Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Yetişkin sıçan böbrek üzerinden olduğu gibi Glomeruli yalıtmak için verimli bir eleme yöntemi

doi: 10.3791/58162 Published: November 1, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Bu protokol ana odak verimli bir şekilde uygun birincil glomeruli kültürlerin çeşitli aşağı akım uygulamaları kullanmak için en az kirletici maddeleri ile izole etmektir. İzole glomeruli bileşeni hücre tipleri arasındaki yapısal ilişkileri korumak ve kültürlü ex vivo kısa bir süre için olabilir.

Abstract

Glomerular yapısı ve işlevi korunması çok önemli glomerülonefrit önlenmesi, hangi sonunda kronik için yol açabilir proteinüri ile karakterize olan böbrek hastalığı ve son aşama böbrek hastalığı kategorisi. Glomerulus vücuttan sorumlu plazma filtrasyon için karmaşık bir aparat var. Hastalık, yapısal bütünlük kaybolur ve plazma içeriği anormal kaçağı için idrar içine sağlar. Yalıtmak ve kültür glomeruli incelemek için bir yöntem bu hastalıklar çalışma için önemlidir. Bu protokol için yapısal ve morfolojik özellikleri korunması ise yetişkin sıçan böbrek sağlam glomeruli alma verimli bir yöntem açıklanır. Bu işlem başına en az kirlenme ile böbrek glomeruli yüksek verim--dan diğer nefron kesimleri üretme yeteneğine sahip. Bu glomeruli ile yaralanma koşulları kimyasal toksinlerin protamine sülfat, hangi nedenleri ayak işlem efasman ve proteinüri hayvan modellerinde de dahil olmak üzere, çeşitli onlarla kuluçka tarafından taklit. Yaralanma derecesi transmisyon elektron mikroskobu, ayirt boyama ve western Blot kullanarak tespit edilebilir. Nephrin ve Wilms tümörü 1 (WT1) düzeyleri de bu kültürler tespit edilebilir. Kolaylığı ve esnekliği bu protokol nedeniyle izole glomeruli açıklandığı gibi ya da daha iyi çalışma glomerular sağlık ve yapısı hastalıklı Birleşik Devletleri yardım için araştırmacı ihtiyaçlarına en uygun bir şekilde yararlı olabilir.

Introduction

Glomerulus uzmanlaşmış bir tutam kapiller plazma dolaşan filtrasyon için sorumlu olduğunu. Böbrek temel fonksiyonel birimdir nefron başına oluşturur. Glomerular işlevi benzersiz delikli bir kapiller endotel, podocytes yarık diyafram ve aradan geçen bir membran tarafından tanımlanır. Bu katmanlar filtrate içine maddelerin boşaltım seçici için izin vermek için semipermeable bir bariyer oluşturmak. Büyük moleküllerin plazmada korunur ise su, iyonlar ve diğer küçük moleküller genelde, geçişi. Podocytes membran üzerinde yaymak özel epitel hücreleri kılcal sitoplazmik projeksiyonlar ayak işlemleri olarak bilinen çevreleyen vardır. Ayak bitişik podocytes interdigitate işler ve nephrin, podocin, P-cadherin ve ZO-11gibi proteinlerin oluşan yarık diyaframlar çarpı işareti vardır. Eşit olarak çapraz bölümünde bu ayak süreçleri membran üzerinde düzenlenir. Hastalıklı glomeruli içinde ayak süreçleri fena halde anormal veya "yok," plazma İçindekiler anormal sızıntı filtrate lider olmak. Bu nedenle, glomerular hasar genellikle anormal derecede büyük miktarda protein (Örneğin, proteinüri) ve/veya idrarda kırmızı kan hücreleri (Örneğin, hematüri) varlığı ile karakterizedir. Buna ek olarak, yaralı podocytes ifade nephrin hem de onun regülatör Wilms tümörü 1 (WT1), anahtar protein farklılaşma2,3bakımı için sorumlu kaybetmek. Glomeruli birincil hedefi olan hasarı diyabetik nefropati ve minimal değişiklik hastalığı, Membranöz nefropati ve fokal segmental glomerulosclerosis gibi diğer glomerulonephritides vardır. Bu hastalık ilerleyici böbrek yetmezliği ve son aşama böbrek hastalığı gelişimi, hayatta kalma diyaliz veya böbrek nakli dayanır bir durumda önemli nedenleri. Bu nedenle, kronik böbrek hastalığı (CKD) patoloji daha iyi anlamak için glomeruli çalışma önemlidir.

Bir hücre kültür sistemi glomerular biyoloji okuyan için önemlidir. Varlığı nedeniyle yarık diyafram protein mutasyonlar belli proteinuric hastalıkların yanı sıra yarık diyafram üreten merkezi rolü nedeniyle, çok fazla araştırma anlaşılır izolasyon podocyte kullanıldığında vardır. Bu vitroyararlanmak için birincil podocyte hücre hatları üretimi için neden olmuştur. Bu hücreler çeşitli koşullar altında kültürlü olabilir ve hatta üzerinde geçirgen destekler geçirgenliği4değerlendirmek için yetiştirilen olabilir. Ancak, yalıtım Proliferasyona hücre kez bazı onların podocyte işaretleri kaybetmiş dediferansiye hücreleri seçer. Koşullu olarak ölümsüzleştirdi podocytes hangi kültür büyümüş olabilir ama aynı zamanda SV40 büyük T genin (Örneğin immortomouse), bir sıcaklığa duyarlı mutant taşıyan bir transgenik fare yük türetilmiş nesil yol açmıştır podocyte işaretleri5tam bir dizi ifade etmek için farklı. Bu yöntemler birincil kültür anlayış podocyte biyoloji4,6,7' çok önemli olmuştur.

Yine de, tek hücre türleri içeren kültürler içinde vivo yanı sıra destek yapısı ve matrisler oluşan hücreler arası ilişkiler eksikliği ve bu hücrelerin monolayers mutlaka üç boyutlu özetlemek değil glomeruli mimarisi. Ölümsüzleştirdi podocytes da hantal ve8kültür ve her iki immortomouse bulundurma gerektirecek şekilde zor olabilir veya bir başlangıç aliquot hücre müfettişler başlamak için kurulmuş. Ayrıca, glomerulus sadece podocytes, ama aynı zamanda kapiller endotel hücreleri ve membran yanı sıra yapısı için destek sağlayan mesangial hücreler oluşur. Bu nedenle yerel mimarileri korumak olduğu gibi glomeruli incelenmesi için bütün müfettişlerin yanı sıra normal glomerulus oluşturan tüm hücreler için bir ex vivo yaklaşım geliştirmek kullanışlıdır.

1958 yılında, aşçı ve Pickering glomeruli tavşan böbrek gelen ilk yalıtım nitelendirdi. Yağ embolisi glomeruli içinde teslim oldu gözlemler sonra onlar aynı boyutta parçacıkların özellikle bu yapıların yalıtmak için kullanılabilir olduğu varsayılmıştır. Gerçekten de, demir oksit partikülleri infüzyon böbrek içine glomeruli bu parçacıklar bindirme yol açtı. Mekanik ayrışma ve böbrek eleme sonra glomeruli sağlam ve kullanımı ile manyetik ayırma9saflık ile izole olabilir. 1971 yılında enesali infüzyon ihmal demir oksit ve glomerular yalıtım eleme kıyılmış insan, köpek, tavşan veya sıçan böbrek doku10ile elde gösterdi. Bu teknik beri sonra müfettişler hedef bağlı olarak değiştirilmiş olabilir ama aslında bu daha da okudu olabilir veya hangi-ebil var olmak birincil hücre kültürleri kurulan11,12 arıtılmış hazırlıkları sonuçlandı , 13 , 14 , 15 , 16 , 17.

Burada bir iletişim kuralı üzerinden sıçan böbrek olduğu gibi uygun glomeruli yalıtım için açıklamak. Tüm iletişim kuralı sadece birkaç saat sürer. Her ne kadar onlar prolifere değil, her boyuttaki deneysel planları sadece malzeme başlangıç olarak böbrekler sayısını artırarak desteklenebilir. Glomeruli manyetik boncuk ayrılması için yayımlanmış protokolleri olmakla birlikte, onlar, daha pahalı boncuk İntravenöz enjeksiyon gerektirir ve boncuk da kültür glomeruli tarafından korunur ya da glomerular gerektirir beri biyoloji değiştirebilir" lysing"ve kaldırma Santrifüjü19tarafından. Fare glomeruli için karşılaştırıldığında, fare glomeruli (iki aylık fareleri18yaklaşık 100 µm) daha büyük boyutu basit bir eleme tekniği kullanarak diğer böbrek yapılardan ayırmak çok daha kolay yapar.

Kullanışlılığı bir kanıtı olarak, farklı hücre tipleri göstermek için glomeruli nitelendirmiştir. Glomeruli içinde vivo zarar için bilinen acentelere gösterilebilir ve yan etkilerinin protamine sülfat (PS) bu kültürler üzerinde göstermek. PS20glomerular kapiller duvarı boyunca yer alan anyonik siteler etkisiz hale getirir bir polycation olduğunu. Bu nötralizasyon glomerular filtrasyon bariyer üzerinde dramatik bir etkisi yoktur ve bu nedenle proteinüri ve ayak işlem efasman artırır. Bu glomeruli immunoblots için nephrin ve genel sağlık değerlendirmek için WT1 gibi anahtar proteinler ile tespit edilebilir. Ayrıca, onların yapısı ışık, ayirt ve elektron mikroskobu ile değerlendirilebilir.

Genel olarak, bu iletişim kuralını (sadece hayvanlar ve basit bazı ekipman erişim ihtiyacı) çoğu müfettişler için erişilemez. Morfolojik özellikleri, hasarsız yaptı glomeruli matris korunması işlevini ve hastalık ilerleme, bir eksiklik podocyte kültürlerin etkiler ve araştırmacı glomeruli analiz ve nasıl diğer önemli hücre türlerini görmek yapabiliyor.

Protocol

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Pittsburgh Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1. yalıtım sıçan Glomeruli

  1. Steril % 1 yalıtım arabellek hazırlamak için 600 mL kabı Sığır serum albumin (BSA) 5 g ekleyin.
    1. 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) x 500 mL kabı için ekleyin ve bir manyetik karıştırma çubuk ile tüm BSA eriyene kadar karıştırın.
    2. Steril filtre % 1 BSA/PBS arabellek bir hücre kültür Hood.
      Not: Steril % 1 BSA/PBS arabellek 4 ° C'de için bir hafta kadar tutulabilir.
  2. 2-4 Sprague-Dawley rat 150 ila 200 g ağırlığındaki elde edilir.
    1. Karbon dioksit inhalasyon yolu ile fareler dakikada Odası hacmi 10-%30 oranında % 100 karbon dioksit tanıtıldı bir odası kullanarak ötenazi. Hayvanlar solunum kesilmesi için gözlemlemek ve karbon dioksit kaldırılması önce göz rengi solmuş.
    2. Cilt üzerinden % 70 etanol ile ön karın hazırlamak ve istenirse saç kesme makineleri saç, kaldırmak için kullanır. Bir ensizyon deri cerrahi makas veya skalpel kullanarak olun. Başka bir ensizyon iç organlar ortaya çıkarmak için kas katmanı yoluyla olun. Ötenazi, ikincil Yöntem olarak konumlanmıştır diyafram ve göğüs kemiği veya göğüs kafesi üzerinden kesi genişletir.
    3. İzole etmek ve her iki böbrek çıkarın ve 30 mL Hanks tamponlu tuz çözeltisi (HBSS) on Ice ile steril 50 mL Plastik Konik tüp içine yerleştirin.
      Not: Birkaç fareler aynı odada ötenazi ve böbrekler tümünün aynı konik tüp içinde yerleştirilebilir.
  3. Buz ve taşıma böbrekler steril hücre kültür kukuIeta tutun. HBSS, 5 mL buz, üzerinde de içeren bir steril Petri böbrekler aktarmak ve kaldırmak ve perirenal yağ makasa atmak ve forseps keskin. Hala varsa, ayrıca kaldırmak ve küçük bir yüzeysel kesik yaparak böbrek çevreleyen kapsül atın ve sonra yavaşça uzak organ çekin için keskin forseps kullanın.
    Not: Her zaman buz ve uygulama steril tekniği böbrek yalıtır tutun. Steril gazlı bez bir parça kabında böbrek düzenleme sırasında tutmak için dokulu yüzeyi olarak yerleştirilebilir.
    1. Böbrekler yarıya boyuna (midsagittal bölümü) ve kaldırmak ve (daha koyu renkte olan) medulla HBSS 5 mL ile ikinci bir Petri bir neşter ile atmak.
    2. Üçüncü bir Petri kabına HBSS 5 mL ile içine ağırlıklı olarak böbrek korteks vardır, geri kalan parçaları aktarmak ve steril bir tıraş bıçağı ile daha az 1 mm boyutunda adettir kadar veya bir hamur kurdu kadar kıyma.
  4. Üst ve alt kısımlarında % 1 ile 180 µm elek ıslak BSA/PBS üzerinden 500 mL Atık kabı. Protein ile elek kat ve verimi artıracak glomeruli bağlılık azaltır gibi kritik bir adımdır.
  5. Kıyılmış korteks elek küçük bir kenarına yerleştirin ve buz üzerinde oturan bir alt tava içine elek ile dokuyu ezme için bir 10 mL şırınga dokulu dalgıç flanş (kauçuk conta karşısında taraf) kullanın. HBSS ile düzenli olarak yıkayın ama numune dilüsyonu önlemek mümkün olduğu kadar az kullanın.
    Not: bir arabellek toplam, bu yüzden sadece 25 mL daha fazla burada kullanılabilir 30 mL fazla olamaz. Elek tek bir kenarında kıyılmış doku yerleştirmek için sebebi elek tercihan--dan tüm elek yüzey alanı parçası maruz sınırlayarak bağlılık glomeruli önlemektir.
    1. Bunu kolaylaştırmak için toplama elek durulama için alt tavada sıvı yeniden. Eleme işlemi tamamlandıktan sonra dikkatli bir şekilde bir kez daha % 1 BSA/PBS arabelleği alt gevşek yapıştırılır herhangi bir glomeruli yakalamak için Pan ile elek alt yıkayın.
    2. Tüm alt tavada sıvı içine birkaç 10 mL şırınga 20 G iğneler ile donatılmış toplamak ve en az 2 ek kez iğne geçer. Üzerinde son koleksiyon, glomeruli içeren sıvı şırıngada 90 µm elekten geçirmek için hazır kadar devam et.
  6. Sıvı şırıngalarda depolanır iken alt pan %1 BSA/PBS içine atık kabı ve ıslak üst ve alt kısımlarında % 1 ile 90 µm elek ile temizlenerek yıkama BSA/PBS. Elek üstünde tepe-in buz üzerinde alt tava koyun.
    1. Şırıngaları örnek olarak yukarıda tarif başka bir şırınga flanş ile elek ile elek ve lapa bir kenarına uygulayın. Her şey bir elek kenarında toplamak için alt pan çözümden yıkayın.
    2. Bir kez eleme tamamlandıktan, dikkatli bir şekilde olduğu gibi adım 1.5.1 Elek alt yıka. 50 mL Plastik Konik tüp alt tavada tüm sıvı toplamak.
  7. %1 BSA/PBS bir atık kabı ve ıslak üst ve alt kısımlarında %1 75 µm elek alt tavayla yıkama BSA/PBS. Elek üstünde tepe-in buz üzerinde alt tava koyun.
    1. Örnek bir elek kenarına uygulayın. Sıvı ile kolayca akışı gerekir. Durulama ile en az 20 mL % 1'lik üst aracılığıyla BSA/PBS Atık kabı içine. Dikkatle de elek alt yıkayın. Glomeruli bu 75 µm elek üstünde kalır.
    2. HBSS elek ile baş aşağı durulama tarafından glomeruli bir petri içinde toplamak için kullanın. Buraya kadar HBSS gerektiği gibi kullanın. Bir veya daha fazla 50 mL Plastik Konik tüpler buz üzerinde toplamak.
  8. Vasıl 1800 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi, dikkatli bir pipet ile süpernatant kaldırmak ve Pelet 10 mL soğuk HBSS resuspend. Örnekleri dolduğunda birden çok konik Tüpler 1.7.2 içinde toplanmıştır. Santrifüjü adımı yineleyin.
  9. Glomeruli 5 mL HBSS sonraki adımdan devam etmek için hazır kadar resuspend.
  10. İstenirse, toplam glomeruli sayısı al. Bunun için bir pipet ile 10 µL örnek alıp açılan bir cam slayt üzerinde yerleştirin. Mikroskop altında görüntülemek, glomeruli alanında saymak ve toplam verim almak için 500 tarafından çarpın.
    Not: Saflık alanında görülen tübüllerin sayılması tarafından belirlenebilir ve yapıları glomeruli ve tübül toplam sayısına bölünmesi. Görme alanı > %95 glomeruli olmalıdır.
    1. Önemli tübüler kirlenme ise aygıtlarından 1.6.1 ileriye ve ne zaman tamamlanıyor adım 1.7.1 iyice yıkayın emin olun. Bu adımdır içinde hangi borulu kirlenme olasılığı en yüksektir.

2. yaralanma Glomeruli

  1. Glomeruli 15 mL Plastik Konik tüp ve spin aşağı 200 x g. Resuspend böylece yaklaşık 9,000 glomeruli iyi başına toplam verim dayalı HBSS uygun bir miktarda toplamak. Örnek 450 µL 24-şey plaka her kuyuya pipet veya aşağı akım deneyleri uyan herhangi bir plaka biçim gerekli.
    Not: glomeruli tampon karıştırmak için yukarı ve aşağı Pipetting homojen bir çözüm sağlar. Glomeruli çok yapışkan ve ağır birbirlerine sopa ve bir çözüm alt kısmında hızlı ve tüp tarafı üzerine yerleşmek.
  2. (PS) çözüm sülfat 6 mg/mL protamine yapmak için ilk PS 1 g ile 40 ° C arasında 15 mL Plastik Konik tüp ve girdap iyice ısıtılan dH2O 10 mL içine geçiyoruz. Çözümün 30 µL alıp dH2O 470 µL için ekleyin.
    Not: Bu 6 mg/mL çözüm üretecek ve 50 µL eklendiğinde kuyuya aşağıda açıklandığı gibi son konsantrasyonu 0.6 mg/mL olur.
    1. Protamine sülfatın 50 µL yinelenen ekleyin (Bu 1:10 numara seyreltme) HBSS (negatif kontrol), başka bir grup 50 µL sağlama sırasında bir grup her şey.
  3. 4 h 37 ° C'de plaka kuluçkaya
  4. Her şey bir microcentrifuge tüp (4000 x g, 4 ° C, 10-15 s) içeriğini aşağı spin ve PBS her iki kez 1 mL ile yıkayın.
  5. Son yıkama Aspire edin ve PBS 300 µL içinde resuspend. Protein yalıtım, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) görselleştirme ve (varsa) boyama ayirt için hazırlanacak üç aliquots ayrılmıştır.

3. analiz için Glomeruli hazırlanması

  1. Spin aşağı üç aliquots (4000 x g, 4 ° C, 10-15 s) ve Aspire edin kapalı kalan arabellek içeriğini ve numune analizine tarafından TEM, geçin Eğer, ya da protein yalıtım.
  2. TEM için işleme
    1. 0,01 M PBS soğuk % 2.5 oxazolidin 150 µL glomerular granül düzeltin. Sabitleştirici dikkatle Pelet Pelet bozmaya değil emin bir Pasteur pipet kullanarak sonra PBS ile durulanır kaldırmak ve % 1 osmiyum tetroxide içinde % 1 potasyum ferricyanide ile sonrası düzeltebilirim.
    2. Etanol kademeli bir dizi örnek kurutmak (30, 50, 70, 90, 100, 100, %100) ve propilen oksit epoksi malzeme gömme embed.
    3. Yarı ince kesilmiş (300 nm) bir ultramicrotome ilgili bölümlerde. % 0,5 ile % 1 sodyum borat toluidin Blue leke ve ışık mikroskobunda inceleyebilirsiniz.
    4. Ultrathin bölümleri kesme (65 nm), uranyl asetat ve Reynolds kurşun sitrat ile leke ve transmisyon elektron mikroskobunun inceleyin.
  3. Eğer işleme
    1. PBS çözümde 150 µL % 12 jelatin ekleyin ve hemen bir Pelet oluşturmak için kuru buza koyun. Pelet % 2 paraformaldehyde/1 500 µL içinde emmek PBS gecede 4 ° C'de bir microcentrifuge tüp x
    2. Pelet temel bir kalıp içine yerleştirin ve en uygun kesme sıcaklık (OCT) orta Kuru buz üzerine ekleyerek embed. 5-10 µm bölümler bir cryotome üzerinde kesme ve ayirt/immünhistokimya veya standart histolojik lekeleri ile devam edin.
  4. Protein yalıtım için
    1. 1,5 µL proteaz inhibitörü ile centrifuged glomerular Pelet ve dounce doku homogenizers ile 150 µL RIPA arabelleği ekleyin.
    2. Protein miktar ve immunoblotting ya da diğer protein analizi için devam edin.

Representative Results

Glomeruli yalıtım ötenazi andan itibaren protokole az 2 h olarak tamamlanmış ve bir yüksek üretilen iş ve verimlilik vardır. Tekniği, glomeruli sıçan böbrek aralıkları ile 8 böbrekler başlatırken 6.000-10,000 glomeruli başına verim uygun kullanımı ile. Son süspansiyon yoğun glomeruli ile doludur ve borulu kesimleri veya diğer hücre tipleri (Şekil 1A, B) en az kirlenme gösterilen genel bir saflık > %95 vardır. Buna ek olarak, OCT gömülü glomeruli morfoloji (Şekil 1C) görmek için hematoksilen ve eozin (H & E) lekeleri ile lekeli. Bu glomeruli bile işlendikten sonra bütün protokolü boyunca onların yapısını korumak. Biz izole glomeruli sağlam ve kalıcı podocytes (resim 2A), mesangial hücreler (Şekil 2B) ve endotel hücreleri (Şekil 2C) sahip göstermek.

Bir zamanlar glomeruli vivo içinde patoloji benzetimini yapmak için iyi bilinen kimyasal yaralanmalara maruz kalabilirler. Bu durumda, protamine sülfat (PS) onun yetenek şarj işlemi efasman ayak sonunda neden glomerular filtrasyon bariyer bozmaya seçildi. PS tedavi glomeruli nephrin (kırmızı) çarpıcı bir azalma ve çekirdekleri WT1 (yeşil) yolu ile ayirt için (Şekil 3A, B) olumlu bir dizi var. Glomeruli iletim elektron mikroskobu (Şekil 3C) için hazır olun. Kontrol örnekleri normal podocyte kara delik var ve PS tedavi glomeruli podocyte disfonksiyon işaretidir ve PS21kullanarak in vivo modellerinde görülen ayak işlem efasman (Şekil 3D), var ise işlemler ayak. Bu da immunoblotting (Şekil 3E, F) tarafından tespit nephrin bir düşüş için denk.

Canlılığı belirlemek için i ciddi caspase-3 apoptosis bir işareti olarak değerlendirildi. Ayirt kullanarak, i ciddi caspase-3 ilk 2 h yalıtım (Şekil 4) sonra başlayan bir kaç hücrelerdeki görünür. Bu proteaz ifade hücre sayısı zamanla, en üst düzey 24 ve 48 s ile daha bol oldu. Bu o apoptosis nispeten erken kültürde ortaya göstermektedir ve aşağı akım uygulamaları yalıtım en iyi sonuç için kısa bir süre sonra yapılmalıdır.

Figure 1
Resim 1 . Sıçan glomerular kültürler tipik görünümünü yalıtım sonra. (A)aydınlık alan görüntü glomerular kültür. Bir alan olduğu bir tek böbrek tübül bu test (ok ucu) seçtik, elde edilen kültürler genellikle > %95 saf olmakla birlikte. Ölçek çubuğu 100 µm. (B) büyütülmüş görüntü tek bir glomerulus eşittir. (C) Hematoksilen ve eozin leke tek glomerulus. B ve C ölçek barlarda eşit 10 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 . Kurucu hücre tipleri içinde izole glomeruli korunur. Confocal ayirt mikroskopi nephrin (kırmızı, podocytes) ve hücrenin özgü işaretleri podocytes, mesangial hücreler ve endotel tanımlamak için gerçekleştirildi. (A)Costain nephrin ve WT1 için (yeşil, podocytes). Nephrin ve PDGFR-β (yeşil, mesangial hücreler, ok) (B) Costain. (C) Costain nephrin ve CD31 için (yeşil, endotel hücreleri, damarları çapraz ok uçları tarafından işaretlenmiş bölümünde). Ölçek çubuğu tüm panelleri üzerinde 25 µm =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 . Podocyte yaralanma indüklenen vitro izole sıçan glomeruli kullanarak olabilir. (A)Confocal ayirt nephrin ve WT1 için bir tedavi edilmezse glomerular kültür mikroskobu. Doğrusal nephrin (kırmızı) boyama ve sağlıklı podocytes olduğunda görülen genellikle WT1 pozitif hücre çekirdeği (yeşil) varlığı dikkat edin. (Protamine sülfat sonra tedavi, nephrin ifadeB) azalmış ve doğrusal olmayan, ve WT1 podocyte yaralanma gösteren, yoktur. (C) transmisyon elektron microscpy (TEM) görüntü gösteren ayak işlemleri, membran ve delikli endotel normal glomerular yapısını tipik. Eşittir 500 nm Bar. (D) sonra protamine sülfat, ayak veya işlemler birbirine uzamış (ok uçları) yok, hangi podocyte yaralanma gösterir. (E) Western blot gösterilen nephrin için nephrin protamine sülfat tedaviden sonra azalmıştır. (F) aktin Batı leke için denetimi yükleme gösterilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 . Hücre canlılığı izole glomeruli olarak değerlendirilmesi. Confocal ayirt mikroskobu i ciddi caspase-3 (yeşil) gerçekleştirildi. Nephrin Co leke kolay glomeruli bulmak için gerçekleştirildi. Glomeruli yalıtım sonra 0 ve 1 h cleaved yok caspase-3 pozitif iken, floresans sinyal birkaç hücrelerdeki 2 h'de giderek daha fazla hücre artık onlar incelenmiş yalıtım sonra olumlu döndü belirtilmişti. Caspase-3 pozitif hücrelerinin en fazla 24 ve 48 h'de kaydedildi Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Bu ucuz, yeniden kullanılabilir ekipman ile basit bir protokol kullanarak sıçan böbrek glomeruli kurtarma için etkili bir yöntemdir. Tüm yordamlar gibi onun usefulness sınırlamalar vardır. > %95 saflıkta elde olmasına rağmen ilk olarak, protokol ve imkansız dışlamak Başlangıç materyali eleme yapısı nedeniyle bütün kirletici maddeleri ve bir kaç kırmızı kan hücreleri ve ara sıra borulu segment kültüründe mevcut olacak. Uygulamaların büyük çoğunluğu için bir sorun olacak bu küçük kirletici düşünmüyoruz. İkinci olarak, eleme Protokolü işlemleri sıçan böbrek, glomeruli fareler daha büyük olan kullanımına dayanır. Fare glomeruli gerekiyorsa, bir teknik ticari manyetik boncuklar (Örneğin, Dynabeads) kullanarak yayımlanmış22oldu. Üçüncü olarak, bu belirli mRNA'ların gösterilmiştir (plazminojen aktivatör inhibitörü-1 ve kollajen ben) yerine intraglomerular23hücreleri izole glomeruli neredeyse tamamen Bowman's kapsülü türetmek. MRNA yalıtım bu glomeruli teşebbüs ise bu uygunsuz sonuçlara neden olabilir. Bu bizim ellerde glomeruli çoğunluğu decapsulated vardır ve bu nedenle Bowman'ın kapsül önemli katkıları olmaması belirtmek gerekir. Dördüncü olarak, nispeten hızlı bir şekilde kültür koşullar altında gerçekleşmesi hücre ölümü başlar.

Apoptotik program i ciddi caspase-3, görünümünü tarafından kanıtlanan kültür 2 h olarak başlayan aktif bulduk. Genel olarak o apoptosis DNA parçalanma, tünel ve histolojik analizi, tarafından değerlendirildi içinde 1-2 h yalıtım24sonra oluşmaya başlar gösteren önceki raporlar ile anlaşma bu. Ancak, ayrıca erken gözlemler metabolik aktivite izole süzülen glomeruli için en az 3 h önemli hücresel canlılık bu timepoint16düşündüren, kültürlü üzerinden tespit edilemedi gösterdiğine dikkat edilmelidir. Yine de, sonuçlarına göre en iyi sonuçlar için amaçlanan deneyleri içinde hemen izole glomeruli yararlanmak için ihtiyatlı olacağına inanıyorum. Biz tüm glomerular yapısı bu timepoint bozulmaya başlar gözlemledim gibi tüm deneylerin 72 h önce yapılması önerilir.

4-8 böbrekler aksine sadece 2 ile glomeruli belirli sayıda çeşitli elekler bağlılığı nedeniyle kaybolur, elekler sonuna kadar kaplı olan bir kez çünkü ama orada hiçbir ek kaybı başlatma sırasında daha yüksek verim elde etmek daha kolaydır. Aynı nedenle, glomeruli için kuru bir elek uymaları ve doku pozlama elek bir kenarına sınırlamak için daha muhtemel olarak kullanmadan önce BSA/PBS arabellek elekler emmek önemlidir. Biz makul bir verim elde etmek hiç az 6 böbrek (3 Rat) ile başlayan öneririz.

Bazı araştırmacılar birincil podocyte kültürleri meyletmek-e doğru glomeruli dışarı kültür17sırasında büyümek izole glomeruli izole ettim. Bazı izole glomeruli kültür çanak Plastik için uygun olacaktır ve hücreleri geç timepoints (72 h yalıtım sonra), glomerular yapısı dışında geçirmek başlayacak gözlemlemekteyiz. Bu hücreler çalışma bu yalıtım Protokolü kapsamı dışındadır ve bu hücreler podocytes, parietal epitel hücreleri veya her iki15,25olup olarak bazı tartışmalara. Özellikle, Mundel vd., Arnavut kaldırımlı hücreleri süzülen glomeruli hasat özel koşullar26kültür altında olgun podocytes içine ayırt etmek için indüklenen bildirdin. Bazı karışıklık hücre kimliğini ilgili olup olmadığı izole glomeruli (çeper epitel hücreleri tarafından doldurulur Bowman's kapsülü de dahil olmak üzere) kapsüllü bağlı olabilir veya decapsulated eleme yordamdaki. Sıralı elek boyutları 180 kullanarak bizim ellerimizde, 90 ve 75 µm decapsulated olmak glomeruli çoğunluğu için yol açtı.

Çoğu proteinuric kronik böbrek hastalığı nedeniyle glomerular geçirgenliği artar biçimleridir. Birden çok yazar izole glomeruli ex vivo geçirgenliği deneylerde kullanılan. Bir yöntem, glomerular birim değişikliği çevreleyen ortamın ozmotik içeriğini değiştirme sonra geçirgenliği27tahmin etmek için kullanıldı. Son zamanlarda, bir floresan sonda gelen izole glomeruli kaçağı geçirgenliği ölçmek için sayısal ve glomerular hastalığı deneysel modeller28için maruz Rodents gerçekleştirilebilir kurulmuştur.

TEM hazırlık sürecinde biz bazen işlemlerin Asansör membran kapalı ayak podocyte görmek gözlemlemekteyiz. Bu kültürde oluyor ve daha büyük olasılıkla TEM numune hazırlama sırasında bir eserdir hissetmiyorum. Hatta bu durumda, özellikle, o ayak süreçleri "normal" bak ya da yok açıktır.

Genel olarak, bu iletişim kuralı tarafından bir yanıt olarak yaralanma morfolojik ve hücresel değişiklikler değerlendirebilir bir yöntem sağlar. Biz ne zaman hücre dışı matriks veya diğer yerel hücre tipleri ile etkileşimleri özellikle olarak bu izole podocyte kültürleri, bir arkadaşı Teknik olarak kullanılabileceğini tahmin. Bu zayıflatıcı hastalığı için gelecekteki tedavi geliştirmek yeteneğini artıracak proteinuric CKD anlayışı artırmak için söz sahibidir.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu eser Amerikan Kalp Derneği grant FTF 16990086, NIH P30 DK079307, Amerikan Derneği Nefroloji Gottschalk Ödülü, Pittsburgh Tıp Merkezi rekabetçi tıbbi araştırma fonu Ödülü Üniversitesi ve Pittsburgh Üniversitesi tarafından desteklenmiştir Doktorlar akademik Vakfı Ödülü. Gerard Apodaca histolojik analiz, Mara Sullivan ve Ming elektron mikroskobu, hakkında yardım almak için güneş ve Yingjian Li glomerular korunması ve Youhua Liu teknik onların giriş yapması bu iletişim kuralı için onun teknik öneriler için teşekkür ediyoruz. Ayrıca Cynthia St Hilaire CD31 antikor için teşekkür ediyoruz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Solutions, Chemicals, and Animals
Sprague-Dawley Rats Envigo 207M
Bovine serum albumin Fisher BP1605100
Hank's Balanced Salt Solution with Ca2+ and Mg2+ Thermo 14025092
1x Phosphate Buffered Saline VWR 97063-660
Protamine sulfate MP Bio ICN15197105
Karnovsky's Fixative
Gelatin
Paraformaldehyde EMD EM-PX0055-3
O.C.T. Scigen 23730571
RIPA Buffer
Halt Protease Inhibitors Thermo PI78442
Nephrin Antibody Fitzgerald 2OR-NP002
WT-1 Antibody Abcam ab89901-10ul
PDGFR-β Antibody Cell Signaling #3169S
CD31 Antibody LSBio LS-C348736
Cleaved caspase-3 antibody Cell Signaling 9661S
Poly/Bed 812 (Luft) epoxy Polysciences 08792-1
Equipment
Carbon dioxide chamber
Conical tubes, 15 mL
Conical tubes, 50 mL
Surgical scissors
Surgical forceps
Sterile gauze
Petri dishes, 100 mm
Scalpels
Razor blades
Sterile filter apparatus
Sieve Pan Alfa Aesar AA39999ON
180um Sieve Alfa Aesar AA39996ON
90um Sieve Alfa Aesar AA39990ON
75um Sieve Alfa Aesar AA39991ON
10 mL syringes
600 mL beakers
Cell culture incubator
Picofuge
Vortex
Tissue Homogenizers Fisher Scientific 50550226
20 G needles
Leica Reichart Ultracut ultramicrotome

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grahammer, F., Schell, C., Huber, T. B. Molecular understanding of the slit diaphragm. Pediatric Nephrology. 28, (10), 1957-1962 (2013).
  2. Tan, R. J., Zhou, L., Zhou, D., Lin, L., Liu, Y. Endothelin receptor a blockade is an ineffective treatment for adriamycin nephropathy. PLoS One. 8, (11), 79963 (2013).
  3. Wagner, N., Wagner, K. D., Xing, Y., Scholz, H., Schedl, A. The major podocyte protein nephrin is transcriptionally activated by the Wilms' tumor suppressor WT1. Journal of the American Society of Nephrology. 15, (12), 3044-3051 (2004).
  4. Rogacka, D., et al. Insulin increases filtration barrier permeability via TRPC6-dependent activation of PKGIalpha signaling pathways. Biochimica et Biophysica Acta. 1863, (6), 1312-1325 (2017).
  5. Mundel, P., et al. Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines. Experimental Cell Research. 236, (1), 248-258 (1997).
  6. Moller, C. C., et al. Induction of TRPC6 channel in acquired forms of proteinuric kidney disease. Journal of the American Society of Nephrology. 18, (1), 29-36 (2007).
  7. Tian, D., et al. Antagonistic regulation of actin dynamics and cell motility by TRPC5 and TRPC6 channels. Science Signaling. 3, (145), 77 (2010).
  8. Shankland, S. J., Pippin, J. W., Reiser, J., Mundel, P. Podocytes in culture: past, present, and future. Kidney Internationalernational. 72, (1), 26-36 (2007).
  9. Cook, W. F., Pickering, G. W. A rapid method for separating glomeruli from rabbit kidney. Nature. 182, (4642), 1103-1104 (1958).
  10. Misra, R. P. Isolation of glomeruli from mammalian kidneys by graded sieving. American Journal of Clinical Pathology. 58, (2), 135-139 (1972).
  11. Burlington, H., Cronkite, E. P. Characteristics of cell cultures derived from renal glomeruli. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 142, (1), 143-149 (1973).
  12. Harper, P. A., Robinson, J. M., Hoover, R. L., Wright, T. C., Karnovsky, M. J. Improved methods for culturing rat glomerular cells. Kidney International. 26, (6), 875-880 (1984).
  13. Kreisberg, J. I., Hoover, R. L., Karnovsky, M. J. Isolation and characterization of rat glomerular epithelial cells in vitro. Kidney International. 14, (1), 21-30 (1978).
  14. Weinstein, T., Cameron, R., Katz, A., Silverman, M. Rat glomerular epithelial cells in culture express characteristics of parietal, not visceral, epithelium. Journal of the American Society of Nephrology. 3, (6), 1279-1287 (1992).
  15. Yaoita, E., Kurihara, H., Sakai, T., Ohshiro, K., Yamamoto, T. Phenotypic modulation of parietal epithelial cells of Bowman's capsule in culture. Cell and Tissue Research. 304, (3), 339-349 (2001).
  16. Meezan, E., Brendel, K., Ulreich, J., Carlson, E. C. Properties of a pure metabolically active glomerular preparation from rat kidneys. I. Isolation. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 187, (2), 332-341 (1973).
  17. Piwkowska, A., et al. Insulin increases glomerular filtration barrier permeability through PKGIalpha-dependent mobilization of BKCa channels in cultured rat podocytes. Biochimica et Biophysica Acta. 1852, (8), 1599-1609 (2015).
  18. Kotyk, T., et al. Measurement of glomerulus diameter and Bowman's space width of renal albino rats. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 126, 143-153 (2016).
  19. Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Exp Ther Med. 5, (5), 1322-1326 (2013).
  20. Leeuwis, J. W., Nguyen, T. Q., Dendooven, A., Kok, R. J., Goldschmeding, R. Targeting podocyte-associated diseases. Advanced Drug Delivery Reviews. 62, (14), 1325-1336 (2010).
  21. Subramanian, B., et al. Mice with mutant Inf2 show impaired podocyte and slit diaphragm integrity in response to protamine-induced kidney injury. Kidney International. 90, (2), 363-372 (2016).
  22. Takemoto, M., et al. A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice. American Journal of Pathology. 161, (3), 799-805 (2002).
  23. Steinmetz, O. M., et al. A pitfall of glomerular sieving: profibrotic and matrix proteins derive from the Bowman's capsule and not the glomerular tuft in rats with renovascular hypertension. Nephrology Dialysis Transplantation. 22, (10), 3055-3060 (2007).
  24. Ishikawa, Y., Kitamura, M. Spontaneous apoptosis of podocytes in explanted glomeruli. Technical note. Kidney International. 54, (6), 2008-2013 (1998).
  25. Krtil, J., Platenik, J., Kazderova, M., Tesar, V., Zima, T. Culture methods of glomerular podocytes. Kidney and Blood Pressure Research. 30, (3), 162-174 (2007).
  26. Mundel, P., Reiser, J., Kriz, W. Induction of differentiation in cultured rat and human podocytes. Journal of the American Society of Nephrology. 8, (5), 697-705 (1997).
  27. McCarthy, E. T., et al. TNF-alpha increases albumin permeability of isolated rat glomeruli through the generation of superoxide. Journal of the American Society of Nephrology. 9, (3), 433-438 (1998).
  28. Desideri, S., et al. A novel assay provides sensitive measurement of physiologically relevant changes in albumin permeability in isolated human and rodent glomeruli. Kidney International. 93, (5), 1086-1097 (2018).
Yetişkin sıçan böbrek üzerinden olduğu gibi Glomeruli yalıtmak için verimli bir eleme yöntemi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rush, B. M., Small, S. A., Stolz, D. B., Tan, R. J. An Efficient Sieving Method to Isolate Intact Glomeruli from Adult Rat Kidney. J. Vis. Exp. (141), e58162, doi:10.3791/58162 (2018).More

Rush, B. M., Small, S. A., Stolz, D. B., Tan, R. J. An Efficient Sieving Method to Isolate Intact Glomeruli from Adult Rat Kidney. J. Vis. Exp. (141), e58162, doi:10.3791/58162 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter