Summary
Hovedfokus i denne protokol er effektivt isolere levedygtige primære glomeruli kulturer med minimal forurenende stoffer til brug i en lang række downstream applikationer. Isolerede glomeruli bevarer strukturelle relationer mellem komponent celletyper og kan være kulturperler ex vivo for kort tid.
Abstract
Bevarelse af glomerulær struktur og funktion er omdrejningspunktet for en kategori af nyresygdom karakteriseret ved proteinuri, som kan i sidste ende føre til kronisk og slutstadiet nyresygdom, forebyggelse af glomerulonephritis. Glomerulus er en kompleks apparater ansvarlig for filtrering af plasma fra kroppen. I sygdom, strukturelle integritet er tabt og giver mulighed for unormal udsivning af plasma indholdet i urinen. En metode til at isolere og undersøge glomeruli i kultur er afgørende for studiet af disse sygdomme. I denne protokol, er en effektiv metode til hentning af intakt glomeruli fra voksen rotte nyrerne samtidig bevare strukturelle og morfologiske karakteristika beskrevet. Denne proces er i stand til at generere høje udbytter af glomeruli pr. nyre med minimal forurening fra andre segmenter, nephron. Med disse glomeruli kan skade betingelser efterlignes af inkubere dem med en bred vifte af kemiske giftstoffer, herunder protamine-sulfat, der forårsager foden proces effacement og proteinuri i dyremodeller. Graden af skade kan vurderes ved hjælp af transmissions elektronmikroskopi, immunofluorescens farvning og western blotting. Nephrin og Wilms Tumor 1 (WT1) niveauer kan også vurderes ud fra disse kulturer. På grund af den lethed og fleksibilitet i denne protokol, kan de isolerede glomeruli udnyttes som beskrevet eller på en måde, der bedst passer til behovene hos forskeren til at hjælpe bedre undersøgelse glomerulær sundhed og struktur i syge stater.
Introduction
Glomerulus er en højt specialiseret TOT af kapillærer ansvarlig for filtrering af cirkulerende plasma. Det danner begyndelsen af nephron, som er den grundlæggende funktionelle enhed i nyrerne. Glomerulær funktion er defineret af et entydigt fenestrated kapillære endothelium, slids mellemgulvet af podocytes og en mellemliggende basalmembranen. Disse lag danner en semipermeable barriere at muliggør selektiv udskillelsen af stoffer til filtratet. Vand, ioner og andre små molekyler generelt passerer igennem, mens større molekyler er bevaret i plasma. Podocytes er specialiserede epitelceller, der breder sig over basalmembranen, omgivende kapillærer med cytoplasmatisk fremskrivninger kendt som foden processer. Foden processer af tilstødende podocytes interdigitate og er gennemskåret af slids membraner består af proteiner som nephrin, podocin, P-cadherin og ZO-11. I tværsnit, disse mund processer er jævnt arrangeret over basalmembranen. I syge glomeruli bliver foden processer groft unormal eller "udviskes," fører til unormal lækage af plasma indholdet i filtratet. Som sådan er glomerulær skade generelt kendetegnet ved tilstedeværelsen af unormalt store mængder af protein (fx proteinuri) og/eller røde blodlegemer (fx hæmaturi) i urinen. Tilskadekomne podocytes mister desuden udtryk nephrin såvel som dens regulator Wilms Tumor 1 (WT1), en vigtig protein ansvarlig for vedligeholdelse af differentiering2,3. Glomeruli er et primært mål for skader i diabetisk nefropati og andre glomerulonephritides som minimal ændring sygdom, hindeagtige nefropati og fokale segmental glomerulosclerosis. Disse sygdomme er store årsager til gradvis nyresvigt og udviklingen af slutstadiet nyresygdom, en tilstand, hvor overlevelse er afhængig af dialyse eller renal transplantation. Det er derfor vigtigt at studere glomeruli for bedre at forstå kronisk nyre sygdom (Cementovnstøv) patologi.
En celle kultur system er afgørende for at studere glomerulær biologi. På grund af sin centrale rolle i at generere slids mellemgulvet, samt eksistensen af specifikke proteinuric sygdomme som følge af slids mellemgulvet protein mutationer, har megen forskning forståeligt nok udnyttet podocyte i isolation. Dette har ført til generation af primær podocyte cellelinjer til at udnytte i vitro. Disse celler kan være kulturperler under en række betingelser og kan endda dyrkes på gennemtrængelig understøtter at vurdere permeabilitet4. Men isolationen af prolifererende celler ofte vælger dedifferentiated celler, der har mistet noget af deres podocyte markører. Dette har ført til generation af betinget udødeliggjort podocytes stammer fra en Transgene mus stamme bærer et temperatur-følsomme mutant af SV40 store T genet (f.eks. immortomouse), der kunne dyrkes i kultur, men også være differentieret for at udtrykke en komplet vifte af podocyte markører5. Disse metoder til primære kultur har været afgørende i forståelsen podocyte biologi4,6,7.
Ikke desto mindre kulturer der indeholder enkelt celletyper mangler de intercellulære relationer, der opstår i vivo samt den støttestruktur og matricer, og encellelag af disse celler nødvendigvis sammenfatte ikke det tredimensionale arkitektur af glomeruli. Udødeliggjort podocytes kan også være besværlige og udfordrende at kultur8, og kræver besiddelse af enten en immortomouse eller en start alikvot af celler fra etableret efterforskerne at komme i gang. Yderligere, glomerulus består af ikke blot podocytes, men også kapillære endothelceller den basalmembranen, samt og mesangial celler, som yder støtte til struktur. Det er derfor nyttigt at udvikle en ex vivo tilgang anvendelig til alle efterforskere for studiet af intakt glomeruli, der bevarer deres oprindelige arkitektur samt alle de celler, der udgør den normale glomerulus.
I 1958 beskrevet Cook og Pickering den første isolation af glomeruli fra kanin nyre. Efter iagttagelser at fedt emboli blev indgivet i glomeruli, postuleret de, at partikler af samme størrelse kan bruges til at specifikt isolere disse strukturer. Faktisk, infusion af jernoxid partikler ind i nyren førte til fangst af disse partikler i glomeruli. Efter mekanisk dissociation og sigtning af nyrerne, kunne glomeruli være isolerede intakt og med renhed ved hjælp af magnetisk separation9. I 1971 viste Misra, at jernoxid infusioner kan udelades, og glomerulær isolation opnåede med sigtning af hakket human, hund, kanin eller rotte nyre væv10. Denne teknik er blevet ændret siden derefter afhængigt af målet for efterforskerne men har hovedsagelig resulterede i renset præparater der kunne undersøges yderligere eller hvorfra primære cellekulturer kunne være etableret11,12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17.
Her beskriver vi en protokol til isolering af intakt levedygtige glomeruli fra rotte nyre. Hele protokollen tager kun et par timer. Selv om de ikke formere sig, kan eksperimentelle planer af enhver størrelse understøttes ved blot at øge antallet af nyrerne som udgangspunkt materiale. Mens der er publicerede protokoller for magnetisk bead adskillelse af glomeruli, de kræver en intravenøs injektion af perler, er dyrere, og kan ændre biologi da perlerne bevares enten ved glomeruli i kultur eller kræve glomerulær" Lysing"og fjernelse af centrifugering19. Sammenlignet med musen glomeruli, gør den større størrelse af rotte glomeruli (næsten 100 µm i to måneder gamle rotter18) det meget lettere at adskille dem fra andre nyre strukturer ved hjælp af en simpel sieving teknik.
Som bevis for deres nytte, har vi kendetegnet glomeruli for at demonstrere de forskellige celletyper. De kan også blive udsat for agenser, der vides at skade glomeruli in vivo og vi påvise de negative virkninger af protamine sulfat (PS) på disse kulturer. PS er en polycation, der neutraliserer de anioniske steder langs glomerulær kapillar væggen20. Denne neutralisering har en dramatisk effekt på glomerulær filtration barriere og derfor øger proteinuri og mund proces effacement. Disse glomeruli kan vurderes med immunoblots for vigtige proteiner som nephrin og WT1 at vurdere generelle sundhed. Desuden kan deres struktur evalueres med lys, immunofluorescens og elektronmikroskopi.
Samlet set er denne protokol tilgængelig for de fleste efterforskere (man behøver blot adgang til dyrene og nogle enkle udstyr). Med morfologiske træk tilbage ubeskadiget, forskeren er i stand til at analysere glomeruli og se hvordan andre vigtige celletyper og matrix bevarelse i glomeruli påvirke funktion og sygdom progression, en mangel ved podocyte kulturer.
Protocol
Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) på University of Pittsburgh.
1. isolering af rotte Glomeruli
- For at forberede en steril 1% isolation buffer, tilsaettes 5 g bovint serumalbumin (BSA) til et 600 mL bægerglas.
- Tilsættes 500 mL 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS) til bægerglasset og rør med en magnetisk omrøring stang indtil alle BSA er opløst.
- Sterile filter 1% BSA/PBS buffer i en celle kultur hætte.
Bemærk: Den sterile 1% BSA/PBS buffer kan opbevares ved 4 ° C i op til en uge.
- Få 2 til 4 Sprague-Dawley rotter vejer 150 til 200 g hver.
- Aflive rotter via CO2-indånding ved hjælp af et kammer, hvor 100% kuldioxid er indført med en hastighed på 10-30% af salen volumen pr. minut. Observere dyr for ophør af respiration, og falmet øjenfarve før fjernelse fra kuldioxid.
- Forbereder huden over den forreste del af maven med 70% ethanol og udnytte hårklippemaskiner for at fjerne hår, hvis det ønskes. Gøre en midterlinjen snit i huden ved hjælp af kirurgiske saks eller skalpel. Gøre en anden midterlinjen snit gennem muskel lag at eksponere indre organer. Udvide snit overlegent gennem mellemgulvet og brystbenet eller rib bur som en sekundær metode af aktiv dødshjælp.
- Isolere og fjerne begge nyrer og anbringes i en steril 50 mL konisk plastikrør med 30 mL af Hanks' salt bufferopløsning (HBSS) på is.
Bemærk: Flere rotter kan aflives i den samme afdeling og alle nyrerne kan placeres i den samme koniske rør.
- Holde nyrer på is og transport til en steril celle kultur hætte. Overføre nyrerne til en steril petriskål der indeholder 5 mL af HBSS, også over isen, og fjerne og kassere perirenal fedt med saks og skarpe pincet. Hvis den stadig findes, også fjerne og kassere kapsel omgiver nyren ved at lave en lille overfladisk snit og derefter bruge skarpe pincet til at trække det forsigtigt fra orglet.
Bemærk: Hold altid nyre isolater på is og praksis steril teknik i hele. Et stykke af steril gaze kan placeres i petriskålen som en tekstureret overflade at holde nyre på plads under manipulation.- Skær nyrerne i halve på langs (anslagsfladen afsnit) og fjern og kassér medulla (som er mørkere i farve) med en skalpel i en anden petriskål med 5 mL af HBSS.
- Overføre de resterende stykker, som er overvejende nyre cortex, ind i en tredje petriskål med 5 mL af HBSS og hakkekød med en steril barberblad indtil stykker er mindre end 1 mm i størrelse, eller en pasta er dannet.
- Våd i toppen og bunden af en 180 µm sigte med 1% BSA/PBS over en 500 mL affald bægerglas. Dette trin er kritisk, da det frakker sigte med protein og reducerer overholdelse af glomeruli, som vil forbedre udbyttet.
- Sted hakket cortex på en lille kant af sien og bruge tekstureret stemplet flange (side overfor gummipakning) i et 10 mL sprøjte til grød vævet gennem sien ned i en bund gryde sidder på is. Skyl jævnligt med HBSS men bruge så lidt som muligt at undgå prøveopløsning.
Bemærk: Ikke overstige 30 mL buffer alt, så kun 25 mL mere kan bruges her. Årsagen til markedsfoering kun én kant om sigten hakket væv er at reducere overholdelse af glomeruli ved at begrænse eksponering for del af sien snarere end hele si areal.- For at lette dette, genbruge væske indsamler i bunden pan til skylning af sien. Når sigtning er færdig, omhyggeligt vaske bunden af sien endnu en gang med 1% BSA/PBS buffer fra bunden af gryden til at fange eventuelle glomeruli, der løst kan overholdes.
- Saml alle væske i bunden pan i flere 10 mL sprøjter udstyret med 20 G nåle og passerer det gennem nålen mindst 2 ekstra gange. På den sidste samling, holde den glomeruli-holdige væske i sprøjten indtil klar til passerer 90 µm sigte.
- Mens væsken er gemt i sprøjter, vaske bunden pan ved gennemskylning med 1% BSA/PBS i affald bægerglas og våd toppen og bunden af en 90 µm sigte med 1% BSA/PBS. Sigten på toppen af den nederste gryde på is.
- Anvende prøven i sprøjter til kanten af sien og grød gennem sien ned med en anden sprøjte flange, som beskrives ovenfor. Vask med løsning fra bunden panden til at indsamle alt på kanten af sien.
- Når sigtning er færdig, vaske omhyggeligt bunden af sien i trin 1.5.1. Indsamle alle væske i bunden pan i en 50 mL konisk plastikrør.
- Vaske bunden pan med 1% BSA/PBS til en affald bægerglas og våd toppen og bunden af en 75 µm sigte med 1% BSA/PBS. Sigten på toppen af den nederste gryde på is.
- Anvende prøven til kanten af sien. Væske skal flyde gennem let. Skyl gennem top med mindst 20 mL af 1% BSA/PBS i affald bægerglas. Forsigtigt vaske bunden af i sigten. Glomeruli vil forblive på toppen af denne 75 µm sigte.
- Brug HBSS til at indsamle glomeruli i en petriskål ved at skylle gennem sien hovedet. Brug så meget HBSS efter behov her. Indsamle i en eller flere 50 mL plastik konisk røret på is.
- Der centrifugeres ved 1800 x g i 5 min. ved 4 ° C og Fjern supernatanten omhyggeligt med en pipette resuspend pellet i 10 mL af kolde HBSS. Kombinere prøverne, hvis flere koniske rør blev indsamlet i 1.7.2. Gentag trinnet centrifugering.
- Resuspend glomeruli i 5 mL af HBSS indtil klar til at gå videre til næste trin.
- Hvis det ønskes, tage en tælle i de samlede glomeruli. For dette, tage en 10 µL prøve med en pipette og placere drop på et glas dias. Se under et mikroskop, tælle glomeruli i feltet og ganger med 500 at få samlede udbytte.
BEMÆRKNING: Renheden kan bestemmes ved at tælle antallet af tubuli set i feltet og dividere med antallet af glomeruli og tubulus strukturer. Der skal være > 95% glomeruli i synsfeltet.- Hvis der er betydelig rørformede forurening, Gentag trin 1.6.1 videre, og sørg for at vaske grundigt når at fuldføre trin 1.7.1. Dette er skridt i hvilke rørformede forurening er mest tilbøjelige til at forekomme.
2. skade af Glomeruli
- Indsamle glomeruli i en 15 mL plastik koniske rør og spin ned på 200 x g. Resuspend i en passende mængde af HBSS baseret på det samlede udbytte, således at der er cirka 9.000 glomeruli pr. brønd. Der afpipetteres 450 µL af prøven i hver brønd med en 24-godt plade, eller nogen plade-format, der passer til de downstream assays kræves.
Bemærk: Pipettering op og ned for at blande glomeruli i buffer sikrer en ensartet løsning. Glomeruli vil er meget klæbrige og tunge holde sig til hinanden samt og bosætte sig i bunden af en løsning hurtigt og på siderne af røret. - For at gøre 6 mg/mL protamine sulfat (PS) løsning, først opløse 1 g af PS i 10 mL af dH2O opvarmes til 40 ° C i en 15 mL plastik koniske rør og vortex grundigt. Tage 30 µL af opløsningen og tilføje til 470 µL af dH2O.
Bemærk: Dette vil producere en 6 mg/mL opløsning, og når 50 µL føjes til brønden, som beskrevet nedenfor, den endelige koncentration er 0,6 mg/mL.- I to eksemplarer, tilsæt 50 µL af protamine sulfat (dette er en 1:10 fortynding) til hvert hul i en gruppe, mens levere en anden gruppe 50 µL HBSS (negativ kontrol).
- Inkuber plade i 4 timer ved 37 ° C.
- Spin ned indholdet af hver brønd i et microcentrifuge rør (4000 x g, 4 ° C, 10-15 s) og vaskes to gange med 1 mL PBS hver.
- Opsug off de sidste vask og resuspend i 300 µL af PBS. Opdelt i tre delprøver skal forberedes til protein isolation, transmissions-elektronmikroskop (TEM) visualisering og immunfluorescens farvning (hvis).
3. forberedelse Glomeruli for analyse
- Spin ned indholdet af de tre delprøver (4000 x g, 4 ° C, 10-15 s) og aspirat off resterende buffer og gå videre til analysen af TEM, hvis, eller protein isolation.
- Behandling for TEM
- Fix glomerulær pellets i 150 µL koldt 2,5% glutaraldehyd i 0,01 M PBS. Fjerne fiksativ omhyggeligt fra pellet ved hjælp af Pasteurs pipette, og sørg for ikke at forstyrre pelleten, og derefter skylles den med PBS og post løse det i 1% osmium dinitrogentetraoxid med 1% kalium Ferricyanid.
- Dehydrere prøven gennem en gradueret serie af ethanol (30, 50, 70, 90, 100, 100, 100%) og propylenoxid derefter integrere i epoxy indlejring materiale.
- Skære semi-tynd (300 nm) sektioner på en ultramicrotome. Pletten med 0,5% toluidin blå i 1% natriumborat og undersøge dem under den lysmikroskop.
- Skær ultratynde sektioner (65 nm), bejdse dem med uranyl acetat og Reynolds bly citrat og undersøge på et transmissions-elektronmikroskop.
- Behandling for hvis
- Tilsæt 150 µL af en 12% gelatine i PBS løsning og umiddelbart sted på tøris til at danne en pellet. Sættetid pellet i 500 µL af 2% PARAFORMALDEHYD/1 x PBS i et microcentrifuge rør natten over ved 4 ° C.
- Placere pelleten i en base mug og integrere ved at tilføje optimal opskæring temperatur (OCT) medium tøris. Skær 5-10 µm sektioner på en cryotome og gå videre med immunofluorescens/Immunhistokemi eller standard histologiske pletter.
- For Protein Isolation
- Tilføj 150 µL af RIPA buffer til centrifugeret glomerulær pellet med 1,5 µL af protease hæmmer og dounce med væv homogenizers.
- Fortsæt til protein kvantificering og immunoblotting eller andre proteinanalyse.
Representative Results
Protokol fra tid af aktiv dødshjælp til isolation af glomeruli kan være afsluttet i så lidt som 2 h og har en høj produktivitet og effektivitet. Med korrekt udnyttelse af teknikken, udbyttet af glomeruli pr. rotte nyre spænder fra 6.000-10.000 glomeruli når du starter med 8 nyrerne. Den endelige suspension er tæt pakket med glomeruli og har en samlet renhed > 95%, viser minimal forurening fra rørformede segmenter eller andre celletyper (figur 1A, B). Derudover kan OCT-embedded glomeruli farves med hæmatoxylin og Eosin (H & E) pletter at se morfologi (figur 1C). Disse glomeruli opretholde deres struktur i hele den hele protokol, selv efter behandling. Vi demonstrere, at isolerede glomeruli besidder intakt og levedygtig podocytes (figur 2A), mesangial celler (figur 2B) og endotelceller (figur 2C).
Når isoleret, kan glomeruli blive udsat for velkendte kemiske skader at simulere i vivo patologi. I dette tilfælde blev protamine sulfat (PS) valgt for sin evne til at forstyrre anklagen om glomerulær filtration barriere, som i sidste ende fører til fods proces effacement. PS-behandlede glomeruli har en slående reduktion i nephrin (rød) og et antal kerner positiv for WT1 (grøn) via immunofluorescens (fig. 3A, B). Glomeruli kan også være forberedt på transmissions Elektron Mikroskopi (figur 3C). Kontrolprøver har normal podocyte morfologi og fod processer PS-behandlede glomeruli have foden proces effacement (figur 3D), som er et tegn på podocyte dysfunktion og ses i i vivo modeller bruger PS21. Dette svarede også til et fald i nephrin opdaget af immunoblotting (figur 3E, F).
For at bestemme levedygtighed, blev kløvet caspase-3 vurderet som markør af apoptose. Bruger immunofluorescens, vises kløvet caspase-3 først i et par celler begynder 2 h efter isolation (figur 4). Antallet af celler, der udtrykker denne protease blev mere rigeligt over tid, med de højeste niveauer set på 24 og 48 timer. Dette tyder på, at apoptose forekommer relativt tidligt i kultur og at downstream programmer bør udføres snarest efter isolation for de bedste resultater.
Figur 1 . Typisk udseende af rotte glomerulær kulturer efter isolation. (A) Brightfield billede af glomerulær kultur. Selv om vi vælger et felt, hvor der er en enkelt renale tubuli i denne Mikrograf (pilespids), er kulturer opnås generelt > 95% ren. Skalalinjen er lig med 100 µm. (B) forstørret billede af et enkelt glomerulus. (C) hæmatoxylin og eosin pletten af en enkelt glomerulus. Skala barer i B og C være lig 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Konstituerende celletyper er bevaret i isolerede glomeruli. Konfokal immunofluorescens mikroskopi blev udført for nephrin (rød, podocytes) og celle-specifikke markører til at identificere podocytes, mesangial celler og endotelet. (A) Costain til nephrin og WT1 (grønne, podocytes). (B) Costain for nephrin og PDGFR-β (grøn, mesangial celler, pil). (C) Costain for nephrin og CD31 (grønne, endothelial celler, fartøjer i tværsnit præget af pilespidser). Skalalinjen = 25 µm på alle paneler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Podocyte skade kan være induceret in vitro- ved hjælp af isolerede rotte glomeruli. (A) Konfokal immunofluorescens mikroskopi for nephrin og WT1 i en ubehandlet glomerulær kultur. Bemærk den lineære nephrin farvning (rød) og tilstedeværelsen af WT1-positive kerner (grøn), som er typisk ses når der er sund podocytes. (B) efter protamine sulfat behandling, nephrin udtryk er nedsat og ikke-lineære, og WT1 er fraværende, der angiver podocyte skade. (C) transmissions elektron microscpy (TEM) billede viser mund processer, basalmembran og et fenestrated endotelet typiske for normale glomerulær struktur. Bar er lig med 500 nm. (D) efter protamine sulfat, foden processer er aflange eller udviskes (pilespidser), som angiver podocyte skade. (E) vestlige skamplet for nephrin viser faldt nephrin efter protamine sulfat behandling. (F) Actin lastning kontrol for vestlige skamplet er vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Vurdering af cellernes levedygtighed i isolerede glomeruli. Konfokal immunofluorescens mikroskopi for kløvet caspase-3 (grøn) blev udført. En nephrin Co plet blev udført for at nemt finde glomeruli. Mens der var ingen kløvet caspase-3 positivitet på 0 og 1 h efter isolering af glomeruli, blev fluorescens signal i et par celler bemærket på 2 h. gradvist flere celler viste positiv længere efter isolering de blev undersøgt. Det største antal caspase-3 positive celler blev noteret på 24 og 48 h. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Dette er en effektiv metode til at inddrive glomeruli fra rotte nyre bruger billig, genanvendelige udstyr med en enkel protokol. Som med alle procedurer, er der begrænsninger for sin nytte. Først, selv om vi får > 95% renhed, på grund af sieving arten af protokollen og råvaren er det umuligt at udelukke alle forurenende stoffer, og et par røde blodlegemer og den lejlighedsvise rørformede segment vil være til stede i kulturen. Vi forventer ikke disse små forurenende stoffer for at være et problem for det store flertal af programmer. For det andet bygger den sieving protokol på brugen af rotte nyrer, hvor glomeruli er meget større end i mus. Hvis musen glomeruli er nødvendigt, har en teknik, ved hjælp af kommercielle magnetiske perler (f.eks.Dynabeads) været offentliggjort22. For det tredje har det vist at specifikke mRNAs (plasminogen aktivator inhibitor-1 og kollagen jeg) i isolerede glomeruli stammer næsten udelukkende fra Bowman's kapsel i stedet for intraglomerular celler23. Dette kan føre til uhensigtsmæssige konklusioner, hvis mRNA isolation er forsøgt fra disse glomeruli. Det skal bemærkes, at størstedelen af glomeruli i vores hænder er decapsulated og bør derfor mangler væsentlige bidrag fra Bowmans kapsler. For det fjerde begynder celledød at optræde relativt hurtigt under kultur.
Vi fandt, at den apoptotiske program, som det fremgår af udseendet af kløvet caspase-3, blev aktiveret, startende fra 2 h af kultur. Generelt er aftale med tidligere betænkninger viser, at apoptose, som vurderet af DNA fragmentering, TUNEL og histologiske analyse, begynder at forekomme inden for 1-2 h efter isolation24. Det skal dog også bemærkes, at tidlige observationer viste, at metaboliske aktivitet kunne påvises fra isolerede sigtede glomeruli når kulturperler i mindst 3 timer, hvilket tyder på stor cellulære levedygtighed på dette tidspunkt16. Ikke desto mindre mener baseret på resultaterne, vi, at det ville være klogt at udnytte isolerede glomeruli straks i tilsigtede eksperimenter for de bedste resultater. Vi anbefaler, at alle eksperimenter skal udføres før 72 h, som vi har bemærket, at hele glomerulær struktur begynder at forringes efter dette tidspunkt.
Det er meget nemmere at opnå højere udbytter, når du starter med 4-8 nyrerne i stedet for kun 2, fordi en række glomeruli er tabt på grund af overholdelse af de forskellige sigter, men når sigterne belægges maksimalt er der ingen yderligere tab. Af samme grund er det vigtigt at suge sigterne i BSA/PBS buffer forudgående bruge som glomeruli er mere tilbøjelige til at overholde en tør si, og at begrænse væv eksponering til kanten af sien. Vi foreslår, begyndende med ikke færre end 6 nyrerne (3 rotter) at få et fornuftigt udbytte.
Nogle efterforskere har isoleret primære podocyte kulturer fra isolerede glomeruli, som har tendens til at vokse ud af glomeruli under kultur17. Vi har bemærket at nogle isolerede glomeruli vil overholde kultur parabol plast og at celler vil begynde at migrere ud af glomerulær struktur på sene timepoints (72 h efter isolation). Studiet af disse celler er uden for rammerne af denne isolation protokol, og der er en vis uenighed om, hvorvidt disse celler er podocytes, parietal epitelceller eller begge15,25. Især, Mundel et al., har rapporteret at brostensbelagte celler høstet fra sigtede glomeruli kan foranlediges til at differentiere i modne podocytes under specifikke dyrkning betingelser26. Nogle forvirring om cellen identitet kan afhænge af om isolerede glomeruli er indkapslet (herunder Bowman's kapsel, som er befolket af parietal epitelceller) eller decapsulated i den sieving procedure. I vores hænder, ved hjælp af sekventielle si størrelser af 180, 90 og 75 µm førte til størstedelen af glomeruli bliver decapsulated.
De fleste former for proteinuric kronisk nyresygdom er som følge af stigninger i glomerulær permeabilitet. Flere forfattere har udnyttet isolerede glomeruli i ex vivo permeabilitet eksperimenter. I én metode, blev ændring i glomerulær volumen efter at ændre den osmotiske indhold af de omkringliggende medier brugt til at estimere permeabilitet27. For nylig, blev det konstateret, lækage af en fluorescerende sonde fra isolerede glomeruli kunne kvantificeres for at måle permeabilitet og kunne udføres i gnavere udsat for glomerulær sygdom eksperimentelle modeller28.
Vi har bemærket, at i forberedelsesprocessen TEM vi undertiden Se podocyte fod processer lift off basalmembranen. Vi mener ikke, dette sker i kulturen og er mere sandsynligt en artefakt under TEM prøveforberedelse. Navnlig, selv når det sker, er det klart, om foden processer ser "normal" eller er udviskes.
Samlet set giver denne protokol en metode, hvormed man kan evaluere morfologiske og cellulære ændringer som reaktion på skade. Vi forventer, at det kan bruges som en følgesvend teknik til isolerede podocyte kulturer, især når interaktioner med ekstracellulære matrix eller andre indfødte celletyper er under overvejelse. Det holder løftet for at øge forståelsen af proteinuric Cementovnstøv, som ville forbedre evnen til at udvikle fremtidige therapeutics for denne invaliderende sygdom.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af American Heart Association grant FTF 16990086, NIH P30 DK079307, American Society of nefrologi Gottschalk Award, en University of Pittsburgh Medical Center konkurrencedygtige medicinsk forskning fond Award og en University of Pittsburgh Læger akademiske Foundation Award. Vi takker Gerard Apodaca for hans tekniske forslag til glomerulær bevarelse for histologiske analyse, Mara Sullivan og Ming solen for bistand med elektronmikroskopi, og Yingjian Li og Youhua Liu for deres tekniske input i denne protokol. Vi takker også Cynthia St. Hilaire for CD31 antistof.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions, Chemicals, and Animals | |||
| Sprague-Dawley Rats | Envigo | 207M | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1605100 | |
| Hank's Balanced Salt Solution with Ca2+ and Mg2+ | Thermo | 14025092 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline | VWR | 97063-660 | |
| Protamine sulfate | MP Bio | ICN15197105 | |
| Karnovsky's Fixative | |||
| Gelatin | |||
| Paraformaldehyde | EMD | EM-PX0055-3 | |
| O.C.T. | Scigen | 23730571 | |
| RIPA Buffer | |||
| Halt Protease Inhibitors | Thermo | PI78442 | |
| Nephrin Antibody | Fitzgerald | 2OR-NP002 | |
| WT-1 Antibody | Abcam | ab89901-10ul | |
| PDGFR-β Antibody | Cell Signaling | #3169S | |
| CD31 Antibody | LSBio | LS-C348736 | |
| Cleaved caspase-3 antibody | Cell Signaling | 9661S | |
| Poly/Bed 812 (Luft) epoxy | Polysciences | 08792-1 | |
| Equipment | |||
| Carbon dioxide chamber | |||
| Conical tubes, 15 mL | |||
| Conical tubes, 50 mL | |||
| Surgical scissors | |||
| Surgical forceps | |||
| Sterile gauze | |||
| Petri dishes, 100 mm | |||
| Scalpels | |||
| Razor blades | |||
| Sterile filter apparatus | |||
| Sieve Pan | Alfa Aesar | AA39999ON | |
| 180um Sieve | Alfa Aesar | AA39996ON | |
| 90um Sieve | Alfa Aesar | AA39990ON | |
| 75um Sieve | Alfa Aesar | AA39991ON | |
| 10 mL syringes | |||
| 600 mL beakers | |||
| Cell culture incubator | |||
| Picofuge | |||
| Vortex | |||
| Tissue Homogenizers | Fisher Scientific | 50550226 | |
| 20 G needles | |||
| Leica Reichart Ultracut | ultramicrotome |
References
- Grahammer, F., Schell, C., Huber, T. B. Molecular understanding of the slit diaphragm. Pediatric Nephrology. 28 (10), 1957-1962 (2013).
- Tan, R. J., Zhou, L., Zhou, D., Lin, L., Liu, Y. Endothelin receptor a blockade is an ineffective treatment for adriamycin nephropathy. PLoS One. 8 (11), 79963 (2013).
- Wagner, N., Wagner, K. D., Xing, Y., Scholz, H., Schedl, A. The major podocyte protein nephrin is transcriptionally activated by the Wilms' tumor suppressor WT1. Journal of the American Society of Nephrology. 15 (12), 3044-3051 (2004).
- Rogacka, D., et al. Insulin increases filtration barrier permeability via TRPC6-dependent activation of PKGIalpha signaling pathways. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (6), 1312-1325 (2017).
- Mundel, P., et al. Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines. Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).
- Moller, C. C., et al. Induction of TRPC6 channel in acquired forms of proteinuric kidney disease. Journal of the American Society of Nephrology. 18 (1), 29-36 (2007).
- Tian, D., et al. Antagonistic regulation of actin dynamics and cell motility by TRPC5 and TRPC6 channels. Science Signaling. 3 (145), 77 (2010).
- Shankland, S. J., Pippin, J. W., Reiser, J., Mundel, P. Podocytes in culture: past, present, and future. Kidney Internationalernational. 72 (1), 26-36 (2007).
- Cook, W. F., Pickering, G. W. A rapid method for separating glomeruli from rabbit kidney. Nature. 182 (4642), 1103-1104 (1958).
- Misra, R. P. Isolation of glomeruli from mammalian kidneys by graded sieving. American Journal of Clinical Pathology. 58 (2), 135-139 (1972).
- Burlington, H., Cronkite, E. P. Characteristics of cell cultures derived from renal glomeruli. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 142 (1), 143-149 (1973).
- Harper, P. A., Robinson, J. M., Hoover, R. L., Wright, T. C., Karnovsky, M. J. Improved methods for culturing rat glomerular cells. Kidney International. 26 (6), 875-880 (1984).
- Kreisberg, J. I., Hoover, R. L., Karnovsky, M. J. Isolation and characterization of rat glomerular epithelial cells in vitro. Kidney International. 14 (1), 21-30 (1978).
- Weinstein, T., Cameron, R., Katz, A., Silverman, M. Rat glomerular epithelial cells in culture express characteristics of parietal, not visceral, epithelium. Journal of the American Society of Nephrology. 3 (6), 1279-1287 (1992).
- Yaoita, E., Kurihara, H., Sakai, T., Ohshiro, K., Yamamoto, T. Phenotypic modulation of parietal epithelial cells of Bowman's capsule in culture. Cell and Tissue Research. 304 (3), 339-349 (2001).
- Meezan, E., Brendel, K., Ulreich, J., Carlson, E. C. Properties of a pure metabolically active glomerular preparation from rat kidneys. I. Isolation. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 187 (2), 332-341 (1973).
- Piwkowska, A., et al. Insulin increases glomerular filtration barrier permeability through PKGIalpha-dependent mobilization of BKCa channels in cultured rat podocytes. Biochimica et Biophysica Acta. 1852 (8), 1599-1609 (2015).
- Kotyk, T., et al. Measurement of glomerulus diameter and Bowman's space width of renal albino rats. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 126, 143-153 (2016).
- Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Exp Ther Med. 5 (5), 1322-1326 (2013).
- Leeuwis, J. W., Nguyen, T. Q., Dendooven, A., Kok, R. J., Goldschmeding, R. Targeting podocyte-associated diseases. Advanced Drug Delivery Reviews. 62 (14), 1325-1336 (2010).
- Subramanian, B., et al. Mice with mutant Inf2 show impaired podocyte and slit diaphragm integrity in response to protamine-induced kidney injury. Kidney International. 90 (2), 363-372 (2016).
- Takemoto, M., et al. A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice. American Journal of Pathology. 161 (3), 799-805 (2002).
- Steinmetz, O. M., et al. A pitfall of glomerular sieving: profibrotic and matrix proteins derive from the Bowman's capsule and not the glomerular tuft in rats with renovascular hypertension. Nephrology Dialysis Transplantation. 22 (10), 3055-3060 (2007).
- Ishikawa, Y., Kitamura, M. Spontaneous apoptosis of podocytes in explanted glomeruli. Technical note. Kidney International. 54 (6), 2008-2013 (1998).
- Krtil, J., Platenik, J., Kazderova, M., Tesar, V., Zima, T. Culture methods of glomerular podocytes. Kidney and Blood Pressure Research. 30 (3), 162-174 (2007).
- Mundel, P., Reiser, J., Kriz, W. Induction of differentiation in cultured rat and human podocytes. Journal of the American Society of Nephrology. 8 (5), 697-705 (1997).
- McCarthy, E. T., et al. TNF-alpha increases albumin permeability of isolated rat glomeruli through the generation of superoxide. Journal of the American Society of Nephrology. 9 (3), 433-438 (1998).
- Desideri, S., et al. A novel assay provides sensitive measurement of physiologically relevant changes in albumin permeability in isolated human and rodent glomeruli. Kidney International. 93 (5), 1086-1097 (2018).
