association grant FTF 16990086, NIH P30 DK079307, American Society of njurmedicin Gottschalk Award, en University of Pittsburgh Medical Center konkurrenskraftiga medicinsk forskning Fund Award och en University of Pittsburgh Läkare akademiska Foundation Award. Vi tackar Gerard Apodaca för hans tekniska förslag för glomerulär bevarande för histologisk analys, Mara Sullivan och Ming solen för hjälp med elektronmikroskopi, och Yingjian Li och Youhua Liu för deras tekniska insatser i detta protokoll. Vi tackar också Cynthia St. Hilaire för CD31 antikroppen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions, Chemicals, and Animals | |||
| Sprague-Dawley Rats | Envigo | 207M | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1605100 | |
| Hank's Balanced Salt Solution with Ca2+ and Mg2+ | Thermo | 14025092 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline | VWR | 97063-660 | |
| Protamine sulfate | MP Bio | ICN15197105 | |
| Karnovsky's Fixative | |||
| Gelatin | |||
| Paraformaldehyde | EMD | EM-PX0055-3 | |
| O.C.T. | Scigen | 23730571 | |
| RIPA Buffer | |||
| Halt Protease Inhibitors | Thermo | PI78442 | |
| Nephrin Antibody | Fitzgerald | 2OR-NP002 | |
| WT-1 Antibody | Abcam | ab89901-10ul | |
| PDGFR-β Antibody | Cell Signaling | #3169S | |
| CD31 Antibody | LSBio | LS-C348736 | |
| Cleaved caspase-3 antibody | Cell Signaling | 9661S | |
| Poly/Bed 812 (Luft) epoxy | Polysciences | 08792-1 | |
| Equipment | |||
| Carbon dioxide chamber | |||
| Conical tubes, 15 mL | |||
| Conical tubes, 50 mL | |||
| Surgical scissors | |||
| Surgical forceps | |||
| Sterile gauze | |||
| Petri dishes, 100 mm | |||
| Scalpels | |||
| Razor blades | |||
| Sterile filter apparatus | |||
| Sieve Pan | Alfa Aesar | AA39999ON | |
| 180um Sieve | Alfa Aesar | AA39996ON | |
| 90um Sieve | Alfa Aesar | AA39990ON | |
| 75um Sieve | Alfa Aesar | AA39991ON | |
| 10 mL syringes | |||
| 600 mL beakers | |||
| Cell culture incubator | |||
| Picofuge | |||
| Vortex | |||
| Tissue Homogenizers | Fisher Scientific | 50550226 | |
| 20 G needles | |||
| Leica Reichart Ultracut | ultramicrotome |
References
- Grahammer, F., Schell, C., Huber, T. B. Molecular understanding of the slit diaphragm. Pediatric Nephrology. 28 (10), 1957-1962 (2013).
- Tan, R. J., Zhou, L., Zhou, D., Lin, L., Liu, Y. Endothelin receptor a blockade is an ineffective treatment for adriamycin nephropathy. PLoS One. 8 (11), 79963 (2013).
- Wagner, N., Wagner, K. D., Xing, Y., Scholz, H., Schedl, A. The major podocyte protein nephrin is transcriptionally activated by the Wilms' tumor suppressor WT1. Journal of the American Society of Nephrology. 15 (12), 3044-3051 (2004).
- Rogacka, D., et al. Insulin increases filtration barrier permeability via TRPC6-dependent activation of PKGIalpha signaling pathways. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (6), 1312-1325 (2017).
- Mundel, P., et al. Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines. Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).
- Moller, C. C., et al. Induction of TRPC6 channel in acquired forms of proteinuric kidney disease. Journal of the American Society of Nephrology. 18 (1), 29-36 (2007).
- Tian, D., et al. Antagonistic regulation of actin dynamics and cell motility by TRPC5 and TRPC6 channels. Science Signaling. 3 (145), 77 (2010).
- Shankland, S. J., Pippin, J. W., Reiser, J., Mundel, P. Podocytes in culture: past, present, and future. Kidney Internationalernational. 72 (1), 26-36 (2007).
- Cook, W. F., Pickering, G. W. A rapid method for separating glomeruli from rabbit kidney. Nature. 182 (4642), 1103-1104 (1958).
- Misra, R. P. Isolation of glomeruli from mammalian kidneys by graded sieving. American Journal of Clinical Pathology. 58 (2), 135-139 (1972).
- Burlington, H., Cronkite, E. P. Characteristics of cell cultures derived from renal glomeruli. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 142 (1), 143-149 (1973).
- Harper, P. A., Robinson, J. M., Hoover, R. L., Wright, T. C., Karnovsky, M. J. Improved methods for culturing rat glomerular cells. Kidney International. 26 (6), 875-880 (1984).
- Kreisberg, J. I., Hoover, R. L., Karnovsky, M. J. Isolation and characterization of rat glomerular epithelial cells in vitro. Kidney International. 14 (1), 21-30 (1978).
- Weinstein, T., Cameron, R., Katz, A., Silverman, M. Rat glomerular epithelial cells in culture express characteristics of parietal, not visceral, epithelium. Journal of the American Society of Nephrology. 3 (6), 1279-1287 (1992).
- Yaoita, E., Kurihara, H., Sakai, T., Ohshiro, K., Yamamoto, T. Phenotypic modulation of parietal epithelial cells of Bowman's capsule in culture. Cell and Tissue Research. 304 (3), 339-349 (2001).
- Meezan, E., Brendel, K., Ulreich, J., Carlson, E. C. Properties of a pure metabolically active glomerular preparation from rat kidneys. I. Isolation. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 187 (2), 332-341 (1973).
- Piwkowska, A., et al. Insulin increases glomerular filtration barrier permeability through PKGIalpha-dependent mobilization of BKCa channels in cultured rat podocytes. Biochimica et Biophysica Acta. 1852 (8), 1599-1609 (2015).
- Kotyk, T., et al. Measurement of glomerulus diameter and Bowman's space width of renal albino rats. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 126, 143-153 (2016).
- Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Exp Ther Med. 5 (5), 1322-1326 (2013).
- Leeuwis, J. W., Nguyen, T. Q., Dendooven, A., Kok, R. J., Goldschmeding, R. Targeting podocyte-associated diseases. Advanced Drug Delivery Reviews. 62 (14), 1325-1336 (2010).
- Subramanian, B., et al. Mice with mutant Inf2 show impaired podocyte and slit diaphragm integrity in response to protamine-induced kidney injury. Kidney International. 90 (2), 363-372 (2016).
- Takemoto, M., et al. A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice. American Journal of Pathology. 161 (3), 799-805 (2002).
- Steinmetz, O. M., et al. A pitfall of glomerular sieving: profibrotic and matrix proteins derive from the Bowman's capsule and not the glomerular tuft in rats with renovascular hypertension. Nephrology Dialysis Transplantation. 22 (10), 3055-3060 (2007).
- Ishikawa, Y., Kitamura, M. Spontaneous apoptosis of podocytes in explanted glomeruli. Technical note. Kidney International. 54 (6), 2008-2013 (1998).
- Krtil, J., Platenik, J., Kazderova, M., Tesar, V., Zima, T. Culture methods of glomerular podocytes. Kidney and Blood Pressure Research. 30 (3), 162-174 (2007).
- Mundel, P., Reiser, J., Kriz, W. Induction of differentiation in cultured rat and human podocytes. Journal of the American Society of Nephrology. 8 (5), 697-705 (1997).
- McCarthy, E. T., et al. TNF-alpha increases albumin permeability of isolated rat glomeruli through the generation of superoxide. Journal of the American Society of Nephrology. 9 (3), 433-438 (1998).
- Desideri, S., et al. A novel assay provides sensitive measurement of physiologically relevant changes in albumin permeability in isolated human and rodent glomeruli. Kidney International. 93 (5), 1086-1097 (2018).
