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Medicine

एक कुशल Sieving विधि वयस्क चूहे गुर्दे से बरकरार Glomeruli को अलग करने के लिए

doi: 10.3791/58162 Published: November 1, 2018
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल का मुख्य फोकस कुशलतापूर्वक बहाव अनुप्रयोगों की एक किस्म में उपयोग के लिए ंयूनतम दूषित पदार्थों के साथ व्यवहार्य प्राथमिक glomeruli संस्कृतियों को अलग करने के लिए है । अलग glomeruli घटक सेल प्रकार के बीच संरचनात्मक संबंधों को बनाए रखने और एक छोटे समय के लिए पूर्व vivo cultureed जा सकता है ।

Abstract

glomerular संरचना और समारोह के संरक्षण स्तवकवृक्कशोथ, गुर्दे की बीमारी की एक श्रेणी proteinuria जो अंततः जीर्ण और अंत चरण गुर्दे की बीमारी के लिए नेतृत्व कर सकते हैं की विशेषता की रोकथाम में निर्णायक है । glomerulus एक जटिल उपकरण शरीर से प्लाज्मा के निस्पंदन के लिए जिंमेदार है । रोग में, संरचनात्मक अखंडता खो दिया है और मूत्र में प्लाज्मा सामग्री के असामान्य रिसाव के लिए अनुमति देता है । एक विधि को अलग करने और संस्कृति में glomeruli की जांच करने के लिए इन रोगों के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है । इस प्रोटोकॉल में, जबकि संरचनात्मक और रूपात्मक विशेषताओं के संरक्षण वयस्क चूहे गुर्दे से बरकरार glomeruli पुन प्राप्त करने का एक कुशल विधि वर्णित है । यह प्रक्रिया अन्य nephron खंडों से न्यूनतम संदूषण के साथ प्रति गुर्दे glomeruli की उच्च पैदावार पैदा करने में सक्षम है । इन glomeruli के साथ, चोट की स्थिति उन्हें protamine सल्फेट सहित रासायनिक विषाक्त पदार्थों की एक किस्म के साथ, जो पैर प्रक्रिया effacement और पशु मॉडल में proteinuria कारण बनता है द्वारा नकल उतारा जा सकता है । चोट के अंश संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला, और पश्चिमी सोख्ता का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है । Nephrin और Wilms ट्यूमर 1 (WT1) के स्तर का भी इन संस्कृतियों से आकलन किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल की सहजता और लचीलेपन के कारण, पृथक glomeruli के रूप में वर्णित या एक तरह से उपयोग किया जा सकता है कि सबसे अच्छा सूट शोधकर्ता की जरूरतों को बेहतर अध्ययन glomerular स्वास्थ्य और रोगग्रस्त राज्यों में संरचना में मदद करने के लिए ।

Introduction

glomerulus प्लाज्मा घूम के निस्पंदन के लिए जिंमेदार केशिकाओं का एक अति विशिष्ट गुच्छा है । यह nephron की शुरुआत है, जो गुर्दे की बुनियादी कार्यात्मक इकाई है रूपों । Glomerular समारोह एक विशिष्ट fenestrated केशिका endothelium, podocytes के भट्ठा डायाफ्राम, और एक हस्तक्षेप तहखाने झिल्ली द्वारा परिभाषित किया गया है । इन परतों को छानने का में पदार्थों के चयनात्मक उत्सर्जन के लिए अनुमति देने के लिए एक semipermeable बाधा के रूप में । पानी, आयनों, और अंय छोटे अणुओं के माध्यम से आम तौर पर गुजरती हैं, जबकि बड़े अणुओं प्लाज्मा में बनाए रखे हैं । Podocytes विशेष उपकला कोशिकाओं है कि तहखाने झिल्ली पर फैल रहे हैं, पैर प्रक्रियाओं के रूप में जाना जाता cytoplasmic अनुमानों के साथ केशिकाओं आसपास । सन्निकट podocytes interdigitate के पैर प्रक्रियाओं और भट्ठा डायाफ्राम द्वारा पार कर रहे हैं जैसे कि nephrin, podocin, पी-cadherin, और ZO-11के रूप में प्रोटीन के शामिल. पार अनुभाग में, इन पैरों की प्रक्रियाओं को समान रूप से तहखाने झिल्ली पर व्यवस्थित कर रहे हैं । रोगग्रस्त glomeruli में, पैर प्रक्रियाओं मोटे तौर पर असामान्य हो या "effaced," छानने का में प्लाज्मा सामग्री के असामान्य रिसाव के लिए अग्रणी । जैसे, glomerular नुकसान आम तौर पर प्रोटीन की असामान्य रूप से बड़ी मात्रा की उपस्थिति की विशेषता है (जैसे, proteinuria) और/या लाल रक्त कोशिकाओं (जैसे, रक्तमेह) मूत्र में । इसके अलावा, घायल podocytes nephrin की अभिव्यक्ति खो के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अपने नियामक Wilms ट्यूमर 1 (WT1), एक प्रमुख प्रोटीन2,3विभेद के रखरखाव के लिए जिंमेदार है । glomeruli मधुमेह नेफ्रोपैथी और अन्य glomerulonephritides जैसे न्यूनतम परिवर्तन रोग, झिल्लीदार नेफ्रोपैथी, और फोकल फॉल्ट glomerulosclerosis में नुकसान का एक प्राथमिक लक्ष्य कर रहे हैं । इन रोगों प्रगतिशील गुर्दे की विफलता के प्रमुख कारण है और अंत चरण गुर्दे की बीमारी के विकास, एक शर्त है जिसमें जीवन रक्षा डायलिसिस या गुर्दे प्रत्यारोपण पर निर्भर करता है । इसलिए क्रोनिक किडनी डिजीज (सीकेडी) पैथोलॉजी को बेहतर ढंग से समझने के लिए glomeruli का अध्ययन करना जरूरी है ।

एक कोशिका संस्कृति प्रणाली glomerular जीवविज्ञान का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है । भट्ठा डायाफ्राम पैदा करने में अपनी केंद्रीय भूमिका के कारण, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विशिष्ट proteinuric भट्ठा डायाफ्राम प्रोटीन उत्परिवर्तनों के कारण रोगों के अस्तित्व, बहुत अनुसंधान जाहिर है अलगाव में podocyte का उपयोग किया । यह प्राथमिक podocyte सेल लाइनों की पीढ़ी के लिए इन विट्रो मेंउपयोग करने के लिए नेतृत्व किया गया है । इन कोशिकाओं की स्थिति की एक किस्म के तहत किया जा सकता है और भी पारगंय पर उगाया जा सकता है4पारगम्यता का आकलन करने के लिए समर्थन करता है. हालांकि, proliferating कोशिकाओं के अलगाव अक्सर विभेदित कोशिकाओं है कि उनके podocyte मार्करों के कुछ खो दिया है चुनता है । यह सशर्त अमर एक ट्रांसजेनिक माउस SV40 बड़ी टी जीन (जैसे immortomouse), जो संस्कृति में उगाया जा सकता है, लेकिन यह भी हो सकती है की एक तापमान के प्रति संवेदनशील उत्परिवर्ती ले जाने के तनाव से व्युत्पंन podocytes की पीढ़ी के लिए नेतृत्व किया है podocyte मार्करों की एक पूरी सरणी व्यक्त करने के लिए विभेदित5. प्राथमिक संस्कृति के इन तरीकों को समझने में निर्णायक रहा है podocyte जीव विज्ञान4,6,7

फिर भी, एकल कोशिका प्रकार वाले संस्कृतियों में सेलुलर संबंधों की कमी होती है जो vivo के साथ-साथ समर्थन संरचना और मैट्रिक्स में होती है, और इन कोशिकाओं के monolayers तीन आयामी दोहराऊंगा जरूरी नहीं है glomeruli की वास्तुकला । अमर podocytes भी बोझिल और संस्कृति8के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है, और या तो immortomouse या स्थापित जांचकर्ताओं से कोशिकाओं के एक प्रारंभिक aliquot के कब्जे की आवश्यकता को आरंभ करने के लिए । इसके अलावा, glomerulus न केवल podocytes के शामिल है, लेकिन यह भी केशिका endothelial कोशिकाओं और तहखाने झिल्ली, साथ ही साथ mesangial कोशिकाओं जो संरचना के लिए समर्थन प्रदान करते हैं । इसलिए यह एक पूर्व vivo बरकरार glomeruli के अध्ययन के लिए सभी जांचकर्ताओं के लिए उपलब्ध दृष्टिकोण है कि उनके मूल संरचना को बनाए रखने के साथ ही सभी कोशिकाओं को विकसित उपयोगी है सामांय glomerulus ।

१९५८ में, कुक और पिकरिंग खरगोश गुर्दे से glomeruli के पहले अलगाव वर्णित है । टिप्पणियों के बाद कि वसा emboli glomeruli में दर्ज हो गया, वे माने कि एक ही आकार के कणों को विशेष रूप से इन संरचनाओं को अलग किया जा सकता है । दरअसल, गुर्दे में आयरन ऑक्साइड कणों का अर्क glomeruli में इन कणों के फँसाने के लिए नेतृत्व किया. यांत्रिक पृथक्करण और गुर्दे की sieving के बाद, glomeruli बरकरार रखा जा सकता है और शुद्धता के साथ चुंबकीय जुदाई9के उपयोग के माध्यम से. १९७१ में, मिसळा दिखाया है कि लौह ऑक्साइड सुई लेनी छोड़ा जा सकता है, और glomerular अलगाव कीमा बनाया हुआ मानव, कुत्ता, खरगोश या चूहे गुर्दे ऊतक10के sieving के साथ हासिल की । इस तकनीक के बाद से संशोधित किया गया है तो जांचकर्ताओं के लक्ष्य पर निर्भर करता है, लेकिन अनिवार्य रूप से शुद्ध तैयारी है कि आगे का अध्ययन किया जा सकता है या से जो प्राथमिक सेल संस्कृतियों11,12 स्थापित किया जा सकता है के परिणामस्वरूप , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. शी.

यहां हम चूहे गुर्दे से बरकरार व्यवहार्य glomeruli के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । पूरे प्रोटोकॉल बस कुछ ही घंटे लगते हैं । हालांकि वे पैदा करना नहीं है, किसी भी आकार की प्रयोगात्मक योजनाओं बस शुरू सामग्री के रूप में गुर्दे की संख्या में वृद्धि के द्वारा समर्थित किया जा सकता है । जबकि वहां glomeruli के चुंबकीय मनका जुदाई के लिए प्रोटोकॉल प्रकाशित कर रहे हैं, वे मोतियों की नसों में इंजेक्शन की आवश्यकता होती है, और अधिक महंगे हैं, और जीव विज्ञान को बदलने के बाद से मोतियों या तो संस्कृति में glomeruli द्वारा बनाए रखा या glomerular की आवश्यकता हो सकती है " lysing "और हटाने के द्वारा केंद्रापसारक19। माउस glomeruli की तुलना में, चूहे glomeruli का बड़ा आकार (लगभग १०० µm दो महीने पुराने चूहों18में) बनाता है यह बहुत आसान उंहें एक सरल sieving तकनीक का उपयोग कर अंय गुर्दे की संरचनाओं से अलग करने के लिए ।

उनकी उपयोगिता के सबूत के रूप में, हम glomeruli विशेषता है कि विभिंन प्रकार के सेल का प्रदर्शन । वे भी vivo में glomeruli घायल करने के लिए जाना जाता एजेंटों को उजागर किया जा सकता है, और हम इन संस्कृतियों पर protamine सल्फेट (पी एस) के प्रतिकूल प्रभाव प्रदर्शित करता है । पुनश्च एक polycation कि glomerular केशिका दीवार20के साथ anionic साइटों बेअसर है । इस बेअसर glomerular निस्पंदन बाधा पर एक नाटकीय प्रभाव पड़ता है और इसलिए proteinuria और पैर प्रक्रिया effacement बढ़ जाती है । इन glomeruli में nephrin और WT1 जैसे प्रमुख प्रोटीन्स के लिए immunoblots के साथ समग्र स्वास्थ्य का आकलन किया जा सकता है. इसके अलावा, उनकी संरचना प्रकाश, इम्यूनोफ्लोरेसेंस, और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है ।

कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल सबसे जांचकर्ताओं के लिए सुलभ है (एक ही जानवरों और कुछ सरल उपकरणों के लिए उपयोग की जरूरत है) । रूपात्मक सुविधाओं के साथ नुकसान छोड़ दिया है, शोधकर्ता को glomeruli का विश्लेषण करने में सक्षम है और कैसे अंय महत्वपूर्ण कोशिका प्रकार और मैट्रिक्स संरक्षण glomeruli में समारोह और रोग प्रगति, podocyte संस्कृतियों की एक कमी को प्रभावित करते हैं ।

Protocol

सभी तरीकों यहां वर्णित संस्थागत पशु देखभाल और विश्वविद्यालय पिट्सबर्ग के उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. चूहा Glomeruli का अलगाव

  1. एक बाँझ 1% अलगाव बफर तैयार करने के लिए, एक ६०० मिलीलीटर चोंच करने के लिए गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) के 5 जी जोड़ें ।
    1. चोंच के लिए 1x फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) की ५०० मिलीलीटर जोड़ें और सभी BSA भंग हो गया है जब तक एक चुंबकीय सरगर्मी रॉड के साथ हलचल ।
    2. बाँझ फ़िल्टर 1% BSA/एक सेल संस्कृति हूड में/
      नोट: बाँझ 1% BSA/पंजाबियों बफर एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है ।
  2. प्राप्त 2 से 4 Sprague-Dawley १५० २०० g प्रत्येक के लिए वजन चूहों ।
    1. Euthanize एक चैंबर जिसमें १००% कार्बन डाइऑक्साइड प्रति मिनट चैंबर की मात्रा के 10-30% की दर से शुरू की है का उपयोग कर कार्बन डाइऑक्साइड साँस लेना के माध्यम से चूहों । कार्बन डाइऑक्साइड से हटाने से पहले श्वसन और फीका आंखों का रंग की समाप्ति के लिए जानवरों का निरीक्षण ।
    2. ७०% इथेनॉल के साथ पूर्वकाल पेट पर त्वचा तैयार है और बाल कतरनी का उपयोग बालों को हटाने के लिए, यदि वांछित । सर्जिकल कैंची या स्केलपेल का उपयोग कर त्वचा में एक midline चीरा बनाओ । आंतरिक अंगों को बेनकाब करने के लिए मांसपेशी परत के माध्यम से एक और midline चीरा बनाओ । इच्छामृत्यु का एक द्वितीयक विधि के रूप में डायाफ्राम और उरोस्थि या रिब पिंजरे के माध्यम से बेहतर चीरा बढ़ाएं ।
    3. अलग और एक बाँझ ५० मिलीलीटर प्लास्टिक शंकु ट्यूब में हैंक्स के 30 मिलीलीटर ' बफर नमक समाधान (HBSS) बर्फ पर के साथ दोनों गुर्दे और जगह को हटा दें ।
      नोट: कई चूहों को एक ही चैम्बर में euthanized जा सकता है और गुर्दे के सभी समान शंकु ट्यूब में रखे जा सकते हैं.
  3. एक बाँझ कोशिका संस्कृति हूड के लिए बर्फ और परिवहन पर गुर्दे रखें. एक बाँझ पेट्री पकवान HBSS के 5 मिलीलीटर युक्त, यह भी बर्फ पर, और हटाने और कैंची और तेज संदंश के साथ perirenal वसा को त्यागने के लिए गुर्दे स्थानांतरण । यदि अब भी मौजूद है, भी निकालें और एक छोटे से सतही चीरा बनाकर गुर्दे के आसपास के कैप्सूल को त्याग दें और फिर तेज संदंश का उपयोग करने के लिए धीरे से इसे अंग से दूर खींच.
    नोट: हमेशा गुर्दे और अभ्यास बाँझ तकनीक भर बर्फ पर अलग रखें. बाँझ धुंध का एक टुकड़ा एक textured सतह के रूप में पेट्री डिश में हेरफेर के दौरान जगह में गुर्दे पकड़ रखा जा सकता है ।
    1. आधा लंबाई (midsagittal खंड) में गुर्दे कट और हटाने और मज्जा (जो रंग में गहरा है) के साथ एक दूसरे पेट्री पकवान में एक स्केलपेल के साथ 5 मिलीलीटर HBSS ।
    2. शेष टुकड़े, जो मुख्य रूप से गुर्दे प्रांतस्था है हस्तांतरण, एक तिहाई पेट्री डिश में HBSS और कीमा एक बाँझ उस्तरा ब्लेड के साथ जब तक टुकड़े से कम 1 मिमी आकार में हैं, या जब तक एक पेस्ट का गठन किया है ।
  4. गीला ऊपर और एक १८० µm छन्नी के नीचे 1% BSA/पंजाबियों के साथ एक ५०० मिलीलीटर अपशिष्ट चोंच पर । यह कदम महत्वपूर्ण है क्योंकि यह प्रोटीन के साथ छलनी कोट और glomeruli का पालन कम कर देता है, जो उपज में सुधार होगा ।
  5. छलनी के एक छोटे से किनारे पर कीमा बनाया हुआ प्रांतस्था प्लेस और textured गोताख़ोर निकला हुआ किनारा का उपयोग करें (रबर सील विपरीत पक्ष) एक 10 मिलीलीटर के लिए एक तल में छलनी के माध्यम से ऊतक गूदा सिरिंज की बर्फ पर बैठे पैन । HBSS के साथ समय पर कुल्ला लेकिन नमूना कमजोर पड़ने से बचने के लिए संभव के रूप में कम का उपयोग करें ।
    नोट: बफ़र कुल के 30 मिलीलीटर से अधिक नहीं है, तो केवल 25 मिलीलीटर अधिक यहां इस्तेमाल किया जा सकता है । छलनी के केवल एक किनारे पर कीमा बनाया हुआ ऊतक रखने के लिए कारण छलनी के भाग के लिए जोखिम को सीमित करने के बजाय पूरे छलनी सतह क्षेत्र से glomeruli के पालन को कम करने के लिए है ।
    1. इस सुविधा के लिए, नीचे पैन में तरल पदार्थ इकट्ठा करने के लिए छलनी कुल्ला पुनः प्रयोग । एक बार sieving पूरा हो गया है, ध्यान से छलनी के नीचे 1% BSA/किसी भी glomeruli है कि ढीला किया जा सकता है कब्जा करने के लिए पैन के तल से एक बार फिर से धो लो ।
    2. नीचे पैन में तरल पदार्थ के सभी 20 ग्राम सुई से सुसज्जित कई 10 मिलीलीटर सिरिंजों में ले लीजिए और यह सुई के माध्यम से पारित कम से कम 2 अतिरिक्त समय. पिछले संग्रह पर, सिरिंज में glomeruli युक्त तरल पदार्थ रखने के लिए तैयार जब तक यह ९० µm छलनी के माध्यम से पारित करने के लिए.
  6. तरल पदार्थ सिरिंजों में संग्रहीत किया जाता है, जबकि 1% BSA/पंजाबियों के साथ अपशिष्ट चोंच में निस्तब्धता और ऊपर और एक ९० µm छलनी के नीचे गीला 1% BSA/ नीचे की ओर छलनी को बर्फ पर पैन रखें ।
    1. ऊपर वर्णन के रूप में एक और सिरिंज निकला हुआ के साथ छलनी के माध्यम से छलनी और गूदा के एक किनारे करने के लिए सिरिंज में नमूना लागू करें. छलनी के एक किनारे पर सब कुछ इकट्ठा करने के लिए नीचे पैन से समाधान के साथ धो लो ।
    2. एक बार sieving पूरा हो गया है, ध्यान से चरण 1.5.1 में के रूप में छलनी के नीचे धो लो । एक ५० मिलीलीटर प्लास्टिक शंकु ट्यूब में नीचे पैन में सभी तरल पदार्थ ले लीजिए ।
  7. एक बेकार चोंच में 1% BSA/पंजाबियों के साथ नीचे पैन धो और एक ७५ µm चलनी के ऊपर और नीचे गीला 1% BSA/ नीचे की ओर छलनी को बर्फ पर पैन रखें ।
    1. छलनी के एक किनारे पर नमूना लागू करें । तरल आसानी से के माध्यम से प्रवाह करना चाहिए । अपशिष्ट यूरिन में 1% BSA/पंजाबियों के कम से 20 मिलीलीटर के साथ शीर्ष के माध्यम से कुल्ला । ध्यान से छलनी के नीचे के रूप में अच्छी तरह से धो लो । glomeruli इस ७५ µm चलनी के शीर्ष पर रहेगा ।
    2. छलनी को उल्टा करके कुल्ला करके एक पेट्री डिश में glomeruli इकट्ठा करने के लिए HBSS का प्रयोग करें । जरूरत के रूप में ज्यादा HBSS के रूप में यहां का उपयोग करें । बर्फ पर एक या एक से अधिक ५० मिलीलीटर प्लास्टिक शंकु ट्यूब (ओं) में ले लीजिए ।
  8. 4 ° c में 5 मिनट के लिए १८०० x g पर केंद्रापसारक, एक पिपेट के साथ ध्यान से supernatant निकालें, और ठंड HBSS के 10 मिलीलीटर में गोली resuspend । यदि एकाधिक शंकु ट्यूबों 1.7.2 में एकत्र किए गए नमूनों का मिश्रण । इस केंद्रापसारक कदम दोहराएं ।
  9. अगले कदम के लिए आगे बढ़ने के लिए तैयार जब तक HBSS के 5 मिलीलीटर में glomeruli resuspend ।
  10. यदि चाहें तो कुल glomeruli की गिनती करा लें । इसके लिए एक पिपेट के साथ 10 µ l का नमूना लें और एक ग्लास स्लाइड पर ड्रॉप लगाएं । एक खुर्दबीन के नीचे देखें, क्षेत्र में glomeruli गिनती और कुल उपज प्राप्त करने के लिए ५०० से गुणा ।
    नोट: पवित्रता क्षेत्र में देखा नलिकाओं की संख्या की गिनती और glomeruli और tubule संरचनाओं की कुल संख्या के द्वारा विभाजित द्वारा निर्धारित किया जा सकता है । दृश्य फ़ील्ड में > ९५% glomeruli होना चाहिए ।
    1. यदि वहाँ महत्वपूर्ण ट्यूबलर संदूषण है, दोहराएँ कदम 1.6.1 आगे, और जब कदम 1.7.1 को पूरा करने के लिए अच्छी तरह से धोने के लिए सुनिश्चित करें. यह वह कदम है जिसमें ट्यूबलर संदूषण होने की संभावना सबसे अधिक होती है.

2. Glomeruli की चोट

  1. एक 15 मिलीलीटर प्लास्टिक शंकु ट्यूब में glomeruli लीजिए और २०० एक्स जी पर नीचे स्पिन कुल उपज के आधार पर HBSS की एक उचित मात्रा में resuspend ताकि लगभग ९,००० glomeruli प्रति अच्छी तरह से कर रहे हैं । पिपेट ४५० µ एक 24-अच्छी तरह से थाली, या किसी भी प्लेट प्रारूप है कि बहाव की परख के लिए आवश्यक फिट बैठता है की एक अच्छी तरह से नमूना के एल ।
    नोट: Pipetting ऊपर और नीचे बफर में मिश्रण करने के लिए glomeruli एक सजातीय समाधान सुनिश्चित करता है । glomeruli बहुत चिपचिपा और भारी रहे है और एक दूसरे के साथ ही एक समाधान के तल पर जल्दी से बसने और ट्यूब के पक्षों पर रहना होगा ।
  2. 6 मिलीग्राम/एमएल protamine सल्फेट (पी एस) समाधान बनाने के लिए, पहले एक 15 मिलीलीटर प्लास्टिक शंकु ट्यूब और भंवर में ४० ° c को गर्म dH2O के 10 मिलीलीटर में पी एस के 1 जी भंग अच्छी तरह से । समाधान के 30 µ l को ले और dH2O के ४७० µ l को जोड़ें ।
    नोट: यह एक 6 मिलीग्राम/एमएल समाधान का उत्पादन होगा, और जब ५० µ एल अच्छी तरह के रूप में नीचे वर्णित करने के लिए जोड़ रहे हैं, अंतिम एकाग्रता ०.६ मिलीग्राम/एमएल है ।
    1. डुप्लिकेट में, protamine सल्फेट के ५० µ एल जोड़ें (यह एक 1:10 कमजोर पड़ने) एक समूह की एक अच्छी तरह से है, जबकि एक और समूह ५० µ एल HBSS (नकारात्मक नियंत्रण) की आपूर्ति ।
  3. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 4 एच के लिए थाली मशीन ।
  4. एक microcentrifuge ट्यूब (४००० x g, 4 ° c, 10-15 s) में एक अच्छी तरह से नीचे की सामग्री स्पिन और प्रत्येक पंजाब के 1 मिलीलीटर के साथ दो बार धो लो ।
  5. महाप्राण ने फाइनल वॉश की और पंजाब के ३०० µ एल में फिर से सस्पेंड कर दिया । तीन aliquots में विभाजित करने के लिए प्रोटीन अलगाव, संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (उनि) दृश्य, और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला (यदि) के लिए तैयार हो ।

3. विश्लेषण के लिए Glomeruli की तैयारी

  1. तीन aliquots (४००० x g, 4 ° c, 10-15 s) की सामग्री नीचे स्पिन और शेष बफर बंद महाप्राण और उनि द्वारा नमूना विश्लेषण करने के लिए आगे बढ़ना है, अगर, या प्रोटीन अलगाव ।
  2. उनि के लिए प्रोसेसिंग
    1. फिक्स glomerular छर्रों में १५० µ l ठंड २.५% glutaraldehyde के ०.०१ मीटर पंजाब में. एक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर गोली से निर्धारण सावधानी से निकालें, गोली को बाधित करने के लिए नहीं यकीन कर रही है, तो यह पंजाबियों के साथ कुल्ला और पोस्ट-1% आज़मियम tetroxide में इसे 1% पोटेशियम ferricyanide के साथ ठीक ।
    2. इथेनॉल की एक वर्गीकृत श्रृंखला (30, ५०, ७०, ९०, १००, १००, १००%) और propylene ऑक्साइड तो epoxy embedding सामग्री में एंबेड के माध्यम से नमूने निर्जलीकरण ।
    3. एक ultramicrotome पर अर्द्ध पतली (३०० एनएम) वर्गों में कटौती । 1% सोडियम बोराटे में ०.५% Toluidine नीले रंग के साथ दाग और प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत उन्हें जांच ।
    4. कट ultrathin वर्गों (६५ एनएम), उंहें uranyl एसीटेट और Reynold का नेतृत्व साइट्रेट के साथ दाग, और एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप पर जांच ।
  3. के लिए संसाधन यदि
    1. पंजाब के समाधान में एक 12% जिलेटिन की १५० µ एल जोड़ें और तुरंत सूखी बर्फ पर जगह के लिए एक गोली फार्म । 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एक microcentrifuge ट्यूब में 2% paraformaldehyde/1x पंजाबियों के ५०० µ एल में गोली भिगोना ।
    2. एक बेस मोल्ड में गोली प्लेस और इष्टतम काटने के तापमान (OCT) सूखी बर्फ पर मध्यम जोड़ने के द्वारा एंबेड । कट 5-10 µm वर्गों एक cryotome पर और इम्यूनोफ्लोरेसेंस/immunohistochemistry या मानक ऊतकवैज्ञानिक दाग के साथ आगे बढ़ना ।
  4. प्रोटीन अलगाव के लिए
    1. RIPA बफर के १५० µ एल जोड़ें १.५ µ के साथ glomerular गोली को छेड़ने अवरोध करनेवाला और dounce ऊतक homogenizers के साथ ।
    2. प्रोटीन ठहराव और immunoblotting या अन्य प्रोटीन विश्लेषण करने के लिए आगे बढ़ें ।

Representative Results

glomeruli के अलगाव के लिए इच्छामृत्यु के समय से प्रोटोकॉल के रूप में छोटे रूप में 2 ज में पूरा किया जा सकता है और एक उच्च प्रवाह और दक्षता है । तकनीक के समुचित उपयोग के साथ, ६,०००-१०,००० glomeruli से चूहा गुर्दे पर्वतमाला प्रति glomeruli की उपज जब 8 गुर्दे के साथ शुरू । अंतिम निलंबन घनी glomeruli के साथ पैक किया जाता है और एक समग्र शुद्धता है > ९५%, ट्यूबलर खंडों या अन्य सेल प्रकार से कम से संदूषण दिखा रहा है (चित्रा 1ए, बी). इसके अलावा, OCT-एम्बेडेड glomeruli Hematoxylin और Eosin (एच एंड ई) दाग के साथ दाग हो सकता है आकृति विज्ञान (चित्रा 1सी) को देखने के लिए । इन glomeruli पूरे प्रोटोकॉल भर में अपनी संरचना बनाए रखने के बाद भी प्रसंस्करण । हम प्रदर्शित करते है कि पृथक glomeruli बरकरार है और व्यवहार्य podocytes (चित्रा 2), mesangial कोशिकाओं (चित्रा 2बी), और endothelial कोशिकाओं (चित्रा 2सी) के अधिकारी ।

एक बार अलग, glomeruli के लिए अच्छी तरह से ज्ञात रासायनिक चोटों के सामने किया जा सकता है vivo विकृति में अनुकरण । इस मामले में, protamine सल्फेट (पी एस) के लिए glomerular निस्पंदन बाधा है, जो अंततः पैर प्रक्रिया effacement की ओर जाता है के आरोप को बाधित करने की क्षमता के लिए चुना गया था । पुनश्च-इलाज glomeruli nephrin में एक हड़ताली कमी (लाल) और WT1 के लिए सकारात्मक नाभिक की एक संख्या (ग्रीन) के माध्यम से इम्यूनोफ्लोरेसेंस (चित्रा 3ए, बी) है । glomeruli को ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (चित्रा 3सी) के लिए भी तैयार किया जा सकता है । नियंत्रण नमूने सामान्य podocyte आकृति विज्ञान और पैर प्रक्रियाओं है, जबकि पी एस-इलाज glomeruli है पैर प्रक्रिया effacement (चित्रा 3डी), जो podocyte शिथिलता का संकेत है और vivo में देखा जाता है मॉडल ps21का उपयोग कर । यह भी immunoblotting द्वारा पता लगाया nephrin में कमी के अनुरूप (चित्रा 3ई, एफ) ।

व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए, सट caspase-3 apoptosis के एक मार्कर के रूप में मूल्यांकन किया गया था । इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करना, सट caspase-3 पहले कुछ कोशिकाओं में दिखाई देता है अलगाव के बाद 2 एच शुरू (चित्रा 4). इस चिढ़ाने व्यक्त कोशिकाओं की संख्या अधिक समय के साथ प्रचुर मात्रा में हो गया, उच्चतम 24 और ४८ ज में देखा स्तरों के साथ । यह पता चलता है कि apoptosis अपेक्षाकृत संस्कृति में जल्दी होती है और बहाव अनुप्रयोगों के बाद जल्द ही अच्छा परिणाम के लिए अलगाव का प्रदर्शन किया जाना चाहिए ।

Figure 1
चित्रा 1 . अलगाव के बाद चूहे glomerular संस्कृतियों की ठेठ उपस्थिति । () glomerular संस्कृति की Brightfield छवि. हालांकि हम एक क्षेत्र है जिसमें इस micrograph में एक भी गुर्दे tubule है चुना (arrowhead), प्राप्त संस्कृतियों आम तौर पर कर रहे है > ९५% शुद्ध । स्केल बार बराबर होती है १०० µm. (B) एक एकल glomerulus की बढ़ी हुई छवि. () Hematoxylin और eosin के दाग एक भी glomerulus. B और C के बराबर 10 µm में स्केल पट्टियां । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

Figure 2
चित्रा 2 . घटक कक्ष प्रकार पृथक glomeruli में रखे जाते हैं । फोकल इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी nephrin के लिए प्रदर्शन किया गया था (लाल, podocytes) और सेल विशेष मार्करों podocytes, mesangial कोशिकाओं, और endothelium की पहचान करने के लिए. () nephrin और WT1 (green, podocytes) के लिए Costain. () nephrin और PDGFR-β (green, mesangial cells, arrow) के लिए Costain । () nephrin और CD31 के लिए Costain (हरे, endothelial कोशिकाओं, ऐरोहेड द्वारा चिह्नित क्रॉस सेक्शन में जहाजों). स्केल बार = 25 सभी पैनलों पर µm । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 . Podocyte चोट अलग चूहे glomeruli का उपयोग कर इन विट्रो में प्रेरित किया जा सकता है । () एक अनुपचारित glomerular संस्कृति में nephrin और WT1 के लिए फोकल इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी. ध्यान दें रैखिक nephrin धुंधला (लाल) और WT1 की उपस्थिति-सकारात्मक नाभिक (हरा) जो आम तौर पर देखा जाता है जब वहां स्वस्थ podocytes हैं । () protamine सल्फेट उपचार के बाद, nephrin अभिव्यक्ति में कमी हुई है और गैर रेखीय, और WT1 अनुपस्थित है, podocyte चोट का संकेत है । () संचरण इलेक्ट्रॉन microscpy (उनि) पैर प्रक्रियाओं, तहखाने झिल्ली, और एक fenestrated endothelium सामांय glomerular संरचना की विशिष्ट दिखा छवि । बार ५०० एनएम के बराबर होती है । () protamine सल्फेट के बाद, पैर की प्रक्रियाएँ लम्बी या effaced (ऐरोहेड) होती हैं, जो podocyte चोट को इंगित करती हैं. () protamine सल्फेट उपचार के बाद घटी हुई nephrin दिखा nephrin के लिए पश्चिमी दाग. () पश्चिमी ब्लाटर के लिए Actin लोडिंग कंट्रोल दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 . पृथक glomeruli में कोशिका व्यवहार्यता का आकलन । सट caspase-3 (green) के लिए फोकल इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का प्रदर्शन किया गया । glomeruli को आसानी से ढूंढने के लिए एक nephrin सह दाग का प्रदर्शन किया गया । जबकि 0 पर कोई सट caspase-3 धनात्मकता नहीं थी और glomeruli के अलगाव के बाद 1 ज, कुछ कोशिकाओं में प्रतिदीप्ति संकेत 2 ज पर नोट किया गया था । उत्तरोत्तर अधिक कोशिकाओं को सकारात्मक कर दिया अब अलगाव के बाद वे जांच की गई । caspase की सबसे बड़ी संख्या-3 सकारात्मक कोशिकाओं पर ध्यान दिया गया 24 और ४८ ज. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Discussion

यह एक सरल प्रोटोकॉल के साथ सस्ती, पुन: प्रयोज्य उपकरणों का उपयोग कर चूहे गुर्दे से glomeruli उबरने के लिए एक कारगर तरीका है । सभी प्रक्रियाओं के साथ के रूप में, वहां अपनी उपयोगिता के लिए सीमाएं हैं । सबसे पहले, यद्यपि हम प्राप्त > ९५% शुद्धता, क्योंकि प्रोटोकॉल और प्रारंभिक सामग्री के sieving प्रकृति के सभी दूषित पदार्थों को बाहर करने के लिए असंभव है, और कुछ लाल रक्त कोशिकाओं और सामयिक ट्यूबलर खंड संस्कृति में मौजूद हो जाएगा । हम इन छोटे दूषित अनुप्रयोगों के विशाल बहुमत के लिए एक समस्या होने की आशंका नहीं है । दूसरा, sieving प्रोटोकॉल चूहा गुर्दे, जिसमें glomeruli बहुत चूहों की तुलना में बड़ा कर रहे हैं के उपयोग पर निर्भर करता है । यदि माउस glomeruli की जरूरत है, एक तकनीक का उपयोग कर वाणिज्यिक चुंबकीय मोती (जैसे, Dynabeads)22प्रकाशित किया गया है । तीसरे, यह दिखाया गया है कि विशिष्ट mRNAs (plasminogen उत्प्रेरक अवरोधक-1 और कोलेजन मैं) अलग glomeruli में लगभग पूरी तरह से है बोमन कैप्सूल से नहीं बल्कि intraglomerular कोशिकाओं से प्राप्त23। यह अनुचित निष्कर्ष के लिए नेतृत्व अगर mRNA अलगाव इन glomeruli से प्रयास किया है सकता है । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि हमारे हाथ में glomeruli के बहुमत decapsulated है और इसलिए है बोमन कैप्सूल से महत्वपूर्ण योगदान की कमी चाहिए । चौथा, कोशिका मृत्यु संस्कृति की स्थिति के तहत अपेक्षाकृत जल्दी होते है शुरू होता है ।

हमने पाया है कि अपोप्तोटिक कार्यक्रम, के रूप में सट caspase-3 की उपस्थिति द्वारा सबूत, संस्कृति के 2 ज में शुरू सक्रिय था । यह है कि apoptosis, डीएनए विखंडन, TUNEL, और histologic विश्लेषण के द्वारा मूल्यांकन के रूप में दिखा पिछले रिपोर्टों के साथ सामांय समझौते में24अलगाव के बाद 1-2 ज के भीतर होने शुरू होता है । हालांकि, यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि प्रारंभिक टिप्पणियों से पता चला है कि चयापचय गतिविधि पृथक छलनी glomeruli से पता लगाया जा सकता है जब कम 3 ज के लिए संस्कृति, इस timepoint16में काफी सेलुलर व्यवहार्यता का सुझाव । फिर भी, परिणामों के आधार पर, हमें विश्वास है कि यह सबसे अच्छा परिणाम के लिए इरादा प्रयोगों में अलग glomeruli तुरंत उपयोग करने के लिए विवेकपूर्ण होगा । हम अनुशंसा करते हैं कि सभी प्रयोगों ७२ ज के पहले किया जा के रूप में हमने देखा है कि पूरे glomerular संरचना कि timepoint से परे खराब करने के लिए शुरू होता है.

यह बहुत अधिक उपज प्राप्त करने के लिए आसान है जब 4-8 गुर्दे के साथ शुरू करने के रूप में केवल 2 का विरोध किया क्योंकि glomeruli की एक निश्चित संख्या विभिंन छलनी के पालन के कारण खो रहे हैं, लेकिन एक बार छलनी अधिक से लेपित है वहां कोई अतिरिक्त नुकसान है । एक ही कारण के लिए, यह BSA/पंजाबियों बफर में छलनी सोख महत्वपूर्ण है के रूप में उपयोग करने से पहले glomeruli अधिक एक सूखी चलनी का पालन करने की संभावना है, और छलनी के एक किनारे करने के लिए ऊतक जोखिम सीमा । हम एक उचित उपज प्राप्त करने के लिए कोई कम से 6 गुर्दे (3 चूहों) के साथ शुरू करने का सुझाव ।

कुछ जांचकर्ताओं पृथक glomeruli जो संस्कृति17के दौरान glomeruli से बाहर हो जाना करते है से प्राथमिक podocyte संस्कृतियों अलग है । हमने उल्लेख किया है कि कुछ अलग glomeruli संस्कृति डिश प्लास्टिक का पालन करेंगे और है कि कोशिकाओं को देर timepoints (अलगाव के बाद ७२ ज) में glomerular संरचना से बाहर प्रवास शुरू हो जाएगा । इन कक्षों का अध्ययन इस आइसोलेशन प्रोटोकॉल के दायरे से बाहर है, और क्या इन कोशिकाओं podocytes हैं, पार्श्विका उपकला कोशिकाओं, या दोनों15,25के रूप में कुछ विवाद है. विशेष रूप से, Mundel एट अल, ने बताया है कि cobblestone कोशिकाओं को छलनी glomeruli से काटा को विशिष्ट संवर्धन26शर्तों के तहत परिपक्व podocytes में अंतर प्रेरित किया जा सकता है । सेल पहचान के बारे में भ्रम की कुछ है कि अलग glomeruli (बोमन के कैप्सूल जो पार्श्विका उपकला कोशिकाओं से आबाद है सहित) encapsulated रहे हैं या sieving प्रक्रिया में decapsulated पर निर्भर हो सकता है । हमारे हाथ में, १८०, ९० के अनुक्रमिक चलनी आकार का उपयोग कर, और ७५ µm glomeruli के बहुमत के लिए नेतृत्व decapsulated जा रहा है ।

proteinuric क्रोनिक गुर्दे की बीमारी के अधिकांश रूपों glomerular पारगम्यता में वृद्धि के कारण कर रहे हैं । कई लेखकों पूर्व vivo पारगम्यता प्रयोगों में अलग glomeruli का उपयोग किया है. एक विधि में, आसपास के मीडिया के आसमाटिक सामग्री बदलने के बाद glomerular मात्रा में परिवर्तन27पारगम्यता अनुमान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । हाल ही में, यह स्थापित किया गया था कि पृथक glomeruli से एक फ्लोरोसेंट जांच के रिसाव पारगम्यता को मापने के लिए quantified किया जा सकता है और glomerular रोग प्रयोगात्मक मॉडल28को उजागर कुतर में प्रदर्शन किया जा सकता है ।

हमने उल्लेख किया है कि उनि तैयारी की प्रक्रिया में, हम कई बार देख podocyte पैर तहखाने झिल्ली से लिफ्ट प्रक्रियाओं । हमें लगता है कि इस संस्कृति में हो रहा है और अधिक होने की संभावना है एक विरूपण साक्ष्य के दौरान उनि नमूना तैयारी है । विशेष रूप से, यहां तक कि जब यह होता है, यह स्पष्ट है कि क्या पैर प्रक्रियाओं देखो "सामांय" या effaced हैं ।

कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल एक विधि जिसके द्वारा एक चोट के जवाब में सुघड़ और सेलुलर परिवर्तन का मूल्यांकन कर सकते है प्रदान करता है । हमें आशा है कि यह पृथक podocyte संस्कृतियों के लिए एक साथी तकनीक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, खासकर जब extracellular मैट्रिक्स या अंय देशी सेल प्रकार के साथ बातचीत पर विचार किया जा रहा है । यह proteinuric सीकेडी की समझ बढ़ाने के लिए वादा है, जो इस दुर्बल रोग के लिए भविष्य चिकित्सकीय विकास करने की क्षमता में सुधार होगा रखती है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन ग्रांट FTF १६९९००८६, NIH P30 DK079307, अमेरिकन सोसायटी ऑफ नेफ्रोलॉजी ट्विटर अवार्ड, पिट्सबर्ग के एक विश्वविद्यालय के चिकित्सा केंद्र प्रतियोगी चिकित्सा अनुसंधान निधि पुरस्कार, और पिट्सबर्ग के एक विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया फिजीशियन अकादमिक फाउंडेशन पुरस्कार । हम histologic विश्लेषण के लिए glomerular संरक्षण के लिए अपने तकनीकी सुझाव के लिए गेरार्ड Apodaca, धंयवाद मारा सुलिवान और मिंग के साथ सहायता के लिए सूर्य, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और Yingjian ली और Youhua लियू इस प्रोटोकॉल में अपने तकनीकी इनपुट के लिए । हम भी CD31 एंटीबॉडी के लिए सिंथिया सेंट Hilaire धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Solutions, Chemicals, and Animals
Sprague-Dawley Rats Envigo 207M
Bovine serum albumin Fisher BP1605100
Hank's Balanced Salt Solution with Ca2+ and Mg2+ Thermo 14025092
1x Phosphate Buffered Saline VWR 97063-660
Protamine sulfate MP Bio ICN15197105
Karnovsky's Fixative
Gelatin
Paraformaldehyde EMD EM-PX0055-3
O.C.T. Scigen 23730571
RIPA Buffer
Halt Protease Inhibitors Thermo PI78442
Nephrin Antibody Fitzgerald 2OR-NP002
WT-1 Antibody Abcam ab89901-10ul
PDGFR-β Antibody Cell Signaling #3169S
CD31 Antibody LSBio LS-C348736
Cleaved caspase-3 antibody Cell Signaling 9661S
Poly/Bed 812 (Luft) epoxy Polysciences 08792-1
Equipment
Carbon dioxide chamber
Conical tubes, 15 mL
Conical tubes, 50 mL
Surgical scissors
Surgical forceps
Sterile gauze
Petri dishes, 100 mm
Scalpels
Razor blades
Sterile filter apparatus
Sieve Pan Alfa Aesar AA39999ON
180um Sieve Alfa Aesar AA39996ON
90um Sieve Alfa Aesar AA39990ON
75um Sieve Alfa Aesar AA39991ON
10 mL syringes
600 mL beakers
Cell culture incubator
Picofuge
Vortex
Tissue Homogenizers Fisher Scientific 50550226
20 G needles
Leica Reichart Ultracut ultramicrotome

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References

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एक कुशल Sieving विधि वयस्क चूहे गुर्दे से बरकरार Glomeruli को अलग करने के लिए
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Rush, B. M., Small, S. A., Stolz, D. B., Tan, R. J. An Efficient Sieving Method to Isolate Intact Glomeruli from Adult Rat Kidney. J. Vis. Exp. (141), e58162, doi:10.3791/58162 (2018).More

Rush, B. M., Small, S. A., Stolz, D. B., Tan, R. J. An Efficient Sieving Method to Isolate Intact Glomeruli from Adult Rat Kidney. J. Vis. Exp. (141), e58162, doi:10.3791/58162 (2018).

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