Summary
O foco principal do presente protocolo é eficientemente isolar culturas viáveis glomérulos primário com contaminantes mínimas para uso em uma variedade de aplicações a jusante. Os glomérulos isolados mantém relações estruturais entre tipos de células do componente e podem ser cultivadas ex vivo por um curto período de tempo.
Abstract
Preservação da estrutura glomerular e função é essencial na prevenção da glomerulonefrite, uma categoria de doença renal, caracterizada por proteinúria, que pode eventualmente levar a crônica e o estágio final da doença renal. O glomérulo é um complexo aparato responsável para a filtragem do plasma do corpo. Na doença, integridade estrutural está perdida e permite o vazamento anormal do conteúdo de plasma na urina. Um método para isolar e examinar glomérulos na cultura é fundamental para o estudo destas doenças. Neste protocolo, é descrito um método eficiente de recuperar glomérulos intactos em rins de ratos adultos, preservando as características estruturais e morfológicas. Este processo é capaz de gerar rendimentos elevados dos glomérulos por rim com contaminação mínima de outros segmentos do néfron. Com estes glomérulos, condições de lesão podem ser imitadas por incubando-os com uma variedade de toxinas químicas, incluindo sulfato de protamina, que faz com que os pés processo de apagamento e proteinuria em modelos animais. Grau de lesão pode ser avaliada usando microscopia eletrônica de transmissão, mancha da imunofluorescência e mancha ocidental. Nefrina e níveis 1 de Tumor de Wilms (WT1) também podem ser avaliados destas culturas. Devido à facilidade e flexibilidade do presente protocolo, os glomérulos isolados podem ser utilizados conforme descrito, ou de uma forma que melhor se adapte às necessidades do pesquisador para ajudar o melhor estudo saúde glomerular e estrutura nos Estados doentes.
Introduction
O glomérulo é um altamente especializado tufo de capilares responsáveis pela filtragem do plasma de circulação. Forma-se o início do néfron, que é a unidade funcional básica do rim. Função glomerular é definida por um endotélio capilar excepcionalmente fenestrado, o diafragma de fenda de podócitos e uma membrana basal intermediárias. Estas camadas formam uma barreira semipermeável para permitir a excreção seletiva de substâncias no filtrado. Água, íons e outras moléculas pequenas geralmente passam, enquanto moléculas maiores são retidas no plasma. Podócitos são células epiteliais especializadas que se espalham ao longo da membrana basal, cercando os capilares com projeções citoplasmáticas, conhecidas como processos de pé. O pé processos dos podócitos adjacentes interdigitate e é atravessado por diafragmas de fenda compostos por proteínas como a Nefrina, podocin, caderina P e ZO-11. Em seção transversal, esses pé processos uniformemente dispostos sobre a membrana basal. Em glomérulos doentes, os processos de pé tornam-se grosseiramente anormais ou "apagados", levando à fuga anormal do conteúdo de plasma no filtrado. Como tal, o dano glomerular geralmente é caracterizado pela presença de quantidades anormalmente grandes de proteínas (por exemplo, proteinúria) e/ou células vermelhas do sangue (por exemplo, hematúria) na urina. Além disso, lesionados podócitos perdem expressão de Nefrina, bem como seu regulador 1 de Tumor de Wilms (WT1), uma proteína-chave responsável pela manutenção da diferenciação2,3. Os glomérulos são um alvo primário de danos na nefropatia diabética e outros glomerulonephritides, tais como doença de mudança mínima, glomeruloesclerose segmentar e nefropatia membranosa. Estas doenças são principais causas de insuficiência renal progressiva e o desenvolvimento de estágio final da doença renal, uma condição em que sobrevivência depende de diálise ou transplante renal. Portanto, é importante estudar glomérulos para entender melhor a patologia de (CKD) de doença renal crônica.
Um sistema de cultura de células é fundamental para estudar Biologia glomerular. Devido ao seu papel central na geração do diafragma de fenda, bem como a existência de doenças específicas de contraste devido a mutações de proteínas de membrana de fenda, muita pesquisa compreensivelmente tem utilizado o podocyte isoladamente. Isto levou à geração de linhas de células primárias podocyte para utilizar em vitro. Estas células podem ser cultivadas sob uma variedade de condições e até mesmo podem ser cultivadas em suportes permeáveis para avaliar a permeabilidade4. No entanto, o isolamento de pilhas proliferating muitas vezes seleciona células condrossarcoma que perderam alguns dos seus marcadores podocyte. Isto levou à geração de podócitos condicionalmente imortalizados derivadas de uma cepa de rato geneticamente modificado carregando um mutante sensível à temperatura do SV40 grande T gene (por exemplo, immortomouse), que poderia ser cultivado em cultura, mas também ser diferenciadas para expressar uma gama completa de marcadores de podocyte5. Esses métodos de cultura primária tem sido fundamentais na compreensão podocyte biologia4,6,7.
No entanto, culturas contendo os tipos de célula única faltam as relações intercelulares que ocorrem in vivo , bem como a estrutura de apoio e matrizes, e monocamadas dessas células não necessariamente recapitular o tridimensional arquitetura de glomérulos. Os podócitos imortalizados também podem ser complicado e desafiador de cultura8e requerem a posse de ambos o immortomouse ou estabelecida de uma alíquota inicial de células de investigadores para começar. Além disso, o glomérulo é composto não só podócitos, mas também células endoteliais capilares e a membrana basal, bem como as células mesangiais, que fornecem suporte para a estrutura. É, portanto, útil desenvolver uma ex vivo abordagem disponível para todos os investigadores para o estudo de glomérulos intactos que retêm sua arquitetura nativa, bem como todas as células que constituem o glomérulo normal.
Em 1958, cozinheiro e Pickering descrevem o primeiro isolamento de glomérulos do rim coelho. Após as observações que embolia gordurosa tornou-se apresentado em glomérulos, eles postularam que partículas do mesmo tamanho poderiam ser usadas para isolar especificamente essas estruturas. Com efeito, a infusão de partículas de óxido de ferro para o rim levou a captura destas partículas em glomérulos. Após dissociação mecânica e peneiramento do rim, o glomérulo pode ser isolado intacta e com pureza através do uso de separação magnética9. Em 1971, Misra mostrou que o óxido de ferro infusões podem ser omitidos e isolamento glomerular alcançado com peneiramento de humanos picado, cachorro, coelho ou rato de tecido renal10. Esta técnica foi modificada desde então dependendo o objetivo dos investigadores, mas essencialmente resultou em preparações purificadas, que poderia ser ainda mais estudado ou do que as culturas de células primárias poderiam ser estabelecida11,12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17.
Aqui descrevemos um protocolo para a isolação de glomérulos viáveis intactos desde o rim de rato. O protocolo inteiro leva apenas algumas horas. Embora eles não proliferam, planos experimentais de qualquer tamanho podem ser suportados, simplesmente aumentando o número de rins como material de partida. Embora existam protocolos publicados para a separação magnética do grânulo de glomérulos, eles exigem uma injeção intravenosa de grânulos, são mais caros e podem alterar a biologia desde os grânulos são também mantidos pelos glomérulos na cultura ou exigem glomerulares" Lise"e remoção por centrifugação19. Em comparação com glomérulos do mouse, o maior tamanho de glomérulos de rato (cerca de 100 µm em dois meses de idade ratos18) facilita muito para separá-los de outras estruturas do rim usando uma técnica simples de peneiramento.
Como prova da sua utilidade, nós têm caracterizado os glomérulos para demonstrar os diferentes tipos de células. Eles também podem ser expostos a agentes conhecidos por ferir glomérulos in vivo e demonstramos os efeitos negativos do sulfato de protamina (PS) para essas culturas. PS é um polycation que neutraliza os aniônicos locais ao longo da parede capilar glomerular20. Esta neutralização tem um efeito dramático sobre a barreira de filtração glomerular e, portanto, aumenta a proteinúria e pé processo de apagamento. Esses glomérulos podem ser avaliados com immunoblots para proteínas chaves como Nefrina e WT1 para avaliar a saúde geral. Além disso, sua estrutura pode ser avaliada com luz, imunofluorescência e microscopia eletrônica.
Globalmente, este protocolo é acessível para a maioria dos investigadores (um só precisa de acesso para os animais e alguns equipamentos simples). Com características morfológicas deixadas intactas, o pesquisador é capaz de analisar os glomérulos e ver como outros tipos de células importantes e preservação de matriz em glomérulos afetam a função e doença progressão, uma lacuna de culturas podocyte.
Protocol
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade de Pittsburgh e institucional Cuidado Animal.
1. isolamento de rato glomérulos
- Para preparar um buffer de isolamento de 1% estéril, adicione 5 g de albumina de soro bovino (BSA) para um béquer de 600 mL.
- Adicionar 500 mL de 1x salina tamponada fosfato (PBS) para o copo e mexa com uma vara de agita magnética até todos BSA é dissolvido.
- Filtro estéril o buffer de BSA/PBS de 1% em uma capa de cultura de células.
Nota: O buffer de BSA/PBS estéril 1% pode ser mantido a 4 ° C por até uma semana.
- Obter ratos Sprague-Dawley de 2 a 4 pesando 150 a 200 g cada.
- Eutanásia em ratos através de dióxido de carbono por inalação usando uma câmara em que 100% de dióxido de carbono é introduzido em uma taxa de 10-30% do volume da câmara por minuto. Observar os animais, pela cessação da respiração e desvaneceu-se a cor dos olhos antes da remoção de dióxido de carbono.
- Prepare a pele ao longo do abdômen anterior com 70% de etanol e utilizar a máquina de cortar cabelo para remover o cabelo, se desejado. Fazer uma incisão na pele usando uma tesoura cirúrgica ou bisturi. Fazer outra incisão através da camada muscular para expor os órgãos internos. Estenda a incisão superiormente pelo diafragma e esterno ou caixa torácica como um método secundário de eutanásia.
- Isolar e remover ambos os rins e colocar em um tubo cônico de plástico estéril 50 mL com 30 mL de sal solução tamponada Hanks (HBSS) no gelo.
Nota: Vários ratos podem ser sacrificados na mesma Câmara e todos os rins podem ser colocados no mesmo tubo cónico.
- Manter os rins em gelo e transporte para uma capa de cultura de células estéreis. Transferir os rins para uma placa de Petri estéril contendo 5 mL de HBSS, também com gelo e remover e descartar gordura perirrenal com tesoura e pinça em ponto. Se ainda está presente, também remover e descartar a cápsula ao redor do rim, fazendo uma pequena incisão superficial e use Pinças afiadas delicadamente puxá-lo longe do órgão.
Nota: Sempre rim isolados no gelo e prática técnica estéril durante todo. Um pedaço de gaze estéril pode ser colocado na caixa de Petri como uma superfície texturizada para segurar o rim no lugar durante a manipulação.- Corte os rins ao meio longitudinalmente (secção sagital) e remover e descartar a medula (que é de cor mais escura) com um bisturi em uma segunda placa de Petri com 5 mL de HBSS.
- Transferir as peças restantes, que são predominantemente córtex renal, para um terceiro tubo de ensaio com 5 mL de HBSS e picar com uma lâmina de barbear estéril até que as peças são menos de 1 mm de tamanho, ou até um colar é formado.
- Molhar a parte superior e inferior de uma peneira de 180 µm com 1% BSA/PBS sobre um copo de resíduos de 500 mL. Este passo é fundamental pois reveste a peneira com proteína e reduz a aderência dos glomérulos, que irá melhorar o rendimento.
- Coloque o córtex picado sobre uma pequena borda da peneira e use o flange de êmbolo texturizada (do lado oposto a vedação de borracha) de uma seringa de 10 mL para embaralhou o tecido através da peneira em uma panela de fundo sentado no gelo. Lavar periodicamente com HBSS, mas usar o mínimo possível para evitar a diluição da amostra.
Nota: Não ultrapasse 30 mL do total da reserva, tão somente de 25 mL, mais podem ser usado aqui. A razão para a colocação do tecido picado de apenas um lado da peneira é reduzir a aderência dos glomérulos, limitando a exposição de parte da peneira ao invés de área de superfície inteira da peneira.- Para facilitar isso, reutilize o líquido coleta na panela para enxaguar a peneira inferior. Concluído o peneirar, Lave cuidadosamente a parte inferior da peneira mais uma vez com o tampão de BSA/PBS 1% do fundo da panela para capturar qualquer glomérulos que podem ser livremente aderiu.
- Coletar todos os fluidos na panela inferior em várias seringas de 10 mL, equipadas com agulhas de 20 G e passá-lo através da agulha de pelo menos 2 vezes adicionais. Na última coleção, manter o fluido contendo glomérulos na seringa até estar pronto para passá-lo pela peneira 90 µm.
- Enquanto o fluido é armazenado nas seringas, lave a panela de fundo por lavagem com 1% BSA/PBS em copo de resíduos e molhado no topo e no fundo de uma peneira de 90 µm com 1% BSA/PBS. Coloque a peneira em cima da panela de fundo no gelo.
- Aplique a amostra em seringas de uma borda da peneira e pirão através da peneira com outro flange seringa como descrever acima. Lave com solução da bandeja inferior para recolher tudo numa ponta da peneira.
- Uma vez peneirando é completa, lavar cuidadosamente a parte inferior da peneira etapa 1.5.1. Recolha todo o líquido na panela inferior em um tubo cônico plástico de 50 mL.
- Lave a panela de fundo com 1% de BSA/PBS em um copo de resíduos e molhado a parte superior e inferior da peneira 75 µm com 1% BSA/PBS. Coloque a peneira em cima da panela de fundo no gelo.
- Aplique a amostra uma borda da peneira. Líquido deve fluir facilmente. Lavar com a parte superior com pelo menos 20 mL de 1% BSA/PBS matraz de resíduos. Lave cuidadosamente o fundo da peneira também. Os glomérulos permanecerá no topo desta peneira 75 µm.
- Use HBSS para coletar glomérulos em uma placa de Petri enxaguando pela peneira de cabeça para baixo. Use tanto HBSS conforme necessário aqui. Colete em um ou mais 50 mL plástico tubos cónicos no gelo.
- Centrifugar a 1800 x g por 5 min a 4 ° C, remover o sobrenadante com uma pipeta e resuspenda o pellet em 10 mL de HBSS frio. Combine as amostras se vários tubos cónicos foram coletados em 1.7.2. Repita a etapa de centrifugação.
- Resuspenda os glomérulos em 5 mL de HBSS até estar pronto para prosseguir para a próxima etapa.
- Se desejar, leve uma contagem de glomérulos totais. Para isso, leve uma amostra de 10 µ l com uma pipeta e coloque a gota em uma lâmina de vidro. Visualizar sob um microscópio, contar os glomérulos no campo e multiplique por 500 para obter rendimento total.
Nota: A pureza pode ser determinada pela contagem do número de túbulos visto no campo e dividindo pelo número total de glomérulos e túbulos estruturas. Deve haver > 95% de glomérulos no campo visual.- Se houver contaminação significativa tubular, repita as etapas 1.6.1 em diante e certifique-se de lavar cuidadosamente quando completar passo 1.7.1. Esta é a etapa na qual tubular contaminação é mais provável de ocorrer.
2. a lesão dos glomérulos
- Colete os glomérulos em um plástico tubo cônico de 15 mL e spin para baixo em 200 x g. Ressuspender em uma quantidade adequada de HBSS baseia o rendimento total que existem aproximadamente 9.000 glomérulos por alvéolo. Pipetar 450 µ l de amostra para cada poço de uma placa de 24, ou qualquer formato de placa que se encaixa os jusante ensaios necessários.
Nota: Pipetagem acima e para baixo para misturar glomérulos no buffer garante uma solução homogênea. Os glomérulos são muito pegajoso e pesado e vão enfiar uns aos outros bem como acertar na parte inferior de uma solução rápida e para os lados do tubo. - Para tornar a protamina 6 mg/mL de sulfato solução (PS), primeiro dissolva 1 g de PS em 10 mL de dH2O aquecida a 40 ° C em um plástico tubo cônico de 15 mL e vórtice completamente. Tome 30 µ l da solução e adicione a 470 µ l de dH2O.
Nota: Isto irá produzir uma solução de 6 mg/mL, e quando 50 µ l são adicionados ao poço, conforme descrito abaixo, a concentração final é de 0,6 mg/mL.- Em duplicado, adicionar 50 µ l de sulfato de protamina (este é um 01:10 diluição) para cada poço de um grupo, ao fornecer outro µ l do grupo 50 de HBSS (controle negativo).
- Incubar a placa por 4 h a 37 ° C.
- Spin para baixo conteúdo de cada poço em um tubo de microcentrifugadora (4000 x g, 4 ° C, 10-15 s) e lavar duas vezes com 1 mL de PBS cada.
- Aspirar fora a lavagem final e ressuspender em 300 µ l de PBS. Dividido em três alíquotas de estar preparado para o isolamento da proteína, visualização de transmissão microscópio de elétron (TEM) e imunofluorescência (IF) de coloração.
3. preparar glomérulos para análise
- Spin para baixo o conteúdo das três alíquotas (4000 x g, 4 ° C, 10-15 s) e aspirado de fora o restante do buffer e proceder à análise da amostra pela TEM, se, ou isolamento da proteína.
- Processamento para TEM
- Corrigi pelotas glomerulares em 150 µ l de frio glutaraldeído 2,5% em PBS de 0,01 M. Retire cuidadosamente o fixador a pelota com uma pipeta Pasteur, certificando-se para não perturbar a pelota, e depois enxaguado com PBS e pós-corrigi-lo em tetróxido de ósmio 1% com 1% de ferricianeto de potássio.
- Desidratar a amostra através de uma série graduada de etanol (30, 50, 70, 90, 100, 100, 100%) e óxido de propileno em seguida incorporar em epóxi incorporação material.
- Corte semi fina (300 nm) seções sobre um ultramicrotome. Mancha com 0,5% de azul de toluidina em borato de sódio 1% e examiná-las sob o microscópio de luz.
- Corte de seções ultra-finas (65 nm), mancha-las com acetato de uranilo e citrato de chumbo de Reynold e examinar em um microscópio eletrônico de transmissão.
- Processamento para se
- Adicionar 150 µ l de uma gelatina de 12% em solução de PBS e colocar imediatamente em gelo seco para formar um pellet. Mergulhe a pelota em 500 µ l de 2% paraformaldeído/1 x PBS em um tubo de microcentrifugadora durante a noite a 4 ° C.
- Coloque a pelota em um molde de base e incorporar adicionando médio de temperatura (OCT) corte ideal sobre gelo seco. 5-10 µm seções em um cryotome de corte e proceder com imunofluorescência/imunohistoquímica ou padrão histológicas manchas.
- Para isolamento da proteína
- Adicione 150 µ l de tampão RIPA a pelota glomerular centrifugada com 1,5 µ l de inibidor de protease e homogenizacao com Homogeneizadores de tecido.
- Proceda à quantificação de proteína e immunoblotting ou outras análises de proteína.
Representative Results
O protocolo da época de eutanásia para o isolamento de glomérulos pode ser concluído em menos de 2h e tem um alto rendimento e eficiência. Com a utilização da técnica adequada, o rendimento dos glomérulos por rim de rato varia de 6.000-10.000 glomérulos quando começando com 8 rins. A suspensão final é densamente com glomérulos e tem um total pureza > 95%, apresentando contaminação mínima de segmentos tubulares ou outros tipos de células (Figura 1A, B). Além disso, glomérulos OCT-incorporado podem ser corados com hematoxilina e eosina (H & E) manchas para ver a morfologia (Figura 1C). Esses glomérulos mantêm sua estrutura em todo o protocolo inteiro, mesmo após o processamento. Demonstramos que os glomérulos isolados possuem podócitos intactos e viáveis(Figura 2), células mesangiais (Figura 2B) e células endoteliais (Figura 2C).
Uma vez isolado, o glomérulo pode ser exposto a lesões químicas bem conhecidos para simular patologia na vivo . Neste caso, o sulfato de protamina (PS) foi escolhido por sua capacidade de perturbar a carga da barreira de filtração glomerular, que eventualmente leva a processo de apagamento do pé. PS-tratados glomérulos têm uma redução marcante Nefrina (vermelha) e um número de núcleos positivos para WT1 (verde) através de imunofluorescência (Figura 3A, B). Os glomérulos também podem ser preparados por microscopia eletrônica de transmissão (Figura 3C). Amostras de controlo têm morfologia normal podocyte e processos os pés enquanto os glomérulos PS-tratados têm pé processo de apagamento (Figura 3-D), que é um sinal de disfunção podocyte e é visto em modelos na vivo usando PS21. Isto também correspondeu a uma diminuição da Nefrina detectada pelo immunoblotting (Figura 3E, F).
Para determinar a viabilidade, clivados caspase-3 foi avaliado como um marcador da apoptose. Usando a imunofluorescência, caspase-3 clivada aparece pela primeira vez em algumas células começando 2 h após isolamento (Figura 4). O número de células expressando essa protease tornou-se mais abundante ao longo do tempo, com os mais altos níveis vistos em 24 e 48 h. Isto sugere que apoptose ocorre relativamente cedo na cultura e que aplicações a jusante devem ser realizadas logo após o isolamento para obter melhores resultados.
Figura 1 . A aparência típica de culturas glomerular rato após isolamento. (A) imagem Brightfield da cultura glomerular. Embora nós escolhemos um campo em que há um único túbulo renal nesta Micrografia (seta), as culturas obtidas são geralmente > 95% puro. Barra de escala é igual a 100 µm. (B) alargada da imagem de um único Glomérulo. (C) coloração de hematoxilina e eosina de um glomérulo único. Barras de escala em B e C igual a 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Tipos de células constituintes são retidos em glomérulos isolados. Microscopia confocal da imunofluorescência foi realizada para Nefrina (vermelhos, podócitos) e marcadores de células específicas para identificar podócitos, células mesangiais e o endotélio. (A) Costain Nefrina e WT1 (verdes, podócitos). (B) Costain Nefrina e PDGFR-β (verde, células mesangiais, seta). (C) Costain Nefrina e CD31 (células endoteliais, verdes, vasos em seção transversal, marcado por setas). Barra de escala = 25 µm em todos os painéis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Podocyte lesão pode ser induzida em vitro usando glomérulos isolados rato. (A) microscopia de imunofluorescência Confocal para Nefrina e WT1 em uma cultura glomerular não tratada. Observe a linear Nefrina coloração (vermelho) e a presença de núcleos de WT1 positivo (verde), que normalmente são vistos quando há podócitos saudáveis. (B) depois de sulfato de protamina tratamento, Nefrina expressão está diminuída e não-linear, e WT1 está ausente, indicando lesão podocyte. Processos de pé (C) exibição de imagem transmissão eletrônica microscpy (TEM), membrana basal e um endotélio fenestrado típico de estrutura glomerular normal. Bar é igual a 500 nm. (D) depois de sulfato de protamina, processos de pé são alongados ou apagados (setas), que indica lesão podocyte. (E) borrão ocidental para Nefrina mostrando diminuíram Nefrina após tratamento de sulfato de protamina. Actina (F) carregar o controle para o borrão ocidental é mostrada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . Avaliação da viabilidade celular em glomérulos isolados. Microscopia confocal imunofluorescência para clivada caspase-3 (verde) foi realizada. Realizou-se uma mancha co Nefrina para localizar facilmente os glomérulos. Enquanto não havia nenhuma positividade de caspase-3 clivada em 0 e 1 h após o isolamento de glomérulos, sinal de fluorescência em algumas células foi observado em 2 h. progressivamente que mais células virou positiva a longo após isolamento, que eles foram examinadas. O maior número de células positivas de caspase-3 foram observado em 24 e 48 h. , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Este é um método eficiente para a recuperação de glomérulos do rim de rato usando equipamento barato e reutilizável com um protocolo simples. Como com todos os procedimentos, existem limitações a sua utilidade. Em primeiro lugar, embora nós obtemos > 95% de pureza, devido à natureza de peneiramento do protocolo e matérias-primas é impossível eliminar todos os contaminantes e alguns glóbulos vermelhos e o segmento tubular ocasional estará presentes na cultura. Não prevemos estes contaminantes pequenos para ser um problema para a maioria das aplicações. Em segundo lugar, o protocolo de peneiramento baseia-se na utilização de rins de ratos, em que os glomérulos são muito maiores do que em ratos. Se glomérulos do mouse são necessários, uma técnica usando grânulos magnéticos comerciais (por exemplo, Dynabeads) tem sido publicado22. Em terceiro lugar, tem sido demonstrado que os mRNAs específicos (inibidor de ativador de plasminogênio-1 e colágeno eu) em glomérulos isolados derivam quase inteiramente cápsula de Bowman em vez de intraglomerular células23. Isso pode levar a conclusões inadequadas, se a tentativa de isolamento do mRNA destes glomérulos. Deve notar-se que, nas nossas mãos, a maioria dos glomérulos é congelada e deve, portanto, falta de contribuições significativas de cápsulas de Bowman. Em quarto lugar, a morte celular começa a ocorrer relativamente rapidamente em condições de cultura.
Nós achamos que o programa de apoptose, como evidenciado pela aparição do clivada caspase-3, foi ativado começando às 2 h da cultura. Este é em geral de acordo com relatórios anteriores, mostrando que a apoptose, avaliada pelo DNA fragmentação, TUNEL e análise histológica, começa a ocorrer dentro de 1-2h após isolamento24. No entanto, também deve ser notado que as primeiras observações mostraram que atividade metabólica pode ser detectada de glomérulos peneirados isolados quando cultivados pelo menos 3 h, sugerindo considerável viabilidade celular neste Commit16. Não obstante, baseado nos resultados, acreditamos que seria prudente utilizar glomérulos isolados imediatamente em experimentos pretendidos para os melhores resultados. Recomendamos que todos os experimentos ser executados antes de 72 h, como temos observado que toda a estrutura glomerular começa a deteriorar-se além que Commit.
É muito mais fácil de obter rendimentos mais elevados, quando se inicia com 4-8 rins em oposição a apenas 2 porque um certo número de glomérulos é perdido devido a aderência para as peneiras de vários, mas uma vez que as peneiras são revestidas màxima não há nenhuma perda adicional. Pela mesma razão, é importante embeber as peneiras no antes do tampão BSA/PBS usar como glomérulos são mais propensos a aderir a uma peneira seca e para limitar a exposição de tecido para uma borda da peneira. Sugerimos começar com nada menos que 6 rins (3 ratos) obter um rendimento razoável.
Alguns investigadores isolaram primário podocyte culturas de glomérulos isolados que tendem a crescer fora de glomérulos durante cultura17. Temos observado que alguns glomérulos isolados irão aderir ao plástico de prato de cultura e que as células vão começar a migrar fora da estrutura glomerular em momentos finais (72 h após o isolamento). O estudo destas células está além do escopo do presente protocolo de isolamento, e há alguma controvérsia sobre se essas células são podócitos, células epiteliais parietais ou ambos15,25. Notavelmente, Mundal et al, relataram que células de paralelepípedos de glomérulos peneirados colhidas podem ser induzidas para se diferenciar em podócitos maduros sob específicas condições26de cultivo. Algumas das confusões sobre identidade da célula podem depender se a glomérulos isolados são encapsulados (incluindo a cápsula de Bowman, que é preenchida por células epiteliais parietais) ou congelada no processo de peneiramento. Em nossas mãos, usando tamanhos de peneira sequencial de 180, 90 e 75 µm levou à maioria dos glomérulos sendo congelada.
A maioria das formas de doença renal crônica contraste são devido ao aumento da permeabilidade glomerular. Diversos autores utilizaram glomérulos isolados em ex vivo experimentos de permeabilidade. Em um método, a mudança no volume glomerular após alterar o conteúdo osmótico da mídia circundante foi usada para estimar a permeabilidade27. Recentemente, foi estabelecido que vazamento de uma sonda fluorescente de glomérulos isolados pode ser quantificado, para medir a permeabilidade e pode ser executado em roedores expostos a modelos experimentais de doença glomerular28.
Temos observado que o processo de preparação TEM, às vezes, vemos o podocyte processos levantar a membrana basal do pé. Nós não sentimos isto está acontecendo na cultura e é mais provável um artefato durante a preparação da amostra TEM. Notavelmente, mesmo quando isso ocorre, é claro se os processos de pé parecem "normais" ou são apagados.
Em geral, este protocolo fornece um método pelo qual um pode avaliar as alterações morfológicas e celulares em resposta a lesões. Nós antecipamos que pode ser usado como uma técnica complementar para culturas de podocyte isolada, especialmente quando as interações com a matriz extracelular ou outros tipos de células nativas estão sendo consideradas. Isso é uma promessa para aumentar a compreensão do contraste CKD, que melhoraria a capacidade de desenvolver futuras terapêuticas para esta doença debilitante.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela American Heart Association grant 16990086 FTF, NIH P30 DK079307, American Society of Nephrology Gottschalk Award, uma Universidade de Pittsburgh Medical Center competitiva médico pesquisa fundo Award e uma Universidade de Pittsburgh Médicos acadêmicos Foundation Award. Agradecemos suas sugestões técnicas para preservação glomerular para análise histológica, Mara Sullivan e Ming Sun para obter assistência com microscopia eletrônica e Yingjian Li e Youhua Liu para seu técnica entrada neste protocolo Gerard Apodaca. Também agradecemos Cynthia St. Hilaire o anticorpo CD31.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions, Chemicals, and Animals | |||
| Sprague-Dawley Rats | Envigo | 207M | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1605100 | |
| Hank's Balanced Salt Solution with Ca2+ and Mg2+ | Thermo | 14025092 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline | VWR | 97063-660 | |
| Protamine sulfate | MP Bio | ICN15197105 | |
| Karnovsky's Fixative | |||
| Gelatin | |||
| Paraformaldehyde | EMD | EM-PX0055-3 | |
| O.C.T. | Scigen | 23730571 | |
| RIPA Buffer | |||
| Halt Protease Inhibitors | Thermo | PI78442 | |
| Nephrin Antibody | Fitzgerald | 2OR-NP002 | |
| WT-1 Antibody | Abcam | ab89901-10ul | |
| PDGFR-β Antibody | Cell Signaling | #3169S | |
| CD31 Antibody | LSBio | LS-C348736 | |
| Cleaved caspase-3 antibody | Cell Signaling | 9661S | |
| Poly/Bed 812 (Luft) epoxy | Polysciences | 08792-1 | |
| Equipment | |||
| Carbon dioxide chamber | |||
| Conical tubes, 15 mL | |||
| Conical tubes, 50 mL | |||
| Surgical scissors | |||
| Surgical forceps | |||
| Sterile gauze | |||
| Petri dishes, 100 mm | |||
| Scalpels | |||
| Razor blades | |||
| Sterile filter apparatus | |||
| Sieve Pan | Alfa Aesar | AA39999ON | |
| 180um Sieve | Alfa Aesar | AA39996ON | |
| 90um Sieve | Alfa Aesar | AA39990ON | |
| 75um Sieve | Alfa Aesar | AA39991ON | |
| 10 mL syringes | |||
| 600 mL beakers | |||
| Cell culture incubator | |||
| Picofuge | |||
| Vortex | |||
| Tissue Homogenizers | Fisher Scientific | 50550226 | |
| 20 G needles | |||
| Leica Reichart Ultracut | ultramicrotome |
References
- Grahammer, F., Schell, C., Huber, T. B. Molecular understanding of the slit diaphragm. Pediatric Nephrology. 28 (10), 1957-1962 (2013).
- Tan, R. J., Zhou, L., Zhou, D., Lin, L., Liu, Y. Endothelin receptor a blockade is an ineffective treatment for adriamycin nephropathy. PLoS One. 8 (11), 79963 (2013).
- Wagner, N., Wagner, K. D., Xing, Y., Scholz, H., Schedl, A. The major podocyte protein nephrin is transcriptionally activated by the Wilms' tumor suppressor WT1. Journal of the American Society of Nephrology. 15 (12), 3044-3051 (2004).
- Rogacka, D., et al. Insulin increases filtration barrier permeability via TRPC6-dependent activation of PKGIalpha signaling pathways. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (6), 1312-1325 (2017).
- Mundel, P., et al. Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines. Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).
- Moller, C. C., et al. Induction of TRPC6 channel in acquired forms of proteinuric kidney disease. Journal of the American Society of Nephrology. 18 (1), 29-36 (2007).
- Tian, D., et al. Antagonistic regulation of actin dynamics and cell motility by TRPC5 and TRPC6 channels. Science Signaling. 3 (145), 77 (2010).
- Shankland, S. J., Pippin, J. W., Reiser, J., Mundel, P. Podocytes in culture: past, present, and future. Kidney Internationalernational. 72 (1), 26-36 (2007).
- Cook, W. F., Pickering, G. W. A rapid method for separating glomeruli from rabbit kidney. Nature. 182 (4642), 1103-1104 (1958).
- Misra, R. P. Isolation of glomeruli from mammalian kidneys by graded sieving. American Journal of Clinical Pathology. 58 (2), 135-139 (1972).
- Burlington, H., Cronkite, E. P. Characteristics of cell cultures derived from renal glomeruli. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 142 (1), 143-149 (1973).
- Harper, P. A., Robinson, J. M., Hoover, R. L., Wright, T. C., Karnovsky, M. J. Improved methods for culturing rat glomerular cells. Kidney International. 26 (6), 875-880 (1984).
- Kreisberg, J. I., Hoover, R. L., Karnovsky, M. J. Isolation and characterization of rat glomerular epithelial cells in vitro. Kidney International. 14 (1), 21-30 (1978).
- Weinstein, T., Cameron, R., Katz, A., Silverman, M. Rat glomerular epithelial cells in culture express characteristics of parietal, not visceral, epithelium. Journal of the American Society of Nephrology. 3 (6), 1279-1287 (1992).
- Yaoita, E., Kurihara, H., Sakai, T., Ohshiro, K., Yamamoto, T. Phenotypic modulation of parietal epithelial cells of Bowman's capsule in culture. Cell and Tissue Research. 304 (3), 339-349 (2001).
- Meezan, E., Brendel, K., Ulreich, J., Carlson, E. C. Properties of a pure metabolically active glomerular preparation from rat kidneys. I. Isolation. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 187 (2), 332-341 (1973).
- Piwkowska, A., et al. Insulin increases glomerular filtration barrier permeability through PKGIalpha-dependent mobilization of BKCa channels in cultured rat podocytes. Biochimica et Biophysica Acta. 1852 (8), 1599-1609 (2015).
- Kotyk, T., et al. Measurement of glomerulus diameter and Bowman's space width of renal albino rats. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 126, 143-153 (2016).
- Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Exp Ther Med. 5 (5), 1322-1326 (2013).
- Leeuwis, J. W., Nguyen, T. Q., Dendooven, A., Kok, R. J., Goldschmeding, R. Targeting podocyte-associated diseases. Advanced Drug Delivery Reviews. 62 (14), 1325-1336 (2010).
- Subramanian, B., et al. Mice with mutant Inf2 show impaired podocyte and slit diaphragm integrity in response to protamine-induced kidney injury. Kidney International. 90 (2), 363-372 (2016).
- Takemoto, M., et al. A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice. American Journal of Pathology. 161 (3), 799-805 (2002).
- Steinmetz, O. M., et al. A pitfall of glomerular sieving: profibrotic and matrix proteins derive from the Bowman's capsule and not the glomerular tuft in rats with renovascular hypertension. Nephrology Dialysis Transplantation. 22 (10), 3055-3060 (2007).
- Ishikawa, Y., Kitamura, M. Spontaneous apoptosis of podocytes in explanted glomeruli. Technical note. Kidney International. 54 (6), 2008-2013 (1998).
- Krtil, J., Platenik, J., Kazderova, M., Tesar, V., Zima, T. Culture methods of glomerular podocytes. Kidney and Blood Pressure Research. 30 (3), 162-174 (2007).
- Mundel, P., Reiser, J., Kriz, W. Induction of differentiation in cultured rat and human podocytes. Journal of the American Society of Nephrology. 8 (5), 697-705 (1997).
- McCarthy, E. T., et al. TNF-alpha increases albumin permeability of isolated rat glomeruli through the generation of superoxide. Journal of the American Society of Nephrology. 9 (3), 433-438 (1998).
- Desideri, S., et al. A novel assay provides sensitive measurement of physiologically relevant changes in albumin permeability in isolated human and rodent glomeruli. Kidney International. 93 (5), 1086-1097 (2018).
