Summary
该协议的主要重点是有效地分离可行的初级肾小球培养物, 将污染物降至最低, 用于各种下游应用。分离的肾小球保留了组分细胞类型之间的结构关系, 可以在体内培养很短的时间。
Abstract
肾小球结构和功能的保存是预防肾小球肾炎的关键, 肾肾炎是以蛋白尿为特征的一类肾病, 最终可导致慢性和终末期肾病。肾小球是一种复杂的装置, 负责从体内过滤血浆。在疾病中, 结构完整性丧失, 并允许血浆内容物异常泄漏到尿液中。分离和检测培养中肾小球的方法对这些疾病的研究至关重要。该方案介绍了在保存结构和形态特征的同时, 从成年大鼠肾脏中提取完整肾小球的有效方法。这一过程能够产生高产量的每个肾脏肾肾小球, 并将来自其他肾段的污染降至最低。有了这些肾小球, 损伤条件可以通过培养它们与各种化学毒素, 包括硫酸丙胺, 这导致足部过程的脱落和蛋白尿在动物模型中的模仿。损伤程度可通过透射电子显微镜、免疫荧光染色和西方印迹进行评估。肾小细胞素和威尔姆斯肿瘤 1 (wt1) 的水平也可以从这些培养物中进行评估。由于该协议的易用性和灵活性, 孤立的肾小球可以按照描述的方式使用, 也可以以最适合研究人员需要的方式加以利用, 以帮助更好地研究病变状态下的肾小球健康和结构。
Introduction
肾小球是一个高度专业化的毛细血管, 负责循环等离子体的过滤。它形成肾的开始, 这是肾脏的基本功能单位。肾小球功能的定义是一个独特的被过滤的毛细血管内皮细胞, 足质的裂隙隔膜, 和中间的基底膜。这些层形成半渗透屏障, 允许物质选择性排泄到滤液中。水、离子和其他小分子通常通过, 而较大的分子则保留在血浆中。足细胞是一种特殊的上皮细胞, 分布在基底膜上, 围绕着毛细血管, 细胞质的突起被称为足部过程。相邻足细胞的足部过程相互干扰, 并由由肾素、波多辛、p-钙粘蛋白和 zo-1 等蛋白质组成的缝隙隔膜交叉.在横截面上, 这些足部过程均匀地排列在基底膜上。在病变的肾小球中, 足部过程变得非常不正常或 "擦伤", 导致血浆内容物异常泄漏到滤液中。因此, 肾小球损伤的一般特征是尿液中存在异常大量的蛋白质 (如蛋白尿) 和/或红细胞 (如血尿)。此外, 受伤的足细胞失去了肾素的表达, 以及其调节剂 wilms tumor 1 (wt1), 这是一种负责维持分化 2,3的关键蛋白。肾小球是糖尿病肾病和其他肾小球的主要损伤靶点, 如最小变化疾病、膜性肾病和局灶性节段肾小球硬化。这些疾病是进行性肾功能衰竭和终末期肾病发展的主要原因, 在这种情况下, 生存依赖于透析或肾移植。因此, 研究肾小球对于更好地了解慢性肾病 (ckd) 病理具有重要意义。
细胞培养系统是研究肾小球生物学的关键。由于其在产生裂隙隔膜的中心作用, 以及由于裂隙膜片蛋白突变而存在特定的蛋白尿疾病, 许多研究都可以理解地孤立使用了足虫。这导致了原代足细胞系的产生,以便在体外利用。这些细胞可以在各种条件下培养, 甚至可以在渗透支撑下生长, 以评估渗透性4。然而, 增殖细胞的分离往往选择失去了一些足细胞标记的去分化细胞。这导致了从携带 sv40 大型 t 基因 (如归生 t 基因) 的温度敏感突变体的转基因小鼠株中产生有条件的不朽足虫, 这种突变体可以在培养中生长, 但也可以在培养中生长。区分表示一个完整的阵列的 podocyte 标记5。这些原代培养方法在理解足虫生物学4、6、7方面发挥了关键作用。
然而, 含有单个细胞类型的培养物缺乏体内发生的细胞间关系以及支持结构和矩阵, 而这些细胞的单层不一定能重述三维细胞肾小球的建筑。不朽的足细胞也可能是繁琐和具有挑战性的培养 8, 需要拥有不朽的细胞或从老牌的研究人员开始的细胞。此外, 肾小球不仅由足细胞组成, 还由毛细血管内皮细胞和基底膜以及为结构提供支撑的系膜细胞组成。因此, 开发一种可供所有研究人员研究的体外方法是有益的, 该方法保留了它们的原生结构以及构成正常肾小球的所有细胞。
1958年, 库克和皮克林描述了第一次从兔肾中分离出肾小球。在观察到脂肪栓塞被存在于肾小球后, 他们假设相同大小的粒子可以用来专门分离这些结构。事实上, 将氧化铁颗粒注入肾脏后, 这些颗粒被困在肾小球中。经肾脏机械分离和筛分后, 通过磁选9可完整、纯净地分离肾小球。1971年, misra 表明, 氧化铁输液可以省略, 肾小球分离实现与筛碎的人, 狗, 兔子或大鼠肾脏组织10。此后, 根据调查人员的目标对这一技术进行了修改, 但基本上产生了纯化的制剂, 可以进一步研究, 也可以从这些制剂中建立原代细胞培养物 11,12,13,14,15,16,17岁
在这里, 我们描述了从大鼠肾脏中分离完整可行肾小球的协议。整个协议只需几个小时。虽然它们不增殖, 但任何大小的实验计划都可以通过简单地增加肾脏作为起始材料的数量来支持。虽然有公布的磁珠分离肾小球的协议, 但它们需要静脉注射珠子, 成本更高, 而且可能会改变生物学, 因为珠子要么被培养中的肾小球保留, 要么需要肾小球 "裂解 "和离心去除19。与小鼠肾小球相比, 大鼠肾小球 (两个月大的大鼠18近 100μm) 使它们更容易使用简单的筛分技术将它们与其他肾脏结构分离。
作为其有用性的证据, 我们已经定性的肾小球, 以证明不同的细胞类型。它们还可以暴露在体内已知会损伤肾小球的药物中,我们证明了硫酸丙胺 (ps) 对这些培养物的不利影响。ps 是一种多离子, 中和沿肾小球毛细血管壁20的阴离子位点。这种中和对肾小球滤过屏障有显著的影响, 因此增加了蛋白尿和足部过程的消减。这些肾小球可以用免疫印迹评估关键蛋白质, 如肾素和 wt1, 以评估整体健康。此外, 它们的结构可以用光、免疫荧光和电子显微镜进行评估。
总体而言, 大多数调查人员都可以使用这一协议 (一个人只需要接触动物和一些简单的设备)。在形态特征不受损害的情况下, 研究人员能够分析肾小球, 并观察肾小球中其他重要的细胞类型和基质保存是如何影响功能和疾病进展的, 这是足细胞培养的一个缺陷。
Protocol
这里描述的所有方法都得到了匹兹堡大学动物护理和使用机构委员会 (iacuc) 的批准。
1. 大鼠肾小球的分离
- 要制备无菌1% 隔离缓冲液, 请在600毫升烧杯中加入5克牛血清白蛋白 (bsa)。
- 在烧杯上加入500毫升的1x 磷酸盐缓冲盐水 (pbs), 用磁搅拌棒搅拌, 直到所有 bsa 溶解。
- 无菌过滤 1% bsa/pbs 缓冲区在细胞培养罩中。
注: 无菌 1% bsa/pbs 缓冲液可在4°c 下保存长达一周。
- 获得2到 4只 sprague-dawley 大鼠, 每只重150至200克。
- 利用以每分钟 10-30 的速度引入100% 二氧化碳的腔来通过吸入二氧化碳对大鼠进行安乐死。观察动物停止呼吸和褪色的眼睛颜色, 然后再从二氧化碳中去除。
- 准备皮肤在前腹部与70% 的乙醇, 并利用剪发剂, 以消除头发, 如果需要。用手术剪刀或手术刀在皮肤上做一个中线切口。通过肌肉层做另一个中线切口, 露出内脏。将切口通过隔膜、胸骨或肋骨笼上延伸, 作为安乐死的次要方法。
- 分离和取出两个肾脏, 并放置在一个不育的50毫升塑料锥形管与30毫升的汉克斯的缓冲盐溶液 (hbss) 在冰上。
注: 有几只老鼠可以在同一个腔内安乐死, 所有的肾脏都可以放在同一个锥形管中。
- 保持肾脏在冰上和运输到一个无菌细胞培养罩。将肾脏转移到含有5毫升 hbss 的无菌培养皿中, 也在冰上, 用剪刀和锋利的钳子切除和丢弃肾周脂肪。如果仍然存在, 也删除和丢弃周围的肾脏的胶囊, 做一个小的浅表切口, 然后使用尖锐的钳子轻轻地把它从器官。
注: 始终保持肾脏隔离在冰上, 并在整个过程中练习无菌技术。一块无菌纱布可以放在培养皿中, 作为纹理表面, 在操作过程中将肾脏固定在适当的位置。- 将肾脏切成半纵向 (中矢状部分), 并在带有5毫升 hbss 的第二个培养皿中用手术刀切除和丢弃髓质 (颜色较深)。
- 将剩余的碎片, 主要是肾皮质, 转移到第三个培养皿与5毫升的 hbss 和薄荷与无菌剃须刀刀片, 直到件小于1毫米的大小, 或直到浆糊形成。
- 用 1 0 0 微米的 bsa/pbs 将180微米筛的顶部和底部弄湿, 超过500毫升的废烧杯。这一步是至关重要的, 因为它覆盖在筛子与蛋白质, 并减少粘附肾小球, 这将提高产量。
- 将碎皮层放在筛子的小边缘, 并使用10毫升注射器的纹理柱塞法兰 (橡胶密封的一侧) 将组织通过筛子弄脏, 放入坐在冰上的底平底锅中。定期用 hbss 冲洗, 但尽量减少使用, 以避免样品稀释。
注: 不要超过缓冲区总数的30毫升, 因此这里只能使用25毫升。将碎组织放置在筛子的一个边缘的原因是通过限制接触部分筛子而不是整个筛子表面面积来减少肾小球的粘附。- 为了方便这一点, 请重复使用在底锅中收集的液体来冲洗筛子。筛分完成后, 用 1% bsa/pbs 缓冲液从平底锅底部再次仔细清洗筛子底部, 以捕获任何可能松散粘附的肾小球。
- 将底部平底锅中的所有液体收集到几个装有 20 g 针的10毫升注射器中, 并将其通过针头至少增加2次。在最后一次采集时, 将含有肾小球的液体保存在注射器中, 直到准备好通过90μm 筛子。
- 当液体储存在注射器中时, 用 1% bsaepbs 冲洗底部平底锅, 放入废烧杯中, 用 1% bsa/pbs 将90μm 筛子的顶部和底部弄湿。将筛子放在底部平底锅的顶部。
- 将注射器中的样品涂在筛子的一个边缘上, 并通过筛网用上面描述的另一个注射器法兰进行。用溶液从底部平底锅中清洗, 收集筛子一侧的所有东西。
- 筛分完成后, 按照步骤1.5.1 小心清洗筛子底部。收集所有的液体在底部平底锅在一个50毫升的塑料锥形管。
- 用 1% bsa/pbs 将底锅洗成废烧杯, 并用 1% bsa/pbs 将75μm 筛子的顶部和底部弄湿。将筛子放在底部平底锅的顶部。
- 将样品应用于筛子的一个边缘。液体应该很容易通过。用至少20% 的 bsa/pbs 冲洗到顶部的废物烧杯。也要小心地清洗筛子的底部。肾小球将保持在这个75μm 筛子的顶部。
- 使用 hbss 通过倒置筛子来收集 petri 培养皿中的肾小球。在此处根据需要使用尽可能多的 hbss。收集到一个或多个50毫升塑料锥形管 (s) 在冰上。
- 在4°c 条件下, 以 1800 x 克离心 5分钟, 用移液器小心去除上清液, 并在10毫升的冷 hbss 中重新悬浮颗粒。如果在1.7.2 中采集了多个锥形管, 则将样品结合起来。重复离心步骤。
- 在 hbss 5 毫升中重新利用肾小球, 直到准备好进入下一步。
- 如果需要, 取一个总肾小球的计数。为此, 取一个10μl 样品和移液器, 并将滴放在玻璃滑梯上。在显微镜下观察, 计算野外的肾小球, 乘以 500, 得到总产量。
注: 纯度可以通过计算在野外看到的小管数量并除以肾小球和小管结构的总数来确定。在视野中应该有 & gt; 95% 的肾小球。- 如果有明显的管状污染, 重复步骤1.6.1 前进, 并确保在完成步骤1.7.1 时彻底清洗。这是最有可能发生管状污染的步骤。
2. 肾小球损伤
- 在一个15毫升的塑料锥形管中收集肾小球, 并在 200 x x g. 的情况下旋转, 根据总产量以适当的 hbss 量旋转, 使每口井大约有 9, 000个肾小球。将样品450μl 放入24孔板的每口井中, 或符合所需下游检测的任何板材格式。
注: 上下移液混合在缓冲中的肾小球, 确保了均匀的溶液。肾小球非常粘稠和沉重, 会粘在一起, 同时迅速在溶液底部和管的两侧安顿下来。 - 为了使 6 mg/ml 硫酸丙胺 (ps) 溶液, 首先将1克 ps 溶解成 10 ml 的 dh2o 加热到40°c 的15毫升塑料锥形管中, 并彻底产生涡旋。取30μl 的溶液, 加入470μl 的 dh2o。
注: 这将产生一个 6 mg/ml 溶液, 当在井中添加 50μl, 如下所述, 最终浓度为 0.6 mg/ml。- 一式两份, 在一组的每口井中添加50μl 的硫酸丙胺 (这是1:10 稀释), 同时为另一组提供50μl 的 hbss (负对照)。
- 在37°c 下将板材孵化4小时。
- 将每口井的含量在微离心管 (4000 x 克、4°c、10-15 s) 中向下旋转, 并用每个 pbs 1 毫升清洗两次。
- 在 pbs 的300μl 中吸气, 并重新暂停最后的洗涤。分成三个等价物, 用于蛋白质分离、透射电子显微镜 (tem) 可视化和免疫荧光染色 (if)。
3. 准备肾小球进行分析
- 向下旋转三个等价物的含量 (4000 x 克、4°c、10-15秒), 抽走剩余的缓冲液, 然后通过透射电镜、if 或蛋白质分离进行样品分析。
- tem 的加工
- 将肾小球固定在150μl 的冷2.5% 的戊二醛 0.01 m pbs 中。使用巴斯德移液器小心地从颗粒中取出固定剂, 确保不破坏颗粒, 然后用 pbs 冲洗, 并将其固定在1% 的四氧化铬中, 用1% 的铁氰化钾进行修复。
- 通过分级系列乙醇 (30、50、70、90、100、100、100%) 和环氧丙烷使样品脱水, 然后嵌入环氧嵌入材料中。
- 在超微体上切割半薄 (300 nm) 部分。在1% 硼酸钠中摄入0.5% 的甲苯蓝, 并在光镜下进行检查。
- 切割超薄切片 (65 纳米), 用醋酸铀和雷诺尔德的铅柠檬酸酯染色, 并在透射电子显微镜下进行检查。
- 中频处理
- 在 pbs 溶液中加入150μl 的12% 明胶, 并立即放置在干冰上形成颗粒。在4°c 的微离心管中隔夜将颗粒浸泡在500μl 的2% 对甲醛 pbs 中。
- 将颗粒放入基模中, 并通过在干冰上添加最佳切割温度 (oct) 介质进行嵌入。在低温体上切割5-10μm 切片, 并进行免疫荧光/免疫组织化学或标准组织学染色。
- 用于蛋白质分离
- 在离心肾小球颗粒中加入150μl 的 ripa 缓冲液, 加入1.5μl 蛋白酶抑制剂, 并加入组织均质机。
- 进行蛋白质定量和免疫印迹或其他蛋白质分析。
Representative Results
从安乐死到肾小球隔离的协议可以在2小时内完成, 具有较高的吞吐量和效率。该技术得到了适当的应用, 从8个肾开始, 每只大鼠肾小球的产率从 6, 000-10, 000 不等。最后的悬浮液密集地填充肾小球, 总纯度 & gt; 95%, 显示最小的污染来自管状段或其他细胞类型 (图 1a, b)。此外, oct 嵌入的肾小球可以被血红素和 eosin (h & amp; e) 染色, 以查看形态 (图 1c)。这些肾小球在整个协议中保持其结构, 即使经过处理。我们证明, 分离的肾小球拥有完整和可行的足细胞 (图 2a), 系膜细胞 (图 2b) 和内皮细胞 (图 2c)。
一旦分离, 肾小球可暴露于众所周知的化学损伤, 以模拟体内病理。在这种情况下, 选择硫酸丙胺 (ps) 是因为它能够破坏肾小球滤过屏障的电荷, 最终导致足部过程的脱落。pds 处理的肾小球通过免疫荧光对 wt1 (绿色) 有显著的减少 (图3a,b). 也可以为透射电子显微镜准备肾小球 (图 3c)。对照样本具有正常的足质形态和足部过程, 而 pds 处理的肾小球有足部过程的脱落 (图 3d), 这是足细胞功能障碍的表现, 在体内使用 ps 21 在体内模型中可以看到。这也与免疫印迹检测到的肾素减少相对应 (图 3e、f)。
为了确定其可行性, 将裂解的西帕斯-3 评估为细胞凋亡的标志物。使用免疫荧光, 裂解的 caspase-3 首先出现在几个细胞中, 分离后2小时开始 (图 4)。随着时间的推移, 表达这种蛋白酶的细胞数量变得更加丰富, 最高水平在24小时和48小时。这表明, 细胞凋亡确实发生在培养的较早的时间, 下游的应用程序应在隔离后不久进行, 以获得最佳效果。
图 1.分离后大鼠肾小球培养的典型表现.肾小球培养的明亮场图像。虽然我们选择了一个领域, 其中有一个单一的肾小管在这个微图 (箭头), 所获得的培养通常 & gt; 95% 纯。刻度条等于 100μm (b) 单个肾小球的放大图像。(c) 血红素和单一肾小球的 eosin 染色。b 和 c 中的刻度条等于 10μm. 请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 2.组成细胞类型保留在孤立的肾小球中.对肾素 (红色、足细胞) 和细胞特异性标记物进行共聚焦免疫荧光显微镜检查, 以识别足细胞、系膜细胞和内皮细胞。(a) 肾素和 wt1 (绿色、podocytes) 的着色剂。(b) 肾素和 pdgfr-β (绿色、系膜细胞、箭头) 的着色剂。(c) 肾素和 cd31 (绿色、内皮细胞、横截面上有箭头标记的血管) 的着色。所有面板上的刻度柱 = 25μm。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3.利用分离的大鼠肾小球可在体外诱导足细胞损伤.(a) 未处理肾小球培养中的肾素和 wt1 共聚焦免疫荧光显微镜。请注意线性肾染色 (红色) 和 wt1 阳性核 (绿色) 的存在, 这通常是在有健康的足细胞时看到的。(b) 硫酸丙胺治疗后, 肾素表达减少, 非线性, wt1 不存在, 表明其损伤。(c) 透射电子微链 (tem) 图像, 显示足部过程, 基底膜, 和典型的正常肾小球结构的过滤内皮。酒吧等于500纳米。(d) 硫酸丙胺后, 足部过程拉长或脱落 (箭头), 这表明足部损伤。(e) 硫酸丙胺治疗后, 用于肾素显示的西方印迹肾素含量下降。(f) 显示了西部印迹的吸积加载控制。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4.离体肾小球细胞活力的评估.对裂解的 caspase-3 (绿色) 进行了共聚焦免疫荧光显微镜检查。为了方便地定位肾小球, 进行了肾素共染色。虽然在肾小球分离后, 在0和1小时时没有裂解的 caspase-3 阳性, 但在2小时时, 在几个细胞中发现荧光信号, 在分离后更多的细胞在被检查后逐渐变得阳性。在24小时和48小时时, 注意到的 caspase-3 阳性细胞最多,请点击这里查看这个数字的更大版本.
Discussion
这是一种利用廉价、可重复使用的简单协议从大鼠肾脏中回收肾小球的有效方法。与所有程序一样, 其效用也有局限性。首先, 虽然我们获得了 & gt; 95% 的纯度, 但由于该协议的筛分性质和起始材料, 不可能排除所有的污染物, 并且培养中会出现一些红血球和偶尔的管状片段。我们预计这些小污染物不会成为绝大多数应用的问题。其次, 筛分协议依赖于大鼠肾脏的使用, 在大鼠肾脏中, 肾小球比小鼠大得多。如果需要小鼠肾小球, 则公布了一种使用商业磁珠 (如dynabeads) 的技术。第三, 已经证明, 特定的 mrna (纤溶酶原激活物抑制剂-1 和胶原蛋白 i) 在孤立的肾小球几乎完全来自鲍曼的胶囊, 而不是子叶内细胞 23.如果试图从这些肾小球中分离 mrna, 这可能会导致不恰当的结论。需要注意的是, 在我们手中, 大多数肾小球都被去封, 因此应该缺乏鲍曼胶囊的重大贡献。第四, 在培养条件下, 细胞死亡开始相对较快发生。
我们发现, 从2小时开始, 被裂解的虾-3 的出现就证明了凋亡程序。这与以前的报告总体上一致, 这些报告显示, 通过 dna 分裂、tunel 和组织学分析评估的细胞凋亡在隔离 24后的1-2小时内开始发生。然而, 也应该指出的是, 早期的观察表明, 代谢活性可以检测到孤立的筛肾小球时, 培养至少 3小时, 这表明相当的细胞活力在这个时候 16。然而, 根据这些结果, 我们认为, 谨慎的做法是在预定的实验中立即利用孤立的肾小球, 以取得最佳结果。我们建议所有实验都在72小时之前进行, 因为我们已经观察到, 整个肾小球结构开始恶化超过该时间点。
从4-8 个肾脏开始时, 获得更高的收益率要容易得多, 而不是只有 2个, 因为一定数量的肾小球由于粘附在各种筛子上而丢失, 但一旦筛子被最大地涂层, 就不会有额外的损失。出于同样的原因, 重要的是先将筛子浸泡在 bsa/pbs 缓冲液中, 因为肾小球更有可能粘附在干燥的筛子上, 并限制组织暴露在筛子的一个边缘。我们建议从不少于6个肾脏 (3只老鼠) 开始, 以获得合理的产量。
一些研究人员从孤立的肾小球中分离出原代多培养物, 而这些肾小球往往在17培养过程中从肾小球中生长出来。我们已经注意到, 一些孤立的肾小球会粘附在培养皿塑料上, 细胞会在后期 (隔离后 72小时) 开始从肾小球结构中迁移出来。对这些细胞的研究超出了这一隔离协议的范围, 对于这些细胞是足细胞、顶叶上皮细胞, 还是两者兼而有之, 都存在一些争议.值得注意的是, mundel等人报告说, 在特定的培养条件下, 从筛肾小球中提取的鹅卵石细胞可能会被诱导分化为成熟的足细胞26。关于细胞身份的一些混淆可能取决于分离的肾小球是否被封装 (包括由顶叶上皮细胞填充的鲍曼胶囊) 或在筛分过程中脱脂。在我们的手中, 使用180、90和75μm 的连续筛子尺寸导致大多数肾小球被分离。
大多数形式的蛋白尿慢性肾病是由于肾小球通透性的增加。一些作者在体外通透性实验中使用了孤立的肾小球。在一种方法中, 利用改变周围介质渗透含量后肾小球体积的变化来估计渗透率27。最近, 人们证实, 荧光探针从孤立的肾小球中泄漏可以量化来测量渗透性, 并可在暴露于肾小球疾病实验模型28的啮齿类动物中进行。
我们已经注意到, 在 tem 的制备过程中, 我们有时会看到足部过程从基底膜上抬起。我们不觉得这种情况发生在文化中, 更有可能是 tem 样品制备过程中的产物。值得注意的是, 即使发生这种情况, 脚部过程看起来是 "正常" 还是被抹去是显而易见的。
总体而言, 该协议提供了一种方法, 通过该方法可以评估肿瘤和细胞在损伤反应中的变化。我们预计, 它可以作为一种伴随技术, 孤立的足细胞培养, 特别是当与细胞外基质或其他本地细胞类型的相互作用正在考虑。它为增进对蛋白质尿 ckd 的了解提供了希望, 这将提高为这种使人衰弱的疾病开发未来疗法的能力。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了美国心脏协会16990086、nih p30 dk079307、美国肾脏病学会 gottschalk 奖、匹兹堡大学医学中心竞争性医学研究基金奖和匹兹堡大学颁发的奖项医师学术基金会奖。我们感谢 gerard apadaca 为组织学分析提供的肾小球保存技术建议, 感谢 mara sullivan 和 ming sun 对电子显微镜的帮助, 并感谢李英健和刘友华在本协议中的技术投入。我们还感谢 cynthia st. hilaire 的 cd31 抗体。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions, Chemicals, and Animals | |||
| Sprague-Dawley Rats | Envigo | 207M | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1605100 | |
| Hank's Balanced Salt Solution with Ca2+ and Mg2+ | Thermo | 14025092 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline | VWR | 97063-660 | |
| Protamine sulfate | MP Bio | ICN15197105 | |
| Karnovsky's Fixative | |||
| Gelatin | |||
| Paraformaldehyde | EMD | EM-PX0055-3 | |
| O.C.T. | Scigen | 23730571 | |
| RIPA Buffer | |||
| Halt Protease Inhibitors | Thermo | PI78442 | |
| Nephrin Antibody | Fitzgerald | 2OR-NP002 | |
| WT-1 Antibody | Abcam | ab89901-10ul | |
| PDGFR-β Antibody | Cell Signaling | #3169S | |
| CD31 Antibody | LSBio | LS-C348736 | |
| Cleaved caspase-3 antibody | Cell Signaling | 9661S | |
| Poly/Bed 812 (Luft) epoxy | Polysciences | 08792-1 | |
| Equipment | |||
| Carbon dioxide chamber | |||
| Conical tubes, 15 mL | |||
| Conical tubes, 50 mL | |||
| Surgical scissors | |||
| Surgical forceps | |||
| Sterile gauze | |||
| Petri dishes, 100 mm | |||
| Scalpels | |||
| Razor blades | |||
| Sterile filter apparatus | |||
| Sieve Pan | Alfa Aesar | AA39999ON | |
| 180um Sieve | Alfa Aesar | AA39996ON | |
| 90um Sieve | Alfa Aesar | AA39990ON | |
| 75um Sieve | Alfa Aesar | AA39991ON | |
| 10 mL syringes | |||
| 600 mL beakers | |||
| Cell culture incubator | |||
| Picofuge | |||
| Vortex | |||
| Tissue Homogenizers | Fisher Scientific | 50550226 | |
| 20 G needles | |||
| Leica Reichart Ultracut | ultramicrotome |
References
- Grahammer, F., Schell, C., Huber, T. B. Molecular understanding of the slit diaphragm. Pediatric Nephrology. 28 (10), 1957-1962 (2013).
- Tan, R. J., Zhou, L., Zhou, D., Lin, L., Liu, Y. Endothelin receptor a blockade is an ineffective treatment for adriamycin nephropathy. PLoS One. 8 (11), 79963 (2013).
- Wagner, N., Wagner, K. D., Xing, Y., Scholz, H., Schedl, A. The major podocyte protein nephrin is transcriptionally activated by the Wilms' tumor suppressor WT1. Journal of the American Society of Nephrology. 15 (12), 3044-3051 (2004).
- Rogacka, D., et al. Insulin increases filtration barrier permeability via TRPC6-dependent activation of PKGIalpha signaling pathways. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (6), 1312-1325 (2017).
- Mundel, P., et al. Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines. Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).
- Moller, C. C., et al. Induction of TRPC6 channel in acquired forms of proteinuric kidney disease. Journal of the American Society of Nephrology. 18 (1), 29-36 (2007).
- Tian, D., et al. Antagonistic regulation of actin dynamics and cell motility by TRPC5 and TRPC6 channels. Science Signaling. 3 (145), 77 (2010).
- Shankland, S. J., Pippin, J. W., Reiser, J., Mundel, P. Podocytes in culture: past, present, and future. Kidney Internationalernational. 72 (1), 26-36 (2007).
- Cook, W. F., Pickering, G. W. A rapid method for separating glomeruli from rabbit kidney. Nature. 182 (4642), 1103-1104 (1958).
- Misra, R. P. Isolation of glomeruli from mammalian kidneys by graded sieving. American Journal of Clinical Pathology. 58 (2), 135-139 (1972).
- Burlington, H., Cronkite, E. P. Characteristics of cell cultures derived from renal glomeruli. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 142 (1), 143-149 (1973).
- Harper, P. A., Robinson, J. M., Hoover, R. L., Wright, T. C., Karnovsky, M. J. Improved methods for culturing rat glomerular cells. Kidney International. 26 (6), 875-880 (1984).
- Kreisberg, J. I., Hoover, R. L., Karnovsky, M. J. Isolation and characterization of rat glomerular epithelial cells in vitro. Kidney International. 14 (1), 21-30 (1978).
- Weinstein, T., Cameron, R., Katz, A., Silverman, M. Rat glomerular epithelial cells in culture express characteristics of parietal, not visceral, epithelium. Journal of the American Society of Nephrology. 3 (6), 1279-1287 (1992).
- Yaoita, E., Kurihara, H., Sakai, T., Ohshiro, K., Yamamoto, T. Phenotypic modulation of parietal epithelial cells of Bowman's capsule in culture. Cell and Tissue Research. 304 (3), 339-349 (2001).
- Meezan, E., Brendel, K., Ulreich, J., Carlson, E. C. Properties of a pure metabolically active glomerular preparation from rat kidneys. I. Isolation. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 187 (2), 332-341 (1973).
- Piwkowska, A., et al. Insulin increases glomerular filtration barrier permeability through PKGIalpha-dependent mobilization of BKCa channels in cultured rat podocytes. Biochimica et Biophysica Acta. 1852 (8), 1599-1609 (2015).
- Kotyk, T., et al. Measurement of glomerulus diameter and Bowman's space width of renal albino rats. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 126, 143-153 (2016).
- Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Exp Ther Med. 5 (5), 1322-1326 (2013).
- Leeuwis, J. W., Nguyen, T. Q., Dendooven, A., Kok, R. J., Goldschmeding, R. Targeting podocyte-associated diseases. Advanced Drug Delivery Reviews. 62 (14), 1325-1336 (2010).
- Subramanian, B., et al. Mice with mutant Inf2 show impaired podocyte and slit diaphragm integrity in response to protamine-induced kidney injury. Kidney International. 90 (2), 363-372 (2016).
- Takemoto, M., et al. A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice. American Journal of Pathology. 161 (3), 799-805 (2002).
- Steinmetz, O. M., et al. A pitfall of glomerular sieving: profibrotic and matrix proteins derive from the Bowman's capsule and not the glomerular tuft in rats with renovascular hypertension. Nephrology Dialysis Transplantation. 22 (10), 3055-3060 (2007).
- Ishikawa, Y., Kitamura, M. Spontaneous apoptosis of podocytes in explanted glomeruli. Technical note. Kidney International. 54 (6), 2008-2013 (1998).
- Krtil, J., Platenik, J., Kazderova, M., Tesar, V., Zima, T. Culture methods of glomerular podocytes. Kidney and Blood Pressure Research. 30 (3), 162-174 (2007).
- Mundel, P., Reiser, J., Kriz, W. Induction of differentiation in cultured rat and human podocytes. Journal of the American Society of Nephrology. 8 (5), 697-705 (1997).
- McCarthy, E. T., et al. TNF-alpha increases albumin permeability of isolated rat glomeruli through the generation of superoxide. Journal of the American Society of Nephrology. 9 (3), 433-438 (1998).
- Desideri, S., et al. A novel assay provides sensitive measurement of physiologically relevant changes in albumin permeability in isolated human and rodent glomeruli. Kidney International. 93 (5), 1086-1097 (2018).
